Name: Obrazowanie uszkodzeń błon komórkowych i procesów subkomórkowych zaangażowanych w naprawę (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-24T20:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 44 s
Description: Poznaj metody obrazowania uszkodzeń błon komórkowych i procesów naprawczych z użyciem fluorescencyjnych barwników. Protokół ten pozwala badać kinetykę odpowiedzi komórkowych oraz rolę lizosomów w fuzji z uszkodzoną błoną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grants AR055686 i AR060836 oraz stypendium podoktorskie dla AD przez Francuskie Stowarzyszenie Dystrofii Mięśniowej (AFM). Urządzenie do obrazowania komórkowego wykorzystane w tym badaniu jest wspierane przez National Institutes of Health Grants HD040677.

1. Obrazowanie naprawy błony komórkowej za pomocą masowego ranienia (szklane kulki)
Ten protokół pozwala na oddzielne oznaczanie uszkodzonych komórek i tych, które się nie goją. Kwantyfikacja tych populacji komórek wymaga zastosowania trzech warunków: 1. Test (C1) - Komórki mogą się naprawiać w obecności Ca2+, 2. Kontrola 1 (brak uszkodzenia C2) - Komórki są inkubowane w obecności Ca2+, ale nie są uszkodzone, i 3. Kontrola 2 (brak naprawy C3) - komórki mogą się naprawiać przy braku Ca2+.
<ol>
	<li>Hoduj komórki do >50% konfluencji na trzech sterylnych szkiełkach nakrywkowych i umyj C1 i C2 dwukrotnie CIM w temperaturze 37 °C i C3 PBS w temperaturze 37 °C, a następnie przenieś szkiełka nakrywkowe na silikonowe O-ringi.</li>
	<li>Dodać 100 μl wstępnie podgrzanego roztworu dekstranu FITC w CIM na C1 i C2 lub w PBS na C3.</li>
	<li>Uszkodzić błonę plazmatyczną na C1 i C3, delikatnie tocząc szklane kulki 40 mg po szkiełku nakrywkowym w temperaturze pokojowej, ręcznie przechylając szkiełka nakrywkowe do przodu i do tyłu 6-8 razy pod kątem 30°. 
	Uwaga: W przypadku lekkich obrażeń upewnij się, że szklane koraliki są równomiernie rozłożone, minimalizując w ten sposób powtarzające się obrażenia. Aby poprawić odtwarzalność uszkodzeń między próbkami, należy jednocześnie przeprowadzić zranienie kulką szklaną różnych próbek, które mają być porównane.</li>
	<li>Unikając dalszego zwijania się ściegów, przenieść wszystkie szkiełka nakrywkowe do inkubatora o temperaturze 37 °C przy temperaturze otoczeniaCO 2 i odczekać, aż naprawa będzie kontynuowana przez 5 minut.</li>
	<li>Nie dopuszczając do toczenia się kulek, usuń szklane kulki i dekstran FITC, przemywając CIM (C1 i C2) lub PBS (C3) w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umieścić szkiełka nakrywkowe z powrotem na pierścieniu uszczelniającym o przekroju okrągłym i dodać 100 μl wstępnie podgrzanego, utrwalanego lizyną, roztworu dekstranu TRITC w CIM na C1 i C2 lub w PBS na C3.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut w temperaturze otoczeniaCO 2 .</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe umyć dwukrotnie wstępnie podgrzanym CIM i utrwalić 4% PFA przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć dwukrotnie PBS i inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej w barwniku Hoechst.</li>
	<li>Próbki należy dwukrotnie przemyć PBS, zamontować na szkiełku za pomocą pożywki montażowej i komórkach obrazowych za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.</li>
	<li>Użyj komórek z C2, aby określić intensywność czerwonego i zielonego zabarwienia tła i użyj tej wartości, aby określić próg kanałów czerwonego i zielonego dla wszystkich próbek (C1-C3).</li>
	<li>Oceń całkowitą liczbę komórek, które są a) zielone (uszkodzone i naprawione) oraz b) czerwone lub zarówno czerwone, jak i zielone (uszkodzone, ale nie udało się naprawić) w próbkach C1 i C3.</li>
	<li>Policz >100 zielonych komórek dla każdego stanu i wyraź frakcję komórek, które nie uległy naprawie, jako procent wszystkich uszkodzonych komórek (zielony i czerwony).</li>
</ol>
2. Obrazowanie na żywo kinetyki naprawy błony komórkowej po uszkodzeniu laserowym
<ol>
	<li>Umyj komórki wstępnie podgrzanym CIM, a następnie umieść szkiełko nakrywkowe w CIM z barwnikiem FM.</li>
	<li>Umieścić szkiełko nakrywkowe w uchwycie w inkubatorze ze stopniem utrzymywanym w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wybierz obszar błony komórkowej o wielkości 1-2mm2 i naświetlaj przez <10 ms laserem impulsowym. Osłabij moc lasera za pomocą oprogramowania do 40-50% mocy szczytowej. Optymalna moc pozwala na konsekwentne, ale nieśmiertelne obrażenia, które muszą być określane metodą prób i błędów dla każdego używanego instrumentu i linii komórkowej.</li>
	<li>Aby monitorować naprawę, obrazuj co 10 sekund w epifluorescencji i jasnym polu, zaczynając przed urazem i kontynuuj przez 3-5 minut po urazie. 
	Uwaga: W przypadku braku kontroli naprawy powtórz kroki 2.1-2.4 z komórkami uszkodzonymi w PBS zawierającym barwnik FM.</li>
	<li>Aby określić ilościowo kinetykę naprawy, zmierz komórkową fluorescencję barwnika FM i wykreśl zmianę intensywności (ΔF/F0) w trakcie obrazowania. Dane te należy uśrednić dla ponad 10 komórek w każdym warunku i wykreślić jako wartość uśrednioną lub wartość pojedynczej komórki, w zależności od potrzeb.</li>
</ol>
3. Obrazowanie masowe (szklane kulki) Uraz wywołany lizosomalną egzocytozą
Próbki zawierają następujące komórki wyhodowane do>50% konfluencji: 1. Test (C1) - Komórki dopuszczone do naprawy w obecności Ca>2+, 2. Kontrolka 1 (C2; Brak uszkodzeń) - Komórki nie uszkodzone ani nie inkubowane z przeciwciałem pierwszorzędowym, oraz 3. Kontrolka 2 (C3; Brak naprawy) - Komórki mogą się naprawiać przy braku Ca2+.
<ol>
	<li>Szkiełka nakrywkowe C1 i C2 umyć dwukrotnie CIM w temperaturze 37 °C, a C3 PBS w temperaturze 37 °C i przenieść na silikonowe O-ringi.</li>
	<li>Dodać 100 μl wstępnie podgrzanego, utrwalanego lizyny dekstranu TRITC w CIM na C1 i C2 oraz w PBS na C3.</li>
	<li>Uszkodzić błonę plazmatyczną na C1 i C3, jak w kroku 1.3.</li>
	<li>Unikając dalszego zwijania się ściegów, przenieść wszystkie szkiełka nakrywkowe do inkubatora o temperaturze 37 °C przy temperaturze otoczeniaCO 2 i odczekać, aż naprawa będzie kontynuowana przez 5 minut.</li>
	<li>Usuń szklane kulki i dekstran TRITC, myjąc szkiełka nakrywkowe w zimnym podłożu wzrostowym, ponownie upewniając się, że szklane kulki nie toczą się na komórkach.</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe należy dwukrotnie przepłukać zimnym podłożem i przenieść na O-ringi.</li>
	<li>Do C1 i C3 dodać 100 μl szczurzego przeciwciała anty mysiego LAMP1 w zimnej pożywce pełnoporcjowej i dodać zimną, kompletną pożywkę wzrostową do C2.</li>
	<li>Aby umożliwić wiązanie przeciwciał, inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie zimnym CIM i utrwal wszystkie szkiełka nakrywkowe 4% PFA przez 10 minut w temperaturze suchej, a następnie spłucz 3x CIM.</li>
	<li>Inkubować wszystkie szkiełka nakrywkowe w 100 μl roztworu blokującego przez 15 minut w temperaturze pokojowej</li>
	<li>Inkubować wszystkie szkiełka nakrywkowe w 100 μl przeciwciała przeciw szczurom Alexa Fluor 488 przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć dwukrotnie PBS i inkubować przez 2 minuty w RT w Hoechst.</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie PBS, zamontuj na szkiełku za pomocą podłoża montażowego i zobrazuj za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.</li>
	<li>Korzystając z obrazów komórek C2, określ niespecyficzne barwienie tła w kanałach czerwonym (dekstran TRITC) i zielonym (przeciwciało Alexa Fluor 488) i użyj tych wartości barwienia tła do progu kanałów czerwonego i zielonego dla wszystkich próbek (C1-C3).</li>
	<li>Użyj >100 oznaczonych na czerwono komórek C1 i C3, aby zmierzyć intensywność barwienia LAMP1 (na zielono) w uszkodzonych komórkach. Aby eksperyment zakończył się sukcesem, barwienie LAMP1 w komórkach z C3 będzie znacznie niższe niż w komórkach z C1.</li>
</ol>
4. Obrazowanie na żywo uszkodzenia błony komórkowej wywołane transportem subkomórkowym
<ol>
	<li>Fluorescencyjnie znakować interesujący nas przedział poprzez transfekcję odpowiedniego reportera (np. CD63-GFP dla lizosomów8) lub przy użyciu barwników fluorescencyjnych9.</li>
	<li>W celu znakowania lizosomów barwnikiem fluorescencyjnym należy inkubować komórki wyhodowane do 50% konfluencji w pożywkach wzrostowych zawierających FITC-dekstran</li>
	<li>Pozostawić dekstran do endocytozy przez 2 godziny (lub dłużej, w zależności od potrzeb, w celu wystarczającego znakowania endosomalnego dekstranem przez linię komórkową będącą przedmiotem zainteresowania) w inkubatorze CO2 .</li>
	<li>Umyj komórki wstępnie podgrzaną pożywką wzrostową i inkubuj w niej przez 2 godziny w inkubatorze CO2 , aby umożliwić zgromadzenie całego endocytozowanego dekstranu w lizosomie.</li>
	<li>Przed obrazowaniem przepłukać szkiełko nakrywkowe we wstępnie ogrzanym CIM i zamontować w uchwycie szkiełka nakrywkowego na inkubatorze stage w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie szerokopolowe (do ruchu w całej komórce) lub TIRF (ruch na powierzchni komórki i egzocytoza) - komórki, które nie mają stłoczonych lizosomów znakowanych dekstranem FITC, są idealne do obrazowania ruchu i egzocytozy poszczególnych lizosomów.</li>
	<li>Ustawianie laserów TIRF do mikroskopu obrazowego: Użyj obiektywu 60X lub 100X z >1.45 NA. Ustaw kąt padania wiązki laserowej TIRF, korzystając z podejścia producenta.</li>
	<li>Uszkodzić błonę komórkową, naświetlając mały obszar (1-2mm2) przez <100 ms, laserem impulsowym o tłumieniu 40-50%.</li>
	<li>Aby monitorować odpowiedź lizosomu na uszkodzenie komórek, obrazuj komórki z prędkością 4-6 klatek na sekundę przez co najmniej 2 minuty lub dłużej, w zależności od dynamiki egzocytozy w interesujących komórkach.</li>
</ol>

<ol><li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li>
<li>Togo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+plasma+membrane+stimulates+rearrangement+of+microtubules+and+lipid+traffic+toward+the+wound+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site.</a> Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).</li>
<li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2%2B-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li>
<li>Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbing+confers+resistance+against+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Blebbing confers resistance against cell lysis.</a> Death Differ. 18, 80-89 Forthcoming.</li>
<li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li>
<li>Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wound+repair+in+Drosophila+occurs+through+three+distinct+phases+of+membrane+and+cytoskeletal+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling.</a> Cell Biol. 193, 455-464 (2011).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+VII+restricts+fusion+pore+expansion+during+lysosomal+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis.</a> PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).</li>
<li>McNeil, P. L., Clarke, M. F., Miyake, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wound+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell wound assays.</a> Protoc. Cell Biol. Chapter 12, (2001).</li>
<li>McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+introduction+of+molecules+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct introduction of molecules into cells.</a> Protoc. Cell Biol. Chapter 20, (2001).</li>
<li>Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).</li>
<li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li>
<li>Benink, H. A., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentric+zones+of+active+RhoA+and+Cdc42+around+single+cell+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds.</a> Cell Biol. 168, 429-439 (2005).</li>
<li>Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+constitutive+exocytosis+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Cell Biol. 149, 23-32 (2000).</li>
<li>Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((docking+and+exocytosis+of+single+secretory+granules+in+live+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells.</a> 388, 474-478 (1997).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaiswal%2C+JK+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , Wiley and Sons Inc. 4.12.1-4.12.15 (2003).</li>
<li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+events+at+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging single events at the cell membrane.</a> Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Uszkodzenie błony komórkowej in vivo występuje z powodu różnych fizjologicznych czynników stresogennych i opracowano kilka podejść eksperymentalnych w celu ich naśladowania. Obejmują one uszkodzenie błony komórkowej przylegających komórek poprzez zeskrobanie ich z naczynia lub przejście przez strzykawkę o wąskim otworze9,10. Po takich urazach komórki goją się w zawiesinie i nie przylegają do macierzy zewnątrzkomórkowej, jak to zwykle ma miejsce w tkance. Jeszcze inne, takie jak stosowanie toksyn tworz...

Błona komórkowa utrzymuje integralność komórek, zapewniając barierę między komórką a środowiskiem zewnątrzkomórkowym. Bodziec chemiczny, elektryczny lub mechaniczny, który przekracza normalny próg fizjologiczny, a także obecność atakujących patogenów, może spowodować uszkodzenie błony komórkowej i wywołać późniejszą odpowiedź komórkową w celu naprawy tego urazu. Aby przetrwać te uszkodzenia błony komórkowej, komórki posiadają skuteczny mechanizm naprawy. Mechanizm ten jest zależny od wapnia i obejmuje wewnątrzkomórkowy transport białek, takich jak między innymi aneksyny i MG53, a także przedziałów subkomórkowych, takich jak endosomy, lizosomy, pęcherzyki Golgiego i mitochondria do uszkodzonej błony komórkowej1-7. Jednak szczegóły sekwencji zdarzeń molekularnych i subkomórkowych zaangażowanych w naprawę uszkodzonej błony komórkowej pozostają słabo poznane.
Odpowiedź naprawcza komórki może być podzielona na wczesne i późne odpowiedzi. Wczesne reakcje, które zachodzą w skali od kilku sekund do minut, są niezwykle ważne w określaniu charakteru późnych odpowiedzi prowadzących do udanej naprawy komórki lub śmierci komórki. Testy punktu końcowego oparte na masowej analizie biochemicznej i komórkowej pomogły ustalić udział procesów molekularnych i komórkowych w naprawie. Jednak ze względu na niejednorodność i szybkość odpowiedzi na naprawę komórkową, testy punktu końcowego nie dostarczają szczegółów kinetycznych i przestrzennych sekwencji zdarzeń prowadzących do naprawy. Podejścia, które umożliwiają kontrolowane uszkodzenie błony komórkowej i umożliwiają monitorowanie naprawy błony komórkowej i związanych z nią odpowiedzi subkomórkowych w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej, idealnie nadają się do takich badań. Tutaj takie podejścia zostały zaprezentowane. Dwa z tych protokołów opisują podejścia do monitorowania kinetyki naprawy błony komórkowej w czasie rzeczywistym oraz odpowiedzi subkomórkowych związanych z procesem naprawy w żywych komórkach po uszkodzeniu laserowym. Jako uzupełnienie tych testów opartych na obrazowaniu żywych komórek, opisano również testy punktu końcowego, które zapewniają populacyjną miarę monitorowania naprawy pojedynczych komórek i związanych z nią odpowiedzi subkomórkowych. Aby zademonstrować ich użyteczność, podejścia te wykorzystano do monitorowania transportu i egzocytozy lizosomów w odpowiedzi na uszkodzenie błony komórkowej.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H1387</td><td>Służy do przygotowania CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7,4)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP410</td><td>Służy do przygotowania CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7,4)</td></tr><tr><td>Dekstran FITC (utrwalany lizyną)</td><td>Invitrogen</td><td>D1820</td><td>2 mg/ml w CIM lub PBS</td></tr><tr><td>Koraliki szklane</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>TRITC dekstran (utrwalany lizyną)</td><td>Invitrogen</td><td>D1818</td><td>2 mg/ml w CIM lub PBS</td></tr><tr><td>PFA 16%</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>4% w PBS</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1/10 000 w PBS</td></tr><tr><td>FM barwnik</td><td>Invitrogen</td><td>T3163</td><td>1 &micro; g/&mikro; l w CIM lub PBS</td></tr><tr><td>FITC dekstran</td><td>Sigma</td><td>FD40S</td><td>2 mg/ml w pożywce wzrostowej</td></tr><tr><td>LAMP1&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-19992</td><td>1/300 w pożywce wzrostowej</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kurczak anty-szczurzy IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21470</td><td>1/500 w roztworze blokującym</td></tr><tr><td>Nośnik montażowy</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher</td><td>12-545-86</td><td></td></tr><tr><td>Szklane dno petridish</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Silikonowy O-ring</td><td>Bellco</td><td>1943-33315</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na szkiełko nakrywkowe</td><td>Bellco</td><td>1943-11111</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>A-7816</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>12001-566</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>MP1400-500H</td><td>Używany do podłoża wzrostowego: 10% FBS, 1% P/S w DMEM</td></tr><tr><td>Penicylina/Sreptomycyna</td><td>VWR</td><td>12001-350</td><td>Używany do podłoża wzrostowego: 10% FBS, 1% P/S w DMEM</td></tr><tr><td>Surowica kurczaka</td><td>Sigma</td><td>C5405</td><td>5% surowica kurczaka w CIM służy do blokowania roztworu podczas barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>PBS (wolne od Ca2+ i Mg2+)</td><td>VWR</td><td>12001-664</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Olympus America, oświetlacz PA</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>TIRF&nbsp;</td><td>Olympus America, PA</td><td>Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlacz epifluorescencyjny</td><td>Sutter Instruments, Novato CA</td><td>Lambda DG-4 (DG-4 30)</td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Photometrics, Tucson, AZ</td><td>Evolve 512 EMCCD&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazów</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Slidebook 5</td><td></td></tr><tr><td>Laser impulsowy</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Ablate (3iL13)</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator górny</td><td>Tokaihit, Japonia</td><td>INUBG2ASFP-ZILCS</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie uszkodzeń błon komórkowych i procesów subkomórkowych zaangażowanych w naprawę

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

Zdolność uszkodzonych komórek do leczenia jest podstawowym procesem komórkowym, ale mechanizmy komórkowe i molekularne związane z leczeniem uszkodzonych komórek są słabo poznane. Tutaj opisano testy monitorujące zdolność i kinetykę gojenia się hodowanych komórek po miejscowym urazie. Pierwszy protokół opisuje podejście oparte na punkcie końcowym w celu jednoczesnej oceny zdolności do naprawy błon komórkowych setek komórek. Drugi protokół opisuje podejście do obrazowania w czasie rzeczywistym w celu monitorowania kinetyki naprawy błon komórkowych w poszczególnych komórkach po miejscowym uszkodzeniu za pomocą lasera pulsacyjnego. Ponieważ gojenie uszkodzonych komórek wiąże się z transportem określonych białek i przedziałów subkomórkowych do miejsca uszkodzenia, trzeci protokół opisuje zastosowanie podejścia opartego na powyższym punkcie końcowym do oceny jednego takiego zdarzenia transportu (lizosomalnej egzocytozy) w setkach komórek uszkodzonych jednocześnie, a ostatni protokół opisuje zastosowanie impulsowego uszkodzenia laserowego wraz z mikroskopią TIRF do monitorowania dynamiki poszczególnych przedziałów subkomórkowych w uszkodzonych komórkach przy wysokim poziomie przestrzennym i czasowym rezolucja. Chociaż przedstawione tutaj protokoły opisują zastosowanie tych podejść do badania związku między naprawą błony komórkowej a lizosomalną egzocytozą w hodowanych komórkach mięśniowych, można je zastosować jako takie do każdej innej przylegającej hodowli komórkowej i wybranego przedziału subkomórkowego.

Opisane tutaj protokoły obrazowania pojedynczych komórek służą do monitorowania zdolności i kinetyki naprawy błony komórkowej (protokoły 1 i 2) oraz podkomórkowego transportu i fuzji lizosomów podczas naprawy (protokoły 3 i 4).
Protokół 1 przedstawia analizę zbiorczą, która umożliwia znakowanie wszystkich uszkodzonych komórek i zidentyfikowanie tych z nich, którym nie udało się zregenerować. Wyniki przedstawione na Rysunku 1 pokazują, że podczas gdy komórki nieuszkodzone (<str...

Proces leczenia uszkodzonych komórek polega na transporcie określonych białek i subkomórkowych przedziałów do miejsca uszkodzenia błony komórkowej. W tym protokole opisano testy do monitorowania tych procesów.

Obrazowanie uszkodzeń błon komórkowych i procesów subkomórkowych zaangażowanych w naprawę

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zaobserwowanie wpływu wybranych zabiegów na naprawę uszkodzonych komórek oraz zbadanie procesów subkomórkowych, które wspomagają tę naprawę. Cel ten osiąga się poprzez uszkadzanie komórek w obecności barwników fluorescencyjnych, które nie przenikają przez nienaruszone błony komórkowe, co pozwala ocenić kinetykę oraz zdolność uszkodzonych komórek do powstrzymania wnikania tych barwników. W drugim kroku monitorujemy pojawienie się białek wewnątrzkomórkowych w miejscu uszkodzenia błony komórkowej, co pozwala zidentyfikować zdolność interesującego nas przedziału komórkowego do udziału w naprawie poprzez fuzję z uszkodzoną błoną komórkową.Następnie monitorujemy fuzję wybranych przedziałów komórkowych z uszkodzoną błoną komórkową, aby badać kinetykę uszkodzenia. Wyniki wywołanej fuzji tych przedziałów wykazują, że naprawa uszkodzeń błony komórkowej wiąże się z egzocytozą lizosomalną, co potwierdza zwiększona obecność białka błony lizosomalnej 1 (LAMP1) na powierzchni uszkodzonej komórki oraz obrazowanie na żywo sekrecji zawartości lizosomów przez uszkodzone komórki. Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na istotne pytania dotyczące uszkodzeń i na

imaging-cell-membrane-injury-subcellular-processes-involved

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie uszkodzenia błony komórkowej i subkomórkowych procesów zaangażowanych w naprawę

Opisano szczegółowy protokół obrazowania w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksów naprawy DNA w komórkach Bacillus subtilis.

Obrazowanie naprawy niedopasowań oraz odpowiedzi komórkowych na uszkodzenia DNA w Bacillus subtilis

Opisano tutaj protokoły służące do wizualizacji dynamicznego procesu naprawy błony komórkowej zapośredniczonej przez MG53 w całych organizmach oraz na poziomie komórkowym. Metody te mogą być stosowane do badania biologii komórkowej uszczelniania błony plazmatycznej oraz w medycynie regeneracyjnej.

Wizualizacja naprawy błony komórkowej pośredniczonej przez MG53 z wykorzystaniem systemów in vivo i in vitro

Obrazowanie na żywo komórek narażonych na działanie barwnika lipofilowego FM1-43 pozwala na precyzyjne określenie kinetyki, za pomocą której toksyny tworzące pory są usuwane z błony plazmatycznej. Jest to czuły test, który można wykorzystać do oceny wymagań dotyczących Ca2+, sfingomielinazy i innych czynników dotyczących naprawy błony komórkowej.

Test obrazowania na żywo do oceny roliCa2+ i sfingomielinazy w naprawie ran toksyn tworzących pory

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Celem tego protokołu jest opisanie, jak używać mikronapromieniowania laserowego do wywoływania różnych rodzajów uszkodzeń DNA, w tym stosunkowo prostych pęknięć nici i złożonych uszkodzeń, do badania sygnalizacji uszkodzeń DNA i montażu czynników naprawczych w miejscach uszkodzenia in vivo.

Mikronapromienianie laserowe do badania in vivo odpowiedzi komórkowych na proste i złożone uszkodzenia DNA

Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna i mikropromieniowanie laserowe oferują narzędzia do indukowania uszkodzeń DNA i monitorowania odpowiedzi białek naprawy DNA w wybranych obszarach subjądrowych. Technika ta znacznie poszerzyła naszą wiedzę na temat wykrywania uszkodzeń, sygnalizacji i rekrutacji. Niniejszy manuskrypt demonstruje te technologie do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych.

Zastosowanie mikronapromieniania laserowego do badania naprawy pęknięć jedno- i dwuniciowych w komórkach ssaków

Uwijanie błony komórkowej za pomocą lasera dwufotonowego jest powszechnie stosowaną metodą oceny zdolności do ponownego uszczelniania błony i może być stosowane do wielu typów komórek. W tym miejscu opisujemy protokół obrazowania in vitro na żywo ponownego uszczelniania błony w komórkach pacjenta z dysferlinopatią po dwufotonowej ablacji laserowej.

Test naprawy błony komórkowej przy użyciu dwufotonowego mikroskopu laserowego

Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Tutaj opisujemy wysokoprzepustowy test oparty na fluorescencji, który mierzy skuteczność uszczelniania błony plazmatycznej za pomocą analiz fluorometrycznych i obrazowych w żywych komórkach. Test ten może być stosowany do badań przesiewowych leków lub genów docelowych, które regulują ponowne uszczelnianie błony plazmatycznej w komórkach ssaków.

Wysokoprzepustowy pomiar skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków

Ten artykuł przedstawia podstawowe etapy immunobarwienia i immunoprecypitacji chromatyny. Protokoły te są powszechnie stosowane do badania procesów komórkowych związanych z uszkodzeniem DNA oraz do wizualizacji i ilościowego określenia rekrutacji białek zaangażowanych w naprawę DNA.

Wizualizacja i ilościowe określanie uszkodzeń DNA specyficznych dla miejsca na podstawie endonukleazy

Metoda nakłuwania termoplazmonicznego łączy mikroskopię konfokalną, pęsetę optyczną i nanocząstki złota do badania reakcji białek podczas naprawy błony plazmatycznej w komórkach i gigantycznych pęcherzykach jednopłytkowych. Technika ta umożliwia szybkie i miejscowe nakłucie błony, co pozwala na identyfikację kluczowych białek i ich ról funkcjonalnych w skomplikowanej maszynerii naprawy błony plazmatycznej.

Termoplazmoniczne podejście do badania naprawy błon plazmatycznych w żywych komórkach i błonach modelowych

Poznaj metody obrazowania uszkodzeń błon komórkowych i procesów naprawczych z użyciem fluorescencyjnych barwników. Protokół ten pozwala badać kinetykę odpowiedzi komórkowych oraz rolę lizosomów w fuzji z uszkodzoną błoną.

Obrazowanie uszkodzeń błon komórkowych i procesów subkomórkowych zaangażowanych w naprawę

Przeglądaj więcej filmów