Pobieranie i analiza wysięków łyka Arabidopsis przy użyciu metody wspomaganej przez EDTA
23 października 2013
Znajomość składu soku łyka, jak również mechanizmu jego ładowania i transportu na duże odległości jest niezbędna do zrozumienia długodystansowej sygnalizacji w rozwoju roślin i odpowiedzi na stres/patogen oraz transportu asymilacyjnego. Niniejszy manuskrypt opisuje pobieranie wysięków łyka przy użyciu metody wspomaganej przez EDTA.
Ogólnym celem tej procedury jest zebranie wysięku z rzodkiewnika lub innych roślin w celu przeanalizowania jego zawartości lub potwierdzenia obecności związków w strumieniu muchy. Osiąga się to poprzez pierwsze cięcie i inkubację płatka w potasie EDTA, aby zapobiec uszczelnieniu elementu morskiego. Drugim krokiem jest dokładne umycie płatka w celu usunięcia pozostałego EDTA, który może zakłócać późniejszą analizę, a także uszkadzać komórki podczas długotrwałej ekspozycji.
Następnie przepływowe wysięki EM są zbierane do wody. Ostatnim krokiem jest przygotowanie próbek do późniejszej analizy za pomocą żelu L-C-M-S-G-C-M-S, elektroforezy i chromatografii cienkowarstwowej. Ostatecznie wysięk phem ułatwiony przez EDTA może być wykorzystany do analizy i potwierdzenia zawartości phem, takiej jak metabolity i lipidy, białka lub RNA.
Rośliny nie mogą uciec przed niekorzystnymi warunkami. W związku z tym wymagają one bardzo wydajnych i szybkich systemów do przesyłania sygnałów środowiskowych we wszystkich zakładach i reagowania poprzez zmianę rozwoju. Jednym z tych szlaków sygnałowych jest przepływ roślin, który jest dość skomplikowany do zrozumienia jego składu.
Do zbierania i analizy zawartości przepływu używamy sedacji przepływowej wspomaganej EDTA. Został pierwotnie opracowany w Perilla przez króla, ale może być łatwo zmodyfikowany dla innych gatunków. Demonstracją procedury będą Elena i USA, oboje studenci studiów licencjackich z mojego laboratorium Przed rozpoczęciem tej procedury.
Uprawa rzodkiewnika planuje się na cztery do sześciu tygodni w komorach wzrostowych z 12-godzinnym okresem zdjęciowym w dniu zbioru. Rozcieńczyć uprzednio przygotowany 100-milimolowy roztwór potasu EDTA wodą, aby uzyskać końcowe stężenie 20 milimolowe. Następnie napełnij dwie szklane naczynia o średnicy od siedmiu do 15 centymetrów do połowy 20-milimolowym roztworem EDTA potasu.
Po zakończeniu napełnij 1,7 mililitra probówek reakcyjnych 1,4 mililitra 20-milimolowego roztworu EDTA potasu. Następnie napełnij równą liczbę probówek reakcyjnych 1,4 mililitra mililitra wody. Po usunięciu cztero- lub sześciotygodniowych roślin z komór wzrostowych, zbierz liście rozety, przecinając je żyletką u podstawy płatka blisko środka rozety.
Natychmiast umieść liście w naczyniach zawierających 20 milimolowy EDTA potasu z odciętym końcem peole zanurzonym w roztworze. Po zebraniu 15 liści z trzech do czterech roślin, delikatnie ułóż je jeden na drugim, tak aby pocięte płatki były wyrównane ze sobą. Odetnij podstawę płatków i delikatnie zwiń liście.
Następnie delikatnie włóż zwinięte liście do jednej z probówek reakcyjnych zawierających 20 milimolowy EDTA potasu w celu zebrania wysięku. W ciemności wyłóż dno dużego płytkiego naczynia mokrymi ręcznikami papierowymi. Umieść stojak z probówkami reakcyjnymi wypełnionymi liśćmi w naczyniu i umieść go w czarnej plastikowej torbie ze szczelinami do napowietrzania.
Następnie umieść cały zestaw w szafce w celu zebrania wysięku. W świetle wyłóż dno przezroczystego pojemnika z pleksi mokrymi ręcznikami papierowymi. Umieść stojak z rurkami reakcyjnymi wypełnionymi liśćmi w pojemniku i zamknij go.
Po wyjęciu stojaka z pojemnika, godzinę później, wyjmij liście z probówek reakcyjnych. Dokładnie umyj liście wodą destylowaną, aby usunąć całe EDTA. Natychmiast przenieść liście do probówek reakcyjnych zawierających wodę miliporową i umieścić je z powrotem w nawilżonych pojemnikach w celu zebrania wysięku po wyjęciu stojaka z nawilżonego pojemnika.
Pięć do ośmiu godzin później wyjmij liście z probówek, a następnie zamroź wysięk w ciekłym azocie i przechowuj go w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. W celu dalszej analizy następnego dnia rozmrozić próbki w ramach przygotowań do analizy lipidów. Następnie pobrać dwie do trzech próbek i dodać równą ilość chloroformu i metanolu do połączonego roztworu.
Mieszaj mieszaninę przez kilka sekund. Następnie odwirować próbkę przez cztery minuty w temperaturze 400 g. Po zakończeniu, po powtórzeniu podziału z górną fazą, zebrać dolną fazę organiczną w szklanej probówce, jeszcze trzy razy, wysuszyć połączone fazy organiczne pod strumieniem azotu i poddać chromatografii cienkowarstwowej i analizie LCMS.
Metoda ta pozwala na zebranie wystarczającej ilości wysięków phem, aby zidentyfikować białka zlokalizowane w phem i zmiany ich poziomu w odpowiedzi na rozwój lub stres. W niektórych przypadkach naukowcy mogą chcieć zastosować inhibitory proteinaz, aby zapobiec degradacji białek. Jak wykazano tutaj, białka występują w bardzo niskiej obfitości, ale ich poziom jest wystarczająco wysoki dla kolejnych eksperymentów proteomicznych.
Wyniki analizy LCMS lub western blot w dyniowatych sugerują, że przecięcie STEM prowadzi do zakłócenia równowagi potencjału wodnego, a następnie do napływu wody i ewentualnych zanieczyszczeń z alastu. Jednak pobieranie przez czas od jednej do ośmiu godzin nie wpływa na profil białka M przepływu i skład InOpSys. Ilość zebranego białka i wzór znalezionych białek różni się w zależności od gatunku i leczenia.
W rezultacie sygnały białkowe mogą być wizualizowane, identyfikowane i śledzone. Za pomocą tej metody można również zidentyfikować mRNA i mikroRNA w wysiękach flom. Jednak leczenie inhibitorem RNA jest konieczne, aby zapobiec degradacji MR. NA podczas wydłużonego czasu wysięku.
Ponieważ pierwiastki C nie zawierają funkcjonalnych chloroplastów, rubiny, małe lub duże podjednostki mRNA mogą być stosowane jako kontrole ujemne, podczas gdy mRNA o znanym pH grypy, takie jak enzym sprzężający ubikwitynę, mogą być stosowane jako kontrola pozytywna. Podobnie, cukry lub małe metabolity mogą być analizowane za pomocą GCMS lub LCMS. Należy wspomnieć, że wysięki phem zawierają dużą liczbę funkcjonalnych enzymów, w tym prawie cały szlak glikolityczny.
W związku z tym użycie kilku punktów czasowych może ujawnić procesy metaboliczne podczas pobierania wysięku. We wszystkich wysiękach sacharoza jest najobficiej występującym metabolitem. Jest to najbardziej widoczne po zbiorze przez godzinę.
Jednak po pięciu godzinach stosunek sacharozy do fruktozy jest nieznacznie zmniejszony. Jeśli ten sam wysięk zostanie pobrany na godzinę, a następnie pozostawiony na ławce na dodatkowe cztery godziny, stosunek sacharozy do fruktozy zmniejszy się w znacznie większym stopniu. Sugeruje to, że aktywne enzymy w wysiękach phem prowadzą do degradacji sacharozy w temperaturze pokojowej.
Ponadto fakt, że ciągłe zbieranie przez pięć godzin wykazuje tylko niewielkie zmniejszenie stosunku sacharozy do fruktozy, jest zgodny z ustaleniami, że ładowanie phem i transport cząsteczek z komórek towarzyszących do elementów morskich może być kontynuowane podczas wysięku, dopóki system nie straci swojej żywotności. Lipidy w wysiękach phem, a co za tym idzie sygnalizacja lipidowa na duże odległości, są dość nowym obszarem zainteresowania w nauce o roślinach. Ze względu na ich hydrofobowy charakter lipidy są obecne tylko w niskich stężeniach i mogą być wiązane z innymi cząsteczkami w celu rozpuszczania.
Jednak wysięk ułatwiony przez EDTA pozwala na zebranie wystarczającej ilości materiału do wizualizacji i identyfikacji przepływu i lipidów z kilku gatunków roślin. Jak pokazano tutaj, możliwe jest oddzielenie kilku gatunków lipidów za pomocą chromatografii cienkowarstwowej. LCMS pozwala na identyfikację różnych gatunków lipidów i monitorowanie zmian w profilach lipidowych różnych genotypów lub zabiegów.
Pozwala to na badanie roli lipidów podczas rozwoju roślin i reakcji na stres. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać i to już po trzech godzinach, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Jednak w przypadku większości próbek sugerujemy, aby czas pobierania wynosił od pięciu do ośmiu godzin.
W takim przypadku zaleca się wczesne poranne rozpoczęcie zbioru liści. Procedura ta może być modyfikowana dla innych roślin i może prowadzić do odkrycia lub potwierdzenia nowych związków przepływowych. Podejmując tę procedurę, należy pamiętać o dokładnym obserwowaniu PDL po pierwszej godzinie w celu usunięcia EDTA i nie ściskaniu liści, aby zapobiec zanieczyszczeniu zawartością innych komórek.
Ponadto noszenie rękawiczek chroni również próbki przed zanieczyszczeniami, które mogą zostać wprowadzone przez skórę Aby zapobiec zanieczyszczeniu, należy stosować odpowiednie kontrole dla próbek białkowych RNA lub metabolitów. Sugerowane elementy sterujące są wymienione w protokole tekstowym. Metoda ta pozwoliła nam uzyskać nowe informacje na temat składu przepływu roślin.
Udało nam się zidentyfikować kilka lipidów w postaci wysięku, których nie spodziewano się w środowisku wodnym podłogi. To skłoniło nas i innych do wprowadzenia koncepcji sygnalizacji lipidowej na duże odległości, która obecnie przekształciła się w nowe, ekscytujące badania terenowe nad implantami.
Przegląd
Niniejsze badanie opisuje metodę pobierania eksudatów łyka z roślin, a konkretnie z Arabidopsis, z zastosowaniem podejścia wspomaganego przez EDTA. Zrozumienie składu soku łykowego jest kluczowe dla uzyskania wiedzy na temat sygnalizacji roślinnej oraz reakcji na stres środowiskowy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia roślin
- Mechanizmy transportu w floemie
- Analiza metabolitów
Wstęp
- Sok łykowy odgrywa kluczową rolę w dalekosiężnym przesyłaniu sygnałów w roślinach.
- Efektywny transport składników odżywczych i sygnałów jest niezbędny dla rozwoju rośliny.
- Metoda wspomagana przez EDTA umożliwia skuteczne gromadzenie eksudatów łykowych.
- Zrozumienie składu soku łykowego pomaga w badaniu reakcji roślin na stres i patogeny.
Cel badania
- Pozyskanie i analiza eksudatów łykowca z Arabidopsis oraz innych roślin.
- Potwierdzenie obecności metabolitów, białek i RNA w soku łykowym.
- Badanie szlaków sygnalizacyjnych zaangażowanych w reakcje roślin na warunki środowiskowe.
Zastosowane metody
- Inkubacja płatków roślinnych w EDTA potasu w celu zapobiegania zamykaniu się rurek sitowych.
- Zbieranie wysięków floemu do probówek reakcyjnych w celu przeprowadzenia analizy.
- Wykorzystanie LC-MS, GC-MS oraz chromatografii cienkowarstwowej do analizy metabolitów.
- Zamrażanie i rozmrażanie próbek w celu dalszej analizy białek i RNA.
Główne wyniki
- Skuteczne zebranie wysięków łykowca w ilościach wystarczających do badań proteomicznych i metabolomicznych.
- Identyfikacja białek i metabolitów, w tym sacharozy jako najliczniejszego metabolitu.
- Wykazanie możliwości zastosowania tej metody u różnych gatunków roślin.
- Wgląd w dynamikę składu łykowca w odpowiedzi na warunki rozwojowe i stresowe.
Wnioski
- Metoda z zastosowaniem EDTA jest skuteczna w badaniu eksudatów floemowych.
- Analiza soku floemowego może dostarczyć istotnych informacji na temat sygnalizacji i metabolizmu roślin.
- Podejście to można dostosować do różnych gatunków roślin, aby pogłębić zrozumienie funkcji floemu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Zrozumienie składu łyka umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w walidacji celów dla zastosowań biofarmaceutycznych opartych na roślinach, szczególnie w analizie metabolitów i szlaków sygnalizacyjnych. Metoda eksudatu wspomagana przez EDTA zwiększa pewność predykcyjną, zapewniając powtarzalny dostęp do zawartości łyka u różnych gatunków, co wspomaga wczesne etapy procesów odkrywania. Podejście to poprawia ciągłość translacyjną od fazy odkrywania po przedkliniczną ocenę związków pochodzenia roślinnego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez analizę zlokalizowanych w łyku metabolitów, białek i RNA zaangażowanych w szlaki sygnalizacji stresu.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez funkcjonalną walidację celów, wykorzystując profile sacharozy, lipidów i białek jako biomarkery integralności i aktywności łyka.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez powiązanie zmian w składzie łyka z warunkami rozwojowymi lub stresowymi, co dostarcza informacji niezbędnych do podjęcia decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań w procesie screeningu związków w systemach roślinnych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy poprzez uzyskiwanie eksudatów odpowiednich do analizy metabolitów i lipidów metodami LC-MS, GC-MS oraz chromatografii cienkowarstwowej.
- Wartość operacyjna: Zwiększa standaryzację i powtarzalność testów dzięki kontrolowanemu czasowi zbierania eksudatów oraz etapom usuwania EDTA, co zmniejsza zmienność wyników w badaniach przesiewowych związków.
- Skalowalność: Umożliwia niezawodną ocenę związków w odniesieniu do gatunków zielnych i zdrewniałych przy minimalnym nakładzie sprzętowym, co wspiera ponowne wykorzystanie platformy w procesach badawczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Omawia istotność choroby poprzez analizę sygnalizacji lipidowej i enzymów glikolitycznych w eksudatach floemu, co jest zgodne z translacyjnym odkrywaniem biomarkerów w odpowiedziach roślin na stres.
- Wartość operacyjna: Opisuje ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, umożliwiając podłużne profilowanie metabolitów i białek floemu w różnych punktach czasowych i przy różnych zastosowaniach.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Wspiera decyzje dotyczące rozwoju związków pochodzenia roślinnego poprzez identyfikację stabilnych biomarkerów (np. stosunków sacharozy), które odzwierciedlają żywotność ładowania i transportu w floemie.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć — od testowania hipotez po identyfikację wiodących cząsteczek — wspierając analizę metabolitów, białek i lipidów pochodzących z łyka u Arabidopsis oraz innych gatunków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie analizy związków zlokalizowanych w floemie, które uczestniczą w sygnalizacji stresu i strumieniu metabolicznym.
- Przesiewanie: Opisuje gotowość do przeprowadzania testów poprzez zestandaryzowane etapy zbierania i oczyszczania eksudatów, zapewniając powtarzalne wyniki ilościowe dla przesiewania metabolitów i lipidów.
- Analityka: Wskazuje LC-MS, GC-MS oraz chromatografię cienkowarstwową jako kluczowe techniki analityczne generujące porównywalne zbiory danych do oceny wpływu związków na skład floemu.
- Badania translacyjne: Łączy metodę z ciągłością przedkliniczną, umożliwiając śledzenie biomarkerów lipidowych i białkowych w różnych warunkach rozwojowych i stresowych, co wspiera postępy skorygowane o ryzyko.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Pozycjonuje metodę wspomaganą przez EDTA jako możliwość wielokrotnego zastosowania w różnych gatunkach roślin i laboratoriach, zmniejszając zależność od specjalistycznego sprzętu do analizy floemu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności prognostycznej w walidacji celów, ograniczenie niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach sygnalizacyjnych floemu oraz odkrywanie biomarkerów odpowiedzi na stres.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność zbierania eksudatów u różnych gatunków oraz w różnych warunkach laboratoryjnych.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa dzięki ograniczeniu strat na późnych etapach opracowywania związków pochodzenia roślinnego oraz zmniejszone ryzyko biologiczne przy wyborze celów.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje o dalszym rozwoju oparte na ilościowych profilach białek i metabolitów floemu.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu fizjologii roślin i analizy metabolomów w celu odróżnienia rzeczywistych eksudatów floemowych od zanieczyszczeń komórkowych.
- Metoda zależy od dostępu do aparatury LC-MS, GC-MS oraz elektroforezy w celu kompleksowej charakterystyki eksudatów.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów płukania EDTA oraz czasu pobierania próbek pomiędzy zespołami, aby zapewnić powtarzalność wyników w różnych laboratoriach.
- Wymagane są modyfikacje przy stosowaniu metody w odniesieniu do gatunków zdrewniałych w porównaniu z roślinami zielnymi ze względu na różnice w kinetyce zamykania tkanek floemu.
- Ograniczenie praktyczne: możliwa jest jedynie kwantyfikacja względna, ponieważ metoda opiera się na eksudacji, a nie na bezpośrednim pobieraniu soku z floemu, co wymaga strategii normalizacji w celu porównania próbek.
