Name: Konstrukcja i działanie komory do ciągłego znakowania izotopami 13C i 15N do jednorodnego lub różnicowego, metabolicznego i strukturalnego znakowania izotopów roślinnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-16T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Poznaj metodę ciągłego znakowania izotopami 13C i 15N w komorze do uprawy roślin. Technika umożliwia jednorodne lub różnicowe oznaczanie tkanek metabolicznych i strukturalnych w badaniach biogeochemicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Specjalne podziękowania dla Plant Growth Facility i analitycznego centrum EcoCore na Uniwersytecie Stanowym Kolorado oraz dla wielu studentów i nauczycieli, którzy pomogli przy tym projekcie. Praca ta jest finansowana przez grant NSF DEB #0918482, USDA National Needs Fellowship oraz fundusz Cotrufo-Hoppess na badania nad ekologią gleby.

1. Budowa komory
<ol>
	<li>Zbuduj komorę etykietowania w szklarni, aby zapewnić maksymalny potencjał naturalnego światła do wzrostu roślin. Upewnij się, że dostępne jest odpowiednie zasilanie do zasilania wszystkich elementów komory.</li>
	<li>Zbuduj komorę etykietowania, montując przezroczyste ścianki akrylowe o grubości 3,175 mm (odpowiedni byłby również poliwęglan) i przezroczysty sufit akrylowy o grubości 6,35 mm na aluminiowej ramie z pomalowaną na biało stalową podłogą, aby zmaksymalizować współczynnik odbicia promieni słonecznych. Wymiary komory mogą być dostosowane do indywidualnych potrzeb badawczych.</li>
	<li>Zamontuj komorę na sklejce 3/4 cala (19 mm) na blokach żużlowych.</li>
	<li>Wywierć otwory w szkle akrylowym, aluminiowej ramie i stalowej podłodze i użyj, aby połączyć ze sobą wszystkie elementy.</li>
	<li>Uszczelnij wszystkie szwy silikonową uszczelką, aby zapewnić hermetyczne uszczelnienie.</li>
	<li>Zbuduj drzwi, montując jedną część paneli akrylowej na długich, które można przykręcić za pomocą zdejmowanych nakrętek motylkowych.</li>
	<li>Uszczelnij drzwi listwą uszczelniającą, aby zapobiec wyciekom powietrza.</li>
	<li>Wybierz obszar bezpośrednio przylegający do komory jako centrum sterowania, aby zamontować wszystkie urządzenia sterujące temperaturą, wilgotnością, CO2 i monitorujące.</li>
	<li>Ostrożnie wywierć małe otwory w ścianie komory przylegającej do centrum sterowania na wszystkie przewody elektryczne i przewody gazowe. Użyj silikonowej uszczelki, aby uszczelnić otwory wokół wszystkich przewodów i rurek, aby zapobiec wyciekom powietrza.</li>
	<li>Przetestuj komorę pod kątem wycieków powietrza, napełniając ją wysokim poziomem CO2 (np. 800 ppm) i pozostawiając na noc. Jeśli stężenie CO2 w komorze jest utrzymywane na pierwotnym poziomie, oznacza to, że jest ona szczelna. Jeśli stężenie spadnie z dnia na dzień, wszystkie szwy należy zbadać i ponownie uszczelnić silikonową uszczelką, aż do uzyskania hermetycznego uszczelnienia.</li>
	<li>W przypadku niektórych roślin przystosowanych do warunków silnego oświetlenia należy dodać światła podłączone do zegara na bezpośredniej zewnątrz komory, aby zwiększyć penetrację światła i produktywność roślin.</li>
</ol>
2. Kontrola temperatury i wilgotności
<ol>
	<li>Reguluj temperaturę w komorze, instalując komercyjny klimatyzator typu split z wężownicami chłodzącymi (parownika) umieszczonymi wewnątrz komory oraz wężownicami sprężarki i skraplacza umieszczonymi na zewnątrz szklarni w celu odprowadzania ciepła. Ustaw klimatyzator tak, aby utrzymywał żądaną temperaturę.</li>
	<li>Użyj małego osuszacza pokojowego, aby kontrolować wilgotność w komorze.
	<ol>
		<li>Wywierć otwór drenażowy w podłodze komory przylegającej do osuszacza.</li>
		<li>Wyjmij kolektor kondensatu z osuszacza i podłącz rurkę odpływową z osuszacza przez otwór odpływowy w podłodze komory.</li>
		<li>Pod komorą umieść otwarty słoik wypełniony wodą, do której osuszacz będzie mógł spłynąć bezpośrednio. Tworzy to hermetyczne uszczelnienie, ale także pozwala na wyrównanie ciśnienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zainstaluj sterownik, taki jak sterownik Omega iSeries, w centrum sterowania z czujnikiem wilgotności wewnątrz komory.
	<ol>
		<li>Podłącz sterownik do systemu osuszania za pomocą przekaźnika półprzewodnikowego i ustaw regulator wilgotności z wysokim alarmem i huśtawką, aby utrzymać optymalne warunki wzrostu w komorze. Optymalne warunki temperatury i wilgotności będą się różnić dla różnych gatunków roślin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kontrole CO2
<ol>
	<li>Wzbogacenie 13C-CO2 uzyskuje się przy użyciu dwóch zbiorników czystego gazu CO2 , jednego o stężeniu 10 atomów%13C-CO2 lub wyższym, a drugiego o zawartości 1,1 atomu%13C-CO2 (naturalna obfitość).</li>
	<li>Monitorowanie stężenia CO2 polega na tym, że pompa membranowa w sposób ciągły zasysa powietrze z komory przez analizator gazów w podczerwieni (IRGA), a następnie pompuje powietrze z powrotem do komory, utrzymując w ten sposób zamknięty system (rysunek 1).</li>
	<li>Ustaw niski alarm i martwą strefę w oprogramowaniu IRGA, aby utrzymać stężenie CO2 w żądanym zakresie. W tym przypadku używamy niskiego alarmu 360 ppm ze strefą martwą 40 ppm, aby utrzymać stężenie CO2 w zakresie 360-400 ppm.</li>
	<li>Podłącz zawór dozujący do każdego zbiornika i ostrożnie je wyreguluj, aby osiągnąć docelowy poziom wzbogacenia 13C. Ustaw regulatory zbiornika na 20 psi.</li>
	<li>Włóż zawór elektromagnetyczny między zawór dozujący a regulator każdego zbiornika. Połącz ze sobą wyloty dwóch zaworów dozujących i doprowadź je do środka komory. Podłącz przekaźnik półprzewodnikowy do wyjścia IRGA, aby sterować zaworami elektromagnetycznymi (rysunek 1).</li>
</ol>
4. Internetowy system zdalnego monitorowania
<ol>
	<li>Monitoruj stężenia CO2 z oprogramowania IRGA, logując je do lokalnego pliku raz na 30 sekund.</li>
	<li>Utwórz niestandardowe narzędzie (np. w perlu lub innym języku programowania), aby pobrać wpisy z lokalnego pliku rejestrowania CO2 wraz z aktualnym znacznikiem czasu laptopa i przesłać je do aplikacji internetowej zaplecza.</li>
	<li>Ustaw aplikację internetową tak, aby wysyłała zapytania dotyczące danych czujnika temperatury i wilgotności.</li>
	<li>Użyj systemu monitorowania, aby sprawdzać stan temperatury w komorze co pięć minut, aby zapobiec potencjalnym skokom temperatury, które zniszczyłyby rośliny w przypadku awarii systemu klimatyzacji.</li>
	<li>Monitoruj dane dotycząceCO2, temperatury i wilgotności w dowolnej standardowej przeglądarce internetowej, aby wszelkie nieoczekiwane skoki temperatury lub spadki CO2 mogły być natychmiast zareagowane.</li>
</ol>
5. System nawadniania
<ol>
	<li>Wywierć jeden mały otwór w ścianie komory ze szkła akrylowego na garnek.</li>
	<li>Użyj rurki irygacyjnej, aby utworzyć jeden pierścień do nawadniania kropelkowego na doniczkę i przeprowadź rurkę irygacyjną przez ścianę komory na zewnątrz.</li>
	<li>Uszczelnij otwory wokół rurki irygacyjnej silikonową uszczelką, aby zapobiec wyciekom powietrza.</li>
	<li>Na zewnątrz komory podłącz rurkę irygacyjną do rurki pompy perystaltycznej.</li>
	<li>Użyj małego węża clamp, aby zamknąć wszystkie rurki irygacyjne, aby zapobiec wyciekowi powietrza między podlewaniem.</li>
</ol>
6. Rośliny doniczkowe
<ol>
	<li>Wybierz rozmiar doniczki odpowiedni dla uprawianych roślin. Tutaj używane są doniczki o pojemności 40, 15 litrów.</li>
	<li>Stwórz wolną od gleby mieszankę doniczkową, mieszając piasek, wermikulit i profilowaną porowatą ceramikę.</li>
	<li>Przetestuj zdolność zatrzymywania wody w mieszance doniczkowej, ważąc napełniony garnek do sucha, mocząc garnek w wodzie i pozwalając mu całkowicie spłynąć, a następnie ważąc garnek mokry. Użyj tej maksymalnej zdolności zatrzymywania wody, aby upewnić się, że nadmiar oznakowanego nawozu i wody nie wycieknie z doniczek podczas podlewania.</li>
	<li>Kiełkuj nasiona w ziemi doniczkowej przed posadzeniem ich w doniczkach. Gwarantuje to, że w komorze etykietowania umieszczane są tylko pomyślnie wykiełkowane nasiona.</li>
	<li>Zaszczep sadzonki świeżą gnojowicą glebową, aby wprowadzić pożyteczne mikroorganizmy.</li>
	<li>Gdy nasiona wykiełkują, ostrożnie przeszczep sadzonki do doniczek w żądanej liczbie.</li>
	<li>Po posadzeniu w doniczce przenieś doniczki do komory i zmontuj każdą doniczkę za pomocą indywidualnego węża do nawadniania.</li>
</ol>
7. Uszczelnienie komory
<ol>
	<li>Podczas pierwszego uszczelnienia drzwi do komory, przestrzeń komory wypełnia duża masa powietrza zewnętrznego. Usuń ten zewnętrzny CO2 , podłączając płuczkę sodowo-wapniową do pompy powietrza, aby szorować stężenie CO2 do co najmniej 200-250 ppm przed ponownym napełnieniem komory do 400 ppm za pomocą mieszaniny zbiornika 13C-CO2.</li>
	<li>Staraj się, aby komora była zamknięta przez cały okres wegetacji, aby zminimalizować naturalne zanieczyszczenie CO2 w obfitości.</li>
	<li>Monitoruj wizualnie wzrost roślin i dostosuj nawożenie i nawadnianie do zapotrzebowania.</li>
</ol>
8. Nawożenie i nawadnianie
<ol>
	<li>Użyj roztworu nawozu, takiego jak zmodyfikowany roztwór Hoaglanda23, aby nawozić rośliny przez system nawadniania.</li>
	<li>Oznaczyć nawóz 15N, stosując podroztwór 15N-KNO3 na docelowym poziomie atomu%15N, mieszając 98 atomów%15N-KNO3z naturalną obfitością 15N-KNO3 (0,37 atomu%15N).</li>
	<li>Wymieszaj wystarczającą ilość roztworu nawozu przy każdym nawożeniu dla całej komory, w oparciu o zdolność zatrzymywania wody przez mieszankę doniczkową. Umieść odpowiednią ilość nawozu na jedną doniczkę w szklanym słoiku i przygotuj tyle słoików, ile jest doniczek.</li>
	<li>Odkręć węże irygacyjne i umieść każdy z nich w słoiku z roztworem nawozu, a następnie podłącz je do pompy perystaltycznej.</li>
	<li>Podlewaj rośliny, pompując wodę przez pompę perystaltyczną przez poszczególne węże do nawadniania kropelkowego regularnie, gdy rośliny tego potrzebują.</li>
	<li>Nawożenie roztworem Hoaglanda powinno być zgodne z zapotrzebowaniem roślin lub projektem eksperymentalnym, przy rosnącym zapotrzebowaniu na składniki odżywcze wraz ze wzrostem produktywności roślin, aby zmaksymalizować produktywność.</li>
	<li>Najpierw przepompuj roztwór Hoaglanda przez wąż irygacyjny, a następnie przepompuj przez niego płukanie wodą, aby zminimalizować rozwój glonów i bakterii w rurkach.</li>
	<li>Ponownie zamocuj wszystkie węże po nawożeniu i nawadnianiu, aby wyeliminować wyciek powietrza z komory.</li>
</ol>
9. Etykietowanie jednolite i zróżnicowane
<ol>
	<li>W celu zróżnicowanego znakowania składników strukturalnych i metabolicznych należy wyjąć rośliny z komory etykietowania 1-3 tygodnie przed zbiorem. Rośliny, które mają być równomiernie oznakowane, mogą pozostać w szczelnie zamkniętej komorze etykietowania w sposób ciągły aż do zbiorów i być nawadniane roztworem 15N-Hoaglanda.</li>
	W <li>tym czasie należy przechowywać usunięte rośliny w szklarni, aby otrzymywały odpowiednią ilość światła i CO2 przy naturalnej obfitości 13C.</li>
	<li>W przypadku różnicowego oznaczania 15N należy kontynuować nawożenie i nawadnianie roślin jak zwykle, ale należy użyć naturalnej obfitości 15N-KNO3 w roztworze nawozu Hoaglanda.</li>
</ol>
10. Żniwa
<ol>
	<li>Przestań podlewać rośliny na 1 tydzień przed zbiorami, aby rośliny zaczęły starzeć się, a podłoże doniczkowe wyschło.</li>
	<li>Otwórz komorę i wyjmij doniczki w celu natychmiastowego strzyżenia i zbioru biomasy nadziemnej</li>
	<li>Wylej mieszankę doniczkową i korzenie na grube sito.</li>
	<li>Użyj sitka, aby oddzielić korzenie od mieszanki doniczkowej i potrząśnij korzeniami z mieszanki doniczkowej.</li>
	<li>Umieść korzenie na sitku o średnicy 2 mm i opłucz je wodą, aby usunąć pozostały materiał doniczkowy. Użyj pęsety, aby usunąć wermikulit, który może przylegać do korzeni</li>.
	<li>Pozostaw korzenie do wyschnięcia na powietrzu w ramach przygotowań do przyszłych eksperymentów.</li>
</ol>
11. Chemia ściółki
<ol>
	<li>Zważyć powietrznie suchy materiał roślinny, aby określić biomasę w komorze etykietowania.</li>
	<li>Zmielić podpróbkę do analizy chemicznej.</li>
	<li>Umieścić 2,0 g ściółki wysuszonej w piekarniku (60 °C) w 125 ml kolbie przemytej kwasem i dodać 50 ml wody dejonizowanej.</li>
	<li>Umieścić próbkę na podgrzanej (60 °C) płycie mieszadła i umieścić mieszadło w kolbie. Ustawić mieszanie na 200 obr./min i pozostawić próbkę do ogrzewania przez 30 minut.</li>
	<li>Po 30 minutach przefiltruj roztwór ściółki przez siatkę nylonową o grubości 20 μm w systemie filtracji próżniowej.</li>
	<li>Przenieś ekstrakt do wstępnie zważonej probówki przemytej kwasem i zamroź.</li>
	<li>Przenieść resztki ściółki na wstępnie zważoną aluminiową miskę i wysuszyć w temperaturze 60 °C. Po wysuszeniu zważyć miskę i ściółkę w celu określenia masy pozostałości gorącej wody.</li>
	<li>Liofilizować ekstrakt z gorącej wody i zważyć, aby określić masę ekstraktu z gorącej wody.</li>
	<li>Analizuj ściółkę suszoną w piecu (60 °C), liofilizowany ekstrakt z gorącej wody i pozostałości gorącej wody suszonej w piekarniku w spektrometrze mas analizatora elementarnego - stosunek izotopów (EA-IRMS).</li>
</ol>

<ol><li>Bird, J. A., Torn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+roots+vs.+Needles%3A+A+comparison+of+%2813%29C+and+%2815%29N+dynamics+in+a+ponderosa+pine+forest+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeochemistry%22%5BJournal%5D)">Fine roots vs. Needles: A comparison of (13)C and (15)N dynamics in a ponderosa pine forest soil.</a> Biogeochemistry. 79, 361-382 (2006).</li>
<li>Bird, J. A., van Kessel, C., Horwath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+C-13-carbon+and+immobilization+of+N-15-nitrogen+from+rice+straw+in+humic+fractions%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Sci.+Soc.+Am.+J%22%5BJournal%5D)">Stabilization of C-13-carbon and immobilization of N-15-nitrogen from rice straw in humic fractions.</a> Soil Sci. Soc. Am. J. 67, 806-816 (2003).</li>
<li>Denef, K., Six, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+incorporated+residue+and+living+roots+to+aggregate-associated+and+microbial+carbon+in+two+soils+with+different+clay+mineralogy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Soil+Sci%22%5BJournal%5D)">Contributions of incorporated residue and living roots to aggregate-associated and microbial carbon in two soils with different clay mineralogy.</a> Eur. J. Soil Sci. 57, 774-786 (2006).</li>
<li>Rubino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+input+belowground+is+the+major+C+flux+contributing+to+leaf+litter+mass+loss%3A+Evidences+from+a+C-13+labelled-leaf+litter+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Carbon input belowground is the major C flux contributing to leaf litter mass loss: Evidences from a C-13 labelled-leaf litter experiment.</a> Soil Biol. Biochem. 42, 1009-1016 (2010).</li>
<li>Cotrufo, M. F., Wallenstein, M. D., Boot, C. M., Denef, K., Paul, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Microbial+Efficiency-Matrix+Stabilization+%28MEMS%29+framework+integrates+plant+litter+decomposition+with+soil+organic+matter+stabilization%3A+do+labile+plant+inputs+form+stable+soil+organic+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Glob.+Change+Biol%22%5BJournal%5D)">The Microbial Efficiency-Matrix Stabilization (MEMS) framework integrates plant litter decomposition with soil organic matter stabilization: do labile plant inputs form stable soil organic matter.</a> Glob. Change Biol. 19, 988-995 (2013).</li>
<li>Mambelli, S., Bird, J. A., Gleixner, G., Dawson, T. E., Torn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+contribution+of+foliar+and+fine+root+pine+litter+to+the+molecular+composition+of+soil+organic+matter+after+in+situ+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Geochem%22%5BJournal%5D)">Relative contribution of foliar and fine root pine litter to the molecular composition of soil organic matter after in situ degradation.</a> Org. Geochem. 42, 1099-1108 (2011).</li>
<li>Prescott, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Litter+decomposition%3A+what+controls+it+and+how+can+we+alter+it+to+sequester+more+carbon+in+forest+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeochemistry%22%5BJournal%5D)">Litter decomposition: what controls it and how can we alter it to sequester more carbon in forest soils.</a> Biogeochemistry. 101, 133-149 (2010).</li>
<li>Denef, K., Roobroeck, D., Wadu, M., Lootens, P., Boeckx, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+community+composition+and+rhizodeposit-carbon+assimilation+in+differently+managed+temperate+grassland+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microbial community composition and rhizodeposit-carbon assimilation in differently managed temperate grassland soils.</a> Soil Biol. Biochem. 41, 144-153 (2009).</li>
<li>Bird, J. A., Kleber, M., Torn, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-13+and+N-15+stabilization+dynamics+in+soil+organic+matter+fractions+during+needle+and+fine+root+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Geochem%22%5BJournal%5D)">C-13 and N-15 stabilization dynamics in soil organic matter fractions during needle and fine root decomposition.</a> Org. Geochem. 39, 465-477 (2008).</li>
<li>Andresen, L. C., Jonasson, S., Strom, L., Michelsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+of+pulse+injected+nitrogen+by+soil+microbes+and+mycorrhizal+and+non-mycorrhizal+plants+in+a+species-diverse+subarctic+heath+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Soil%22%5BJournal%5D)">Uptake of pulse injected nitrogen by soil microbes and mycorrhizal and non-mycorrhizal plants in a species-diverse subarctic heath ecosystem.</a> Plant Soil. 313, 283-295 (2008).</li>
<li>Horwath, W. R., Pregitzer, K. S., Paul, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-14+Allocation+in+tree+soil+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Tree+Physiol%22%5BJournal%5D)">C-14 Allocation in tree soil systems.</a> Tree Physiol. 14, 1163-1176 (1994).</li>
<li>Denef, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+shifts+and+carbon+translocation+within+metabolically-active+rhizosphere+microorganisms+in+grasslands+under+elevated+CO2%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeosciences%22%5BJournal%5D)">Community shifts and carbon translocation within metabolically-active rhizosphere microorganisms in grasslands under elevated CO2.</a> Biogeosciences. 4, 769-779 (2007).</li>
<li>Pollierer, M. M., Langel, R., Korner, C., Maraun, M., Scheu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+underestimated+importance+of+belowground+carbon+input+for+forest+soil+animal+food+webs%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol.+Lett%22%5BJournal%5D)">The underestimated importance of belowground carbon input for forest soil animal food webs.</a> Ecol. Lett. 10, 729-736 (2007).</li>
<li>Stewart, D. P. C., Metherell, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+%28C-13%29+uptake+and+allocation+in+pasture+plants+following+field+pulse-labelling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Soil%22%5BJournal%5D)">Carbon (C-13) uptake and allocation in pasture plants following field pulse-labelling.</a> Plant Soil. 210, 61-73 (1999).</li>
<li>Santos, F., Torn, M. S., Bird, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+degradation+of+pyrogenic+organic+matter+in+temperate+forest+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Biological degradation of pyrogenic organic matter in temperate forest soils.</a> Soil Biol. Biochem. 51, 115-124 (2012).</li>
<li>Bromand, S., Whalen, J. K., Janzen, H. H., Schjoerring, J. K., Ellert, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pulse-labelling+method+to+generate+13C-+enriched+plant+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Soil%22%5BJournal%5D)">A pulse-labelling method to generate 13C- enriched plant materials.</a> Plant Soil. 235, 253-257 (2001).</li>
<li>Putz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+in+situ-labelling+with+15N+and+13C+of+grassland+plant+species+by+foliar+brushing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Ecol.+Evol%22%5BJournal%5D)">A simple method for in situ-labelling with 15N and 13C of grassland plant species by foliar brushing.</a> Methods Ecol. Evol. 2, 326-332 (2011).</li>
<li>Wichern, F., Mayer, J., Joergensen, R., Müller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+wick+method+for+in+situ+%26lt%3Bsup%26gt%3B13%26lt%3B%2Fsup%26gt%3BC+and+%26lt%3Bsup%26gt%3B15%26lt%3B%2Fsup%26gt%3BN+labelling+of+annual+plants+using+sugar-urea+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Soil%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the wick method for in situ &lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C and &lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N labelling of annual plants using sugar-urea mixtures.</a> Plant Soil. 329, 105-115 (2010).</li>
<li>Fahey, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+Carbon+and+Nitrogen+Between+Litter+and+Soil+Organic+Matter+in+a+Northern+Hardwood+Forest%5BTitle%5D)+AND+%22Ecosystems%22%5BJournal%5D)">Transport of Carbon and Nitrogen Between Litter and Soil Organic Matter in a Northern Hardwood Forest.</a> Ecosystems. 14, 326-340 (2011).</li>
<li>Stewart, C. E., Paustian, K., Conant, R. T., Plante, A. F., Six, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+carbon+saturation%3A+Evaluation+and+corroboration+by+long-term+incubations%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Soil carbon saturation: Evaluation and corroboration by long-term incubations.</a> Soil Biol. Biochem. 40, 1741-1750 (2008).</li>
<li>Fry, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFry%2C+B+%22Stable+Isotope+Ecology%22">Stable Isotope Ecology</a>. , Springer. (2006).</li>
<li>Nippert, J. B., Fay, P. A., Carlisle, J. D., Knapp, A. K., Smith, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecophysiological+responses+of+two+dominant+grasses+to+altered+temperature+and+precipitation+regimes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oecol.+Int.+J.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Ecophysiological responses of two dominant grasses to altered temperature and precipitation regimes.</a> Acta Oecol. Int. J. Ecol. 35, 400-408 (2009).</li>
<li>Hoagland, D. R. aA., I, D. The Water-Culture Method for Growing Plants without Soil. , The College of Agriculture, University of California, Berkeley. Berkeley, CA. (1950).</li>
<li>Lett, M. S., Knapp, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+shrub+expansion+in+mesic+grassland%3A+Resource+alterations+and+graminoid+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Veg.+Sci%22%5BJournal%5D)">Consequences of shrub expansion in mesic grassland: Resource alterations and graminoid responses.</a> J. Veg. Sci. 14, 487-496 (2003).</li>
<li>Knapp, A. K., Seastedt, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detritus+Aaccumulation+limits+productivity+of+tallgrass+prairie%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%22%5BJournal%5D)">Detritus Aaccumulation limits productivity of tallgrass prairie.</a> Bioscience. 36, 662-668 (1986).</li>
<li>Ting, K. C., Giacomelli, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solar+photosynthetically+active+radiation+transmission+through+greenhouse+glazings%5BTitle%5D)+AND+%22Energy+Agric%22%5BJournal%5D)">Solar photosynthetically active radiation transmission through greenhouse glazings.</a> Energy Agric. 6, 121-132 (1987).</li>
<li>McDermitt, D. K., Welles, J. M., Eckles, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Temperature%2C+Pressure+and+Water+Vapor+on+Gas+Phase+Infrared+Absorption+by+CO2%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Effects of Temperature, Pressure and Water Vapor on Gas Phase Infrared Absorption by CO2.</a> , Li-Cor, Inc.. Lincoln, NE. Forthcoming.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ten projekt komory do ciągłego znakowania izotopów został wykorzystany do produkcji jednorodnie i różnicowo znakowanych 13C i 15N A. gerardii do późniejszych eksperymentów terenowych i laboratoryjnych. W ciągu trzech sezonów wegetacyjnych komora z powodzeniem utrzymywała temperaturę, wilgotność i stężenia CO2 w zadanych parametrach (rysunek 2). Niezawodność systemu kontroli temperatury ma kluczowe znaczenie w szczycie lata, kiedy wysokie promieniowanie słoneczne może spowodować przegrzanie szczelnej komory. Wyeliminowanie nadmiernej wilgotności spowodowanej transpiracją z rosnących roślin zapewnia, że aparaty szparkowe roślin pozostają otwarte na pobieranie przez fotosyntezę22 oraz że kondensacja wody nie hamuje przenikania światła ani nie uszkadza struktury komory.
Niemal ciągłe monitorowanie stężenia CO2 przez oprogramowanie IRGA utrzymywało ciągłe znakowanie roślin w temperaturze 13C podczas ich wzrostu w komorze. Ze względu na wysoką aktywność fotosyntetyczną A. gerardii rosnącego w tej komorze, CO2 był często wstrzykiwany do systemu w godzinach dziennych szczytu sezonu wegetacyjnego, kiedy aktywność fotosyntetyczna obniżała stężenie CO2 do 360 ppm, mniej więcej co 15-20 minut. Dozowanie 13zbiorników C-CO 2 o wzbogaconej i naturalnej obfitościpozwoliło na uzyskanie kontrolowanej atmosfery o temperaturze 4,4% 13C przez cały sezon wegetacyjny w celu jednolitego znakowania tkanek roślinnych. 13Produkcję C-CO2 można również osiągnąć przez zmieszanie 13C-wodorowęglanu sodu lub 13C-węglan sodu i kwas solny, jednak ten typ systemu jest bardziej skomplikowany i wymaga więcej monitorowania i konserwacji, dlatego zalecamy stosowanie gazu 13C-CO2 . Ważną kwestią przy monitorowaniu stężeń CO2 za pomocą IRGA jest to, że analizatory podczerwieni tracą dwie trzecie swojej czułości podczas pomiaru 13C-CO2 . To niedoszacowanie o około 2,9% ppm dla naszej mieszaniny 4,4%13C-CO2 nie było dla nas wielkim problemem, ale może stać się bardziej znaczącym problemem przy etykietowaniu przy wyższych poziomach 13C27.
A. gerardii to wieloletni gatunek graminoidów preriowych z ciepłą porą roku. Konstrukcja tej komory została zoptymalizowana pod kątem produkcji A. gerardii (ryc. 1). Wielkość i wysokość komory zostały dobrane z uwzględnieniem maksymalnej produktywności wysokościowej A. gerardii w terenie, a także pożądanej produkcji biomasy roślinnej do przyszłych eksperymentów. Wiadomo, że A. gerardii ma ograniczone światło w polu24,25. PAR w szklarni może być zmniejszony o 30-47% w porównaniu z poziomami zewnętrznymi26. Ponieważ nasze rośliny były uprawiane w komorze ze szkła akrylowego w szklarni, ograniczenie PAR było problemem. Po włączeniu lampy fluorescencyjne zwiększyły PAR w komorze o 9,5%, co mogło przyczynić się do zwiększenia wydajności u tego wrażliwego na światło gatunku. Korzystając z tej konstrukcji komory do uprawy innych rodzajów roślin, specyficzne potrzeby fizjologiczne, takie jak wielkość, oświetlenie, zapotrzebowanie na składniki odżywcze, wrażliwość na temperaturę i wilgotność gleby, powinny być starannie dostosowane, aby utrzymać optymalne warunki wzrostu roślin.
Podczas pracy z drogimi związkami znakowanymi izotopowo, takimi jak 10 atom%13C-CO2 i 98 atom%15N-KNO3, wydajność etykietowania jest ważnym czynnikiem. Ta konstrukcja komory optymalizuje etykietowanie 13C, dokładając wszelkich starań, aby uszczelnić komorę i zminimalizować wyciek powietrza do i z komory. Jeżeli komora ta nigdy nie zostanie otwarta w okresie wegetacji, wówczas żaden z 13C oznaczonych CO2 z komory nie wycieka do atmosfery. Wydaje się, że nagromadzenie CO2 podczas oddychania w nocy nie uszkadza rosnących roślin i jest szybko wchłaniane po wschodzie słońca (ryc. 2). Podczas etykietowania różnicowego komora została na krótko otwarta w celu usunięcia różnie oznakowanych doniczek, ale nie wydaje się, aby to rozcieńczyło docelowe znakowanie 4,4 atomu%13C stale znakowanych roślin (Tabela 1). Etykietowanie 13C zostało również zoptymalizowane poprzez usunięcie początkowego powietrza atmosferycznego uwięzionego w komorze po uszczelnieniu. Podczas wstępnych badań w komorze bez wstępnego szorowania atmosferycznego CO2 zmierzono, że rośliny mają rozcieńczony poziom 13C w pierwszych wytworzonych liściach niż w późniejszych wyprodukowanych liściach. Wydaje się, że początkowe usuwanie atmosferycznego CO2 po zamknięciu komory eliminuje ten problem, umożliwiając ciągłe znakowanie 13C od sadzonki do dojrzałości. Utrzymanie wolnej od gleby mieszanki doniczkowej piasku, wermikulitu i gliny eliminuje również naturalne zanieczyszczenie CO2 spowodowane oddychaniem gleby. Eliminacja gleby z systemu wymaga starannego nawożenia i zaszczepiania, które mogą być unikalne dla różnych gatunków roślin. Znakowanie 15N za pomocą docelowego roztworu 7 atomów%15N Hoeglanda dało wysoce znakowany materiał roślinny o stężeniu 6,7 atomu%15N (Tabela 1). Niewielkie rozcieńczenie w stosunku do docelowej zawartości 15N może być spowodowane pewną naturalną obfitością N w mieszance doniczkowej lub szczepieniem w glebie rodzimej.
Podczas biosyntezy związków dochodzi do naturalnej dyskryminacji 13C (lub 15N) w wyniku frakcjonowania kinetycznego i niestatystycznego rozkładu izotopów w syntetyzowanych związkach. Tak więc w przypadku C produkty wtórne (np. lipidy, związki fenolu) są na ogół zubożone w 13C w porównaniu z produktami początkowymi (węglowodanami). Wydaje się, że ta naturalna dyskryminacja 13C utrzymuje się również wtedy, gdy rośliny są uprawiane w atmosferze wzbogaconej o 13C, co można zaobserwować w niewielkiej różnicy w atomie%13C ekstraktów gorącej wody i pozostałości gorącej wody w jednolicie oznakowanych roślinach (Tabela 1). To naturalne frakcjonowanie kinetyczne jest bardzo małe w porównaniu ze wzbogacaniem i nie wpływa negatywnie na jednorodność etykietowania.
Różnicowe znakowanie strukturalnych i metabolicznych tkanek roślinnych jest nowatorską techniką, która może znaleźć się w zaawansowanych badaniach nad rozkładem ściółki, ekologią mikrobiologiczną i tworzeniem się materii organicznej w glebie. Różnica w 13C i 15N ekstraktów z gorącej wody i pozostałości gorącej wody wskazuje na znaczne rozcieńczenie 13C i 15N w wymywalnych związkach o niskiej masie cząsteczkowej (ekstrakty z gorącej wody) ze strukturalnego materiału roślinnego (pozostałości gorącej wody) po 7, 14 i 22 dniach znakowania różnicowego (P<0,005). To różnicowe znakowanie tkanek roślinnych może być wykorzystane do śledzenia losu składników strukturalnych i metabolicznych oddzielnie w ekosystemie. Etykietowanie różnicowe 13C było bardziej ekstremalne niż etykietowanie różnicowe 15N. Może to wynikać z natychmiastowego rozcieńczenia 13C podczas wyjmowania roślin z atmosfery znakowanej 13C-CO2 , podczas gdy etykieta 15N pozostaje jeszcze przez jakiś czas w mieszance doniczkowej, a rozcieńczenie 15N następuje wolniej. W przypadku bardziej drastycznego różnicowego oznaczania 15N, można rozważyć przepłukanie doniczek wodą przed nawożeniem naturalną obfitością w ostatnich tygodniach wzrostu poza komorą.
Konstrukcja i działanie tego systemu ciągłego znakowania 13C i 15N do jednolitego lub różnicowego, metabolicznego i strukturalnego znakowania tkanek roślinnych zapewnia nowatorską metodę produkcji izotopowo znakowanego materiału roślinnego do zaawansowanych badań. Konstrukcja i szczegóły operacyjne tej komory zostały wybrane do znakowania A. gerardii 4,4 atomem%13C i 7 atom%15N, ale można je dostosować do innych typów roślin i poziomów znakowania izotopów. Opisane tutaj warunki uprawy powinny być dostosowane do wielkości, temperatury, wilgotności, światła, wody i wymagań odżywczych poszczególnych gatunków roślin. Etykietowanie za pomocą 18O lub 2H można również osiągnąć poprzez etykietowanie wody używanej w systemie nawadniania. Opisany tutaj system rozwiązuje wiele problemów związanych z jednolitym i zróżnicowanym etykietowaniem materiału roślinnego w temperaturze 13C. Ten podstawowy projekt komory może być wykorzystany przez inne grupy badawcze do produkcji wysoce znakowanego materiału roślinnego do zaawansowanych badań biogeochemii ekosystemów.

Zrozumienie dynamiki procesów zachodzących między roślinami, glebą i atmosferą jest kluczowe dla dokładnego przewidywania, jak funkcjonują globalne cykle węgla (C) i azotu (N) w obecnych i przyszłych warunkach środowiskowych. Izotopy stabilne są potężnymi narzędziami w badaniach ilościowych obiegu C i N roślina, gleba i atmosfera. Śledzenie rzadkich stabilnych izotopów z materiału roślinnego przez ekosystem dostarcza wrażliwych informacji w badaniach cykli biogeochemicznych, od strumieni CO2 i tworzenia się materii organicznej w glebie po sondowanie biomarkerów stabilnych izotopów na małą skalę, np. 4,8,9. Połączenie znakowania 13C ze znakowaniem 15N lub innymi stabilnymi izotopami, takimi jak 2H lub 18O w tkance roślinnej, zapewnia wysoce wykrywalny, identyfikowalny, a jednocześnie złożony substrat do wykorzystania w sprzężonych badaniach biochemii roślin i gleby. Możliwość jednolitego lub zróżnicowanego znakowania strukturalnego i metabolicznego materiału roślinnego zwiększa możliwości rozwiązywania złożonych pytań dotyczących obiegu C i N w ekosystemach. Korzyści płynące z zastosowania materiału roślinnego znakowanego izotopami w badaniach ilościowych rozliczania C i N zależą jednak od zdolności do wytworzenia materiału znakowanego izotopowo 13C i 15N, który jest znakowany jednolicie lub różnicowo.
Oznaczanie izotopów zostało użyte w badaniach dotyczących asymilacji roślin C i N10, alokacji11 i ryzodowania12. Jednolicie znakowany 13C i 15N materiał roślinny stanowi złożony oznakowany substrat do badań rozkładu ściółki1,4, tworzenia materii organicznej w glebie2,6, emisji CO2 w glebie4, badań sieci troficznej w glebie13 oraz badań czasu przebywania C w glebie2,14. Badania wykorzystujące biowęgiel znakowany 13C z oznakowanego materiału roślinnego zaczynają również ujawniać nowe informacje na temat wcześniej pomijanych basenów z węglem glebowym15. Podczas gdy znakowanie 15N, 2H i 18O jest stosunkowo łatwe do osiągnięcia poprzez uzdatnianie wody i nawozów, wyzwaniem jest produkcja jednorodnie znakowanego 13C materiału roślinnego poprzez wiązanie 13C-CO2 .
Ciągłe oznaczanie izotopów od siewki do dojrzałości w szczelnej komorze powoduje jednolite oznaczanie izotopów w całej roślinie. Inne metody, takie jak wielokrotne znakowanie impulsowe16 i stosowanie dolistne lub odprowadzanie wilgoci17,18, nie prowadzą do uzyskania jednolicie znakowanego izotopowo materiału roślinnego ani wyraźnego różnicowego znakowania określonych związków C (np. metabolicznych i strukturalnych)19. Ważnym czynnikiem przy znakowaniu izotopów jest skuteczność etykietowania, ze względu na wysoki koszt rzadkich związków wzbogaconych izotopami stosowanych do znakowania. Chociaż ciągłe znakowanie 13C było stosowane w ciągu ostatnich2-4,20 lat, o ile nam wiadomo, nie ma opublikowanego szczegółowego opisu technicznego komory do ciągłego etykietowania z dowodami na wysoką skuteczność etykietowania i dokładną kontrolę ilości i jednorodności znakowania izotopów.
Na czele badań nad rozkładem ściółki i tworzeniem materii organicznej w glebie znajduje się koncepcja, że metaboliczny materiał roślinny (tj. wymywalne, labilne, niskocząsteczkowe związki) i strukturalny materiał roślinny (np. lignina, celuloza, hemiceluloza) są przetwarzane inaczej pod względem efektywności wykorzystania mikroorganizmów, tworzenia materii organicznej w glebie i długoterminowego przechowywania węgla w glebie5-7. Materiał roślinny, który jest różnie oznakowany pod względem składników strukturalnych i metabolicznych, jest zatem użytecznym narzędziem w postępach w badaniach nad rozkładem ściółki i tworzeniem się materii organicznej w glebie. Znakowanie różnicowe za pomocą podwójnych izotopów pozwala na śledzenie składników strukturalnych i metabolicznych oddzielnie w ekosystemie przy użyciu techniki izotopów wielopulowych21.
Ciągłe znakowanie izotopów z 13C i innymi izotopami w szczelnej komorze wymaga szczególnej uwagi na warunki fizjologiczne roślin, aby zmaksymalizować produktywność roślin i efektywność znakowania izotopów. Skoki temperatury w ciągu dnia muszą być kontrolowane, aby zapobiec uszkodzeniom roślin podczas uprawy w hermetycznej komorze. Optymalny zakres wilgotności i temperatury jest wymagany do utrzymania otwartych aparatów szparkowych roślin i pobierania CO22 . Wysoki poziom wilgotności powoduje zaparowanie ścianek komory, co minimalizuje dostępność światła i może uszkodzić konstrukcję komory. W przypadku pracy z drogimi związkami znakowanymi ciężkimi izotopami ważne jest staranne rozważenie skuteczności znakowania izotopów poprzez eliminację naturalnych izotopów obfitości z komory (np. pochodzących z zasiewania materią organiczną w glebie) i zapobieganie narażeniu na powietrze zewnętrzne.
Tutaj prezentujemy metodę budowy i obsługi ciągłej podwójnej komory do znakowania izotopów 13C i 15N do produkcji materiału roślinnego, który jest albo jednolicie oznakowany, albo ma swoje składniki strukturalne i metaboliczne znakowane na różnych poziomach. 13Znakowanie C jest kontrolowane na poziomie komory, natomiast nawożenie i znakowanie 15N jest kontrolowane na poziomie poszczególnych doniczek. Wykazano, że reprezentatywne wyniki wykazują zdolność tej metody do kontrolowania temperatury, wilgotności i stężenia CO2 przez cały sezon wegetacyjny. Wyniki uprawy Andropogon gerardii, Kaw pokazują również zdolność tej metody do wytwarzania jednolicie lub różnie znakowanego materiału roślinnego. Opisana konkretna konstrukcja i schemat działania komory mogą być modyfikowane w celu uprawy różnych gatunków roślin, a także w celu dostosowania do oznakowania 2H lub 18O.

<table><tbody><tr><td>40-calowy zdalny wentylator wieżowy</td><td>Living Accents</td><td>FS10-S3R-A</td> 42-calowy <td></td></tr><tr><td>elektryczny wentylator wieżowy z pilotem</td><td>LASKO</td><td>2559</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Slim Klimatyzator typu split</td><td>Mitsubishi Electric</td><td>R410A</td><td></td></tr><tr><td>Elektroniczne 24-godzinne wyłączniki czasowe</td><td>Intermatic</td><td>ET100C</td><td>obsługuje system oświetlenia fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Regulator wilgotności i temperatury iSeries</td><td>Omega</td><td>CHiTH-i8DV33-5-El</td><td></td></tr><tr><td>Przekaźnik półprzewodnikowy</td><td>Omega</td><td>SSRL240</td><td></td></tr><tr><td>serii CKR</td> Cewki elektromagnetyczne <td>Crydon</td><td></td><td></td></tr> Dayton <tr><td></td><td></td><td>6X543</td><td></td></tr><tr><td>Analizator CO2 GasHound</td><td>Osuszacz powietrza LI-COR</td><td>LI-800</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dayton</td><td>1DGX4</td><td></td></tr><tr><td>Regulator gazu specjalnego</td><td>Airgas</td><td>CGA 580</td><td></td></tr><tr><td>T5 Wysoka moc wyjściowa Komercyjny system oświetlenia fluorescencyjnego</td><td>Hydro Farm</td><td>FLT48</td><td></td></tr><tr><td>Pompa powietrza</td><td>Thermo Scientific</td><td>420-1901</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Cartridge Pump HeadSystem</td><td>Cole Parmer</td><td>7553-70</td><td></td></tr><tr><td>Przełącznik sieciowy serii 1900</td><td>Profil katalizatora</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Porus Ceramic Top Dressing</td><td>Greens Grade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przemysłowy kwarc 40 mesh</td><td>Unimin</td><td>4095</td><td></td></tr><tr><td>Mycorrhizae Professional Growing Medium</td><td>ProMix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wermikulit i perlit</td><td>Thermo-Ran</td><td>C633</td><td></td></tr><tr><td>Azotan potasu - 15N 98 atomów %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>335134</td><td></td></tr><tr><td>Węgiel-13C Dwutlenek 10 atomów %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>600180</td><td></td></tr><tr><td>Klasa medyczna Regulator CO2</td><td>Airgas</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Airgas</td><td>CGA 350</td><td></td></tr><tr><td>4 w pudełku</td><td>Grainger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Masterflex PharMed BPT Rurka</td><td>Cole Parmer</td><td>HV-06508-24</td><td></td></tr></tbody></table>

konstrukcja i działanie komory do ciągłego znakowania izotopami 13c i 15n do jednorodnego lub różnicowego, metabolicznego i strukturalnego znakowania izotopów roślinnych

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

Śledzenie rzadkich stabilnych izotopów od materiału roślinnego przez ekosystem dostarcza najbardziej wrażliwych informacji o procesach ekosystemowych; od strumieni CO2 i tworzenia się materii organicznej w glebie do sondowania biomarkerów stabilnych izotopów na małą skalę. Sprzężenie wielu stabilnych izotopów, takich jak 13C, z 15N, 18O lub 2H, może ujawnić jeszcze więcej informacji na temat złożonych relacji stechiometrycznych podczas przemian biogeochemicznych. Materiał roślinny znakowany izotopami był wykorzystywany w różnych badaniach rozkładu ściółki i tworzenia się materii organicznej w glebie1-4. Z tych i innych badań wynika jednak, że składniki strukturalne materiału roślinnego zachowują się inaczej niż składniki metaboliczne (tj. wymywalne związki o niskiej masie cząsteczkowej) pod względem wykorzystania mikrobiologicznego i długoterminowego magazynowania węgla5-7. Możliwość oddzielnego badania składników strukturalnych i metabolicznych stanowi nowe, potężne narzędzie do rozwoju czołówki badań biogeochemicznych ekosystemów. W tym miejscu opisujemy metodę wytwarzania materiału roślinnego znakowanego 13C i 15N, który jest albo jednolicie znakowany w całej roślinie, albo znakowany różnicowo w strukturalnych i metabolicznych składnikach rośliny.
Tutaj prezentujemy budowę i działanie ciągłej komory znakującej 13C i 15N, która może być modyfikowana w celu spełnienia różnych potrzeb badawczych. Jednolicie oznakowany materiał roślinny jest wytwarzany poprzez ciągłe etykietowanie od sadzonki do zbioru, podczas gdy etykietowanie różnicowe uzyskuje się poprzez usunięcie rosnących roślin z komory na kilka tygodni przed zbiorem. Reprezentatywne wyniki uprawy Andropogon gerardii Kaw wskazują na zdolność systemu do skutecznego znakowania materiału roślinnego na docelowych poziomach. Dzięki tej metodzie wyprodukowaliśmy materiał roślinny o jednolitej etykiecie roślinnej 4,4 atomu%13C i 6,7 atomu%15N lub materiał, który jest znakowany różnicowo przez maksymalnie 1,29 atomu%13C i 0,56 atomu%15N w swoich składnikach metabolicznych i strukturalnych (odpowiednio składniki ekstrahowane gorącą wodą i resztkowe gorącej wody). Wyzwania polegają na utrzymaniu odpowiedniej temperatury, wilgotności, stężenia CO2 i poziomu światła w szczelnej atmosferze 13C-CO2 dla udanej produkcji roślinnej. Ten opis komory stanowi użyteczne narzędzie badawcze do efektywnego wytwarzania jednorodnie lub różnicowo znakowanego wieloizotopowo materiału roślinnego do wykorzystania w eksperymentach nad cyklem biogeochemicznym ekosystemu.

Nasza komora znakowania ma wymiary 1,2 m x 2,4 m x 3,6 m i mieści donice o pojemności 40,15 L (Rysunek 1). Komputeryzowany system sterowania IRGA utrzymywał stężenia CO2 w zakresie ustalonych wartości od 360 do 400 ppm podczas dziennego okresu aktywności fotosyntetycznej (Rysunek 2a). Funkcja alarmu niskiego poziomu CO2 w systemie IRGA uruchamiała zawory elektromagnetyczne, umożliwiając dopływ CO2 z zbiorników z naturalnym stężeniem oraz wzbogaconych w 13C do komory, gdy stężenie spadło poniżej progu minimalnego (np. 360 ppm). Funkcja martwej strefy zatrzymywała przepływ, gdy stężenie osiągało górny punkt nastawy (np. 400 ppm). System monitorowania temperatury i wilgotności iSeries, połączony z klimatyzatorem i osuszaczem powietrza, utrzymywał warunki klimatyczne w zadanych parametrach przez cały sezon wegetacyjny (Rysunek 2b). Do chłodzenia komory wykorzystaliśmy jednostkę klimatyzacyjną o mocy jednej tony (3,5 kW).
System zdalnego monitorowania umożliwiał przeglądanie zarejestrowanych danych w dowolnym momencie za pomocą standardowej przeglądarki internetowej. Stężenia CO2, wartości temperatury i wilgotności były poddawane próbkowaniu w aplikacji internetowej w celu wyświetlania wykresów z ostatnich 24–240 h w odstępach 24-godzinnych. Pozwalało to na szybką wizualną weryfikację, czy dobowe wahania mieściły się w oczekiwanych granicach. Interfejs internetowy wyświetlał również aktualny stan komory oraz generował powiadomienia o potencjalnych problemach, takich jak brak otrzymywania bieżących danych. W dowolnym momencie z interfejsu internetowego można było również pobrać pełny zestaw danych.
Za pomocą czujnika kwantowego zmierzono promieniowanie czynne fotosyntetycznie (PAR) w bezpośrednim wnętrzu i na zewnątrz komory w czterech punktach, przy włączonym i wyłączonym oświetleniu, w połowie lata i w połowie dnia. Wartość PAR w komorze była o 31,5% niższa niż na zewnątrz przy wyłączonym oświetleniu komory oraz o 22% niższa niż na zewnątrz przy włączonym oświetleniu. Zatem oświetlenie komory pomaga znacząco zwiększyć penetrację PAR wewnątrz komory o 9,5% (P&lt;0.05).
Nasz system ciągłego znakowania pozwolił na uzyskanie 2759 g biomasy A. gerardii, z czego 37% stanowiła biomasa nadziemna, a 63% biomasa podziemna. Osiągnęliśmy znakowanie całej rośliny na poziomie 4,4 atom%13C w jednorodnym materiale roślinnym poprzez odpowiednie ustawienie zaworów elektromagnetycznych w dwóch zbiornikach z CO2 (Rycina 1, Tabela 1). Uzyskano znakowanie całej rośliny na poziomie 6,7 atom%15N w jednorodnym materiale roślinnym poprzez zmieszanie 98 atom%15N-KNO3 z 0,37 atom%15N-KNO3 w podroztworze KNO3 zmodyfikowanej pożywki Hoaglanda23 (Tabela 1). Rośliny A. gerardii podlewano co tydzień łącznie 750 ml cieczy (woda oraz pożywka Hoaglanda) przez cały sezon wegetacyjny. Nawożenie przeprowadzano za pomocą 200-500 ml pożywki Hoaglanda znakowanej 15N na tydzień, w zależności od produktywności roślin.
Wykorzystaliśmy metodę ekstrakcji gorącą wodą, aby ustalić, czy istnieją różnice izotopowe między materiałem roślinnym znakowanym jednorodnie a materiałem znakowanym różnicowo. W przypadku roślin znakowanych różnicowo, podczas zbiorów usunęliśmy wszystkie całkowicie obumarłe liście i potraktowaliśmy je oddzielnie, ponieważ prawdopodobnie nie były one znakowane różnicowo. Analizując zawartość 13C, wszystkie cztery dni inkorporacji różniły się znacząco od siebie w przypadku całej rośliny oraz ekstraktu z gorącej wody, natomiast dla pozostałości po ekstrakcji gorącą wodą dni 14 i 22 nie wykazywały istotnych różnic (Tabela 1). Porównując frakcje tkanek roślinnych w ramach każdego dnia, ekstrakt i pozostałość z gorącej wody różniły się znacząco od siebie przez wszystkie cztery dni, a do 22. dnia cała roślina, ekstrakt i pozostałość różniły się od siebie w sposób istotny (Tabela 1). W odniesieniu do inkorporacji 15N w komponenty roślinne, zaobserwowano różnice między dniami inkorporacji a frakcjami tkanek roślinnych. Dla ekstraktu z gorącej wody wszystkie cztery dni inkorporacji różniły się znacząco od siebie pod kątem 15N, a dla całej rośliny i pozostałości po ekstrakcji gorącą wodą krótsze okresy inkorporacji różniły się znacząco od dłuższych okresów inkorporacji (Tabela 1). Frakcje tkanek roślinnych w roślinach znakowanych jednorodnie nie różniły się znacząco od siebie pod kątem 15N, natomiast ekstrakt i pozostałość z gorącej wody różniły się znacząco pod kątem 15N w przypadku ściółki znakowanej różnicowo.
Wszystkie wartości izotopowe podano w zapisie procentowym atomowym (atom %) (Równanie 1), który jest dokładniejszym zapisem niż % przy wysokich poziomach wzbogacenia w ciężki izotop21. Na przykład:
<img alt="Wzór na obliczanie obfitości izotopowej, równanie Atom% 13C dla analizy w badaniach chemicznych." height="54" src="/files/ftp_upload/51117/51117eq2.jpg" width="202" data-altupdatedat="1787630408000"> (1)
W niniejszym badaniu przeprowadziliśmy analizy statystyczne przy użyciu programu SAS w wersji 9.2. Różnice między poziomami natężenia światła wewnątrz i na zewnątrz komory przetestowano za pomocą testu t-studenta dla prób zależnych. Różnice w znakowaniu 13C i 15N ekstraktów wodnych oraz pozostałości po ekstrakcji wodnej przetestowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) w procedurze PROC ANOVA. Do analizy porównań wielokrotnych wykorzystano test wielu zakresów Duncan'a. Istotność przyjęto na poziomie P = 0,05. Aby sprawdzić, czy dane spełniają założenia analizy, zastosowano test sum rang Wilcoxona.
<img alt="Schemat systemu kontroli CO2 w szklarni z IRGA, zaworami elektromagnetycznymi i czujnikami temperatury." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51117/51117fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51117/51117fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Schemat komory do ciągłego znakowania wieloizotopowego o pojemności 40 doniczek widziany z góry. Linie przerywane reprezentują okablowanie elektryczne, natomiast linie ciągłe reprezentują rurki doprowadzające gaz lub wodę. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51117/51117fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
<img alt="Stężenie CO2, temperatura, wilgotność w funkcji czasu; wykres dwuliniowy przedstawiający zmienność środowiskową." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51117/51117fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51117/51117fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. A) Średnie stężenie CO2 (ppm) (+/- SE) w ciągu doby dla całego sezonu wegetacyjnego. B) Średnia temperatura (ºC), otwarte kółka, oraz wilgotność (%), zamknięte kółka (+/- SE) w ciągu doby dla całego sezonu wegetacyjnego. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51117/51117fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="559">
	<colgroup>
		<col>
		<col>
		<col>
		<col>
		<col span="2">
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:77px;"></td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:92px;">Jednolity (0)</td>
			<td style="width:97px;">Różnicowanie (7)</td>
			<td style="width:104px;">Różnicowanie (14)</td>
			<td style="width:104px;">Różnicowanie (22)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="38" rowspan="2" style="height:38px;width:77px;">Cały miot</td>
			<td>13At % C</td>
			<td>4,46±0,02 Aab</td>
			<td>3,93±0,05 Ba</td>
			<td>3,64±0,03 Ca</td>
			<td>3,35±0,06 Db</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">15N At%</td>
			<td>6,69±0,07 Aa</td>
			<td>6,72±0,01 Aa</td>
			<td>6,33±0,06 Ba</td>
			<td>6,41±0,07 Ba</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="38" rowspan="2" style="height:38px;width:77px;">Wodny ekstrakt na gorąco</td>
			<td>13% atomów C</td>
			<td>4,59±0,04 Aa</td>
			<td>3,35±0,06 Bb</td>
			<td>2,79±0,06 Cb</td>
			<td>2,37±0,03 Dc</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">15N atom %</td>
			<td>6,69±0,03 Aa</td>
			<td>6,43±0,01 Bb</td>
			<td>5,89±0,07 Db</td>
			<td>6,16±0,05 Cb</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="38" rowspan="2" style="height:38px;width:77px;">Osad z gorącej wody</td>
			<td>13% atomów C</td>
			<td>4,37±0,06 Ab</td>
			<td>4,1±0,03 Ba</td>
			<td>3,79±0,10 Ca</td>
			<td>3,66±0,05 Ca</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">15N At %</td>
			<td>6,57±0,04 Ba</td>
			<td>6,71±0,02 Aa</td>
			<td>6,45±0,02 Ca</td>
			<td>6,44±0,03 Ca</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Skład izotopowy i chemia ściółki dla ściółki znakowanej jednorodnie i różnicowo. Liczba dni różnicowego znakowania poza komorą podano w nawiasach. Porównania między dniami wbudowy oznaczono wielkimi literami (w wierszach), a porównania między frakcjami ściółki małymi literami (w kolumnach) dla każdej zmiennej.

Ta metoda wyjaśnia, jak zbudować i obsługiwać ciągłą komorę do znakowania izotopów 13C i 15N do jednolitego lub zróżnicowanego etykietowania tkanek roślinnych. Omówiono reprezentatywne wyniki znakowania metabolicznego i strukturalnego Andropogon gerardii.

Konstrukcja i działanie komory do ciągłego znakowania izotopami 13C i 15N do jednorodnego lub różnicowego, metabolicznego i strukturalnego znakowania izotopów roślinnych

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie materiału roślinnego o wysokim stopniu wzbogacenia w węgiel 13 i azot 15, równomiernie w całej roślinie lub różnicowo w tkankach strukturalnych i metabolicznych. Osiąga się to najpierw poprzez zbudowanie szczelnej komory do wzrostu roślin. Drugim krokiem jest kontrola temperatury, wilgotności i poziomu dwutlenku węgla w komorze w celu utrzymania odpowiednich warunków wzrostu roślin.Następnie rośliny są hodowane w szczelnej komorze z powietrzem zawierającym 13 C, dwutlenkiem węgla oraz systemem nawadniania i nawożenia zawierającym azot 15. Ostatnim krokiem jest zakończenie znakowania poprzez usunięcie różnicowo znakowanych roślin z komory na kilka tygodni przed zbiorem, tak aby ich materiał metaboliczny stał się mniej wzbogacony w węgiel 13 i azot 15. W porównaniu do strukturalnych komponentów roślin po zbiorze materiału roślinnego, do pomiaru ogólnego znakowania izotopowego oraz różnic w sile znakowania wykorzystuje się ekstrakcję gorącą wodą oraz spektrometrię mas z analizą stosunku izotopów.Główną zaletą ciągłego znakowania w porównaniu z innymi metodami, takimi jak aplikacja dolistna czy powtarzalne znakowanie impulsowe, jest uzyskanie jednorodnie znakowanego materiału roślinnego, w którym poszczególne komponenty metaboliczne lub strukturalne mogą być znakowane w różny sposób. Aby rozpocząć tę procedurę, należy skonstruować komorę znakowania zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym, montując przezroczyste ścianki z akrylu o grubości 3,18 mm oraz przezroczysty sufit z akrylu o grubości 6,35 mm na aluminiowej ramie z podłogą ze stali malowanej na biało; wymiary komory można dostosować do konkretnych potrzeb wzrostu roślin. Przedstawiona tutaj komora ma wymiary 1,2 na 2,4 na 3,6 m i mieści 40 doniczek o pojemności 15 l; należy zapewnić szczelność komory, pokrywając wszystkie łączenia odpowiednim uszczelniaczem silikonowym.Zamontuj drzwiczki na śrubach maszynowych, które można przykręcać i odkręcać za pomocą odkręcanych nakrętek motylkowych. Uszczelnij drzwiczki uszczelką pogodową, aby zapobiec wyciekom powietrza w obszarze bezpośrednio sąsiadującym z komorą etykietowania. Podłącz centrum sterowania do monitora i dostosuj temperaturę, wilgotność oraz poziom dwutlenku węgla wewnątrz komory.Należy upewnić się, że przewody elektryczne i rurki gazowe przechodzące do komory są szczelnie uszczelnione silikonem, aby zapobiec wyciekom powietrza. Opcjonalnie do komory można dodać oświetlenie w celu zwiększenia penetracji światła i kontroli długości dnia. Aby regulować temperaturę w komorze, należy zainstalować komercyjną klimatyzację typu split z cewkami parownika znajdującymi się wewnątrz komory oraz sprężarką i cewkami skraplacza umieszczonymi na zewnątrz komory w celu odprowadzania ciepła.Następnie w komorze należy zainstalować niewielki osuszacz powietrza. Wywierć otwór w podłodze obok osuszacza, a następnie przeprowadź rurkę odpływową z osuszacza przez otwór do słoika wypełnionego wodą. Tworzy to szczelne zamknięcie odpływu i umożliwia wyrównanie ciśnienia. Regulację wilgotności w komorze realizuje się poprzez podłączenie do osuszacza programowalnego kontrolera, takiego jak seria Omega i, wyposażonego w czujnik wilgotności.Następnie należy zainstalować podczerwony analizator gazu lub ER a z pompą membranową, która stale pobiera powietrze z komory przez ER A i tłoczy je z powrotem do komory. Pozwala to na utrzymanie układu zamkniętego przy jednoczesnym ciągłym monitorowaniu stężenia dwutlenku węgla w komory. Następnie należy podłączyć dwa zbiorniki z czystym dwutlenkiem węgla do systemu kontroli stężenia dwutlenku węgla.Jeden z zbiorników powinien zawierać dwutlenek węgla z zawartością 10 atomowych procentów 13 C lub wyższą, a drugi dwutlenek węgla o naturalnej obfitości 13 C. Ustaw regulatory zbiorników na 20 PSI, a następnie za regulatorami zamontuj zawory elektromagnetyczne w liniach gazowych, aby sterować wtryskami dwutlenku węgla za pomocą oprogramowania Ergo.Sterowanie otwieraniem i zamykaniem zaworów elektromagnetycznych odbywa się poprzez podłączenie ich do ER rga za pomocą programu przekaźnika stanu stałego. W oprogramowaniu ergas należy ustawić niski alarm, który wyzwoli otwarcie zaworów elektromagnetycznych, gdy stężenie dwutlenku węgla w komorze spadnie poniżej określonej wartości, oraz strefę martwą, aby zamknąć zawory po osiągnięciu górnego punktu nastawy stężenia dwutlenku węgla. Za zaworami elektromagnetycznymi należy zamontować zawór dozujący na każdej z dwóch linii zbiorników z gazem i ostrożnie wyregulować je do pożądanego poziomu wzbogacenia atmosfery w carbon 13.W tym przypadku stosujemy wzbogacenie w węgiel 13 na poziomie 4,4% atomowego. Połącz wyloty, a następnie wprowadź linię do środka komory pomiędzy wentylatory, co pomoże w równomiernym rozprowadzeniu znakowanego dwutlenku węgla w całej komorze w celu przygotowania systemu nawadniania. Najpierw utwórz jeden pierścień nawadniania kropelkowego na każdą doniczkę i wyprowadź rurkę nawadniającą na zewnątrz przez mały otwór wykonany w ściance komory.Następnie uszczelnij otwory wokół rurek nawadniających silikonem, aby zapobiec wyciekom powietrza na zewnątrz komory. Połącz rurki nawadniające z przewodami pompy perystaltycznej i załóż na nie małą opaskę zaciskową, aby zapobiec wyciekom powietrza pomiędzy cyklami podlewania. Przed przesadzeniem do doniczek przeprowadź kiełkowanie, aby zapewnić żywotność, a następnie zaszczep siewki świeżą zawiesiną glebową. Aby wprowadzić korzystne mikroorganizmy, wypełnij doniczki bezglebowym podłożem do przesadzania, co wyeliminuje wprowadzenie nieznakowanego węgla i azotu z gleby.W niniejszym doświadczeniu stosujemy mieszaninę piasku, wermikulitu oraz porowanej ceramiki profilowej. Po wykiełkowaniu nasion należy ostrożnie przesadzić siewki do doniczek z minimalną ilością ziemi ogrodniczej. Następnie doniczki przenosi się do komory, a do każdej z nich podłącza się oddzielny wąż nawadniający.Na koniec uszczelnij drzwi komory i usuń zewnętrzny dwutlenek węgla, podłączając pochłaniacz z wapnem sodowym do pompy powietrznej, aż stężenie dwutlenku węgla spadnie do poziomu co najmniej 200 do 250 parts per million. Przed ponownym napełnieniem komory do poziomu 400 parts per million, korzystając z mieszaniny z butli z 13 C dwutlenkiem węgla, staraj się utrzymać komorę zamkniętą przez cały okres wegetacji, aby zminimalizować zanieczyszczenie dwutlenkiem węgla o naturalnej obfitości.Najpierw przygotuj roztwór nawozu typu Hyland znakowany azotem 15, mieszając azotan potasu znakowany azotem 15 o czystości atomowej 98% z azotanem potasu o naturalnej zawartości izotopu azotu 15, a następnie dodaj go do pozostałej części roztworu Hookina. W tym przypadku do nawożenia stosujemy roztwór z 7% zawartością atomową azotu 15. Użyj pompy perystaltycznej, aby podawać znakowany azotem 15 roztwór nawozu przez rurki irygacyjne.Zaciśnij węże nawadniające za pomocą zacisków UNC i podaj zróżnicowane ilości nawozu do poszczególnych roślin, zgodnie z zapotrzebowaniem i planem eksperymentu. Następnie przepompuj wodę przez węże, aby wypłukać z nich nawóz. Całkowita ilość dodanego płynu nie powinna przekraczać pojemności wodnej doniczek, aby zminimalizować straty nawozu.Zaciśnij zaciski na wszystkich wężach po nawożeniu i podlewaniu, aby wyeliminować wycieki powietrza z komory. W celu różnicowego znakowania komponentów strukturalnych i metabolicznych, usuń rośliny z komory znakowania od jednego do trzech tygodni przed zbiorem. Rośliny, które mają zostać oznakowane jednolicie, pozostaw wewnątrz komory aż do zbioru.Aby wywołać starzenie się roślin, należy po prostu zaprzestać nawadniania w odpowiednim momencie. Rośliny zbiera się, zaczynając od ścięcia biomasy nadziemnej.Po zbiorze biomasy nadziemnej, wysyp substrat i korzenie na sito o oczkach 6 mm, aby oddzielić korzenie od substratu. Następnie wypłucz korzenie na sicie o oczkach 2 mm, aby usunąć pozostałości materiału pottingowego. W razie potrzeby użyj pęsety, aby usunąć substrat, który mógł przykleić się do korzeni, a następnie pozostaw korzenie do wyschnięcia na powietrzu w celu przygotowania do przyszłych doświadczeń.Podczas trzech sezonów wegetacyjnych eksploatacji, w komorze z powodzeniem utrzymywano temperaturę między 26 a 29 °C, wilgotność między 36 a 56% oraz stężenie dwutlenku węgla między 360 a 400 ppm, zgodnie z ustawieniami w centrum sterowania. Przedstawione tutaj są reprezentatywne wyniki z sezonu wegetacyjnego 2011 dla *Andra Pogon* Girard di. Nagromadzenie dwutlenku węgla podczas nocnego oddychania nie wydaje się uszkadzać rosnących roślin i jest szybko pochłaniane po wschodzie słońca.Znakowanie azotem 15 z wykorzystaniem docelowego 7 atom% roztworu azotanu azotu 15 doprowadziło do uzyskania materiału roślinnego o wysokim stopniu znakowania wynoszącym 6,7 atom% azotu 15; niewielkie rozcieńczenie docelowego znacznika azotu 15 mogło być spowodowane obecnością naturalnie występującego azotu w podłożu do doniczek lub w wyniku naturalnego zaszczepienia glebą. Znakowanie węglem 13 z użyciem docelowego 4,4 atom% dwutlenku węgla 13 C poskutkowało uzyskaniem 4,46 atom% węgla 13. W całej ściółce z jednorodnie znakowanego materiału roślinnego, rośliny różnicowo znakowane, które zostały usunięte z komory na 7, 14 lub 22 dni przed zbiorem, wykazywały istotne różnice w zawartości węgla 13 i azotu 15.Zawartość w komponentach metabolicznych uzyskanych jako ekstrakty wodne w wysokiej temperaturze oraz w komponentach strukturalnych uzyskanych jako pozostałości po ekstrakcji wodnej w wysokiej temperaturze, wskazująca na zróżnicowane znakowanie metabolicznych i strukturalnych materiałów roślinnych. Po opracowaniu, ciągłe podwójne znakowanie izotopowe utorowało drogę badaczom w dziedzinie biogeochemii do badania losów i transformacji komponentów roślinnych w środowisku w skali makro i nano.

design-operation-continuous-13c-15n-labeling-chamber-for-uniform-or

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Konstrukcja i działanie ciągłej komory do znakowania 13C i 15N do jednolitego lub różnicowego, metabolicznego i strukturalnego, znakowania roślin izotopami

Znakowanie izotopem 13C jest użyteczną techniką określania centralnego metabolizmu komórkowego dla różnych typów mikroorganizmów. Po hodowli komórek ze specyficznym znakowanym substratem, pomiar GC-MS może ujawnić funkcjonalne szlaki metaboliczne na podstawie unikalnych wzorów znakowania w aminokwasach proteinogennych.

Potwierdzanie i odkrywanie szlaków metabolicznych poprzez znakowanie 13C aminokwasów proteinogennych

Procedury znakowania izotopami stabilnymi z wykorzystaniem wody wzbogaconej w 18O (procedury LeO) są wszechstronnymi narzędziami w ilościowych i jakościowych badaniach proteomicznych. W procedurach wspomaganych proteazami (PALeO) atomy 18O są wprowadzane poprzez proteolityczne rozszczepienie oraz reakcje wymiany tlenu karboksylowego katalizowane przez proteazy. W procedurze katalizowanej kwasowo (ALeO) atomy 18O są wprowadzane poprzez wymianę tlenu karboksylowego przy niskim pH.

Procedury znakowania katalizowane przez proteazy i kwasy z wykorzystaniem wody wzbogaconej w 18O

Tutaj opisujemy solidną metodę frakcjonowania błon plazmatycznych roślin na membrany odporne na detergenty i rozpuszczalne w detergentach, oparte na mieszaninie nieznakowanych i in vivo w pełni znakowanych 15N kultur komórkowych Arabidopsis thaliana. Procedura jest stosowana do porównawczych badań proteomicznych w celu zrozumienia procesów sygnalizacyjnych.

Znakowanie metaboliczne i frakcjonowanie błonowe do porównawczej analizy proteomicznej hodowli zawiesinowych komórek Arabidopsis thaliana

In planta pomiar strumieni składników odżywczych i toksycznych jest niezbędny do badania odżywiania i toksyczności roślin. W tym miejscu omawiamy protokoły radioznacznikowe do oznaczania napływu i odpływu w nienaruszonych korzeniach roślin, używając jako przykładów strumieni potasu (K+) i amoniaku/amonu (NH3/NH4+). Omówiono zalety i ograniczenia takich technik.

Pomiar strumieni mineralnych składników odżywczych i substancji toksycznych w roślinach z radioaktywnymi znacznikami

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę ilościowego i kompleksowego badania metabolizmu wielu źródeł składników odżywczych. Ten przepływ pracy, oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi i procedury analitycznej, pozwala na określenie losu spożywanych składników odżywczych i pochodzenia metabolicznego cząsteczek syntetyzowanych przez mikroorganizmy.

Przebieg pracy oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi w celu zbadania metabolizmu mikrobiologicznego wielu źródeł składników odżywczych

Wizualizacja i pomiar wzrostu korzeni in situ jest niezwykle trudne. Przedstawiamy konfigurowalną metodę rhizobox do śledzenia rozwoju i proliferacji korzeni w czasie w odpowiedzi na wzbogacenie w składniki odżywcze. Metoda ta służy do analizy różnic genotypowych w plastyczności korzeni kukurydzy w odpowiedzi na organiczne źródło azotu.

Zoptymalizowany protokół Rhizobox do wizualizacji wzrostu korzeni i reakcji na zlokalizowane składniki odżywcze

Projekt mikrodziałki do badań nad znacznikiem 15N jest opisany tak, aby pomieścić wiele wydarzeń związanych z pobieraniem próbek roślin i gleby w sezonie. Przedstawiono procedury pobierania i przetwarzania próbek gleby i roślin, w tym protokoły mielenia i ważenia, dla analizy 15N.

Projektowanie mikrowykresów oraz przygotowanie próbek roślin i gleby do analizy 15azotu

Opracowana metoda znakowania 13C6-Glucose w połączeniu z chromatografią cieczową o wysokiej rozdzielczości spektrometrią mas jest wszechstronna i stanowi podstawę do przyszłych badań nad pierwotnymi organami i szlakami zaangażowanymi w syntezę metabolitów wtórnych w roślinach leczniczych, jak również kompleksowe wykorzystanie tych wtórnych metabolitów.

13C6-Znakowanie glukozy związane z LC-MS: Identyfikacja pierwotnych organów roślinnych w syntezie metabolitów wtórnych

Ten protokół przedstawia szczegółową procedurę przygotowania czterech radioznaczników węgla-11 za pomocą "metody pętlowej" [11C]metylacji. Opisujemy procedurę syntezy [11C]ER-176, z danymi dla trzech dodatkowych radioznaczników: [11C]MRB, [11C]mHED i [11C]PiB. Metoda pętlowa zapewnia wydajną syntezę ze zwiększoną wydajnością radiochemiczną w porównaniu z tradycyjną metylacją naczynia reakcyjnego [11C].

Zwiększenie wydajności i wydajności znakowania radioligandów węgla-11 w badaniach klinicznych z wykorzystaniem metody pętli

Opisano użycie metody iniekcji igłą do inokulacji roślin kukurydzy i teosinte biotroficznym patogenem Ustilago maydis.  Metoda inokulacji igłowej ułatwia kontrolowane dostarczanie patogenu grzybowego między liście rośliny, gdzie patogen dostaje się do rośliny poprzez tworzenie appresorii. Metoda ta jest bardzo skuteczna, umożliwiając powtarzalne inokulacje U. maydis.

Szybka i skuteczna metoda oceny patogenności Ustilago maydis na liniach kukurydzy i teosinte

Poznaj metodę ciągłego znakowania izotopami 13C i 15N w komorze do uprawy roślin. Technika umożliwia jednorodne lub różnicowe oznaczanie tkanek metabolicznych i strukturalnych w badaniach biogeochemicznych.

Konstrukcja i działanie komory do ciągłego znakowania izotopami 13C i 15N do jednorodnego lub różnicowego, metabolicznego i strukturalnego znakowania izotopów roślinnych (Wideo) | JoVE Journal

Konstrukcja i działanie komory do ciągłego znakowania ^{izotopami 13}C i ¹⁵N do jednorodnego lub różnicowego, metabolicznego i strukturalnego znakowania izotopów roślinnych

Przeglądaj więcej filmów