Konstrukcja i działanie komory do ciągłego znakowania ^{izotopami 13}C i ¹⁵N do jednorodnego lub różnicowego, metabolicznego i strukturalnego znakowania izotopów roślinnych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie materiału roślinnego o wysokim stopniu wzbogacenia w węgiel 13 i azot 15, równomiernie w całej roślinie lub różnicowo w tkankach strukturalnych i metabolicznych. Osiąga się to najpierw poprzez zbudowanie szczelnej komory do wzrostu roślin. Drugim krokiem jest kontrola temperatury, wilgotności i poziomu dwutlenku węgla w komorze w celu utrzymania odpowiednich warunków wzrostu roślin.

Następnie rośliny są hodowane w szczelnej komorze z powietrzem zawierającym 13 C, dwutlenkiem węgla oraz systemem nawadniania i nawożenia zawierającym azot 15. Ostatnim krokiem jest zakończenie znakowania poprzez usunięcie różnicowo znakowanych roślin z komory na kilka tygodni przed zbiorem, tak aby ich materiał metaboliczny stał się mniej wzbogacony w węgiel 13 i azot 15. W porównaniu do strukturalnych komponentów roślin po zbiorze materiału roślinnego, do pomiaru ogólnego znakowania izotopowego oraz różnic w sile znakowania wykorzystuje się ekstrakcję gorącą wodą oraz spektrometrię mas z analizą stosunku izotopów.

Główną zaletą ciągłego znakowania w porównaniu z innymi metodami, takimi jak aplikacja dolistna czy powtarzalne znakowanie impulsowe, jest uzyskanie jednorodnie znakowanego materiału roślinnego, w którym poszczególne komponenty metaboliczne lub strukturalne mogą być znakowane w różny sposób. Aby rozpocząć tę procedurę, należy skonstruować komorę znakowania zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym, montując przezroczyste ścianki z akrylu o grubości 3,18 mm oraz przezroczysty sufit z akrylu o grubości 6,35 mm na aluminiowej ramie z podłogą ze stali malowanej na biało; wymiary komory można dostosować do konkretnych potrzeb wzrostu roślin. Przedstawiona tutaj komora ma wymiary 1,2 na 2,4 na 3,6 m i mieści 40 doniczek o pojemności 15 l; należy zapewnić szczelność komory, pokrywając wszystkie łączenia odpowiednim uszczelniaczem silikonowym.

Zamontuj drzwiczki na śrubach maszynowych, które można przykręcać i odkręcać za pomocą odkręcanych nakrętek motylkowych. Uszczelnij drzwiczki uszczelką pogodową, aby zapobiec wyciekom powietrza w obszarze bezpośrednio sąsiadującym z komorą etykietowania. Podłącz centrum sterowania do monitora i dostosuj temperaturę, wilgotność oraz poziom dwutlenku węgla wewnątrz komory.

Należy upewnić się, że przewody elektryczne i rurki gazowe przechodzące do komory są szczelnie uszczelnione silikonem, aby zapobiec wyciekom powietrza. Opcjonalnie do komory można dodać oświetlenie w celu zwiększenia penetracji światła i kontroli długości dnia. Aby regulować temperaturę w komorze, należy zainstalować komercyjną klimatyzację typu split z cewkami parownika znajdującymi się wewnątrz komory oraz sprężarką i cewkami skraplacza umieszczonymi na zewnątrz komory w celu odprowadzania ciepła.

Następnie w komorze należy zainstalować niewielki osuszacz powietrza. Wywierć otwór w podłodze obok osuszacza, a następnie przeprowadź rurkę odpływową z osuszacza przez otwór do słoika wypełnionego wodą. Tworzy to szczelne zamknięcie odpływu i umożliwia wyrównanie ciśnienia. Regulację wilgotności w komorze realizuje się poprzez podłączenie do osuszacza programowalnego kontrolera, takiego jak seria Omega i, wyposażonego w czujnik wilgotności.

Następnie należy zainstalować podczerwony analizator gazu lub ER a z pompą membranową, która stale pobiera powietrze z komory przez ER A i tłoczy je z powrotem do komory. Pozwala to na utrzymanie układu zamkniętego przy jednoczesnym ciągłym monitorowaniu stężenia dwutlenku węgla w komory. Następnie należy podłączyć dwa zbiorniki z czystym dwutlenkiem węgla do systemu kontroli stężenia dwutlenku węgla.

Jeden z zbiorników powinien zawierać dwutlenek węgla z zawartością 10 atomowych procentów 13 C lub wyższą, a drugi dwutlenek węgla o naturalnej obfitości 13 C. Ustaw regulatory zbiorników na 20 PSI, a następnie za regulatorami zamontuj zawory elektromagnetyczne w liniach gazowych, aby sterować wtryskami dwutlenku węgla za pomocą oprogramowania Ergo.

Sterowanie otwieraniem i zamykaniem zaworów elektromagnetycznych odbywa się poprzez podłączenie ich do ER rga za pomocą programu przekaźnika stanu stałego. W oprogramowaniu ergas należy ustawić niski alarm, który wyzwoli otwarcie zaworów elektromagnetycznych, gdy stężenie dwutlenku węgla w komorze spadnie poniżej określonej wartości, oraz strefę martwą, aby zamknąć zawory po osiągnięciu górnego punktu nastawy stężenia dwutlenku węgla. Za zaworami elektromagnetycznymi należy zamontować zawór dozujący na każdej z dwóch linii zbiorników z gazem i ostrożnie wyregulować je do pożądanego poziomu wzbogacenia atmosfery w carbon 13.

W tym przypadku stosujemy wzbogacenie w węgiel 13 na poziomie 4,4% atomowego. Połącz wyloty, a następnie wprowadź linię do środka komory pomiędzy wentylatory, co pomoże w równomiernym rozprowadzeniu znakowanego dwutlenku węgla w całej komorze w celu przygotowania systemu nawadniania. Najpierw utwórz jeden pierścień nawadniania kropelkowego na każdą doniczkę i wyprowadź rurkę nawadniającą na zewnątrz przez mały otwór wykonany w ściance komory.

Następnie uszczelnij otwory wokół rurek nawadniających silikonem, aby zapobiec wyciekom powietrza na zewnątrz komory. Połącz rurki nawadniające z przewodami pompy perystaltycznej i załóż na nie małą opaskę zaciskową, aby zapobiec wyciekom powietrza pomiędzy cyklami podlewania. Przed przesadzeniem do doniczek przeprowadź kiełkowanie, aby zapewnić żywotność, a następnie zaszczep siewki świeżą zawiesiną glebową. Aby wprowadzić korzystne mikroorganizmy, wypełnij doniczki bezglebowym podłożem do przesadzania, co wyeliminuje wprowadzenie nieznakowanego węgla i azotu z gleby.

W niniejszym doświadczeniu stosujemy mieszaninę piasku, wermikulitu oraz porowanej ceramiki profilowej. Po wykiełkowaniu nasion należy ostrożnie przesadzić siewki do doniczek z minimalną ilością ziemi ogrodniczej. Następnie doniczki przenosi się do komory, a do każdej z nich podłącza się oddzielny wąż nawadniający.

Na koniec uszczelnij drzwi komory i usuń zewnętrzny dwutlenek węgla, podłączając pochłaniacz z wapnem sodowym do pompy powietrznej, aż stężenie dwutlenku węgla spadnie do poziomu co najmniej 200 do 250 parts per million. Przed ponownym napełnieniem komory do poziomu 400 parts per million, korzystając z mieszaniny z butli z 13 C dwutlenkiem węgla, staraj się utrzymać komorę zamkniętą przez cały okres wegetacji, aby zminimalizować zanieczyszczenie dwutlenkiem węgla o naturalnej obfitości.

Najpierw przygotuj roztwór nawozu typu Hyland znakowany azotem 15, mieszając azotan potasu znakowany azotem 15 o czystości atomowej 98% z azotanem potasu o naturalnej zawartości izotopu azotu 15, a następnie dodaj go do pozostałej części roztworu Hookina. W tym przypadku do nawożenia stosujemy roztwór z 7% zawartością atomową azotu 15. Użyj pompy perystaltycznej, aby podawać znakowany azotem 15 roztwór nawozu przez rurki irygacyjne.

Zaciśnij węże nawadniające za pomocą zacisków UNC i podaj zróżnicowane ilości nawozu do poszczególnych roślin, zgodnie z zapotrzebowaniem i planem eksperymentu. Następnie przepompuj wodę przez węże, aby wypłukać z nich nawóz. Całkowita ilość dodanego płynu nie powinna przekraczać pojemności wodnej doniczek, aby zminimalizować straty nawozu.

Zaciśnij zaciski na wszystkich wężach po nawożeniu i podlewaniu, aby wyeliminować wycieki powietrza z komory. W celu różnicowego znakowania komponentów strukturalnych i metabolicznych, usuń rośliny z komory znakowania od jednego do trzech tygodni przed zbiorem. Rośliny, które mają zostać oznakowane jednolicie, pozostaw wewnątrz komory aż do zbioru.

Aby wywołać starzenie się roślin, należy po prostu zaprzestać nawadniania w odpowiednim momencie. Rośliny zbiera się, zaczynając od ścięcia biomasy nadziemnej.

Po zbiorze biomasy nadziemnej, wysyp substrat i korzenie na sito o oczkach 6 mm, aby oddzielić korzenie od substratu. Następnie wypłucz korzenie na sicie o oczkach 2 mm, aby usunąć pozostałości materiału pottingowego. W razie potrzeby użyj pęsety, aby usunąć substrat, który mógł przykleić się do korzeni, a następnie pozostaw korzenie do wyschnięcia na powietrzu w celu przygotowania do przyszłych doświadczeń.

Podczas trzech sezonów wegetacyjnych eksploatacji, w komorze z powodzeniem utrzymywano temperaturę między 26 a 29 °C, wilgotność między 36 a 56% oraz stężenie dwutlenku węgla między 360 a 400 ppm, zgodnie z ustawieniami w centrum sterowania. Przedstawione tutaj są reprezentatywne wyniki z sezonu wegetacyjnego 2011 dla *Andra Pogon* Girard di. Nagromadzenie dwutlenku węgla podczas nocnego oddychania nie wydaje się uszkadzać rosnących roślin i jest szybko pochłaniane po wschodzie słońca.

Znakowanie azotem 15 z wykorzystaniem docelowego 7 atom% roztworu azotanu azotu 15 doprowadziło do uzyskania materiału roślinnego o wysokim stopniu znakowania wynoszącym 6,7 atom% azotu 15; niewielkie rozcieńczenie docelowego znacznika azotu 15 mogło być spowodowane obecnością naturalnie występującego azotu w podłożu do doniczek lub w wyniku naturalnego zaszczepienia glebą. Znakowanie węglem 13 z użyciem docelowego 4,4 atom% dwutlenku węgla 13 C poskutkowało uzyskaniem 4,46 atom% węgla 13. W całej ściółce z jednorodnie znakowanego materiału roślinnego, rośliny różnicowo znakowane, które zostały usunięte z komory na 7, 14 lub 22 dni przed zbiorem, wykazywały istotne różnice w zawartości węgla 13 i azotu 15.

Zawartość w komponentach metabolicznych uzyskanych jako ekstrakty wodne w wysokiej temperaturze oraz w komponentach strukturalnych uzyskanych jako pozostałości po ekstrakcji wodnej w wysokiej temperaturze, wskazująca na zróżnicowane znakowanie metabolicznych i strukturalnych materiałów roślinnych. Po opracowaniu, ciągłe podwójne znakowanie izotopowe utorowało drogę badaczom w dziedzinie biogeochemii do badania losów i transformacji komponentów roślinnych w środowisku w skali makro i nano.