Name: Izolacja i analiza fizjologiczna kardiomiocytów myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Poznaj izolację kardiomiocytów myszy metodą perfuzji LOR do analizy kurczliwości i transjentów wapniowych. Technika ta pozwala badać funkcję komórkową serca i mechanizmy chorób kardiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Marc Wozniak za korzystanie ze sprzętu do filmowania Departamentu Biologii Komórki i Rozwoju.
Wspólny zasób obrazowania komórek Uniwersytetu Vanderbilt.
Ta praca jest wspierana przez grant AHA 12PRE10950005 dla ERP, grant AHA 11GRNT7690040 dla DMB, grant NIH R01 HL037675 dla DMB. DMB jest Kierownikiem Katedry Badań Sercowo-Naczyniowych im. Gladys P. Stahlman.

Upewnij się, że wszystkie procedury dotyczące zwierząt są zatwierdzone przez odpowiedni organ ds. użytkowania i opieki nad zwierzętami.
1. Przygotuj zapasów z wyprzedzeniem
<ol>
	<li>Przygotuj 2 litry zapasu Ca2+ wolne Tyrode (Tabela 1). Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH.</li>
	<li>Przygotuj 2 litry zapasów 1,2 mM Ca2+ Tyrode (Tabela 2). Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH.</li>
</ol>
2. W dniu eksperymentu przygotuj perfuzji, transferu i trawienia
<ol>
	<li>Przygotować 150 ml buforu perfuzyjnego w Tyrode'ie wolnym od Ca2+ (Tabela 3) i przefiltrować przez filtr 0,2 μm.</li>
	<li>Przygotować 35 ml "buforu A" do swobodnego transferuCa2+ (Tabela 4) i 25 ml Ca2+ zawierającego "bufor B" (Tabela 5). Przefiltruj każdy z nich przez filtr 0,2 μm.</li>
	<li>Przygotować roztwory 0,06, 0,24, 0,6 i 1,2 mM Ca2+, mieszając bufor A i B zgodnie z tabelą 6.</li>
	<li>Przygotować 25 ml buforu wytrawiającego, rozpuszczając enzymy wytrawiające w 25 ml buforze perfuzyjnym (Tabela 7) w oparciu o masę ciała (m.c.) myszy. Przed użyciem przefiltrować przez filtr 0,2 μm.</li>
</ol>
3. Konfiguracja eksperymentalna
<ol>
	<li>Zmontuj aparat Langendorffa o stałym przepływie, dostępny na rynku lub przy użyciu pompy perystaltycznej, rurki i cewki wymiennika ciepła, aby umożliwić natężenie przepływu 3 ml/min perfuzatu podgrzanego do 37 °C. Prosty schemat znajduje się w przeglądzie z 2011 r. autorstwa Bella i wsp. 18.</li>
	<li>Ustawić temperaturę kąpieli wodnej obiegowej (~47 °C) aparatu Langendorffa tak, aby odpływ z kaniuli wynosił 37 °C przy natężeniu przepływu 3 ml/min.</li>
	<li>Przepuść 70% etanolu przez system perfuzyjny przez 15 minut, a następnie dodaj 100 ml ultraczystej wody typu I. Przepuść bufor perfuzyjny przez system przez 5 minut, eliminując pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne pożądaną metodą.</li>
	<li>Utwórz kaniulę, przymocowując krótki kawałek (około 3 mm) rurki PE-50 do końcówki adaptera Luer-stub 23 G. Podgrzej końcówkę rurki, aby utworzyć wargę, nad którą zostanie umieszczona aorta.</li>
</ol>
4. Izolacja kardiomiocytów
<ol>
	<li>Wstrzyknąć myszowi 0,2 ml roztworu heparyny (1 000 j.m./ml) we wstrzyknięciu dootrzewnowym.</li>
	<li>Po 5 minutach znieczulij mysz izofluoranem. Po całkowitym znieczuleniu (brak reakcji na silne uszczypnięcie stopy), spryskaj klatkę piersiową 70% EtOH. Otwórz klatkę piersiową, szybko wyciąć serce, uważając, aby nie uszkodzić aorty, i umieść w buforze perfuzyjnym o temperaturze 4 °C. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby chwycić i podnieść pod sercem. Stwarza to miejsce do przycinania nasadek za sercem za pomocą cienkich nożyczek.</li>
	<li>Wykonaj kankaniulację serca, delikatnie chwytając krawędź aorty dwiema parami cienkich kleszczy i ostrożnie przeciągając otwór aorty nad wargą kaniuli. Upewnij się, że końcówka kaniuli nie przechodzi przez zastawkę aortalną i nie wchodzi do komory, ponieważ zahamuje to perfuzję serca przez tętnice wieńcowe.</li>
	<li>Przymocuj aortę do kaniuli, zawiązując pętlę jedwabnego szwu 5-0 wokół aorty bezpośrednio nad krawędzią kaniuli.</li>
	<li>Uwaga: Kroki od 4.2 do 4.4 należy wykonać tak szybko, jak to możliwe, aby uzyskać najlepszą jakość trawienia.</li>
	<li>Uwaga: Serce można zawiesić bezpośrednio na kaniuli już podłączonej do aparatu Langendorffa z przepływającym buforem perfuzyjnym. Jednak zawieszenie serca na kaniuli przymocowanej do małej strzykawki z buforem perfuzyjnym pod mikroskopem preparacyjnym okazało się najbardziej skuteczne. Pozwala to na przepchnięcie niewielkiej ilości buforu perfuzyjnego, obserwując oczyszczenie tętnic wieńcowych i upewniając się, że serce jest bezpiecznie przymocowane do kaniuli. Kaniula jest następnie zawieszana na Langendorffie z uruchomionym buforem perfuzyjnym.</li>
	<li>Perfuzja serca za pomocą wolnego buforu perfuzyjnego Ca2+ o przepływie 3 ml/min przez 2-3 min.</li>
	<li>Przełącz się na bufor trawienia enzymatycznego i perfuzję na 7-10 minut, serce stanie się bardziej miękkie i jaśniejsze.</li>
	<li>Uwaga: Czas trawienia można dostosować w zależności od aktywności enzymu i wielkości serca.</li>
	<li>Gdy serce jest wyczuwalnie wiotkie, wyjmij je z kaniuli i umieść w sterylnym naczyniu p60 z buforem A (bufor do swobodnego przenoszeniaCa2+).</li>
	<li>Usuń przedsionki i wielkie naczynia. W razie potrzeby usuń prawą komorę. Za pomocą kleszczy podziel komorę na małe kawałki. Kilkakrotnie odpipetować sterylną pipetą transferową o pojemności 5 ml w celu dalszego rozproszenia komórek.</li>
	<li>Przefiltrować zawiesinę komórek do stożkowej rurki o pojemności 50 ml przez nylonowy filtr siatkowy o średnicy 250 μm.</li>
	<li>Pozostawić zawiesinę do osadzenia się na około 10 minut.</li>
	<li>Przenieść osad do roztworu 0,06 mM Ca2+. Pozostaw komórki do osadzania się na 10 minut. Zdrowe komórki będą się osadzać, podczas gdy większość martwych komórek będzie unosić się na wodzie.</li>
	<li>Odessać supernatant i przenieść osad do roztworu 0,24 mM Ca2+.</li>
	<li>Powtórz 10-minutową inkubację, aspirację i przenoszenie przez pozostałe dwa roztwory Ca2+, aż komórki znajdą się w roztworze 1,2 mM. W tym momencie większość komórek powinna być miocytami w kształcie pręcików.</li>
</ol>
5. Pomiar kurczliwości i stanów przejściowych wapnia
<ol>
	<li>Uwaga: Zarówno kurczliwość, jak i stany przejściowe wapnia mogą być mierzone jednocześnie.</li>
	<li>Przygotować roztwór Fura-2 AM przez ponowne zawieszenie w bezwodnym DMSO do stężenia 1 μg/μl. Roztwór Fura-2 AM można przechowywać w eksykatorze w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Załadować 1 ml zawieszonych komórek 1 μl Fura-2 AM. Pozostaw komórki w ciemności przez 10 minut, a następnie odessaj supernatant. Umyj dwukrotnie roztworem Ca2+ Tyrode, pozwalając komórkom osadzać się w ciemności przez 10 minut między praniami.</li>
	<li>Umieść szklane szkiełko nakrywkowe we wkładce scenicznej, która umożliwia podgrzewaną perfuzję/aspirację i stymulację elektrod za pomocą stymulatora pola miocytów. Umieść wkładkę stolika na odwróconym mikroskopie ustawionym do pomiaru fluorescencji, dodając kroplę oleju do soczewki, jeśli używasz obiektywu zanurzeniowego z olejkiem.</li>
	<li>Ustawić podgrzaną perfuzję grawitacyjną za pomocą 1,2 mM Ca2+ roztworu Tyrode, aby roztwór na scenie osiągnął temperaturę 37 °C. Podłącz aspirację do próżni. Zamocuj elektrody.</li>
	<li>Włącz system mikroskopu i otwórz oprogramowanie do akwizycji danych fluorescencji ratiometrycznej i wymiarowania komórek.</li>
	<li>Dodaj kilka kropli komórek naładowanych Fura-2 AM do wkładki etapowej, blokując na chwilę perfuzję, aby umożliwić zdrowym komórkom osiedlenie się.</li>
	<li>Użyj obiektywu 40X, aby zlokalizować żądaną komórkę. Zdrowa komórka powinna mieć kształt pręcika i nie powinna się spontanicznie kurczyć. Powinien widocznie i równomiernie się kurczyć, gdy ogniwo jest zasilane napięciem 5-20 V.</li>
	<li>Uwaga: Analiza fizjologiczna wymaga wysokiej jakości trawienia. Możliwe jest posiadanie komórek, które wyglądają zdrowo, ale nie nadają się dobrze do analizy fizjologicznej. Protokół trawienia może wymagać udoskonalenia, aby uzyskać wysokiej jakości, zdrowe miocyty. Dodatkowo, zmutowane lub chore serca mogą wymagać modyfikacji protokołu.</li>
	<li>Dostosuj obrót obiektywu i zmień przysłonę, aby żądana komórka była wyrównana poziomo na ekranie, a tło nie było widoczne.</li>
	<li>Dopasuj paski wykrywania krawędzi do każdego końca miocytów i dostosuj próg. Dopasuj wykrywanie sarkomerów do części komórki z jednolitymi sarkomerami. Im dłuższy jest ten pasek, tym dokładniejszy będzie matematyczny model długości sarkomerów, o ile nie znajduje się on na dwóch populacjach sarkomerów.</li>
	<li>Tempo komórek przy 2 Hz i 5-20 V przez 10-15 sekund przed nagrywaniem.</li>
	<li>Śledzenie rekordów. Światło otoczenia powinno być zminimalizowane, aby uzyskać najlepsze nagrywanie stanów przejściowych wapnia.</li>
</ol>
6. Analiza
<ol>
	<li>Analizuj ślady za pomocą oprogramowania do akwizycji danych fluorescencji ratiometrycznej i wymiarowania komórek.</li>
</ol>
7. Dalsze studia
<ol>
	<li>Protokół ten zapewnia nadmiar komórek, które można wykorzystać do wielu innych eksperymentów, w tym: utrwalania i barwienia immunologicznego, oceny bezpośrednich skutków leku, krótkoterminowej hodowli i mikroskopii sił atomowych.</li>
</ol>

<ol><li>Babick, A. P., Dhalla, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Subcellular+Remodeling+in+Cardiac+Dysfunction+due+to+Congestive+Heart+Failure%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Principles+and+Practice%22%5BJournal%5D)">Role of Subcellular Remodeling in Cardiac Dysfunction due to Congestive Heart Failure.</a> Medical Principles and Practice. 16, 81-89 (2007).</li>
<li>Nogami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje-Related+Arrhythmias+Part+I%3A+Monomorphic+Ventricular+Tachycardias%5BTitle%5D)+AND+%22Pacing+and+Clinical+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Purkinje-Related Arrhythmias Part I: Monomorphic Ventricular Tachycardias.</a> Pacing and Clinical Electrophysiology. 34, 624-650 (2011).</li>
<li>Clancy, R. M., Kapur, R. P., Molad, Y., Askanase, A. D., Buyon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohitologic+Evidence+Supports+Apoptosis%2C+IgG+Deposition%2C+and+Novel+Macrophage%2FFibroblast+Crosstalk+in+the+Pathologic+Cascade+Leading+to+Congenital+Heart+Block%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Immunohitologic Evidence Supports Apoptosis, IgG Deposition, and Novel Macrophage/Fibroblast Crosstalk in the Pathologic Cascade Leading to Congenital Heart Block.</a> Arthritis and Rheumatism. 50, 173-182 (2004).</li>
<li>Splawski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaV1.2+Calcium+Channel+Dysfunction+Causes+a+Multisystem+Disorder+Including+Arrhythmia+and+Autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CaV1.2 Calcium Channel Dysfunction Causes a Multisystem Disorder Including Arrhythmia and Autism.</a> Cell. 119, 19-31 (2004).</li>
<li>Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+Metabolism+of+Intact+Muscle+Cells+Isolated+from+Adult+Rat+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Morphology and Metabolism of Intact Muscle Cells Isolated from Adult Rat Heart.</a> Circulation Research. 26, 679-687 (1970).</li>
<li>Fang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luteolin+Inhibits+Apoptosis+and+Improves+Cardiomyocyte+Contractile+Function+through+the+PI3K%2FAkt+pathway+in+Simulated+Ischemia%2FReperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Luteolin Inhibits Apoptosis and Improves Cardiomyocyte Contractile Function through the PI3K/Akt pathway in Simulated Ischemia/Reperfusion.</a> Pharmacology. 88, 149-158 (2011).</li>
<li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+Regulation+of+Murin+Cardiomyocyte+Contractility+by+Nanomolar+%28-%29-Epigallocatechin-3-Gallate+the+Major+Green+Tea+Catechin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Coordinated Regulation of Murin Cardiomyocyte Contractility by Nanomolar (-)-Epigallocatechin-3-Gallate the Major Green Tea Catechin.</a> Molecular Pharmacology. 82, 993-1000 (2012).</li>
<li>Claycomb, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HL-1+cells%3A+A+cardiac+muscle+cell+line+that+contracts+and+retains+phenotypic+characteristics+of+the+adult+cardiomyocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">HL-1 cells: A cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 95, 2979-2984 (1998).</li>
<li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Genetic+Manipulation+of+Adult+Cardiac+Myocytes+for+Confocal+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging.</a> J Vis Exp. (31), e1433(2009).</li>
<li>Vainio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neronostatin%2C+a+Novel+Peptide+Encoded+by+Somatostatin+Gene%2C+Regulates+Cardiac+Contractile+Function+and+Cardiomyocytes+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Neronostatin, a Novel Peptide Encoded by Somatostatin Gene, Regulates Cardiac Contractile Function and Cardiomyocytes Survival.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 4572-4580 (2012).</li>
<li>Park, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mechanisms+for+caspase+inhibition+protecting+cardiac+function+wth+chronic+pressure+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Novel mechanisms for caspase inhibition protecting cardiac function wth chronic pressure overload.</a> Basic Research in Cardiology. , 108(2013).</li>
<li>Novaes, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Trypanosoma+cruzi+infection+on+myocardial+morphology%2C+single+cardiomyocyte+contractile+function+and+exercise+tolerance+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Effects of Trypanosoma cruzi infection on myocardial morphology, single cardiomyocyte contractile function and exercise tolerance in rats.</a> International Journal of Experimental Pathology. 92, 299-307 (2011).</li>
<li>Weltman, N. Y., Wang, D., Redetzke, R. A., Gerdes, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longstanding+Hyperthyroidism+is+Associated+with+Normal+or+Enhanced+Intrinsic+Cardiomyocyte+Function+despite+Decline+in+Global+Cardiac+Function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Longstanding Hyperthyroidism is Associated with Normal or Enhanced Intrinsic Cardiomyocyte Function despite Decline in Global Cardiac Function.</a> PLoS One. 7, e46655(2012).</li>
<li>Papanicolaou, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+heart+function+and+maintained+response+to+cardiac+stresses+in+a+genetic+model+of+cardiomyocyte-targeted+deficiency+of+cyclooxygenase-2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Preserved heart function and maintained response to cardiac stresses in a genetic model of cardiomyocyte-targeted deficiency of cyclooxygenase-2.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49, 196-209 (2010).</li>
<li>Despa, S., Lingrel, J. B., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B%2FK%2B-ATPase+a2-isoform+preferntially+modulates+Ca2%2B+transients+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+release+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Na+/K+-ATPase a2-isoform preferntially modulates Ca2+ transients and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in cardiac myocytes.</a> Cardiovascular Research. 95, 480-486 (2012).</li>
<li>Touchberry, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF23+is+a+novel+regulator+of+intracellular+calcium+and+cardiac+contractility+in+addition+to+cardiac+hypertophy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">FGF23 is a novel regulator of intracellular calcium and cardiac contractility in addition to cardiac hypertophy.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. , (2013).</li>
<li>Helmes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titin+Determines+the+Frank-Starling+Relation+in+Early+Diastole%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Titin Determines the Frank-Starling Relation in Early Diastole.</a> The Journal of General Physiology. 121, 97-110 (2003).</li>
<li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+heart+perfusion%3A+The+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 940-950 (2011).</li>
<li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Cell+Transcriptional+Profiling+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> J Vis Exp. (58), e3302(2011).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Izolacja wysokiej jakości kardiomiocytów wymaga pewnego poziomu praktyki i optymalizacji. Protokół ten zawiera kluczowe kroki, które mogą znacznie wpłynąć na wynik trawienia. Należy je dokładnie rozważyć podczas wykonywania i rozwiązywania problemów z protokołem. Czas od usunięcia serca do kaniulacji i perfuzji powinien być zminimalizowany, najlepiej krótszy niż pięć minut. Płukanie serca natychmiast w lodowatym buforze perfuzyjnym po wyjęciu od myszy oraz wypreparowanie i kaniulowanie serca w lodowatym buforze również z...

Kardiomiocyty zapewniają siłę skurczu serca. Każdy miocyt zawiera zorganizowane elementy cytoszkieletu i kurczliwe niezbędne do skurczu. Serce zawiera nie tylko kardiomiocyty, ale także fibroblasty, tkankę łączną i zmodyfikowane miocyty, takie jak włókna Purkinjego. Zmiany w którymkolwiek lub wszystkich tych typach komórek można zaobserwować w niewydolności serca, co utrudnia określenie ostatecznej przyczyny dysfunkcji serca. Zmniejszona kurczliwość komór niewydolnego serca jest poprzedzona różnym stopniem nagromadzenia tkanki włóknistej oraz przerostem i dysfunkcją kardiomiocytów1. Zaburzenia rytmu serca mogą być spowodowane dysfunkcją komórek przewodzących2, zwłóknieniem przerywającym przewodnictwo serca3 lub zmianami w ekspresji kanałów jonowych w kardiomiocytach1,4. Rzeczywiście, problemy te często współistnieją w skomplikowany sposób.
Izolowanie i badanie kardiomiocytów pozwala na zbadanie dysfunkcji kurczliwości i elektryczności poszczególnych miocytów w kontekście ogólnej funkcji serca. Techniki izolacji pojedynczych miocytów serca zostały opracowane ponad 40 lat temu w celu lepszego zbadania fizjologii tej komórki serca "konia roboczego". Techniki izolacji zostały ulepszone w celu zwiększenia wydajności i jakości komórek, wraz z niezbędnym rozwojem perfuzji wieńcowej poprzez kaniulację aorty, po raz pierwszy wykonaną w 1970roku5. W artykule opisano izolację kardiomiocytów, a następnie pomiar kurczliwości i stanów przejściowych wapnia przy użyciu oprogramowania do akwizycji danych fluorescencji ratiometrycznej i wymiarowania komórek. Zarówno w genetycznych, jak i środowiskowych modelach chorób serca, wykorzystanie tego protokołu dostarcza kluczowych informacji na temat kurczliwości komórek, kurczliwości i relaksacji sarkomerycznej, stanów przejściowych wapnia i zaburzeń cytoszkieletu. System ten jest często używany do badania wpływu leków na izolowane kardiomiocyty6,7. Wykorzystujemy system do porównywania kurczliwości i stanów przejściowych wapnia kardiomiocytów między myszami typu dzikiego a myszami z mutacją prowadzącą do kardiomiopatii rozstrzeniowej.
Badanie pojedynczych miocytów serca ma wiele zalet w porównaniu z innymi powszechnie stosowanymi metodami badania anatomii i fizjologii serca. Echokardiografia i elektrokardiografia dostarczają informacji na temat funkcji skurczowej i przewodnictwa elektrycznego całego serca. Żadna z tych metod nie wyjaśnia przyczyny ani charakteru dysfunkcji poniżej poziomu całego narządu. Pomiar kurczliwości poszczególnych kardiomiocytów za pomocą algorytmów wykrywania krawędzi i długości sarkomeru może wykazać, że zmiany w komórce kurczliwej serca są obecne w globalnej dysfunkcji serca. Pomiar stanów przejściowych wapnia pokazuje wpływ zmian strumienia jonów na poziomie komórkowym na dysfunkcję skurczu lub arytmie.
Oprócz uzupełniania badań nad całymi narządami, ten protokół zapewnia łatwe barwienie komórek na składniki subkomórkowe. Możliwe jest zaobserwowanie zmian cytoszkieletu poprzez barwienie odcinków tkanek całego serca; Jednak można wizualizować tylko przekrój komórek. Cały kardiomiocyt jest grubszy niż typowy wycinek tkanki, a biorąc pod uwagę układ i długość kardiomiocytów, trudno jest zobaczyć całe komórki w jednej sekcji. Izolowane kardiomiocyty można natychmiast utrwalić i wybarwić pod kątem różnych elementów cytoszkieletu i kanałów jonowych. Obrazy konfokalne można kompilować do stosów z o pełnej grubości komórki. Dodatkowo barwienie izolowanych miocytów serca pozwala na barwienie elementów, które są niemożliwe do uwidocznienia w sekcjach, takich jak wgłębienia błony znane jako kanaliki teowe.
Istnieją hodowlane linie komórkowe miocytów serca, z których niektóre mają podobne profile transkrypcyjne i cechy fenotypowe do miocytów serca. Niektóre, takie jak linia komórkowa HL-1, zachowują nawet pewną organizację sarkomeryczną i szczątkową zdolność skurczową8. Pomimo tych cech, hodowane komórki nie mają kształtu "wagonu pudełkowego" i struktury kanalików T kardiomiocytów i mają mniej sarkomeryczną organizację. Składniki te są niezbędne do funkcjonowania kardiomiocytów in vivo. Ponadto wykorzystanie hodowanych komórek pozwala na manipulację genetyczną, ale nie na manipulację fizjologiczną in vivo. Izolowane kardiomiocyty zachowują swoją organizację komórkową wystarczająco długo, aby można je było badać, ale nadal można je łatwo obrazować, a nawet transdukować. 
Izolowane kardiomiocyty są niezwykle wszechstronne, dostarczając substratu do identycznej analizy komórek z różnych warunków eksperymentalnych. Izolacja i analiza fizjologiczna miocytów były wykorzystywane przez niezliczone laboratoria do różnych eksperymentów, w tym do badania wpływu leków6,7 lub małych cząsteczek10, stresorów środowiskowych11, infekcji12, choroby13 lub mutacji genetycznej14,15 na kurczliwość i / lub przejściowe stany wapnia oraz badanie regulacji kurczliwości i uwalniania wapnia w kardiomiocytach15-17. Przy zastosowaniu któregokolwiek z tych stresorów zmiany w funkcjonowaniu serca mogą być spowodowane dowolną kombinacją zmian w samych kardiomiocytach i zmian w otaczającym środowisku serca, takich jak blizny, zmiany przewodnictwa lub zmiany w macierzy zewnątrzkomórkowej. Jest to idealny protokół do odpowiedzi na pytania badawcze dotyczące indywidualnej struktury i funkcji miocytów w kontekście niewydolności serca z jakiejkolwiek przyczyny.
Chociaż ma niezliczone zalety w porównaniu z innymi technikami, analiza fizjologiczna izolowanych kardiomiocytów nie jest idealna dla każdego pytania badawczego. Izolacja jest procedurą terminalną, dlatego kardiomiocyty można ocenić tylko w jednym momencie życia myszy. Można to częściowo przezwyciężyć za pomocą kohort i poświęcania pojedynczych myszy w trakcie rozwoju choroby lub poprzez monitorowanie myszy w celu ustalenia, czy ma klinicznie istotną niewydolność serca przed izolacją. Chociaż protokół ten może określić, czy wystąpiła dysfunkcja kardiomiocytów, nie można wyciągnąć wniosku, że ta dysfunkcja jest główną przyczyną niewydolności serca bez dodatkowych informacji eksperymentalnych. Możliwe, że sama dysfunkcja kardiomiocytów jest wtórna do innych zmian w sercu. Pomimo tych wyzwań, badanie kardiomiocytów dostarcza cennych informacji w określaniu charakteru dysfunkcji serca, zwłaszcza w połączeniu z innymi eksperymentami. 
Poniższy protokół jest zaadaptowany z dostarczonego przez Dr. Chee Lim, Vanderbilt University. Chociaż dane dotyczące kurczliwości i strumienia wapnia są wysoce powtarzalne i przydatne w porównywaniu serc z manipulacjami genetycznymi lub środowiskowymi, sama izolacja pozostaje protokołem zależnym od techniki, wymagającym optymalizacji. Zminimalizowanie czasu między usunięciem serca od myszy a perfuzją serca przez kaniulację aorty jest niezbędne dla wysokiej jakości trawienia. Ponadto czas trawienia i stężenie enzymów można zoptymalizować w celu uzyskania miocytów najwyższej jakości. Kroki, które mogą wymagać optymalizacji, wraz z sugestiami dotyczącymi optymalizacji, są wymienione poniżej.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>EM Science</td><td>S320</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>2,3-butanodion-monoksymowy (BDM)</td><td>Sigma</td><td>B-0753</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma</td><td>T-0625</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A-7030</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza B</td><td>Roche Diagnostyka</td><td>1-088-823</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza D</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1-088-882</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza XIV</td><td>Sigma</td><td>P-5147</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>APP Pharmaceuticals, LLC</td><td>401586D</td><td></td></tr><tr><td>Izofluoran</td><td>Butler Schein</td><td>11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Teflabs</td><td>103</td><td></td></tr><tr><td>DMSO &ndash; bezwodna</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>System stymulacji komórek i analizy fluorescencyjnej IonOptix</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 &mu; m nylonowy filtr siatkowy</td><td>Sefar America</td><td>Lab Pak 03-250/50</td><td></td></tr><tr><td>23 G Adapter Luer-stub</td><td>Becton Dickinson</td><td>1482619E</td><td></td></tr><tr><td>PE-50 rurka</td><td>Becton Dickinson</td><td>427410</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i analiza fizjologiczna kardiomiocytów myszy

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Kardiomiocyty, komórka robocza serca, zawierają doskonale zorganizowane elementy cytoszkieletu i kurczliwości, które generują siłę skurczu używaną do pompowania krwi. Poszczególne kardiomiocyty zostały po raz pierwszy wyizolowane ponad 40 lat temu, aby lepiej zbadać fizjologię i strukturę mięśnia sercowego. Techniki szybko się poprawiły, obejmując trawienie enzymatyczne za pomocą perfuzji wieńcowej. Niedawno analiza kurczliwości i przepływu wapnia izolowanych miocytów dostarczyła istotnego narzędzia w komórkowej i subkomórkowej analizie niewydolności serca. Echokardiografia i EKG dostarczają informacji o sercu tylko na poziomie narządów. Istnieją systemy hodowli komórek kardiomiocytów, ale komórkom brakuje fizjologicznie niezbędnych struktur, takich jak zorganizowane sarkomery i kanaliki T wymagane do funkcjonowania miocytów w sercu. W przedstawionym tutaj protokole kardiomiocyty są izolowane za pomocą perfuzji Langendorffa. Serce jest usuwane z myszy, montowane przez aortę do kaniuli, perfundowane enzymami trawiennymi, a komórki są wprowadzane do zwiększonego stężenia wapnia. Oprogramowanie do wykrywania krawędzi i sarkomeru służy do analizy kurczliwości, a barwnik fluorescencyjny wiążący wapń służy do wizualizacji stanów przejściowych wapnia w kardiomiocytach o stymulacji elektrycznej; Coraz lepsze zrozumienie roli, jaką zmiany komórkowe odgrywają w dysfunkcji serca. Tradycyjnie używany do testowania wpływu leków na kardiomiocyty, używamy tego systemu do porównywania miocytów myszy WT i myszy z mutacją powodującą kardiomiopatię rozstrzeniową. Protokół ten jest wyjątkowy ze względu na porównanie żywych komórek myszy ze znaną funkcją serca i znaną genetyką. Wiele warunków eksperymentalnych jest wiarygodnie porównywanych, w tym manipulacje genetyczne lub środowiskowe, infekcje, leczenie farmakologiczne i inne. Poza danymi fizjologicznymi, izolowane kardiomiocyty można łatwo utrwalić i wybarwić pod kątem elementów cytoszkieletu. Izolowanie kardiomiocytów za pomocą perfuzji jest niezwykle wszechstronną metodą, przydatną w badaniu zmian komórkowych, które towarzyszą lub prowadzą do niewydolności serca w różnych warunkach eksperymentalnych.

Po zebraniu zapisów kurczliwości i przejściowych zmian stężeń wapnia (Rycina 2), dane można łatwo przeanalizować za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Cały zapis lub jego części mogą zostać uśrednione (Rycina 3). Kurczliwość można analizować na różne sposoby. W przypadku funkcji skurczowej można ocenić wielkość skurczu za pomocą skrócenia frakcyjnego lub szybkość skurczu poprzez czas do maksymalnego skrócenia oraz prędkość skurczu. Funkcję rozkurczową można analizować w podobny sposób,...

Pojedyncze kardiomiocyty od myszy typu dzikiego i zmutowanych mogą być izolowane z serca w celu zbadania ich kurczliwości i przejściowych stanów wapnia. Pozwala to na scharakteryzowanie udziału dysfunkcji komórkowej w dysfunkcji serca z dowolnej przyczyny.

Izolacja i analiza fizjologiczna kardiomiocytów myszy

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Celem niniejszego protokołu jest wykorzystanie perfuzji LOR do izolacji kardiomiocytów z serc dorosłych myszy o znanej genetyce oraz analiza kurczliwości i przejściowych zmian poziomu wapnia w tych kardiomiocytach. Po wstrzyknięciu heparyny serce zostaje usunięte z znieczulonej myszy. Następnie jest ono szybko zamocowane przez aortę do kaniuli podłączonej do strzykawki z buforem perfuzyjnym.Aortę unieruchomiono. Przez naczynie powoli przepływa szew oraz bufor w celu oczyszczenia tętnic wieńcowych. Następnie kaniulę zamontowano w aparaturze LOR z przepływającym buforem perfuzyjnym.Serce trawiono roztworem kolagenazy i proteazy pozbawionym wapnia, aż stanie się wyczuwalnie miękkie. Lewą komorę umieszczono w buforze bezwapniowym i rozdrabniano za pomocą pincety oraz delikatnego pipetowania. Po przefiltrowaniu roztworu przez sito, komórki stopniowo wprowadzano do środowisk o coraz wyższym stężeniu wapnia, aby usunąć martwe komórki i upewnić się, że miocyty są tolerancyjne na wapń.Zdrowe komórki mają kształt pręcikowy, natomiast komórki martwe tracą ten kształt. Następnie miocyty są obciążone radiometrycznym barwnikiem wiążącym wapń RA two A i umieszczane na stoliku mikroskopu. Podczas

isolation-and-physiological-analysis-of-mouse-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja i analiza fizjologiczna kardiomiocy mysich

Pierwotne hodowle kardiomiocytów myszy są jednym z kluczowych narzędzi do badania organizacji i funkcji miofibrylarów. Poniższy protokół opisuje izolację i hodowlę pierwotnych kardiomiocytów z serca noworodków myszy. Uzyskane w ten sposób kultury kardiomiocytów mogą być następnie wykorzystane do różnych testów biomechanicznych, biochemicznych i biologicznych.

Izolacja i hodowla nowonarodzonych kardiomiocytów myszy

Tutaj opisujemy izolację dorosłych kardiomioktyesów myszy za pomocą systemu perfuzyjnego Langendorffa.  Powstałe komórki tolerują Ca2+, są elektrycznie uśpione i mogą być hodowane i transfekowane adeno- lub lentiwirusami w celu manipulowania ekspresją genów.  Ich funkcjonalność może być również analizowana za pomocą systemu MMSYS i technik zacisków krosowych.

Izolacja, hodowla i charakterystyka funkcjonalna kardiomioktaków dorosłych myszy

Opisujemy niezawodną metodę izolacji kardiomiocytów dorosłych myszy. Protokół ten daje spójny wynik dla hodowli funkcjonalnych dorosłych kardiomiocytów od różnych genetycznie zmodyfikowanych myszy.

Izolacja i hodowla kardiomiocytów dorosłych myszy do sygnalizacji komórkowej i przerostu serca in vitro

Ten protokół opisuje krok po kroku metodę powtarzalnej izolacji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy o wysokiej wydajności, czystości i żywotności.

Izolacja, hodowla i transdukcja kardiomiocytów dorosłych myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji, transfekcji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy i szczurów.

Izolacja, transfekcja i długotrwała hodowla dorosłych kardiomiocytów myszy i szczurów

Prezentowany jest protokół izolacji ludzkich i zwierzęcych kardiomiocytów komorowych z wyciętych wibratomem plastrów mięśnia sercowego. Wysoką wydajność komórek tolerujących wapń (do 200 komórek/mg) można uzyskać z niewielkich ilości tkanek (&lt;50 mg). Protokół ma zastosowanie do mięśnia sercowego narażonego na zimne niedokrwienie przez okres do 36 godzin.

Izolacja ludzkich kardiomiocytów komorowych z plastrów mięśnia sercowego wycinanych wibratomem

Opisano metodę jednoczesnej izolacji miocytów i nie-miocytów zarówno z przedsionków, jak i komór serca pojedynczej dorosłej myszy. Protokół ten zapewnia stałą wydajność wysoce żywotnych miocytów serca i niemiocytów oraz szczegółowo opisuje optymalne warunki hodowli specyficzne dla komórek do fenotypowania i analizy in vitro.

Jednoczesna izolacja i hodowla miocytów przedsionkowych, miocytów komorowych i niemiocytów z serca dorosłej myszy

Opracowaliśmy prostąmetodę izolowania wysokiej jakości pojedynczych komórek serca myszy za pomocą techniki perfuzji antegrade. Metoda ta nie zawiera metody Langendorffa i jest przydatna do izolowania miocytów komorowych i przedsionkowych lub komórek śródmiąższowych, takich jak fibroblasty serca lub komórki progenitorowe.

Metoda perfuzji antegrade do izolacji kardiomiocytów od myszy

Modele mysie pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty do wykonywania pomiarów typu patch-clamp. W tym miejscu opisano metodę izolacji mysich miocytów przedsionków i komór za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, która umożliwia jednoczesne pomiary stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

Złotym standardem w kardiologii dla komórkowych i molekularnych eksperymentów funkcjonalnych są kardiomiocyty. W artykule opisano adaptacje techniki innej niż Langendorff do izolowania kardiomiocytów myszy.

Prosta i skuteczna metoda konsekwentnego izolowania kardiomiocytów myszy

Poznaj izolację kardiomiocytów myszy metodą perfuzji LOR do analizy kurczliwości i transjentów wapniowych. Technika ta pozwala badać funkcję komórkową serca i mechanizmy chorób kardiologicznych.

Izolacja i analiza fizjologiczna kardiomiocytów myszy

Przeglądaj więcej filmów