Obrazowanie uszkodzeń błon komórkowych i procesów subkomórkowych zaangażowanych w naprawę

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest obserwacja wpływu pożądanych zabiegów na naprawę uszkodzonych komórek oraz zbadanie procesów subkomórkowych, które pomagają w naprawie uszkodzonych komórek. Osiąga się to poprzez uszkadzanie komórek w obecności barwników fluorescencyjnych, które nie mogą przekroczyć nienaruszonych błon komórkowych, aby ocenić kinetykę i zdolność uszkodzonych komórek do zapobiegania przedostawaniu się tych barwników. W drugim kroku monitorujemy pojawienie się białek wewnątrzkomórkowych na uszkodzonej błonie komórkowej, która identyfikuje zdolność interesującego przedziału komórkowego do udziału w naprawie poprzez łączenie się z uszkodzoną błoną komórkową.

Następnie monitorujemy fuzję interesujących nas przedziałów komórkowych z uszkodzoną błoną komórkową w celu monitorowania kinetyki urazu. Uzyskuje się wyzwalaną fuzję tego przedziału, wyniki pokazują, że naprawa uszkodzenia błony komórkowej jest związana z lizosomalną egzocytozą w oparciu o zwiększone pojawienie się białka błonowego związanego z lizosomami, jednego na powierzchni uszkodzonej komórki i obrazowanie na żywo wydzielania treści lizosomalnej przez uszkodzone komórki. Metody te mogą pomóc w rozwiązaniu ważnych pytań dotyczących uszkodzenia i naprawy komórek.

Na przykład można je wykorzystać do określenia, które białka i przedziały komórkowe reagują na ogniskowe uszkodzenia błony komórkowej, a następnie ocenić ich kinetykę odpowiedzi. Procedurę zademonstrowaliby Aurelia Dfour i hamma stra, dwoje doktorów habilitowanych z mojego laboratorium. Aby osobno oznaczyć uszkodzone komórki, które się goją, i te, które się nie goją.

Wysiewać komórki na sterylnych szkiełkach nakrywkowych dla trzech warunków doświadczalnych. Hoduj komórki, aż osiągną konfluencję większą niż 50%, a następnie umyj C jeden i C dwa dwa razy CIM w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Umyć C3 z PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie przenieś szkiełka nakrywkowe na silikonowe O-ringi. Dodaj 100 mikrolitrów wstępnie ciepłego roztworu fitzy dekstranu do odpowiedniego bufora. Uszkodzić błonę plazmatyczną na C one i C3, dodając 40 miligramów szklanych kulek na szkiełko nakrywkowe w temperaturze pokojowej i ręcznie przechylając pokrywę.

Ślizga się w przód iw tył od sześciu do ośmiu razy pod kątem 30 stopni w przypadku lekkich obrażeń. Upewnij się, że szklane kulki są równomiernie rozłożone, minimalizując w ten sposób powtarzające się urazy, aby poprawić odtwarzalność obrażeń między próbkami. Równocześnie należy przeprowadzić uszkodzenie kulek szklanych różnych próbek, które mają być porównane, unikając dalszego zwijania kulek.

Przenieś wszystkie szkiełka nakrywkowe do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza przy temperaturze CO2 w otoczeniu i pozwól, aby naprawa postępowała przez pięć minut, nie pozwalając, aby kulki się toczyły. Usuń szklane kulki i fitzy dextran, przemywając buforem lub PBS. Teraz umieść szkiełka pokrywy z powrotem na O-ringu i dodaj 100 mikrolitrów wstępnie rozgrzanej lizyny.

Utrwalany roztwór dekstranu trissy Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut w temperaturze CO2 otoczenia. Umyć szkiełka nakrywkowe dwukrotnie za pomocą wstępnie ciepłego CIM i utrwalić 4% PFA przez 10 minut w temperaturze pokojowej po dwóch praniach PBS. Inkubować przez dwie minuty w barwniku hersch, a po dwóch płukaniach PBS umieścić próbkę na szkiełku za pomocą pożywki montażowej.

Następnie zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego epi z próbki C dwa. Określ intensywność czerwonego i zielonego zabarwienia tła. Następnie użyj tej wartości, aby określić progowy kanały czerwony i zielony dla wszystkich próbek.

Oceń łączną liczbę komórek, które są zielone. Oceń również komórki, które są czerwone lub zarówno czerwone, jak i zielone w próbkach C i C3. Teraz policz ponad 100 zielonych uszkodzonych komórek dla każdego stanu i wyraź frakcję komórek, które nie uległy naprawie, jako procent wszystkich uszkodzonych komórek.

Umyj komórki wyhodowane do ponad 50% konfluencji za pomocą wstępnie ostrzeżonego CIM i zamontuj szkiełko nakrywkowe w CIM za pomocą barwnika FM. W uchwycie w inkubatorze stage top utrzymywanym w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wybierz obszar błony komórkowej przy użyciu optymalnej mocy, która umożliwia stałe, ale nieśmiertelne obrażenia.

Aby to osiągnąć, naświetlaj próbkę przez mniej niż 10 milisekund za pomocą lasera impulsowego. Zmniejsz moc lasera za pomocą oprogramowania do 40 do 50% mocy szczytowej, aby monitorować, naprawiać, rejestrować obrazy co dwie do 10 sekund w epi, fluorescencji i jasnym polu, zaczynając przed urazem i kontynuując przez trzy do pięciu minut po urazie. Aby określić ilościowo kinetykę naprawy, zmierz fluorescencję barwnika FM w komórkach.

Oblicz zmianę intensywności w trakcie obrazowania. Uśrednij dane dla ponad 10 komórek w każdym warunku i wykreśl je jako wartość uśrednioną lub wartość poszczególnych komórek. Umyj szkiełka nakrywkowe C pierwsze i C drugie.

Preparaty hodowlane z CIM w temperaturze 37 stopni Celsjusza i przemyć C3 z PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przenieś próbki na silikonowe O-ringi. Dodaj 100 mikrolitrów wstępnie rozgrzanego dekstranu trissy, który można utrwalać lizyną.

Uszkodzić błonę plazmatyczną na C one i C3, jak pokazano wcześniej. Następnie unikanie dalszego zwijania koralików. Przenieść wszystkie szkiełka nakrywkowe do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza przy CO2 w temperaturze otoczenia i odczekać, aby naprawa trwała pięć minut.

Teraz, aby usunąć szklane koraliki i dekstran Trixie, umyj szkiełka nakrywkowe w zimnym podłożu wzrostowym, upewniając się, że szklane kulki nie toczą się na komórkach. Szkiełka nakrywkowe należy dwukrotnie przepłukać zimnym podłożem wzrostowym i przenieść na O-ringi do C one i C3. Dodaj 100 mikrolitrów szczurzej lampy anty-US jedno przeciwciało w zimnej pożywce dla kompletnego wzrostu i dodaj zimną kompletną pożywkę wzrostową do C dwa, aby umożliwić wiązanie przeciwciał. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza po trzech płukaniach zimnym CIM.

Utrwal wszystkie szkiełka nakrywkowe za pomocą 4% PFA przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie spłucz trzykrotnie CIM. Następnie inkubować wszystkie szkiełka nakrywkowe w 100 mikrolitrach roztworu blokującego przez 15 minut, a następnie 100 mikrolitrów lub 4 88 przeciwciał przeciw szczurom przez 15 minut.

Umyj dwukrotnie PBS i inkubuj w jej plamie przez dwie minuty w temperaturze pokojowej po dwóch praniach PBS. Zamontuj próbki na szkiełku, a następnie zobrazuj próbki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego epi, używając obrazów C dwóch komórek. Określ niespecyficzne barwienie tła w kanałach czerwonym i zielonym.

Użyj tych wartości barwienia tła, aby określić progi kanałów czerwonego i zielonego dla wszystkich próbek. Użyj ponad 100 oznaczonych na czerwono komórek z C one i C3, aby zmierzyć intensywność barwienia lampy pierwszej w uszkodzonych komórkach. W udanym eksperymencie lampa pierwsza barwiąca komórki z C3 będzie znacznie niższa niż w komórkach z C jeden do znakowania lizosomów barwnikiem fluorescencyjnym inkubuje komórki wyhodowane do 50% konfluencji w pożywkach wzrostowych zawierających fitzy dextran.

Pozostawić dekstran na endocytozę przez dwie godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych. Umyj komórki pożywką wzrostową Prewarm i inkubuj w niej przez dwie godziny w inkubatorze CO2, aby umożliwić zgromadzenie całego dekstranu endocytozy w lizosomie przed obrazowaniem. Wypłucz szkiełko nakrywkowe w Prewarm CIM i zamontuj w CIM na uchwycie szkiełek nakrywkowych na inkubatorze stage w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Wybierz komórki, które nie mają stłoczonych lizosomów znakowanych dekstranem fitzy do obrazowania. Ruch i egzocytoza poszczególnych lizosomów. Uzyskaj obrazy szerokiego pola dla ruchu lizosomów w całej komórce.

Alternatywnie pobieraj obrazy murawy w celu ruchu na powierzchni komórki i monitorowania ich egzocytozy. Uszkodzić błonę komórkową przez napromieniowanie, jak pokazano wcześniej, aby monitorować odpowiedź lizosomu na komórki obrazu komórek z prędkością od czterech do sześciu klatek na sekundę przez co najmniej dwie minuty lub dłużej, w zależności od dynamiki egzocytozy w interesujących komórkach. W tym masowym teście wszystkie uszkodzone komórki są oznaczane, a te, które nie uległy naprawie, są identyfikowane, podczas gdy nieuszkodzone komórki pozostają nieoznakowane.

Komórki uszkodzone przez szklane kulki w obecności fitzy dekstranu są oznaczone na zielono, gdy komórki mogą się naprawić w obecności wapnia. Większość uszkodzonych komórek udaje się naprawić i nie jest oznaczona dekstranem trissy, gdy komórki mogą się naprawić. W przypadku braku wapnia większość uszkodzonych komórek jest również oznaczona na czerwono przez trissy dekstran.

Eksperyment ten ocenia kinetykę naprawy błony komórkowej poprzez monitorowanie wnikania barwnika FM do komórki. Podczas inkubacji w nienaruszonej matrycy FM komórki wykazują niewielkie lub żadne barwienie wewnątrzkomórkowe. Po miejscowym laserowym uszkodzeniu błony komórkowej, FM D zaczyna wnikać do komórki i wiązać błony endodontyczne, co powoduje nagły wzrost fluorescencji barwnika FM, ponieważ zdolność błony komórkowej do naprawy po uszkodzeniu laserowym zależy od wapnia.

Komórka uszkodzona w obecności wapnia jest w stanie się naprawić, co powoduje zatrzymanie wnikania barwnika FM w ciągu minuty po urazie. Wręcz przeciwnie, komórka, której pozwolono na naprawę przy braku wapnia, nie naprawia się, co powoduje ciągłe wnikanie barwnika, a tym samym ciągły wzrost fluorescencji FM d nawet cztery minuty po urazie. W ten sposób naprawa błony komórkowej prowadzi do ustabilizowania się barwienia barwnikiem FM.

Podczas gdy brak naprawy błony komórkowej powoduje ciągłe wnikanie barwnika, który nie osiąga plateau. Podejście oparte na uszkodzeniu szklanych kulek może być wykorzystane do monitorowania translokacji powierzchni komórek pęcherzyków i białek w odpowiedzi na uraz. W tym przypadku komórki są uszkodzone w obecności dekstranu trissy.

Tak więc, podczas gdy nieuszkodzone komórki nie są oznaczone na czerwono, wszystkie uszkodzone komórki są oznaczone na czerwono. Należy pamiętać, że nieuszkodzone komórki, które nie są traktowane przeciwciałem pierwszorzędowym, wykazują oznakowanie na poziomie tła dla pierwszej lampy na powierzchni komórki. Jednakże, gdy komórki są uszkodzone i pozwalają im się zagoić w obecności wapnia, lizosomy ulegają egzocytozie, a tym samym na powierzchni uszkodzonych komórek występuje zwiększony poziom zabarwienia lampą pierwszą.

Ten wzrost znakowania lampy pierwszej na powierzchni komórki jest znacznie niższy w komórkach, które mogą się zagoić przy braku wapnia. W ten sposób zarówno ilościowe określenie liczby komórek z lampą o dużej powierzchni komórki barwienie, jak i pomiar poziomu lampy na powierzchni komórki. Jeden. Barwienie na poszczególnych uszkodzonych komórkach zapewnia pomiary zdolności komórki do ulegania egzocytozie lizosomalnej wywołanej urazem.

Eksperyment ten bezpośrednio monitoruje kinetykę, charakter i lokalizację fuzji poszczególnych lizosomów. W odpowiedzi na uszkodzenie błony komórkowej komórki są uszkadzane przez laser impulsowy, a lizosomy powierzchniowe komórek są obrazowane za pomocą obrazowania murawy, co umożliwia monitorowanie egzocytozy lizosomów w poszczególnych komórkach wywołanej uszkodzeniem. Ten rysunek przedstawia komórkę, która jest wizualizowana za pomocą obrazowania z kontrastem fazowym w lewym panelu i za pomocą mikroskopii darniowej w środkowym panelu.

Prawy panel pokazuje obraz murawy tej samej komórki 105 sekund po kontuzji. W tym przypadku uszkodzenie wywołało rekrutację lizosomu do błony komórkowej, a następnie egzocytozę. Ten lizosom nie jest widoczny na obrazie murawy przed urazem, ale po urazie lizosom dociera do błony komórkowej i staje się wykrywalny.

Gdy pęcherzyk zbliża się do błony komórkowej, jest lepiej wzbudzany przez oświetlenie murawy, powodując fluorescencję nici lizosomalnej fitsy dex do osiągnięcia maksymalnej wartości. Kiedy lej fuzyjny otwiera się, powoduje to neutralizację lizosomalnego pH, a tym samym wygaszenie fitzy fluorescencji nici DExT. Następnie nić DExT jest odprowadzana z pęcherzyka na zewnątrz komórki, powodując rozlewanie się fluorescencji ZI na boki i można zmierzyć fluorescencję pęcherzyków w celu stopniowego zmniejszania różnych odpowiedzi lizosomów wywołanych uszkodzeniem.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak monitorować zdolność komórek do naprawy po dużych urazach ogniskowych oraz monitorować subkomórkowe przedziały i białka, które reagują i pomagają w procesie naprawy. Dalsze eksperymenty z wykorzystaniem różnych znaczników życiowych, przedziałów lub białek mogą być przeprowadzone w celu monitorowania odpowiedzi na uraz i udziału w naprawie komórek IND.