Name: Test cytometrii przepływowej opartej na komórkach do pomiaru aktywności cytotoksycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Poznaj test cytometrii przepływowej do pomiaru aktywności cytotoksycznej komórek CD8+ T przeciwko komórkom CD4+ T. Ta metoda wykorzystuje autologiczne komórki docelowe i pozwala obliczyć jednostki lityczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Biuro Turystyki, Handlu i Rozwoju Gospodarczego Florydy.

1. Przygotowanie efektorowych limfocytów T CD8+
<ol>
	<li>Rozmrozić autologiczne kriokonserwowane PBMC (2-3 fiolki po 50 x 106 komórek), przenosząc kriowial z ciekłego azotu do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umyj komórki, wypełniając probówkę do 50 ml pełnym RPMI (4 mM L-glutaminy i 100 U/ml penicyliny i streptomycyny, uzupełnione 10% FBS). Policz PBMC i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 5 x 106/ml w pełnym RPMI.</li>
	<li>Dodać specyficzny peptyd (5 μg/ml) i IL-2 (10 ng/ml) do PBMC.</li>
	<li>Założyć kulturę na płytce z 96 głębokimi dołkami; wysiać 1 ml zawiesiny komórkowej do każdej studzienki.</li>
	<li>Po 3 dniach hodowli zastąp połowę pożywki do hodowli komórkowych świeżą, kompletną RPMI.</li>
	<li>Po 6 dniach hodowli zebrać wszystkie PBMC za pomocą pipety wielokanałowej i przenieść komórki do sterylnego zbiornika.</li>
	<li>Policzyć, przemyć i ponownie zawiesić PBMC w dawce 5 x 107/ml w zalecanym buforze separacyjnym w 14 ml probówkach z okrągłym dnem. Dodać ludzki koktajl wzbogacający limfocyty T CD8 + o stężeniu 50 μl/ml komórek. Mieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Dodać cząstki magnetyczne w stężeniu 150 μl/ml i inkubować przez 5 minut.</li>
	<li>Doprowadzić zawiesinę komórek do objętości 7 ml, dodając bufor rozdzielający. Przystąp do izolacji immunomagnetycznej nietkniętych limfocytów T CD8 +, umieszczając rurkę w magnesie. Po 5 minutach, trzymając probówkę nadal w magnesie, przelej interesujące komórki do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Weź małą porcję i wybarwić komórki przeciwciałami przeciwko CD3 i CD8 w 1X PBS-2% FBS przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Czystość limfocytów T CD8 + można następnie zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej z oczekiwaną czystością 95% lub wyższą.</li>
	<li>Zawiesić limfocyty T CD8 + w 450 μl z pełnym RPMI.</li>
	<li>Dodaj 225 μl kompletnego RPMI do 5 probówek z nakrętką.</li>
	<li>Przygotować seryjne rozcieńczenia (od 1:2 do 1:32), przenosząc 225 μl CD8+ do następnej probówki (patrz górny panel Rysunek 1).</li>
</ol>
2. Przygotowanie docelowych limfocytów T CD4+
<ol>
	<li>Rozmrozić autologiczne kriokonserwowane PBMC (1 fiolka z 50 x 106 komórek) poprzez przeniesienie kriowialu z ciekłego azotu do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml RPMI.</li>
	<li>Przemyć komórki i ponownie zawiesić PBMC w dawce 5 x 107/ml z buforem separacyjnym w 14 ml probówkach z okrągłym dnem. Dodać koktajl wzbogacający ludzkie limfocyty T CD4 + o stężeniu 50 μl/ml komórek. Mieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Dodać cząstki magnetyczne w stężeniu 100 μl/ml i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Doprowadzić zawiesinę komórek do objętości 7 ml przez dodanie buforu rozdzielającego. Przystąp do izolacji limfocytów T CD4 +, umieszczając rurkę w magnesie. Po 5 minutach, gdy probówka nadal znajduje się w magnesie, wlej wybrane komórki do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Pobrać małą porcję i wybarwić komórki przeciwciałami przeciwko CD3 i CD4 w 1x PBS-2% FBS przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Czystość limfocytów T CD4 + można następnie zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej z oczekiwaną czystością 95% lub wyższą.</li>
	<li>Policz limfocyty T CD4 +, podziel je na dwie stożkowe probówki o pojemności 15 ml i umyj w ciepłym 1x PBS.</li>
	<li>Przygotować roztwór roboczy o wysokiej zawartości CFSE o wysokiej zawartości 0,4 μM w ciepłym PBS.</li>
	<li>Przygotuj roztwór roboczy o niskiej zawartości CFSE o stężeniu 0,04 μM, rozcieńczając porcję 10-krotnego roztworu roboczego o wysokiej zawartości CFSE w ciepłym PBS.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 20 x 106/ml PBS (jeśli liczba komórek T CD4 + jest mniejsza niż 10 x 106 / ml zawiesić komórki w 0,5 ml PBS) i wybarwić połowę komórek T CD4 +, dodając jedną równą objętość 0,4 μM roztworu roboczego o wysokiej zawartości CFSE (stężenie końcowe 0,2 μM). Na przykład na 1 ml komórek dodać 1 ml roztworu roboczego CFSE. Wybarwić pozostałą połowę CD4+, dodając jedną równą objętość 0,04 μM roztworu roboczego o niskiej zawartości CFSE (stężenie końcowe 0,02 μM). Barwienie komórek przez 15 min w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .</li>
	<li>Po inkubacji osadzać komórki z prędkością 1,500 obr./min przez 5 minut i ponownie zawieś w 1 ml ciepłego pełnego RPMI w celu wygaszenia reakcji znakowania.</li>
	<li>Pulsować limfocyty T CD4 + o niskim poziomie CFSE, dodając interesujący peptyd o końcowym stężeniu 5 μg / ml w pełnym RPMI i inkubować przez 45 minut w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umyj limfocyty T CD4 + o wysokiej i niskiej CFSE w pełnym RPMI. Powtórz w sumie dwa prania. Zawiesić ponownie w stężeniu 2 x 10po 5 komórek/ml w pełnej liczbie obrotów na minutę.</li>
	<li>Wymieszaj dwie populacje docelowe w stosunku 1:1 (CFSE-Wysoki:CFSE-Niski) (patrz Rysunek 1 dolny panel).</li>
</ol>
3. Kultura
<ol>
	<li>Z każdego rozcieńczenia limfocytów T CD8 + wysiewać 100 μl w dwóch egzemplarzach na okrągłodenną 96-dołkową płytkę.</li>
	<li>Dodać zmieszane docelowe limfocyty T CD4+ (100 μl) do każdego rozcieńczenia komórek efektorowych do końcowej objętości 200 μl.</li>
	<li>Aby zmierzyć podstawową apoptozę, wysiewaj 3 dołki samymi komórkami docelowymi.</li>
	<li>Inkubować kokulturę przez 6 godzin w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
4. Barwienie i akwizycja cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Przenieść komórki na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V i wybarwić tetramerami pMHC sprzężonymi z PE przez 15 minut w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umyć w 1x PBS-2% FBS i zabarwić komórki za pomocą Far Red LIVE/DEAD fixable dead cell, αCD3-Alexa700, αCD8-Percp, αCD4-Brilliant Violet 650 przez 30 min w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Umyj komórki raz 1x PBS-2% FBS i ponownie zawieś w 100 μl z 2% formaldehydu w 1x PBS.</li>
	<li>Pozyskaj komórki na cytometrze przepływowym.</li>
</ol>

<ol><li>Appay, V., Van Lier, R. A. W., Sallusto, F., Roederer, M. Cytometry. 73, 975-983 (2008).</li>
<li>Betts, M. R., Harari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+function+of+protective+T+cell+immune+responses+in+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+HIV+AIDS%22%5BJournal%5D)">Phenotype and function of protective T cell immune responses in HIV.</a> Curr. Opin. HIV AIDS. 3, 349-355 (2008).</li>
<li>Roder, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+immunodeficiency+disorder+in+humans+involving+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells.</a> Nature. 284, 553-555 (1980).</li>
<li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J. Immunol. 171, 27-31 (2003).</li>
<li>Byers, A. M., Kemball, C. C., Moser, J. M., Lukacher, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+CTL+activity+by+polyoma+virus-specific+effector+and+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo CTL activity by polyoma virus-specific effector and memory CD8+ T cells.</a> J. Immunol. 171, 17-21 (2003).</li>
<li>Devevre, E., Romero, P., Mahnke, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LiveCount+Assay%3A+concomitant+measurement+of+cytolytic+activity+and+phenotypic+characterisation+of+CD8%28%2B%29+T-cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">LiveCount Assay: concomitant measurement of cytolytic activity and phenotypic characterisation of CD8(+) T-cells by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 311, 31-46 (2006).</li>
<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li>
<li>Mbitikon-Kobo, F. M., Bonneville, M., Sekaly, R. P., Trautmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+measurement+of+the+cytotoxic+capacity+of+human+primary+antigen-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ex vivo measurement of the cytotoxic capacity of human primary antigen-specific CD8 T cells.</a> J. Immunol. Methods. 375, 252-257 (2012).</li>
<li>Bryant, J., Day, R., Whiteside, T. L., Herberman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+lytic+units+for+the+expression+of+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Calculation of lytic units for the expression of cell-mediated cytotoxicity.</a> J. Immunol. Methods. 146, 91-103 (1992).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%28%2B%29+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8(+) T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li>
<li>Trautmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+metabolic%2C+functional%2C+and+cytolytic+differences+characterize+HIV-specific+CD8+T+cells+in+primary+and+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Profound metabolic, functional, and cytolytic differences characterize HIV-specific CD8 T cells in primary and chronic HIV infection.</a> Blood. 120, 3466-3477 (2012).</li>
<li>Hildemann, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Efficiency+of+Antiviral+CD4%28%2B%29+Killer+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High Efficiency of Antiviral CD4(+) Killer T Cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisany tutaj test pozwala na ilościowe określenie głównej funkcji limfocytów T CD8 +: aktywności cytolitycznej. Dokładny pomiar tej funkcji ma ogromne znaczenie przy charakteryzowaniu funkcji efektorowych limfocytów T CD8 +, ponieważ poprzednie badania wykazały niezgodność między tą funkcją a wydzielaniem cytokin przez limfocyty T CD8 + specyficzne dla antygenu10,11. Ze względu na krótki czas inkubacji kokultury (6 godzin) i zastosowanie autologicznych komórek docelowych, wskaźnik niespecyficznego zabijania k...

Aktywność cytolityczna jest główną funkcją limfocytów T CD8+, ale nadal rzadko jest mierzona, ponieważ testy używane do tego celu są kłopotliwe i trudne do standaryzacji. Dokładny pomiar tej funkcji ma ogromne znaczenie przy charakterystyce funkcji efektorowych limfocytów T CD8 +, ponieważ nie opisano jeszcze wiarygodnych predyktorów skutecznej cytotoksyczności za pośrednictwem komórek1,2. W tym miejscu proponujemy nowy test funkcjonalny do pomiaru aktywności cytotoksycznej komórek T CD8 + specyficznych dla antygenu na docelowych limfocytach T CD4 +. Opracowano kilka podejść w celu zapewnienia alternatyw dla złotego standardu, testu uwalniania chromu. Przedstawiamy tutaj test komórkowy, który ujawnia cały proces zabijania, ponieważ mierzy śmierć żywych komórek docelowych. Metodę tę wyprowadzono z protokołów testów cytotoksycznych in vivo opartych na cytometrii przepływowej u myszy4,5 i in vitro u ludzi6. W tym protokole limfocyty T CD8 + specyficzne dla antygenu zawarte w całkowitej populacji limfocytów T CD8 + są używane jako komórki efektorowe, a autologiczne limfocyty T CD4 + są używane jako komórki docelowe. Interesujące nas efektorowe limfocyty T CD8 + są wyliczane za pomocą tetramerów MHCI / peptydów7. Śmierć komórek docelowych oblicza się na podstawie stosunku limfocytów T CD4 + załadowanych peptydami / niezaładowanych. Wcześniej wykazaliśmy, że metoda ta była powtarzalna, czuła, specyficzna i nie zależała od liczby komórek efektorowych w całej populacji limfocytów T CD8 +8. Licząc zarówno liczbę komórek efektorowych, jak i docelowych w teście kokultury, można obliczyć wewnętrzną zdolność limfocytów T CD8 + do zabijania komórek docelowych i wyrazić ją w jednostkach litycznych9.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do wzbogacania ludzkich limfocytów T CD4+ EasySep</td><td>Komórka macierzysta</td><td>19052</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wzbogacania ludzkich limfocytów T EasySep CD8</td>+ Komórka <td>macierzysta</td><td>19053</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do proliferacji komórek CellTrace CFSE - do cytometrii przepływowej</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Far Red LIVE/DEAD do naprawy martwa komórka</td><td>Invitrogen</td><td>L10120</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 Mysz anty-ludzka CD3</td><td>BD</td><td></td><td></td>557943</tr><tr><td>Brilliant Violet 650 Przeciwciało anty-ludzkie CD4</td><td>Biolegend</td><td>317435</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD8 PerCP</td><td>Biolegend</td><td>344707</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium 1x</td><td>VWR</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna 100x Roztwór</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca - złota, inaktywowana termicznie</td><td>PAA</td><td>A15-252</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe; Traktowane; U-dół; z pokrywką</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>25 ml sterylnego polistyrenu, indywidualnie pakowane zbiorniki</td><td>USA Scientific</td><td>2321-2230</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe U-denne, sterylne płytki głębinowe 2 ml</td><td>Thermo Scientific 275743</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human IL-2 (v126), klasa badawcza</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-096</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep Buffer, bufor separacyjny</td><td>Komórka</td> <td>macierzysta20104</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Polipropylenowa rurka stożkowa</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>14 ml probówka z okrągłym dnem, polipropylenowa</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr>Duża <td>komórka trzpieniowa</td><td>z magnesem Easy EasySep</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>VWR</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa; Płytka V dolna z pokrywką</td><td>Fisher</td><td>12-565-481</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu, odczynnik ACS, 37 % wag. w H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml mikroprobówka z nakrętką, stożkowa</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.005</td><td></td></tr></tbody></table>

test cytometrii przepływowej opartej na komórkach do pomiaru aktywności cytotoksycznej

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Aktywność cytolityczna limfocytów T CD8+ jest rzadko oceniana. Opisujemy tutaj nowy test komórkowy do pomiaru zdolności limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu do zabijania limfocytów T CD4 + obciążonych pokrewnym peptydem. Docelowe limfocyty T CD4 + są podzielone na dwie populacje, znakowane dwoma różnymi stężeniami CFSE. Jedna populacja jest pulsowana peptydem będącym przedmiotem zainteresowania (CFSE-niski), podczas gdy druga pozostaje niepulsująca (CFSE-wysoka). Limfocyty T CD4 + z impulsami i bez impulsów miesza się w równych proporcjach i inkubuje z rosnącą liczbą oczyszczonych limfocytów T CD8 +. Specyficzne zabijanie autologicznych docelowych limfocytów T CD4 + analizuje się za pomocą cytometrii przepływowej po kohodowli z limfocytami T CD8 + zawierającymi specyficzne dla antygenu efektorowe limfocyty T CD8 + wykryte przez barwienie peptydem / tetramerem MHCI. Specyficzna liza docelowych limfocytów T CD4 + mierzona w różnych proporcjach efektorowych w stosunku do celu, pozwala na obliczenie jednostek litycznych, LU30/106 komórek. Ten prosty i nieskomplikowany test pozwala na dokładny pomiar wewnętrznej zdolności limfocytów T CD8 + do zabijania docelowych limfocytów T CD4 +.

Schemat przedstawiony na Rysunku 1 podsumowuje przebieg testu. Oczyszczone limfocyty T CD8+ (komórki efektorowe) resuspendowano w 450 µl kompletnego medium RPMI, a następnie wykonano rozcieńczenia seryjne, dodając 225 µl limfocytów T CD8+ do kolejnej probówki zawierającej 225 µl medium (panel górny). Oczyszczone limfocyty T CD4+ (komórki docelowe) policzono, podzielono do dwóch probówek i barwiono dwiema różnymi stężeniami CFSE (wysokim i niskim) zgodnie z opisem w protokole. Limfocyty T CD4+ CFSE-low in...

Ten protokół opisuje czuły, komórkowy test cytotoksyczności. Wyliczając spadek częstości żywych docelowych limfocytów T CD4 + w obecności rosnącej liczby efektorowych limfocytów T CD8 +, test ten pozwala na bezpośrednią ocenę aktywności cytolitycznej limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu.

Test cytometrii przepływowej opartej na komórkach do pomiaru aktywności cytotoksycznej

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar aktywności cytotoksycznej antygenowo specyficznych limfocytów T CD8 za pomocą analizy cytometrii przepływowej w oparciu o komórki. Jest to realizowane najpierw poprzez sześciodniową ekspansję efektorowych limfocytów T CD8 w obecności interesującego nas peptydu; w drugim kroku limfocyty T CD4 pełniące rolę komórek docelowych są inkubowane z tym samym peptydem, a następnie mieszane z nieinkubowanymi limfocytami T CD4. Następnie efektorowe limfocyty T CD8 i docelowe limfocyty T CD4 są współhodowane przez sześć godzin przy różnych stosunkach liczby efektorów do liczby komórek docelowych.W ostatnim kroku, za pomocą cytometrii przepływowej, kwantyfikuje się liczbę zniszczonych obciążonych peptydem komórek docelowych CD4 oraz liczbę efektorowych komórek T CD8. Ostatecznie można obliczyć wewnętrzną zdolność do zabijania antygenowo swoistych limfocytów T CD8, wyrażoną w jednostkach litycznych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z testem uwalniania chromu jest to, że wykorzystuje ona autologiczne pierwotne komórki docelowe zamiast unieśmiertelnionych linii komórkowych i rzeczywiste komórki docelowe.Ponadto liczbę komórek efektorowych można określić na poziomie pojedynczych komórek. Teraz asystent badawczy w moim laboratorium zaprezentuje procedurę izolacji komórek efektorowych CD8+. Należy rozpocząć od rozmrożenia autologicznych kriokonserwowanych PBMC w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C, a następnie przemyć komórki w maksymalnie 50 mL pożywki kompletnej.Po policzeniu rozcieńcz pbmc do stężenia 5 milionów komórek na mililitr w pożywce kompletnej, a następnie dodaj do hodowli IL-2 oraz wybrany peptyd. Następnie nanieś jeden mililitr zawiesiny komórkowej do każdej studni płytki 96-dołkowej. Po trzech dniach hodowli wymień połowę supernatantu na świeżą pożywkę kompletną. Po sześciu dniach hodowli użyj pipety wielokanałowej, aby przenieść komórki do sterylnego zbiornika, a następnie policz i przemyj komórki.Osad resuspender do stężenia 50 milionów komórek na mililitr w buforze separacyjnym i inkubować PBMC w 14-mililitrowej probówce z dnem okrągłym z koktajlem do wzbogacania ludzkich limfocytów T CD8+ w ilości 50 µL na milion komórek w temperaturze pokojowej. Po 10 minutach inkubować komórki z magnetycznymi cząstkami sprzężonymi z anty-CD8 IgG w stężeniu 150 µL na milion komórek przez kolejne pięć minut, a następnie uzupełnić zawiesinę komórkową do objętości 7 ml dodatkowym buforem separacyjnym. Umieścić probówkę w magnesie separacyjnym. Po pięciu minutach, pozostawiając probówkę w magnesie, przelać komórki do 15-mililitrowej probówki stożkowej. Następnie zabarwić niewielką alikwot komórek przeciwciałami przeciwko CD3 i CD8 w PBS uzupełnionym o 2% FBS przez 30 minut w temperaturze 4 °C.Potwierdź za pomocą cytometrii przepływowej, że czystość komórek wynosi 95% dla frakcji CD8+ lub więcej. Następnie dodaj 225 µL kompletnej pożywki do pięciu probówek z nakrętką, a następnie wykonaj seryjne rozcieńczenia komórek od 1:2 do 1:32. Aby wyizolować docelowe komórki CD4+, rozpocznij od rozmrożenia autologicznych kriozachowanych PBMC w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.Przenieś rozmrożone komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml pożywki. Wyselekcjonuj limfocyty T wykazujące ekspresję CD4 za pomocą separacji cząstkami magnetycznymi, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, potwierdzając za pomocą cytometrii przepływowej czystość limfocytów T CD4+ na poziomie 95% lub wyższym. Po policzeniu komórek podziel je do dwóch stożkowych probówek o pojemności 15 ml, a następnie przemyj je w ciepłym PBS i resuspenduj osady w PBS do stężenia 20 milionów komórek na ml.Po upewnieniu się, że komórki są chronione przed światłem, jedną połowę limfocytów T CD4+ barwi się świeżo przygotowanym roztworem roboczym CFSE o wysokim stężeniu do stężenia końcowego 0,2 millimolar, a drugą połowę świeżo przygotowanym roztworem roboczym CFSE o niskim stężeniu do stężenia końcowego 0,04 millimolar przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2. Po zakończeniu barwienia komórki należy odwirować, a osady resuspenderować w jednym mililitrze ciepłej pożywki kompletnej w celu przerwania reakcji znakowania. Limfocyty T CD4+ znakowane niskim stężeniem CFSE poddaje się pulsacji peptydem zainteresowania w pożywce kompletnej w stężeniu końcowym 5 mikrogramów na mililitr przez 45 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych.Po inkubacji przemyj obie populacje limfocytów T o wysokim i niskim poziomie CFSE dwukrotnie w pożywce niepełnej i resuspenduj obie zawiesiny komórkowe do stężenia 200 000 komórek na mililitr pożywki niepełnej, a następnie zmieszaj dwie populacje docelowe w stosunku jeden do jednego (CFSE high do CFSE low).Następnie dodaj 100 µL zmieszanych komórek docelowych T CD4+ do każdej studni w płytce 96-dołkowej z dnem okrągłym, a następnie zasiaj 1 µL zawiesiny komórek T CD8+ w duplikacie, aby uzyskać końcową objętość 200 µL na studnię. Aby zmierzyć poziom apoptozy podstawowej, zasiaj trzy studnie zawierające wyłącznie komórki docelowe, a następnie inkubuj kokulturę przez sześć godzin w inkubatorze do hodowli komórkowej. Po zakończeniu inkubacji przenieś komórki do płytki VBO 96-dołkowej i barw każdą studnię tetramerami MHC sprzężonymi z peptydem i PE przez 15 minut.W inkubatorze do hodowli komórkowej należy przemyć komórki roztworem PBS uzupełnionym o 2% FBS, a następnie barwić komórki przez 30 minut w temperaturze 4°C, w ciemności, po uprzednim przemyciu komórek. Ponownie zawiesić osady w 100 µL 2% formaldehydu w PBS i przeanalizować komórki metodą cytometrii przepływowej. Po współhodowli komórki są analizowane i bramowane zgodnie z przedstawionymi na tych wykresach kropkowych schematami.Stosunek żywotnych komórek docelowych CFSE high do CFSE low, niepobudzonych lub pobudzonych peptydem, analizuje się za pomocą niewielkiej bramki FSC (forward scatter) i SSC (side scatter). Żywe komórki są wyznaczane na podstawie negatywnego markeru live/dead, a komórki T CD4-dodatnie są analizowane pod kątem CFSE w celu określenia stosunku komórek CFSE low do CFSE high. Następnie tworzona jest większa bramka FSC i SSC, aby policzyć całkowitą liczbę martwych lub żywych komórek efektorowych oraz docelowych. Po sześciogodzinnej inkubacji komórki T CD8-dodatnie i tetramer-dodatnie oraz komórki T CD4-dodatnie CFSE low są analizowane w celu określenia stosunku komórek efektorowych do komórek docelowych.Całkowitą liczbę efektorowych limfocytów T CD8+ wyznacza się poprzez bramkowanie komórek CD8+ tetramer+. Całkowitą liczbę komórek docelowych wyznacza się poprzez bramkowanie limfocytów T CD4+, CFSE low oraz komórek żywych i martwych. Stosunek komórek CFSE low do CFSE high wynosi jeden do jednego.W przypadku hodowli docelowych komórek CD4-dodatnich w nieobecności komórek efektorowych, stosunek ten drastycznie spada. W sytuacji, gdy komórki z niskim poziomem CFSE są inkubowane z całkowitą populacją komórek T CD8-dodatnich, zawierającą swoiste dla antygenu efektorowe komórki T CD8-dodatnie.Wraz ze spadkiem stosunku komórki efektorowe CFSE low CD4+ pulsujące peptydem zaczynają wykazywać pozytywny wynik w testach żywotności (live/dead). Rozcieńczenie komórek efektorowych prowadzi zatem do przywrócenia stosunku CFSE, a w konsekwencji do przywrócenia liczby żywotnych komórek docelowych T CFSE low CD4+ pulsujących peptydem. Procent specyficznej lizy można następnie nanieść na wykres jako funkcję stosunku liczby komórek efektorowych do docelowych w skali logarytmicznej. Jak pokazano na wykresie, na podstawie otrzymanego obrazu obliczana jest regresja liniowa, a równanie linii trendu służy do wyznaczenia jednostek litycznych.Jest to liczba CD8+ efektorowych limfocytów T wymagana do zabicia 30% z 1 miliona docelowych limfocytów CD4+, aby określić wewnętrzną zdolność cytolityczną antygenowo specyficznych limfocytów CD8+ oraz porównać wyniki między dawcami. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat wykorzystania cytometrii do pomiaru aktywności toksycznej antygenowo specyficznych limfocytów T. Technika ta może zostać z łatwością zaadaptowana dla własnego typu komórek T.

cell-based-flow-cytometry-assay-to-measure-cytotoxic-activity

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przepływowa metoda cytometryczna oparta na komórkach do pomiaru aktywności cytotoksycznej

Ten film demonstruje technikę in vitro do pomiaru cytotoksyczności komórek zabójczych (CIK) indukowanych cytokinami przeciwko komórkom nowotworowym. Po kokulturze docelowych komórek rakowych z komórkami CIK, martwe komórki rakowe są identyfikowane za pomocą fluorescencyjnego barwnika żywotności i oznaczane ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej, szacując cytotoksyczne działanie komórek CIK.

Test in vitro do badania zdolności cytotoksycznych komórek zabójczych indukowanych cytokinami

Ten film demonstruje aktywność lityczną komórek NK w stosunku do komórek docelowych barwionych fluorescencyjnie. Metoda ta umożliwia pomiar cytotoksyczności indukowanej komórkami NK poprzez barwienie martwych komórek i użycie cytometru przepływowego do ilościowego określenia żywych i martwych komórek docelowych.

Test cytotoksyczności za pośrednictwem komórek NK Przygotowanie próbki do analizy cytometrycznej przepływowej

Ten film prezentuje test apoptozy w komórkach nowotworowych indukowany przez wstępnie aktywowane efektorowe limfocyty T. Poprzez kokulturację tych komórek z komórkami rakowymi oznaczonymi jądrami fluorescencyjnymi, dodaje się substrat fluorogenny rozszczepialny przez kaspazę. Apoptotyczne komórki rakowe będą miały inny kolor w swoich jądrach, co prowadzi do podwójnej fluorescencji. Ta podwójna fluorescencja wskazuje na to, że komórki rakowe ulegają apoptozie.

Test in vitro do badania cytotoksyczności wstępnie aktywowanych limfocytów T CD8 + wobec komórek rakowych

Opisujemy jednokomórkowy test wysokoprzepustowy do pomiaru cytotoksyczności limfocytów T podczas inkubacji z komórkami docelowymi nowotworu. Metoda ta wykorzystuje gęsty, elastomerowy układ dołków sub-nanolitrowych (~ 100 000 dołków / tablicę) w celu przestrzennego ograniczenia limfocytów T i komórek docelowych w określonych proporcjach i jest sprzężona z mikroskopią fluorescencyjną w celu monitorowania koniugacji efektor-cel i późniejszej apoptozy.

Ilościowy, wysokoprzepustowy test cytotoksyczności pojedynczej komórki dla limfocytów T

Test cytotoksyczności krwi pełnej (WCA) jest testem cytotoksyczności opracowanym przez połączenie wysokoprzepustowej technologii pozycjonowania komórek z mikroskopią fluorescencyjną i automatycznym przetwarzaniem obrazu. Tutaj opisujemy, w jaki sposób komórki chłoniaka leczone przeciwciałem anty-CD20 mogą być analizowane w czasie rzeczywistym w ludzkiej krwi pełnej w celu zapewnienia ilościowej analizy cytotoksyczności komórkowej.

Testy cytotoksyczności w czasie rzeczywistym w ludzkiej krwi pełnej

Prosta i niezawodna metoda jest tutaj opisana do analizy zestawu funkcji komórek NK, takich jak degranulacja, produkcja cytokin i chemokiny w różnych podzbiorach komórek NK.

Test oparty na cytometrii przepływowej do monitorowania funkcji komórek NK

Ta praca opisuje zaawansowany proces dokładnego i szybkiego określania liczby komórek NK (Natural Killer) i cytotoksyczności komórek NK w próbkach ludzkiej krwi.

Analiza cytometryczna przepływu aktywności litycznej komórek NK w ludzkiej krwi pełnej

Metoda oparta na cytometrii przepływowej do ilościowego określania aktywności cytotoksycznej ludzkich komórek NK jest pokazana tutaj.

Test cytotoksyczności oparty na cytometrii przepływowej do oceny aktywności ludzkich komórek NK

Tutaj opisujemy metodę tworzenia kropelek podwójnej emulsji otaczających jedną limfocyt T i komórkę docelową raka, aby zbadać zabijanie komórek na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta pozwala na podwójną kwantyfikację zarówno cząsteczek cytotoksycznych, jak i apoptozy komórek docelowych w dużej populacji limfocytów T.

Test cytotoksyczności oparty na kropelkach w celu oceny limfocytów T receptora antygenu chimerycznego na poziomie pojedynczej komórki

Ten protokół zapewnia zstandaryzowany in vitro przepływ pracy dla spójnego pomiaru naturalnej, chimerycznej receptora antygenowego–pośredniczonej i zależnej od przeciwciał cytotoksyczności ludzkich naturalnych komórek zwanych zbójcami przy użyciu żywego obrazu komórkowego i cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórek NK potencjowanej przez chimeryczne receptory antygenowe i przeciwciała terapeutyczne z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek i cytometrii przepływowej

Poznaj test cytometrii przepływowej do pomiaru aktywności cytotoksycznej komórek CD8+ T przeciwko komórkom CD4+ T. Ta metoda wykorzystuje autologiczne komórki docelowe i pozwala obliczyć jednostki lityczne.

Test cytometrii przepływowej opartej na komórkach do pomiaru aktywności cytotoksycznej

Przeglądaj więcej filmów