Name: Pobieranie i analiza wysięków łyka Arabidopsis przy użyciu metody wspomaganej przez EDTA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-23T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj metodę pobierania wysięków łyka z Arabidopsis wspomaganą przez EDTA. Technika ta umożliwia analizę metabolitów, białek i RNA w badaniach sygnałowania roślinnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez grant National Science Foundation NSF-IOS#1144391 dla SHB.

1. Przygotowanie roślin
<ol>
	<li>Nasiona rzodkiewnika mogą kiełkować bezpośrednio na glebie lub na płytkach MS. Uprawiaj rośliny przez cztery do sześciu tygodni w komorach wzrostowych z 12-godzinnym fotoperiodem (22 °C w dzień, 15 °C w nocy14). Podlewaj rośliny raz do dwóch razy w tygodniu. Użyj dolnej tacy do podlewania; nie podlewaj roślin od góry; Pozostaw tace do wyschnięcia przed ponownym podlaniem. Upewnij się, że rośliny są dobrze nawodnione w czasie zbiorów.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów i potraw
<ol>
	<li>Roztwór K2-EDTA: Przygotować 100 mM roztwór podstawowy roztworuK 2-EDTA, który można przechowywać w lodówce. W dniu pobrania rozcieńczyć roztwór od 1 do 5 (jedna część roztworu EDTA, cztery części wody), aby otrzymać roztwór20 mM K 2-EDTA.</li>
	<li>Napełnij szklankę lub szalkę Petriego (średnica 7-15 cm) do połowy roztworem20 mM K 2-EDTA. W przypadku pobierania próbek z różnych zabiegów (na przykład roślin kontrolnych i narażonych na zasolenie lub różnych genotypów), przygotuj osobne potrawy dla każdego zabiegu.</li>
	<li>Napełnij żądaną liczbę probówek reakcyjnych o pojemności 1,7 ml 1,4 ml roztworu 20 mM K2-EDTA. Napełnij równą liczbę probówek reakcyjnych 1,4 ml autoklawowanej wody dejonizowanej lub miliporowej.</li>
	<li>Połóż ręczniki papierowe na ławce, aby posadzić na niej rośliny; weź jedną nową żyletkę i załóż rękawiczki.</li>
</ol>
3. Zbiór wysięków łyka (przedstawiony na schemacie blokowym na rysunku 1)
<ol>
	<li>Zbierz liście rozety z roślin w wieku od czterech do sześciu tygodni, przecinając je żyletką u podstawy ogonka liściowego blisko środka rozety.</li>
	<li>Natychmiast umieść liście w naczyniach zawierających 20 mM K2-EDTA. Upewnij się, że odcięty koniec ogonka liściowego jest zanurzony w roztworze (ryc. 2).</li>
	<li>Po zebraniu 15 liści (ok. trzech do czterech roślin) delikatnie ułóż liście jeden na drugim tak, aby pocięte ogonki były wyrównane ze sobą. Ponownie przeciąć podstawę ogonków liściowych (ok. 1 mm) i natychmiast przenieść liście do jednej z probówek reakcyjnych z roztworem 20 mM K 2-EDTA. Liście pasują najłatwiej, jeśli są lekko zwinięte. Unikaj ściskania liści, ponieważ może to spowodować uszkodzenie komórek, a tym samym prowadzić do gromadzenia się komórek liściowych.</li>
	<li>Jeśli potrzeba więcej materiału, delikatnie przykryj próbki mokrym ręcznikiem papierowym. Użyj nowego zestawu szalek, jeśli do pobierania próbek z różnych zabiegów lub genotypów.</li>
	<li>Po umieszczeniu wszystkich próbek w probówkach reakcyjnych należy zebrać wysięk w ciemności lub w świetle.</li>
	<li>Do zbierania w ciemności wyłóż podłogę dużego płytkiego naczynia mokrymi ręcznikami papierowymi. Umieść ruszt z rurkami reakcyjnymi wypełnionymi liśćmi w naczyniu i przykryj mokrymi ręcznikami papierowymi lub włóż do czarnego plastikowego tyłu ze szczelinami do napowietrzenia. Umieść cały zestaw w szafce lub ciemnym pomieszczeniu.</li>
	<li>Aby zebrać w świetle, wyłóż dno przezroczystego pojemnika z pleksi mokrymi ręcznikami papierowymi. Umieść stojak z rurkami reakcyjnymi wypełnionymi liśćmi w pojemniku i zamknij go.</li>
	<li>Po 1 godzinie delikatnie wyjmij liście z pojemnika i probówek reakcyjnych i dokładnie umyj wodą destylowaną, dejonizowaną lub Millipore w celu usunięcia całego EDTA. Ten krok służy trzem celom: (1) usuwa EDTA w celu zminimalizowania uszkodzeń komórek, (2) eliminuje interferencję EDTA z SDS-PAGE i chromatografią oraz (3) usuwa wszelkie związki, które nagromadziły się z pociętych/uszkodzonych komórek. Natychmiast przenieść do przygotowanych probówek reakcyjnych zawierających autoklawowaną wodę i powrócić do nawilżonych pojemników zbiorczych w celu zebrania wysięku. W tym momencie dodaj inhibitor RNazy, jeśli wysięk musi być użyty do ekstrakcji RNA. Opcjonalnie: inhibitor proteinazy może być dodany, jeśli pożądana jest analiza białka.</li>
	<li>Po zamierzonym czasie zbioru wyciągnąć i wyrzucić liście, a wysięk łyka zamrozić w płynieN2 do dalszego wykorzystania. Jeśli konieczne jest dłuższe przechowywanie, należy liofilizować próbki i przechowywać je w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>W przypadku rzodkiewnika metabolity można wykryć już po pobraniu wysięku przez 1 godzinę. Jednak zbieranie przez 5-8 godzin jest wskazane, jeśli planowana jest analiza mniej obfitych składników. W przypadku większych roślin, takich jak pachnotka, zalecany jest dłuższy czas zbioru (8 godzin). 
	Wysięk zebrany z 15 liści zwykle wystarcza na jeden pas na żelu SDS-PAGE (białka), do ekstrakcji mRNA, GC-MS (cukry i metabolity). W przypadku analizy lipidów zaleca się zebranie 2-3 próbek (wysięk z 30-45 liści), co prowadzi do wyraźniejszych wyników.</li>
</ol>
4. Późniejsza analiza (dla wideo pokazujemy tylko 4.4)
<ol>
	<li>W celu analizy białek należy ponownie zawiesić próbkę w 15 μl wody i 30 μl buforu Lämmli, podgrzać do 95 °C przez 5 minut, szybko odwirować wszelkie osady i załadować całą próbkę do żelu SDS-PAGE (45 μl kieszeni ładujących). Próbki należy barwić koloidalnymi barwnikami Coomassie lub innymi wrażliwymi barwnikami, ponieważ obfitość białek jest bardzo niska.</li>
	<li>W przypadku analizy cukrów i małych metabolitów do wysuszonej próbki dodać środki do derywatyzacji, jak opisano w literaturze14.</li>
	<li>mRNA można analizować za pomocą RT-PCR, mikromacierzy lub analizy RNA-Seq.</li>
	<li>Do analizy lipidów natychmiast zebrać dwie do trzech próbek i podzielić na zawartość chloroformu:metanolu (1:1) w dygestorii w następujący sposób: dodać równą ilość chloroformu: metanolu do każdej próbki, wirować przez kilka sekund i wirować przez 4 minuty przy 400 x g. Zebrać dolną (organiczną) fazę do szklanej probówki z teflonową nakrętką i powtórzyć podział z górną fazą jeszcze trzy razy. Wysuszyć połączone fazy organiczne pod strumieniemN2 i poddać dalszej analizie (chromatografia cienkowarstwowa: TLC14, 37; Chromatografia cieczowa - spektrometria mas: LC-MS14).</li>
</ol>

<ol><li>Balachandran, S., Xiang, Y., Schobert, C., Thompson, G. A., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+sap+proteins+from+Cucurbita+maxima+and+Ricinus+communis+have+the+capacity+to+traffic+cell+to+cell+through+plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Phloem sap proteins from Cucurbita maxima and Ricinus communis have the capacity to traffic cell to cell through plasmodesmata.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 14150-14158 (1997).</li>
<li>Barnes, A., Bale, J., Constantinidou, C., Aston, P., Jones, A., Pritchard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+protein+identity+from+sieve+element+sap+in+Ricinus+communis+L.+by+quadrupole+time+of+flight+%28Q-TOF%29+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Determining protein identity from sieve element sap in Ricinus communis L. by quadrupole time of flight (Q-TOF) mass spectrometry.</a> J. Exp. Bot. 55, 1473-1481 (2004).</li>
<li>Behmer, S. T., Grebenok, R. J., Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+sterols+and+host+plant+suitability+for+a+phloem+feeding+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Ecology%22%5BJournal%5D)">Plant sterols and host plant suitability for a phloem feeding insect.</a> Functional Ecology. , (2010).</li>
<li>Benning, U. F., Tamot, B., Guelette, B. S., Hoffmann-Benning, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+aspects+of+phloem-mediated+long-distance+lipid+signaling+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Front.Plant.Sci%22%5BJournal%5D)">New aspects of phloem-mediated long-distance lipid signaling in plants.</a> Front.Plant.Sci. 3, 53>(2012).</li>
<li>Chen, S., Petersen, B. L., Olsen, C. E., Schulz, A., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+phloem+transport+of+glucosinolates+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22PlantPhysiol%22%5BJournal%5D)">Long-distance phloem transport of glucosinolates in Arabidopsis.</a> PlantPhysiol. 127, 194-201 (2001).</li>
<li>Corbesier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FT+protein+movement+contributes+to+long+distance+signalling+in+floral+induction+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">FT protein movement contributes to long distance signalling in floral induction of Arabidopsis.</a> Science. 316, 1030-1033 (2007).</li>
<li>Dafoe, N. J., Gowen, B. E., &Constabel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thaumatin-like+proteins+are+differentially+expressed+and+localized+in+phloem+tissues+of+hybrid+poplar.BMC%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Thaumatin-like proteins are differentially expressed and localized in phloem tissues of hybrid poplar.BMC.</a> Plant Biology. 10, (2010).</li>
<li>Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Arabidopsis+thaliana+phloem+RNAs+provides+a+search+criterion+for+phloem-based+transcripts+hidden+in+complex+datasets+of+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification of Arabidopsis thaliana phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments.</a> The Plant Journal. 55, 746-759 (2008).</li>
<li>Doering-Saad, C., Newbury, H. J., Bale, J. S., Pritchard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+aphid+stylectomy+and+RT-PCR+for+the+detection+of+transporter+mRNAs+in+sieve+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Use of aphid stylectomy and RT-PCR for the detection of transporter mRNAs in sieve elements.</a> J. Exp. Bot. 53, 631-637 (2002).</li>
<li>Fisher, D. B., Wu, Y., Ku, M. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turnover+of+soluble-proteins+in+the+wheat+sieve+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Turnover of soluble-proteins in the wheat sieve tube.</a> Plant Physiol. 100, 1433-1441 (1992).</li>
<li>Gaupels, F., Buhtz, A., Knauer, T., Deshmukh, S., Waller, F., van Bel, A. J. E., Kogel, K. -H., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+aphid+stylectomy+for+analyses+of+proteins+and+mRNAs+in+barley+phloem+sap%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Adaptation of aphid stylectomy for analyses of proteins and mRNAs in barley phloem sap.</a> J Exp Bot. 59, 3297-3306 (2008).</li>
<li>Giavalisco, P., Kapitza, K., Kolasa, A., Buhtz, A., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+proteome+of+Brassica+napus+phloem+sap%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Towards the proteome of Brassica napus phloem sap.</a> Proteomics. 6, 896-909 (2006).</li>
<li>Guelette, B. S., Chamberlin, B., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. Indications of lipids/lipid signaling in the phloem exudates of Arabidopsis thaliana and Perilla ocymoides. Benning, C., Ohlroggeeds, J. Proceedings of the 17th International Symposium of Plant, , Michigan State University. Lansing, USA. 92-95 (2007).</li>
<li>Guelette, B. S., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+lipids+and+lipid-binding+proteins+in+phloem+exudates+from+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Identification of lipids and lipid-binding proteins in phloem exudates from Arabidopsis thaliana.</a> J. Exp. Bot. 63, 3603-3616 (2012).</li>
<li>Haebel, S., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time+of+flight+mass+spectrometry+peptide+mass+fingerprints+and+post+source+decay%3A+a+tool+for+the+identification+and+analysis+of+phloem+proteins+from+Cucurbita+maxima+Duch.+separated+by+two-dimensional+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry peptide mass fingerprints and post source decay: a tool for the identification and analysis of phloem proteins from Cucurbita maxima Duch. separated by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Planta. 214, 3328(2001).</li>
<li>Hayashi, H., Fukuda, A., Suzui, N., Fujimaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins+in+the+sieve+element-companion+cell+complexes%3A+their+detection%2C+localization+and+possible+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Aust.+J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Proteins in the sieve element-companion cell complexes: their detection, localization and possible functions.</a> Aust. J. Plant Physiol. 27, 489-496 (2000).</li>
<li>Hoffmann-Benning, S., Gage, D. A., McIntosh, L., Kende, H., Zeevaart, J. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+peptides+in+the+phloem+sap+of+flowering+and+non-flowering+Perilla+and+lupine+plants+using+microbore+HPLC+followed+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Comparison of peptides in the phloem sap of flowering and non-flowering Perilla and lupine plants using microbore HPLC followed by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Planta. , 216-2140 (2002).</li>
<li>Jorgensen, R. A., Atkinson, R. G., Forster, R. L., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-Based+Information+Superhighway+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An RNA-Based Information Superhighway in Plants.</a> Science. 6, 1486-1487 (1998).</li>
<li>Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+sap+proteins%3A+their+identities+and+potential+roles+in+the+interaction+between+plants+and+phloem-feeding+insects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Phloem sap proteins: their identities and potential roles in the interaction between plants and phloem-feeding insects.</a> J. Exp. Bot. 57, 767-774 (2006).</li>
<li>King, R. W., Zeevaart, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+phloem+exudation+from+cut+petioles+by+chelating-agents%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of phloem exudation from cut petioles by chelating-agents.</a> Plant Physiol. 53, 96-103 (1974).</li>
<li>Lin, M. -K., Lee, Y. -J., Lough, T. J., Phinney, B., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+pumpkin+phloem+proteome+provides+functional+insights+into+angiosperm+sieve+tube+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the pumpkin phloem proteome provides functional insights into angiosperm sieve tube function.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8, 343-356 (2009).</li>
<li>Lough, T. J., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+plant+biology%3A+role+of+phloem+long-distance+macromolecular+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrative plant biology: role of phloem long-distance macromolecular trafficking.</a> Annu.Rev. Plant Biol. 57, 203-232 (2006).</li>
<li>Madey, E., Nowack, L. M., Thompson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+lipid+in+phloem+sap+of+canola%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of lipid in phloem sap of canola.</a> Planta. 214, 625-634 (2002).</li>
<li>Maeda, H., Song, W., Sage, T. L., DellaPenna, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tocopherols+playa+crucial+role+in+low-temperature+adaptation+and+phloem+loading+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Tocopherols playa crucial role in low-temperature adaptation and phloem loading in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 18, 2710-2732 (2006).</li>
<li>Marentes, E., Grusak, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+determination+of+low-molecular-weight+proteins+in+phloem+sap+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Mass determination of low-molecular-weight proteins in phloem sap using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> J. Exp. Bot. 49, 903-911 (1998).</li>
<li>Prado, E., Tjallingii, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+evidence+for+local+reduction+of+aphid-induced+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+ofInsect+Science%22%5BJournal%5D)">Behavioral evidence for local reduction of aphid-induced resistance.</a> Journal ofInsect Science. 7, 48(2007).</li>
<li>Ruiz-Medrano, R., Xoconostle-Cázares, B., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+long-distance+transport+of+CmNACP+mRNA%3A+implications+for+supracellular+regulation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Phloem long-distance transport of CmNACP mRNA: implications for supracellular regulation in plants.</a> Development. 126, 4405-4419 (1999).</li>
<li>Ryabov, E. V., Robinson, D. J., Taliansky, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plant+virus-encoded+protein+facilitates+long-distance+movement+of+heterologous+viral+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A plant virus-encoded protein facilitates long-distance movement of heterologous viral RNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 1212-1217 (1999).</li>
<li>Schilmiller, A. L., Howe, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+signaling+in+the+wound+response%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Systemic signaling in the wound response.</a> Curr.Opin. Plant Biol. 8, 369-377 (2005).</li>
<li>Thompson, G. A., Goggin, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomics+and+functional+genomics+of+plant+defence+induction+by+phloem-feeding+insects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Transcriptomics and functional genomics of plant defence induction by phloem-feeding insects.</a> J. Exp. Bot. 57, 755-766 (2006).</li>
<li>Thorpe, M. R., Ferrieri, A. P., Herth, M. M., Ferrieri, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%2811%29C-imaging%3A+methyl+jasmonate+moves+in+both+phloem+and+xylem%2C+promotes+transport+of+jasmonate%2C+and+of+photoassimilate+even+after+proton+transport+is+decoupled%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">(11)C-imaging: methyl jasmonate moves in both phloem and xylem, promotes transport of jasmonate, and of photoassimilate even after proton transport is decoupled.</a> Planta. (11), 226-541 (2007).</li>
<li>Truman, W., Bennett, M. H., Kubigsteltig, I., Turnbull, C., Grant, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+systemic+immunity+uses+conserved+defense+signaling+pathways+and+is+mediated+by+jasmonates%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis systemic immunity uses conserved defense signaling pathways and is mediated by jasmonates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 1075-1080 (2007).</li>
<li>van Bel, A. J. E., Knoblauch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sieve+element+and+companion+cell%3A+the+story+of+the+comatose+patient+and+the+hyperactive+nurse%5BTitle%5D)+AND+%22Aust.+J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sieve element and companion cell: the story of the comatose patient and the hyperactive nurse.</a> Aust. J. Plant Physiol. 27, 477-487 (2000).</li>
<li>van Bel, A. J. E., Hess, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexoses+as+phloem+transport+sugars%3A+the+end+of+a+dogma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Hexoses as phloem transport sugars: the end of a dogma.</a> J. Exp. Bot. 59, 261-272 Forthcoming.</li>
<li>Walz, C., Juenger, M., Schad, M., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+presence+and+activity+of+a+complete+antioxidant+defence+system+in+mature+sieve+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Evidence for the presence and activity of a complete antioxidant defence system in mature sieve tubes.</a> Plant J. 31, 189-197 (2002).</li>
<li>Walz, C., Giavalisco, P., Schad, M., Juenger, M., Klose, J., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+curcurbit+phloem+exudate+reveals+a+network+of+defence+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Proteomics of curcurbit phloem exudate reveals a network of defence proteins.</a> Phytochemistry. 65, 1795-1804 (2004).</li>
<li>Wang, Z., Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+thaliana+Polar+Glycerolipid+Profiling+by+Thin+Layer+Chromatography+%28TLC%29+Coupled+with+Gas-Liquid+Chromatography+%28GLC%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC).</a> J. Vis. Exp. (49), e2518(2011).</li>
<li>Will, T., van Bel, A. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+interactions+between+aphids+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical interactions between aphids and plants.</a> J. Exp. Bot. 57, 729-737 (2006).</li>
<li>Yoo, B. C., Kragler, F., Varkonyi-Gasic, E., Haywood, V., Archer-Evans, S., Lee, Y. M., Lough, T. J., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systemic+small+RNA+signaling+system+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A systemic small RNA signaling system in plants.</a> Plant Cell. 16, 1979-2000 (2004).</li>
<li>Zhang, B., Tolstikov, V., Turnbull, C., Hicks, L. M., Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+metabolome+and+proteome+suggest+functional+independence+of+dual+phloem+transport+systems+in+cucurbits%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Divergent metabolome and proteome suggest functional independence of dual phloem transport systems in cucurbits.</a> PNAS USA. 107, 13532-13537 (2010).</li>
<li>Zhang, C., Yu, X., Ayre, B. G., Turgeon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Origin+and+Composition+of+Cucurbit+%22Phloem%22+Exudate%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Origin and Composition of Cucurbit "Phloem" Exudate.</a> Plant Physiology. 158, 1873-1882 (2012).</li>
<li>Zhang, S., Sun, L., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Phloem-Delivered+RNA+Pool+Contains+Small+Noncoding+RNAs+and+Interferes+with+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Phloem-Delivered RNA Pool Contains Small Noncoding RNAs and Interferes with Translation.</a> Plant Physiol. 150, 378-387 (2009).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Zbieranie wysięków łyka wspomagane przez EDTA jest bardzo proste, wymaga minimalnego sprzętu i ma zastosowanie do większości roślin. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta rozszerza możliwość analizy wysięków łyka z większej liczby gatunków. Chociaż wysięk jest rozcieńczony, łatwo jest zebrać wiele różnych próbek lub z wielu roślin, aby zwiększyć skalę do dużej ilości materiału. Pozwala to na wykrycie nowych związków, które występują w bardzo małej ilości i w przeciwnym razie zostałyby przeoczone.
Metoda ta może być stosowana w odniesieniu do wielu gatunków roślin i prac zgodnie z opisem dla tych wymienionych w tym manuskrypcie. Jeśli badane są nowe gatunki, dwa aspekty, które mogą wymagać modyfikacji, to liczba użytych liści i czas wysięku. W większości przypadków odpowiedni powinien być wysięk trwający od pięciu do ośmiu godzin. Aby potwierdzić zastosowanie tej metody w odniesieniu do nowego gatunku roślin, należy pobrać wysięk i przeprowadzić jedną lub więcej późniejszych analiz, jak opisano w części 4 protokołu. W zależności od intensywności obserwowanego sygnału może być konieczne zwiększenie objętości zbierania. Ogólnie rzecz biorąc, analiza lipidów i białek będzie wymagała więcej materiału niż analiza cukrów i metabolitów, ponieważ te pierwsze są mniej obfite w wysięki łyka.
Ze względu na to, że pobieranie wysięku za pomocą EDTA obejmuje powierzchnie cięcia, a także potencjalnie szkodliwe działanie EDTA, należy wziąć pod uwagę kilka punktów: (1) po godzinnej inkubacji z EDTA, ogonki liściowe muszą zostać dokładnie umyte. Usuwa to wszelkie związki uzyskane z uszkodzonych komórek, a także samo EDTA, które mogłyby uszkodzić komórki lub zakłócić ekstrakcję. (2) Należy uwzględnić kontrole dodatnie i ujemne w celu zapewnienia, że uzyskane dane pochodzą z soku łyka, a nie z uszkodzonych komórek (patrz kluczowe etapy poniżej). (3) Sok z łyka zawiera kilka enzymów, które mogą być aktywne podczas zbierania wysięku. Dlatego w niektórych przypadkach może być przydatne zbieranie przez różne okresy czasu. (4) Ponieważ metoda obejmowała wysięk do wody, nie jest możliwe bezwzględne określenie ilościowe związków.
Kroki krytyczne: Kluczem do skutecznego zastosowania tej metody jest zachowanie ostrożności podczas obchodzenia się z próbką, aby nie uszkodzić żadnych komórek, a także zastosowanie odpowiednich kontroli (patrz odnośnik 14). Jedną z odpowiednich kontroli jest pobieranie wysięków łyka bez wcześniejszego leczenia EDTA. W takim przypadku łyko uszczelni się i nie będzie można zebrać wysięku. W tym miejscu zostaną wykryte wszelkie związki zanieczyszczające pochodzące z uszkodzonych komórek. Drugą kontrolą byłaby analiza cukrów w wysięku. U rzodkiewnika sacharoza powinna być dominującym metabolitem w soku łyka, ze stosunkiem fruktozy do sacharozy między 1:4 a 1:8 (ref 8, 14).
Do ekstrakcji RNA konieczne jest użycie inhibitora RNAzy. Ponadto pozytywna kontrola wcześniej opisanego mRNA zlokalizowanego w łyku (UBC9: Ubikwityna sprzęgająca enzym 9, At4g27960; 8, 14) i wskazana jest negatywna kontrola np. mRNA chloroplastu (Rubisco LSU).
Ponieważ wysięk zawiera aktywne enzymy, zaleca się przebieg w czasie, aby upewnić się, że zmiany w profilu łyka nie są spowodowane po prostu zmianami w czasie zbierania. W niektórych przypadkach korzystne może być stosowanie inhibitorów proteinazy. Badacze muszą jednak pamiętać, że zebrany wysięk będzie skoncentrowany, a wszelkie dodane związki będą w dużej mierze skoncentrowane. Drugim krytycznym krokiem w ramach protokołu jest ponowne przecięcie ogonka liściowego w ramach EDTA. Ten etap służy dwóm celom: po pierwsze, usuwa wszelkie uszczelnione płytki sitowe, zapobiegając tworzeniu się nowych korków, umożliwiając w ten sposób swobodny przepływ soku łyka. Po drugie, usuwa pęcherzyki kawitacyjne w ksylemie powstające podczas cięcia, a tym samym umożliwia transport ksylemu. Wielkość drugiego cięcia zależy od użytych roślin. U roślin o większych ogonkach liściowych powinno to być kilka milimetrów (do 1 cm) powyżej pierwszego cięcia, u roślin takich jak Arabidopsis wystarczy 1-2 mm.
Zastosowanie tej metody może prowadzić do odkrycia nowych związków w wysiękach łyka, które mogą mieć implikacje sygnalizacyjne, rozwojowe lub biomedyczne. Skłoniło to do bardziej dogłębnego przyjrzenia się sygnalizacji lipidowej na duże odległości, która była mało zbadaną dziedziną w naukach o roślinach ze względu na brak dostępu do łyka.

Rośliny nie mogą się poruszać, aby uniknąć niekorzystnych warunków. W związku z tym musieli opracować mechanizmy wykrywania stresów środowiskowych, wywoływania i przesyłania odpowiedniego sygnału w całym zakładzie oraz odpowiedniego dostosowania rozwoju. Istnieją dwa systemy transportu do dystrybucji wody, składników odżywczych i innych związków (sygnalizacyjnych). Pierwszym z nich jest ksylem; który zazwyczaj transportuje wodę i minerały pobierane przez korzenie w całej roślinie. Drugi to łyko. Widok łyka zmienił się z prostego systemu transportu asymilacyjnego na kanał dla RNA, białka, wirusów, lipidów i innych małych cząsteczek. Odgrywa ważną rolę w przyswajaniu i transporcie składników odżywczych, odpowiedzi na stres biotyczny i abiotyczny, a także we wzroście i rozwoju roślin. Obecnie nazywa się ją "informacyjną autostradą" elektrowni18.
Łyko składa się z kilku typów komórek: miąższu łyka, a także wyspecjalizowanych komórek towarzyszących i elementów sita. Element sitowy jest miejscem ruchu na duże odległości. Aby umożliwić niezakłócony przepływ wzdłużny, w elementach sita brakuje większości organelli, a także jąder i uważa się, że zawierają w najlepszym razie ograniczoną maszynerię translacyjną21, 33. Uważa się, że komórki towarzyszące syntetyzują białka i inne związki, które przemieszczają się w strumieniu łyka. Związki te są następnie transportowane do elementu sitowego za pośrednictwem plazmodesmatów i mogą funkcjonować jako sygnały na duże odległości 4,16.
W wysiękach łyka można znaleźć kilka grup związków:
<ul>
	<li>Cukry są często produktami fotosyntezy i są transportowane jako cząsteczki "przenoszące energię" do innych części rośliny w celu magazynowania lub jako elementy budulcowe. Mogą jednak również działać jako środek przeciw zamarzaniu lub jako związki sygnalizacyjne.</li>
	<li>Białka można również znaleźć w wysiękach łyka. Obejmują one enzymy metaboliczne, ale pełnią również funkcję sygnalizacyjną. Jednym z przykładów białka, które służy jako sygnał rozwojowy, jest białko locus T kwitnienia, które sygnalizuje indukcję kwitnienia, a także sezonowe odcięcie liści u roślin. 6</li>
	<li>Kwasy nukleinowe są obecne w wysiękach łyka w postaci mRNA, małych i mikro RNA oraz wirusowych RNA. Wydaje się, że są one w dużej mierze zaangażowane w sygnalizację 27, 28, 39. W tym samym czasie zaobserwowano rRNA i tRNA dla prawie wszystkich aminokwasów w soku łykowym dyniowatych42. Wydaje się, że są one selektywnie przenoszone do systemu rurek sitowych. TRNA wykazują modyfikacje niezbędne do przenoszenia aminokwasów do aparatu translacyjnego. Jednak zamiast uczestniczyć w tłumaczeniu, wydają się hamować ten proces. Alternatywnie mogą służyć jako źródło cytokininy lub sygnalizować stan metaboliczny rośliny42.</li>
	<li>Kwasy tłuszczowe, oksylipiny i inne lipidy znaleziono również w wysiękach łyka 3, 13, 14, 23. Kwas jasmonowy, oksylipina, przemieszcza się przez łyko w ramach odpowiedzi na zakażenie patogenem22, 29, 31, 32. Chociaż rola większości lipidów łyka jest nadal niejasna, niektóre z nich prawdopodobnie pełnią funkcję sygnalizacyjną4.</li>
</ul>
Wyzwanie w pracy z łykiem roślinnym polega na jego zdolności do uszczelniania się po zranieniu. Istnieją cztery główne metody stosowane do zbierania wysięków łyka, ale działają one tylko u wybranych gatunków:
1) U dyniowatych możliwe jest uzyskanie rozsądnych ilości wysięku łyka poprzez nacięcia ogonka liściowego. Po usunięciu początkowej kropli z zanieczyszczeniem uszkodzonych komórek możliwe jest uzyskanie rozsądnie dużych ilości czystego soku łyka 1, 15. Jednak wraz z wydłużaniem się czasu zbierania, wysięk ten gęstnieje, co czyni go coraz mniej odpowiednim do metod chromatografii cieczowej (niepublikowanych). Ostatnie publikacje sugerują, że w zależności od gatunku, ten sok łyka pochodzi z łyka pęczkowego (FP) lub pozapęczkowego (EP) i że chociaż zawiera "ruchomy" sok łyka z elementów sita (FP), jest również podatny na zanieczyszczenie innymi typami komórek, w tym ksylemem40, 41.
2) Drugim podejściem jest uzyskanie soku z łyka poprzez płytkie nacięcia lub nakłucia w łodydze lub ogonku liściowym. Metoda ta jest z powodzeniem stosowana w łubinie 17, 25, dyniowatych36 i Brassica napus12. Tutaj zanieczyszczenie uszkodzonymi komórkami jest minimalne, a wysięk jest bardzo czysty. Jednak rośliny muszą być zdrowe i dobrze nawodnione, ponieważ selektywne nakłuwanie samych elementów sita jest bardzo trudne. Jeśli naczynia ksylemu zostaną nacięte, cały wysięk jest wciągany do strumienia ksylemu. To sprawia, że metoda nie jest odpowiednia dla roślin o bardzo kruchych lub silnie zdrewniałych ogonkach lub łodygach.
3) Stylektomia mszyc pozwala mszycom na wprowadzenie swojego styliku do elementów sita, a następnie usunięcie mszycy za pomocą lasera. Sok z łyka jest wydzielany przez pozostały sztylet2, 9, 10, 35, 38. Teoretycznie do tego podejścia można użyć każdej rośliny, która może zostać zainfekowana przez mszyce. Jednak większość osób zarządzających szklarniami lub komorami wzrostu nie poprze stosowania patogenu. Ponadto mszyce wprowadzają kilka białek do łyka wraz ze śliną 19, 33. Prowadzi to do ograniczonego przeprogramowania transkrypcji 30 i może potencjalnie zmienić skład łyka26.
4) Opisana tutaj metoda to wspomagany przez EDTA wysięk z łyka. Ta metoda wykorzystuje EDTA, aby zapobiec uszczelnieniu łyka20. EDTA chelatuje jony Ca2+, które w przeciwnym razie uczestniczyłyby w procesach uszczelniających łyko. Podczas gdy EDTA może prowadzić do uszkodzenia komórek30, kilka grup stosowało tę metodę i nie zaobserwowało niekorzystnego wpływu stężeń EDTA od 10 mM do 20 mM na ultrastrukturę komórki lub na ładowanie i transport łyka5, 24. Aby zmniejszyć szkodliwy wpływ, a także interferencję EDTA z chromatografią i elektroforezą żelową, rośliny przenosi się do wody po 1 godzinie i wykorzystuje się tylko późniejszą część wysięku14. Tak więc, zamiast wysięku do EDTA, łyko jest wysiękiwane do wody (wysięk ułatwiony przez EDTA). Jest to prosta, tania i niezaawansowana technologicznie metoda zbierania wysięków z łyka. Otrzymany w ten sposób sok łykowy może być stosowany do analizy białek, małych cząsteczek, lipidów i RNA i jest z powodzeniem stosowany w wielu roślinach. Chociaż przeprowadzono ograniczoną liczbę eksperymentów na roślinach jednoliściennych11, metoda wydaje się być bardziej odpowiednia dla roślin dwuliściennych (Perilla17, 20, Arabidopsis8, 13, 14, Topola7). Zbieranie wysięków musi odbywać się w wilgotnym środowisku, aby uniknąć utraty wysięku w wyniku transpiracji. W zależności od rośliny, inkubacja w EDTA przez jedną do dwóch godzin jest wystarczająca, aby zapobiec uszczelnieniu elementów łyka/sita. Zbieranie może wtedy nastąpić do wody. Ma to tę zaletę, że zapobiega negatywnemu wpływowi EDTA na strukturę i stabilność komórki. Eliminuje również interferencję EDTA z metodami takimi jak HPLC lub SDS-Page. Jest to pokazane tak, jak w przypadku Arabidopsis. W przypadku większych roślin inkubacja w kolekcjach EDTA i wysięku musi być zwiększona i przeprowadzana w zlewkach, a nie w probówkach reakcyjnych o pojemności 1,7 ml.

<table><tbody><tr><td>K2-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2P-500G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Płytka szklana lub plastikowa szalka Petriego (7-15 cm)</td><td>PYREX lub Corning</td><td></td><td>Każde czyste, płytkie naczynie będzie działać</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>EMD</td><td>CX1054-1</td><td>Tylko otwarte pojemniki w dygestoriach</td></tr><tr><td></td><td>Metanol J.T.Baker</td><td>9070-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rurki z nakrętką</td><td>VWR International</td><td>53283-800</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rurki z nakrętką</td><td>Sun Sri</td><td>13-425</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rurki Eppendorf</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

pobieranie i analiza wysięków łyka arabidopsis przy użyciu metody wspomaganej przez edta

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Łyko roślinne jest niezbędne do transportu na duże odległości asymilatów (foto)jak również sygnałów przenoszących stres biotyczny lub abiotyczny. Zawiera cukry, aminokwasy, białka, RNA, lipidy i inne metabolity. Chociaż istnieje duże zainteresowanie zrozumieniem składu i funkcji łyka, rola wielu z tych cząsteczek, a tym samym ich znaczenie w rozwoju roślin i reakcji na stres, nie została jeszcze określona. Jedną z barier w analizie łyka jest fakt, że łyko uszczelnia się po zranieniu. W rezultacie liczba roślin, z których można uzyskać sok z łyka, jest ograniczona. Jedną z metod, która umożliwia zbieranie wysięków łyka z kilku gatunków roślin bez dodatkowego sprzętu, jest opisane tutaj zbieranie wysięku łyka z wykorzystaniem EDTA. Chociaż jest łatwy w użyciu, prowadzi do zranienia komórek i należy zachować ostrożność, aby usunąć zawartość uszkodzonych komórek. Ponadto konieczne jest przeprowadzenie kilku kontroli w celu udowodnienia czystości wysięku. Ponieważ jest to wysięk, a nie bezpośrednie zebranie soku z łyka (co nie jest możliwe u wielu gatunków), może nastąpić tylko względna kwantyfikacja jego zawartości. Przewagą tej metody nad innymi jest to, że może być stosowana w wielu gatunkach roślin zielnych lub drzewiastych (pachnotka, rzodkiewnik, topola itp.) i wymaga minimalnego sprzętu i treningu. Prowadzi to do powstania dość dużych ilości wysięków, które można wykorzystać do późniejszej analizy białek, cukrów, lipidów, RNA, wirusów i metabolitów. Jest na tyle prosty, że może być używany zarówno w badaniach, jak i w laboratorium dydaktycznym.

W ciągu ostatnich kilku lat stało się jasne, że złożoność soku łykowego może być odpowiedzią na pytanie o to, w jaki sposób rośliny przesyłają zróżnicowane sygnały rozwojowe i stresowe w celu uzyskania optymalnej odpowiedzi. Zastosowanie eksudacji łyka wspomaganej przez EDTA może zapewnić możliwość analizy wysięków łykowych z roślin, które nie nadają się do innych metod, ale mogą być interesujące pod kątem ekonomicznym lub fizjologicznym.
Metoda ta pozwala na pozyskanie wystarczającej ilości eksudatów łyka do identyfikacji białek zlokalizowanych w łyku oraz wykrywania zmian w ich poziomie w odpowiedzi na rozwój lub stres (Rysunek 3). Jak pokazuje rysunek, białka występują w bardzo niskich stężeniach, jednak ich poziom jest wystarczająco wysoki dla późniejszych eksperymentów proteomicznych z wykorzystaniem LC-MS/MS lub dla analizy Western blot. Wyniki uzyskane dla roślin z rodziny dyniowatych sugerują, że przecięcie łodygi prowadzi do zaburzenia równowagi potencjału wody i w konsekwencji do napływu wody oraz możliwych zanieczyszczeń z apoplastu41. Niemniej jednak zbieranie eksudatów przez czas od jednej do ośmiu godzin nie wpływa na profil/skład białek łyka u Arabidopsis (zmienia się jedynie bezwzględna ilość, Guelette et al.), natomiast ilość zebranego białka i wzór znalezionych białek różnią się w zależności od gatunku (Arabidopsis: A.t.; Perilla, ścieżka I i NI) oraz zabiegów (Perilla hodowana przy różnej długości dnia, ścieżka I i NI). W rezultacie sygnały białkowe mogą być wizualizowane, identyfikowane i śledzone.
mRNA i mikroRNA można również zidentyfikować w eksudatach łyka za pomocą tej metody. Jednakże, aby zapobiec degradacji mRNA podczas wydłużonego czasu eksudacji, konieczne jest zastosowanie inhibitora RNAzy. Ponieważ elementy sitowe nie zawierają funkcjonalnych chloroplastów, mRNA małej lub dużej podjednostki Rubisco (odpowiednio RbcS lub RbcL) mogą służyć jako kontrole negatywne, natomiast znane mRNA zlokalizowane w łyku, takie jak enzym konjugujący ubikwitynę, mogą być wykorzystane jako kontrola pozytywna (Rysunek 4).
Podobnie cukry lub małe metabolity można analizować za pomocą GC-MS lub LC-MS. Należy tutaj wspomnieć, że wysięki łyka zawierają dużą liczbę aktywnych enzymów, w tym niemal cały szlak glikolityczny12. W związku z tym zastosowanie kilku punktów czasowych może ujawnić procesy metaboliczne zachodzące podczas pobierania wysięku. Przykład przedstawiono na rysunku 5: we wszystkich wysiękach najliczniejszym metabolitem jest sacharoza; jest to najbardziej widoczne po 1 godzinie pobierania. Jednak po pięciu godzinach stosunek sacharozy do fruktozy jest nieco zmniejszony. Jeśli ten sam wysięk jest pobierany przez jedną godzinę, a następnie pozostawiony na blacie przez kolejne cztery godziny, stosunek sacharozy do fruktozy ulega znacznie większej redukcji, co sugeruje, że aktywne enzymy w wysiękach łyka prowadzą do degradacji sacharozy w temperaturze pokojowej (więcej interpretacji pików patrz w 14). Jest to zgodne z ustaleniami, według których załadunek do łyka i transport cząsteczek z komórek towarzyszących do rurek sitowych mogą trwać podczas wysiękania aż do momentu utraty żywotności układu34.
Lipidy w eksudatach łyka, a co za tym idzie, dalekosiężna sygnalizacja lipidowa, stanowią stosunkowo nową dziedzinę zainteresowań w naukach o roślinach. Ze względu na swoją hydrofobową naturę lipidy występują jedynie w niskich stężeniach i mogą być związane z innymi cząsteczkami w celu ich solubilizacji. Niemniej jednak eksudacja wspomagana przez EDTA umożliwia zebranie wystarczającej ilości materiału do wizualizacji (TLC; Rysunek 6) i identyfikacji (LC-MS; Rysunek 7) lipidów łyka z kilku gatunków roślin. Jak pokazuje rysunek, możliwe jest zidentyfikowanie i rozdzielenie kilku rodzajów lipidów. LC-MS pozwala na identyfikację różnych gatunków lipidów oraz monitorowanie zmian w profilach lipidowych różnych genotypów lub w zależności od zastosowanych zabiegów. Umożliwia to badanie roli lipidów podczas rozwoju roślin i reakcji na stres.
<img alt="Schemat analizy metabolitów liści; ekstrakcja; system chromatografii rozdziału faz; GC-MS, TLC, LC-MS." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig1.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat blokowy zbierania eksudatów łyka Arabidopsis lub Perilla. Różne ścieżki prowadzą do różnych produktów końcowych, które zaznaczono na niebiesko. Do przygotowania RNA do wody, do której zbierany jest eksudat łyka, dodaje się inhibitor RNAzy (100 U/ml, Roche). 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz</a>.
<img alt="Zestaw do rozmnażania roślin z narzędziami do cięcia, rękawiczkami, szalką Petriego i butelką z wodą do eksperymentu." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig2.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Przygotowanie materiałów do pobierania eksudatów łyka. Zestaw zawiera wszystkie materiały niezbędne do wykonania kroków protokołu od 3.1 do 3.4. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Obraz żelu SDS-PAGE pokazujący markery masy cząsteczkowej białek. Elektroforetyczna separacja białek." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig3.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Białka występujące w eksudatach łyka dwóch różnych gatunków roślin, Arabidopsis (A.t.) i Perilla (I i NI; różne długości dnia); MW: marker masy cząsteczkowej (ścieżka 2). Białka rozdzielono przy użyciu gradientowego żelu SDS-PAGE 10-20%. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Wynik elektroforezy żelowej pokazujący prążki RbcS, RbcL i UBC; rozdział DNA, wizualizacja prążków." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig4.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Analiza obecności mRNA dla małej i dużej podjednostki Rubisco (odpowiednio RbcS i RbcL) oraz enzymu konjugującego ubikwitynę (UBC). mRNA pobrano z liści (L), ogonków liściowych (P) i eksudatów łyka (Ph) Arabidopsis, poddano odwrotnej transkrypcji, a specyficzne transkrypty zwizualizowano za pomocą PCR. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Guelette et al.14. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Wykres chromatograficzny; rozdzielanie cukrów; cztery panele (A-D); intensywność względem czasu; fruktoza, glukoza, sacharoza." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig5.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Profil GC-MS eksudatów łyka zbieranych przez różne przedziały czasu. Zwróć uwagę, jak zmienia się względna ilość sacharozy od 1 godziny zbierania (A) do 5 godzin czasu zbierania (B). Profil eksudatu po zbieraniu przez 1 godzinę, a następnie „inkubacji” w temperaturze pokojowej (RT) przez cztery godziny (C). Profil metabolitów liścia (D). 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig5highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Wyniki cienkowarstwowej chromatografii (TLC) rozdziału lipidów w próbkach Perilla i Arabidopsis." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig6.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Chromatogram cienkowarstwowy porównujący lipidy z liści i wysięków łyka Perilla (lewo) oraz Arabidopsis (prawo). Gwiazdki wskazują lipidy specyficzne dla wysięków łyka. DGDG: digalaktosylodiacyloglicerol; PG: fosfatydyloglicerol; MGDG: monogalaktosylodiacyloglicerol; Część ryciny przedstawiająca lipidy Arabidopsis została zmodyfikowana na podstawie pracy Guelette et al.14. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig6highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Wykres chromatograficzny przedstawiający intensywność piku w funkcji czasu, z zaznaczonymi kluczowymi czasami retencji." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig7.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Profil lipidowy wysięków łyka Arabidopsis (faza chloroformowa) z wykorzystaniem LC-MS/ w trybie jonów ujemnych. Wykresy u góry (mutant, A) i na dole (typ dziki, B) pokazują różnice w profilach lipidowych między dwoma różnymi genotypami (wskazane strzałkami). 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig7highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.

Znajomość składu soku łyka, jak również mechanizmu jego ładowania i transportu na duże odległości jest niezbędna do zrozumienia długodystansowej sygnalizacji w rozwoju roślin i odpowiedzi na stres/patogen oraz transportu asymilacyjnego. Niniejszy manuskrypt opisuje pobieranie wysięków łyka przy użyciu metody wspomaganej przez EDTA.

Pobieranie i analiza wysięków łyka Arabidopsis przy użyciu metody wspomaganej przez EDTA

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

Ogólnym celem tej procedury jest pobranie eksudatu łykowca z Arabidopsis lub innych roślin w celu analizy jego zawartości lub potwierdzenia obecności związków w strumieniu łykowca. Osiąga się to poprzez uprzednie odcięcie i inkubację płatka w EDTA potasu, aby zapobiec zamykaniu się elementów sitowych. Drugim krokiem jest dokładne wypłukanie płatka w celu usunięcia pozostałości EDTA, które mogą zakłócić późniejszą analizę oraz uszkodzić komórki podczas długotrwałej ekspozycji.Następnie eksudaty EM przepływowe są zbierane do wody. Ostatnim krokiem jest przygotowanie próbek do dalszej analizy za pomocą L-C-M-S-G-C-M-S, elektroforezy żelowej oraz chromatografii cienkowarstwowej. W efekcie wspomagana przez EDTA eksudacja phem może być wykorzystana do analizy i potwierdzenia zawartości phem, takiej jak metabolity i lipidy, białka lub RNA.Rośliny nie mogą uniknąć niesprzyjających warunków. W konsekwencji wymagają one bardzo wydajnych i szybkich systemów przekazywania sygnałów środowiskowych w całej roślinie oraz reagowania poprzez zmianę rozwoju. Jednym z takich szlaków sygnałowych jest przepływ w roślinie, którego skład jest dość złożony do zrozumienia.W celu pobierania i analizy zawartości pławu stosujemy metodę sedacji przepływowej wspomaganej przez EDTA. Została ona opracowana pierwotnie dla gatunku Perilla przez Kinga i współpracowników, lecz może zostać łatwo zmodyfikowana dla innych gatunków. Procedurę zaprezentują Elena i US, oboje studenci studiów licencjackich z mojego laboratorium, przed rozpoczęciem tego procesu.Hodować rośliny Arabidopsis przez cztery do sześciu tygodni w komorach wzrostowych z 12-godzinnym fotoperiodem do dnia zbioru. Rozcieńczyć wcześniej przygotowany 100 milimolarny roztwór EDTA potasu wodą, aby uzyskać stężenie końcowe 20 milimolarne. Następnie napełnić do połowy dwie szklane płytki o średnicy od 7 do 15 centymetrów 20 milimolarnym roztworem EDTA potasu.Po zakończeniu napełnić probówki reakcyjne o objętości 1,7 ml ilością 1,4 ml 20 mM roztworu EDTA potasu. Następnie napełnić taką samą liczbę probówek reakcyjnych ilością 1,4 ml wody z systemu Millipore. Po wyjęciu roślin w wieku od czterech do sześciu tygodni z komór wzrostowych, zebrać liście rozety, odcinając je żyletką u podstawy płatka blisko centrum rozety.Natychmiast umieść liście w naczyniach zawierających 20 mM EDTA potasu, tak aby odcięty koniec liści był zanurzony w roztworze. Po zebraniu 15 liści z trzech do czterech roślin, delikatnie ułóż je jeden na drugim w taki sposób, aby odcięte końce liści były ze sobą wyrównane. Ponownie odetnij podstawy liści i delikatnie je zwiń.Następnie ostrożnie włóż zwinięte liście do jednej z probórek reakcyjnych zawierających 20 millimolar potasowego EDTA w celuyzebrania eksudatu. W ciemności wyłóż dno dużego, płytkiego naczynia mokrymi ręcznikami papierowymi. Umieść statyw z probówkami wypełnionymi liśćmi w naczyniu, a następnie włóż go do czarnej plastikowej torby z nacięciami zapewniającymi napowietrzanie.Następnie cały zestaw należy umieścić w komorze do zbierania eksudatów. Dno przezroczystego pojemnika z pleksiglasu należy wyłożyć wilgotnymi ręcznikami papierowymi. Do pojemnika należy wstawić statyw z probówkami zawierającymi liście, a następnie go zamknąć.Po wyjęciu statywu z pojemnika, po upływie jednej godziny, należy wyjąć liście z probówek reakcyjnych. Liście należy dokładnie wypłukać wodą destylowaną, aby usunąć cały EDTA. Następnie należy niezwłocznie przenieść liście do probówek reakcyjnych zawierających wodę z systemu Millipore i umieścić je ponownie w nawilżonych pojemnikach w celu zbierania eksudatów po wyjęciu statywu z nawilżonego pojemnika.Po pięciu do ośmiu godzinach wyjmij liście z probówek, a następnie zamroź wysięki z tkanek w ciekłym azocie i przechowuj je w zamrażarce w temperaturze -80 °C. W celu przeprowadzenia dalszych analiz następnego dnia, rozmroź próbki w przygotowaniu do analizy lipidów. Następnie pobierz od dwóch do trzech próbek i dodaj równą ilość chloroformu oraz metanolu do połączonego roztworu.Mieszaninę wierzgać w vortexie przez kilka sekund. Następnie próbkę wirować przez cztery minuty przy 400 gs. Po zakończeniu procesu zebrać dolną fazę organiczną do szklanej probówki po powtórzeniu rozdziału z górną fazą jeszcze trzy razy, osuszyć połączone fazy organiczne pod strumieniem azotu, a następnie poddać analizie metodą chromatografii cienkowarstwowej oraz LCMS.Metoda ta pozwala na zebranie wystarczającej ilości eksudatów phem w celu identyfikacji białek zlokalizowanych w phem oraz zmian w ich poziomie w odpowiedzi na rozwój lub stres. W niektórych przypadkach badacze mogą chcieć zastosować inhibitory proteinaz, aby zapobiec degradacji białek. Jak pokazano tutaj, białka występują w bardzo niskim stężeniu, jednak ich poziom jest wystarczający do przeprowadzenia kolejnych eksperymentów proteomicznych.Wyniki analizy LCMS lub western blot w przypadku tykwowatych sugerują, że przecięcie łodygi prowadzi do zaburzenia równowagi potencjału wodnego i w konsekwencji do napływu wody oraz możliwych zanieczyszczeń z otoczenia. Jednakże czas pobierania próbek, wynoszący od jednej do ośmiu godzin, nie wpływa na profil i skład białek w soku roślinnym. Ilość pobranych białek oraz wzorce występujących białek różnią się w zależności od gatunku i zastosowanych zabiegów.W rezultacie sygnały białkowe mogą zostać zwizualizowane, zidentyfikowane i śledzone. Za pomocą tej metody w eksudatach z kwiatów można zidentyfikować również mRNA oraz mikroRNA. Konieczne jest jednak zastosowanie inhibitorów RNaz, aby zapobiec degradacji mRNA podczas wydłużonego czasu eksudacji.Ponieważ elementy C nie zawierają funkcjonalnych chloroplastów, mRNA małej lub dużej podjednostki rubis można wykorzystać jako kontrole negatywne, natomiast mRNA zlokalizowane w pH flu m, takie jak enzym konjugujący ubikwitynę, może służyć jako kontrola pozytywna. Podobnie cukry lub małe metabolity można analizować za pomocą GCMS lub LCMS. Należy wspomnieć, że eksudaty phem zawierają liczne funkcjonalne enzymy, w tym niemal cały szlak glikolityczny.W związku z tym zastosowanie kilku punktów czasowych może ujawnić procesy metaboliczne zachodzące podczas zbierania eksudatu. We wszystkich eksudatach najliczniejszym metabolitem jest sacharoza. Jest to najbardziej widoczne po godzinnej kolekcji.Jednak po pięciu godzinach stosunek sacharozy do fruktozy ulega niewielkiemu zmniejszeniu. Jeśli ten sam eksudat jest zbierany przez jedną godzinę, a następnie pozostawiony na blacie przez kolejne cztery godziny, stosunek sacharozy do fruktozy ulega znacznie większej redukcji. Sugeruje to, że aktywne enzymy w eksudatach phem prowadzą do degradacji sacharozy w temperaturze pokojowej.Ponadto fakt, że ciągłe zbieranie przez pięć godzin wykazuje jedynie niewielki spadek stosunku sacharozy do fruktozy, jest zgodny z odkryciami, że ładowanie do floemu i transport cząsteczek z komórek towarzyszących do elementów sitowych może trwać podczas eksudacji, aż do momentu utraty żywotności układu. Lipidy w eksudatach floemowych, a co za tym idzie, długodystansowe sygnalizowanie lipidowe, stanowią stosunkowo nową dziedzinę zainteresowań w naukach o roślinach. Ze względu na swoją hydrofobową naturę lipidy występują jedynie w niskich stężeniach i mogą być związane z innymi cząsteczkami w celu ich solubilizacji.Niemniej jednak wysięk wspomagany przez EDTA pozwala na zebranie wystarczającej ilości materiału do wizualizacji i identyfikacji przepływu oraz lipidów z kilku gatunków roślin. Jak tutaj pokazano, możliwe jest rozdzielenie kilku rodzajów lipidów za pomocą chromatografii cienkowarstwowej. LCMS pozwala zidentyfikować różne rodzaje lipidów i monitorować zmiany w profilach lipidowych różnych genotypów lub w zależności od zastosowanych zabiegów.Umożliwia to badanie roli lipidów podczas rozwoju roślin i odpowiedzi na stres. Po opanowaniu techniki ta może zostać przeprowadzona w czasie tak krótkim jak trzy godziny, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Jednak w przypadku większości próbek sugerujemy czas pobierania od pięciu do ośmiu godzin.W tym przypadku zaleca się rozpoczęcie zbioru liści wczesnym rankiem. Procedurę tę można zmodyfikować dla innych roślin, co może doprowadzić do odkrycia lub potwierdzenia nowych związków lotnych. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby uważnie monitorować PDL po pierwszej godzinie w celu usunięcia EDTA oraz nie ściskać liści, aby zapobiec zanieczyszczeniu zawartością innych komórek.Ponadto noszenie rękawiczek chroni próbki przed zanieczyszczeniami, które mogłyby zostać przeniesione ze skóry. Aby zapobiec kontaminacji, należy zastosować odpowiednie kontrole dla próbek białek, RNA lub metabolitów. Sugerowane kontrole wymieniono w protokole tekstowym. Metoda ta pozwoliła nam uzyskać nową wiedzę na temat składu przepływu roślinnego.Zdołaliśmy zidentyfikować w wysięku z formy kilka lipidów, których nie spodziewano się w wodnym środowisku dna. Skłoniło to nas oraz innych badaczy do wprowadzenia koncepcji dalekosiężnego sygnalizowania lipidowego, co przekształciło się obecnie w fascynującą, nową dziedzinę badań nad implantami.

collection-analysis-arabidopsis-phloem-exudates-using-edta

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zbieranie i analiza Arabidopsis eksudatów floemu przy użyciu metody ułatwiającej EDTA

Molekularne podstawy przestrzennie specyficznych odpowiedzi fitochromów są badane z wykorzystaniem roślin transgenicznych wykazujących deficyty fitochromów specyficzne dla tkanek i organów. W celu zidentyfikowania genów zaangażowanych w przestrzennie specyficzne odpowiedzi fitochromów stosuje się izolację konkretnych komórek wykazujących indukowane wyczerpanie chromoforu fitochromu za pomocą sortowania komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a następnie analizy mikromacierzy.

Badanie odpowiedzi fitochromów specyficznych dla tkanek i organów z wykorzystaniem profilowania ekspresji specyficznej dla typów komórek wspomaganego przez FACS u Arabidopsis thaliana

Metoda otrzymywania protoplastów z liści Arabidopsis kompatybilna z fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS), umożliwiająca badania specyficznych populacji komórkowych. Metoda ta jest zgodna z każdą linią Arabidopsis wykazującą ekspresję GFP w podzbiorze komórek.

Analiza specyficzna dla komórek liści Arabidopsis z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Tutaj opisujemy solidną metodę frakcjonowania błon plazmatycznych roślin na membrany odporne na detergenty i rozpuszczalne w detergentach, oparte na mieszaninie nieznakowanych i in vivo w pełni znakowanych 15N kultur komórkowych Arabidopsis thaliana. Procedura jest stosowana do porównawczych badań proteomicznych w celu zrozumienia procesów sygnalizacyjnych.

Znakowanie metaboliczne i frakcjonowanie błonowe do porównawczej analizy proteomicznej hodowli zawiesinowych komórek Arabidopsis thaliana

Krystaliczna celuloza jest ważnym składnikiem ściany komórkowej roślin. Jednak jego kwantyfikacja w rozdzielczości komórkowej jest technicznie trudna.  W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie technologii światła spolaryzowanego i przekrojów korzeniowych w celu uzyskania informacji o składzie ściany komórkowej w rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Kwantyfikacja w wysokiej rozdzielczości akumulacji krystalicznej celulozy w korzeniach rzodkiewnika w celu monitorowania specyficznych tkankowo modyfikacji ściany komórkowej

Zegar okołodobowy reguluje około jednej trzeciej transkryptomu Arabidopsis, ale procent genów, które wracają do pomiaru czasu, pozostaje nieznany. Tutaj wizualizujemy metodę szybkiej oceny fenotypów okołodobowych w dowolnej zmutowanej linii Arabidopsis przy użyciu obrazowania luminescencyjnego reportera okołodobowego przejściowo ulegającego ekspresji w protoplastach.

Szybka analiza fenotypów okołodobowych w protoplastach Arabidopsis transfekowanych zegarem luminescencyjnym

Tutaj prezentujemy protokół do analizy składu białkowego dużych natywnych kompleksów białko:białko i białko:kwasy nukleinowe z łyka rzepakowego (B. napus) przy użyciu metody elektroforezy 3D w żelu poliakrylamidowym (PAGE) łączącej niebieski natywny (BN) z dwoma denaturującymi PAGE, a następnie identyfikacją spektrometryczną mas.

Pobieranie próbek soku łyka z Brassica napus do 3D-PAGE kompleksów białkowych i rybonukleoproteinowych

Przedstawiamy protokół szybkiego badania próbek środowiskowych pod kątem potencjału sideroforu, przyczyniającego się do biodostępności i obrotu mikroelementów w systemach lądowych.

Wysokoprzepustowe przesiewanie sideroforów z próbek środowiskowych: tkanek roślinnych, gleb masowych i gleb ryzosferowych

Przedstawione tutaj jest podejście fosfoproteomiczne, a mianowicie fosfoproteomiczne oparte na końcówce do ekstrakcji stop and go, które zapewnia wysoką przepustowość i głębokie pokrycie fosfoproteomu Arabidopsis. Podejście to wyznacza przegląd sygnalizacji stresu osmotycznego u Arabidopsis.

Fosfoproteomiczna strategia profilowania sygnalizacji stresu osmotycznego u rzodkiewnika

Wydzielanie wysięków z korzeni jest zazwyczaj zewnętrzną strategią detoksykacji roślin w warunkach stresu. Protokół ten opisuje, w jaki sposób można ocenić wpływ ksenobiotyków na lucernę za pomocą niecelowanej analizy metabolomicznej.

Pobieranie wysięków z korzenia lucerny w celu zbadania wpływu ftalanu di(2-etyloheksylu) na produkcję metabolitów

Ulepszona metoda pomiaru profili nawodnienia pyłku u Arabidopsis thaliana jest opisana tutaj. Nowa metoda oferuje wyższą rozdzielczość, jest nieinwazyjna i wysoce odtwarzalna. Protokół stanowi nowe narzędzie do dokładniejszej analizy procesów regulujących wczesne etapy zapylania.

Jednoziarnisty test biologiczny uwodnienia pyłku in vivo o wysokiej rozdzielczości dla Arabidopsis thaliana

Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z liści Arabidopsis thaliana , wspierającą dalsze analizy molekularne i funkcjonalne.

Izolacja i oczyszczanie zewnętrznych pęcherzyków roślinnych z liści Arabidopsis przy użyciu zoptymalizowanej metody zbierania apoplastów

Poznaj metodę pobierania wysięków łyka z Arabidopsis wspomaganą przez EDTA. Technika ta umożliwia analizę metabolitów, białek i RNA w badaniach sygnałowania roślinnego.

Pobieranie i analiza wysięków łyka Arabidopsis przy użyciu metody wspomaganej przez EDTA

Przeglądaj więcej filmów