Test cytometrii przepływowej opartej na komórkach do pomiaru aktywności cytotoksycznej

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar aktywności cytotoksycznej antygenowo specyficznych limfocytów T CD8 za pomocą analizy cytometrii przepływowej w oparciu o komórki. Jest to realizowane najpierw poprzez sześciodniową ekspansję efektorowych limfocytów T CD8 w obecności interesującego nas peptydu; w drugim kroku limfocyty T CD4 pełniące rolę komórek docelowych są inkubowane z tym samym peptydem, a następnie mieszane z nieinkubowanymi limfocytami T CD4. Następnie efektorowe limfocyty T CD8 i docelowe limfocyty T CD4 są współhodowane przez sześć godzin przy różnych stosunkach liczby efektorów do liczby komórek docelowych.

W ostatnim kroku, za pomocą cytometrii przepływowej, kwantyfikuje się liczbę zniszczonych obciążonych peptydem komórek docelowych CD4 oraz liczbę efektorowych komórek T CD8. Ostatecznie można obliczyć wewnętrzną zdolność do zabijania antygenowo swoistych limfocytów T CD8, wyrażoną w jednostkach litycznych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z testem uwalniania chromu jest to, że wykorzystuje ona autologiczne pierwotne komórki docelowe zamiast unieśmiertelnionych linii komórkowych i rzeczywiste komórki docelowe.

Ponadto liczbę komórek efektorowych można określić na poziomie pojedynczych komórek. Teraz asystent badawczy w moim laboratorium zaprezentuje procedurę izolacji komórek efektorowych CD8+. Należy rozpocząć od rozmrożenia autologicznych kriokonserwowanych PBMC w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C, a następnie przemyć komórki w maksymalnie 50 mL pożywki kompletnej.

Po policzeniu rozcieńcz pbmc do stężenia 5 milionów komórek na mililitr w pożywce kompletnej, a następnie dodaj do hodowli IL-2 oraz wybrany peptyd. Następnie nanieś jeden mililitr zawiesiny komórkowej do każdej studni płytki 96-dołkowej. Po trzech dniach hodowli wymień połowę supernatantu na świeżą pożywkę kompletną. Po sześciu dniach hodowli użyj pipety wielokanałowej, aby przenieść komórki do sterylnego zbiornika, a następnie policz i przemyj komórki.

Osad resuspender do stężenia 50 milionów komórek na mililitr w buforze separacyjnym i inkubować PBMC w 14-mililitrowej probówce z dnem okrągłym z koktajlem do wzbogacania ludzkich limfocytów T CD8+ w ilości 50 µL na milion komórek w temperaturze pokojowej. Po 10 minutach inkubować komórki z magnetycznymi cząstkami sprzężonymi z anty-CD8 IgG w stężeniu 150 µL na milion komórek przez kolejne pięć minut, a następnie uzupełnić zawiesinę komórkową do objętości 7 ml dodatkowym buforem separacyjnym. Umieścić probówkę w magnesie separacyjnym. Po pięciu minutach, pozostawiając probówkę w magnesie, przelać komórki do 15-mililitrowej probówki stożkowej. Następnie zabarwić niewielką alikwot komórek przeciwciałami przeciwko CD3 i CD8 w PBS uzupełnionym o 2% FBS przez 30 minut w temperaturze 4 °C.

Potwierdź za pomocą cytometrii przepływowej, że czystość komórek wynosi 95% dla frakcji CD8+ lub więcej. Następnie dodaj 225 µL kompletnej pożywki do pięciu probówek z nakrętką, a następnie wykonaj seryjne rozcieńczenia komórek od 1:2 do 1:32. Aby wyizolować docelowe komórki CD4+, rozpocznij od rozmrożenia autologicznych kriozachowanych PBMC w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.

Przenieś rozmrożone komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml pożywki. Wyselekcjonuj limfocyty T wykazujące ekspresję CD4 za pomocą separacji cząstkami magnetycznymi, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, potwierdzając za pomocą cytometrii przepływowej czystość limfocytów T CD4+ na poziomie 95% lub wyższym. Po policzeniu komórek podziel je do dwóch stożkowych probówek o pojemności 15 ml, a następnie przemyj je w ciepłym PBS i resuspenduj osady w PBS do stężenia 20 milionów komórek na ml.

Po upewnieniu się, że komórki są chronione przed światłem, jedną połowę limfocytów T CD4+ barwi się świeżo przygotowanym roztworem roboczym CFSE o wysokim stężeniu do stężenia końcowego 0,2 millimolar, a drugą połowę świeżo przygotowanym roztworem roboczym CFSE o niskim stężeniu do stężenia końcowego 0,04 millimolar przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2. Po zakończeniu barwienia komórki należy odwirować, a osady resuspenderować w jednym mililitrze ciepłej pożywki kompletnej w celu przerwania reakcji znakowania. Limfocyty T CD4+ znakowane niskim stężeniem CFSE poddaje się pulsacji peptydem zainteresowania w pożywce kompletnej w stężeniu końcowym 5 mikrogramów na mililitr przez 45 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Po inkubacji przemyj obie populacje limfocytów T o wysokim i niskim poziomie CFSE dwukrotnie w pożywce niepełnej i resuspenduj obie zawiesiny komórkowe do stężenia 200 000 komórek na mililitr pożywki niepełnej, a następnie zmieszaj dwie populacje docelowe w stosunku jeden do jednego (CFSE high do CFSE low).

Następnie dodaj 100 µL zmieszanych komórek docelowych T CD4+ do każdej studni w płytce 96-dołkowej z dnem okrągłym, a następnie zasiaj 1 µL zawiesiny komórek T CD8+ w duplikacie, aby uzyskać końcową objętość 200 µL na studnię. Aby zmierzyć poziom apoptozy podstawowej, zasiaj trzy studnie zawierające wyłącznie komórki docelowe, a następnie inkubuj kokulturę przez sześć godzin w inkubatorze do hodowli komórkowej. Po zakończeniu inkubacji przenieś komórki do płytki VBO 96-dołkowej i barw każdą studnię tetramerami MHC sprzężonymi z peptydem i PE przez 15 minut.

W inkubatorze do hodowli komórkowej należy przemyć komórki roztworem PBS uzupełnionym o 2% FBS, a następnie barwić komórki przez 30 minut w temperaturze 4°C, w ciemności, po uprzednim przemyciu komórek. Ponownie zawiesić osady w 100 µL 2% formaldehydu w PBS i przeanalizować komórki metodą cytometrii przepływowej. Po współhodowli komórki są analizowane i bramowane zgodnie z przedstawionymi na tych wykresach kropkowych schematami.

Stosunek żywotnych komórek docelowych CFSE high do CFSE low, niepobudzonych lub pobudzonych peptydem, analizuje się za pomocą niewielkiej bramki FSC (forward scatter) i SSC (side scatter). Żywe komórki są wyznaczane na podstawie negatywnego markeru live/dead, a komórki T CD4-dodatnie są analizowane pod kątem CFSE w celu określenia stosunku komórek CFSE low do CFSE high. Następnie tworzona jest większa bramka FSC i SSC, aby policzyć całkowitą liczbę martwych lub żywych komórek efektorowych oraz docelowych. Po sześciogodzinnej inkubacji komórki T CD8-dodatnie i tetramer-dodatnie oraz komórki T CD4-dodatnie CFSE low są analizowane w celu określenia stosunku komórek efektorowych do komórek docelowych.

Całkowitą liczbę efektorowych limfocytów T CD8+ wyznacza się poprzez bramkowanie komórek CD8+ tetramer+. Całkowitą liczbę komórek docelowych wyznacza się poprzez bramkowanie limfocytów T CD4+, CFSE low oraz komórek żywych i martwych. Stosunek komórek CFSE low do CFSE high wynosi jeden do jednego.

W przypadku hodowli docelowych komórek CD4-dodatnich w nieobecności komórek efektorowych, stosunek ten drastycznie spada. W sytuacji, gdy komórki z niskim poziomem CFSE są inkubowane z całkowitą populacją komórek T CD8-dodatnich, zawierającą swoiste dla antygenu efektorowe komórki T CD8-dodatnie.

Wraz ze spadkiem stosunku komórki efektorowe CFSE low CD4+ pulsujące peptydem zaczynają wykazywać pozytywny wynik w testach żywotności (live/dead). Rozcieńczenie komórek efektorowych prowadzi zatem do przywrócenia stosunku CFSE, a w konsekwencji do przywrócenia liczby żywotnych komórek docelowych T CFSE low CD4+ pulsujących peptydem. Procent specyficznej lizy można następnie nanieść na wykres jako funkcję stosunku liczby komórek efektorowych do docelowych w skali logarytmicznej. Jak pokazano na wykresie, na podstawie otrzymanego obrazu obliczana jest regresja liniowa, a równanie linii trendu służy do wyznaczenia jednostek litycznych.

Jest to liczba CD8+ efektorowych limfocytów T wymagana do zabicia 30% z 1 miliona docelowych limfocytów CD4+, aby określić wewnętrzną zdolność cytolityczną antygenowo specyficznych limfocytów CD8+ oraz porównać wyniki między dawcami. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat wykorzystania cytometrii do pomiaru aktywności toksycznej antygenowo specyficznych limfocytów T. Technika ta może zostać z łatwością zaadaptowana dla własnego typu komórek T.