Rozwój i reprodukcja C. elegans

Caenorhabditis elegans to anatomicznie mały i genetycznie prosty organizm wielokomórkowy o niezmiennym wzorcu rozwoju. Pomimo że inne organizmy, takie jak kręgowce, posiadają bardziej zmienne programy rozwojowe, badania nad rozwojem i reprodukcją nicieni dostarczyły istotnych informacji na temat mechanizmów molekularnych regulujących rozwój u szerokiego spektrum gatunków, w tym u ludzi. Dobra znajomość rozwoju nicieni oraz ich cyklu życiowego jest kluczowa dla powodzenia eksperymentów genetycznych.

Najpierw omówmy kluczowe aspekty rozwoju nicieni. Po zapłodnieniu pierwszym głównym zdarzeniem jest asymetryczny podział komórki, podczas którego ustala się oś przednio-tylna. Oś grzbietowo-brzuszna powstaje między stadium dwukomórkowym a czterokomórkowym, a oś lewo-prawo ustala się krótko po stadium czterokomórkowym.

W ciągu pierwszych pięciu cykli podziałów komórkowych pojawia się sześć komórek założycielskich. Są to AB, MS, E, C, D oraz P4. U każdego nicienia te same komórki założycielskie zawsze dają początek tym samym konkretnym tkankom.

Potomkowie komórki AB ostatecznie dadzą początek neuronom i tkance gardzieli. MS daje początek mięśniom, gardzieli i neuronom. Komórki pochodzące z E stają się tkanką jelitową. C daje początek mięśniom, neuronom i skórze. Komórki z komórki założycielskiej D stają się mięśniami ściany ciała. I wreszcie, komórka P4 da początek linii zarodkowej.

Interakcje międzykomórkowe mają krytyczne znaczenie dla określenia tych ostatecznych losów komórek. Na przykład interakcja ABp z P2 jest ważna dla powstania neuronów i komórek nabłonkowych. Interakcja ABa z EMS jest niezbędna do formowania się komórek gardzieli. Interakcja między tylną stroną EMS a P2 w stadium czterokomórkowym jest niezbędna, aby komórka E, powstała z komórki EMS, zróżnicowała się w komórki jelitowe.

Po kilku wczesnych podziałach, gdy embrion osiągnie stadium około 30 komórek, następuje zniesienie jaja nicienia. Dalsze podziały komórkowe prowadzą do zwiększenia liczby komórek i formowania się organów. W końcu maleńki nicień zaczyna poruszać się wewnątrz skorupki jaja i krótko po tym, jak jego gardziel zaczyna pompować, następuje wyklucie.

Ważnym aspektem rozwoju C. elegans jest apoptoza, czyli programowana śmierć komórki, która prowadzi do selektywnego usuwania niektórych komórek. Podczas fazy embrionalnej rozwoju nicienia 113 komórek obumiera w wyniku apoptozy.

Po przeanalizowaniu rozwoju embrionalnego, dowiedzmy się teraz więcej o cyklu życiowym nowo wyklutego nicienia. Cykl życiowy C. elegans składa się z czterech stadiów larwalnych — L1, L2, L3, L4 — po których następuje faza dorosła. W określonych warunkach środowiskowych, takich jak niedobór pożywienia, larwy w późnej fazie L1 lub L2 zatrzymują wzrost i wchodzą w alternatywny program rozwojowy, zwany stadiem dauer. Formy dauer mogą pozostawać w tym stadium przez wiele miesięcy, jednak po udostępnieniu pożywienia powracają do normalnego programu rozwojowego.

Nicienie występują w dwóch płciach — są to samopłodne hermafrodyty oraz samce. Hermafrodyty mają zaostrzony ogon i są zarówno szersze, jak i dłuższe od samców w tym samym wieku. Pod mikroskopem stereoskopowym samców łatwo rozpoznać po smukłym ciele, jednak najbardziej znaczącą różnicą jest charakterystyczny ogon samca, w którym znajduje się aparat kopulacyjny.

Linia zarodkowa hermafrodyty produkuje zarówno oocyty, jak i plemniki, natomiast linia zarodkowa samca produkuje wyłącznie plemniki. Linia zarodkowa zawiera komórki macierzyste w części dystalnej, które przemieszczają się w stronę końca proksymalnego, aby wytworzyć dojrzałe gamety.

Poprzez samopłodzenie dorosła hermafrodyta produkuje genetycznie identyczne potomstwo hermafrodytyczne z dwoma chromosomami płci. Okazyjnie niedzielenie się chromosomów, czyli brak ich prawidłowej separacji w linii zarodkowej hermafrodyty, prowadzi do powstania potomstwa męskiego z tylko jednym chromosomem płci. Wysoka temperatura zwiększa częstotliwość występowania zjawiska niedzielenia się chromosomów.

Uważa się, że reprodukcja płciowa jest siłą napędową różnorodności genetycznej. Mimo że kojarzenie występuje z niską częstotliwością, samopłodzenie jest głównym trybem reprodukcji C. elegans w naturze. Ważnym, nierozwiązanym pytaniem w biologii nicieni jest to, dlaczego samce przetrwały w toku ewolucji.

Po zapoznaniu się z rozwojem i cyklem życiowym C. elegans, sprawdźmy, jak można w praktyce wykorzystać tę wiedzę do przeprowadzania krzyżówek genetycznych. Przed rozpoczęciem prac należy starannie zaplanować strategię genetyczną.

Technika aseptyczna jest kluczowa dla uniknięcia kontaminacji bakteryjnej i grzybiczej. Nie należy dopuścić do wyschnięcia szalek, ponieważ może to uniemożliwić odzyskanie szczepów nicieni. W dniu rozpoczynania kojarzenia należy przygotować kilka szalek z koncentryczną plamką bakterii w centrum. Szalki należy opisać, podając nazwy szczepów oraz datę. Aby przeprowadzić kojarzenie, na każdą szalkę należy przenieść trzy hermafrodyty w stadium L4 lub młode dorosłe osobniki oraz dwanaście samców w stadium L4 lub młode dorosłe osobniki. Następnie należy inkubować szalki w odpowiedniej temperaturze i po czterech dniach sprawdzić obecność potomstwa z krzyżówki. Pojawienie się około 50% samców jest pierwszym sygnałem, że krzyżówka przebiegła pomyślnie. Należy wyizolować potomstwo hermafrodyty w stadium L4, ponieważ osobniki te nie zdążyły jeszcze kopulować z samcami na szalce. Należy je uważnie monitorować, aby upewnić się, że obserwowany fenotyp jest zgodny z fenotypem oczekiwanym.

Zrozumienie cyklu życiowego i rozwoju C. elegans pomogło w rozwiązaniu ważnych, fundamentalnych pytań z zakresu biologii komórki.

Apoptoza w linii zarodkowej jest integralną częścią oogenezy, embriogenezy i organogenezy u wielu organizmów, w tym u ludzi. Wiele regulatorów apoptozy jest konserwatywnych u ludzi i nicieni. Dlatego C. elegans stanowi unikalny system do zrozumienia, dlaczego tak wiele komórek zarodkowych obumiera podczas oogenezy u różnych gatunków.

Jedynymi rzeczywistymi liniami komórek macierzystych u C. elegans są komórki macierzyste linii zarodkowej w dystalnej części końcówki. Służą one jako paradygmat do zrozumienia, w jaki sposób utrzymywane są nisze komórek macierzystych oraz w jaki sposób komórki przechodzą proces różnicowania.

Wiele pasożytniczych nicieni zakażających ludzi przechodzi przez okres zatrzymania larwalnego, który jest podobny do stadium dauer u C. elegans. Po zakażeniu wznawiają one swój rozwój. Wiele upraw rolniczych jest również atakowanych przez pasożytnicze nicienie, które ulegają zatrzymaniu rozwoju. Lepsze zrozumienie mechanizmów stadium dauer doprowadzi do opracowania skuteczniejszych terapii przeciwko tym nicieniom.

Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do rozwoju i rozmnażania C. elegans. W tym filmie omówiliśmy rozwój embrionalny, specyfikację losów komórek oraz cykl życiowy C. elegans. Badania w tych obszarach dostarczyły istotnych informacji na temat mechanizmów apoptozy, komórek macierzystych oraz infekcyjnych nicieni.

Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w badaniach nad C. elegans.