Wielowarstwowe mocowanie do długotrwałej mikroskopii świetlnej danio pręgowanego

Ogólnym celem tej procedury jest zamontowanie zarodka danio pręgowanego do długotrwałej mikroskopii świetlnej in vivo. Osiąga się to poprzez uprzednie oczyszczenie rurki fluorowanej, etylenowo-propylenowej lub FEP i pokrycie jej metylocelulozą. Następnie powlekany jest interesujący zarodek danio pręgowanego.

Następnie zarodek przenoszony jest najpierw do stopionej agarozy, a następnie do powlekanej rurki FEP. Na koniec dno probówki zamyka się zatyczką aros i dokładnie sprawdza się orientację zamontowanego zarodka. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują niezakłócony rozwój zarodków zebry danio pręgowanego w ciągu kilku dni z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową dzięki mikroskopii świetlnej in vivo.

Cóż, główną zaletą w stosunku do istniejących technik jest to, że możemy teraz obserwować zarodki super ryb przez kilka dni, a nie tylko kilka godzin. Metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat długoterminowej embriogenezy zebry pręgowanego przy użyciu mikroskopii świetlnej. Może być również stosowany do innych małych organizmów, takich jak małe organizmy morskie.

Może być również stosowany z innymi technikami mikroskopii, takimi jak optyczna tomografia projekcyjna, mikroskopia szerokokątna lub mikroskopia konfokalna. Osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, mogą mieć trudności, ponieważ protokół obejmuje pewne krytyczne czasowo kroki, a ocena ostatecznej pozycji zarodka wymaga pewnej wiedzy Aby przygotować probówkę FEP Najpierw wyczyść ją, wielokrotnie przepłukując ją jednym molowym wodorotlenkiem sodu. Następnie przenieś probówkę do 50-mililitrowej probówki wirówkowej wypełnionej 0,5 molowym wodorotlenkiem sodu i ultradźwiękową ósemką przez 10 minut.

Przenieś rurkę polimerową do małej miski z destylowaną wodą dejonizowaną i przepłucz ją. Następnie przepłucz go 70% etanolem przed przeniesieniem go do świeżej probówki wirówkowej. Z ultrasami na etanolu.

Sonikuj probówkę przez 10 minut przed przeniesieniem jej do małej miski z destylowaną wodą dejonizowaną i przepłukaniem. Znów. Pokrój czystą rurkę FEB na trzycentymetrowe kawałki i wyprostuj je, jeśli to konieczne. Przechowuj oczyszczone probówki w świeżej 50-mililitrowej probówce wypełnionej destylowaną wodą dejonizowaną.

Przygotować roztwór podstawowy Trica. 3% metylocelulozy i zarówno 1,5%, jak i 0,1% Aros zgodnie z protokołem tekstowym. Rozpuść 1,5% agarro i wlej go na szalkę Petriego, aby utworzyć warstwę o grubości około dwóch milimetrów.

Zebrać zarodki danio pręgowanego na pożądanym etapie, które mają dodatnią ekspresję wybranego genu fluorescencji i przenieść je do świeżego naczynia z E 3 pod stereoskopem. Używając dwóch ostrych kleszczy, ostrożnie pokryj zarodki, używając jednego kleszcza do przytrzymania korionu, a drugiego kleszczy, aby rozerwać go i ściągnąć w celu przeprowadzenia wielowarstwowego mocowania. Rękami w rękawiczkach przymocuj kaniulę z końcem do strzykawki.

Ostrożnie włóż kaniulę na około trzy milimetry do jednego końca oczyszczonego kawałka rurki FEP. Następnie zanurz wolny koniec rurki FEP w 3% metylocelulozie i napełnij probówkę roztworem. Następnie powoli nacisnąć strzykawkę, aby uwolnić metylocelulozę za pomocą pożywki E trzy, powtórzyć kroki zanurzania i wydalania.

Tymczasem w bloku grzewczym podgrzej jedną porcję 0,1%aros do 70 stopni Celsjusza. Krótko przemieszaj rurkę reakcyjną przed przeniesieniem jej do bloku grzewczego ustawionego na 38 stopni Celsjusza. Po podgrzaniu pozwól probówce na chwilę ostygnąć i dodaj trica do końcowego stężenia od 133 do 200 miligramów na litr i wiruj.

Ponownie, za pomocą szklanej pipety do pasty. Przenieść powleczony zarodek do probówki reakcyjnej z podgrzanym arosem, przenosząc jak najmniej E trzy. Za pomocą rurki FEP i dołączonej strzykawki delikatnie nabierz niewielką ilość aros przed pobraniem zarodka i całkowicie napełnij probówkę aros.

Zarodek powinien być umieszczony na obu końcach rurki z głową skierowaną w stronę otworu. Aby uniknąć wycieku zawartości, trzymaj rurkę w pozycji poziomej, aby podłączyć rurkę. Użyj żyletki, aby odciąć go od kaniuli.

Następnie trzymając rurkę prostopadle, powoli przełóż jej koniec przez całą warstwę 1,5% aros i lekko ją obróć. Aby uniknąć wysuszenia, przed obrazowaniem należy przechowywać zamontowaną próbkę w 1,5-mililitrowej probówce reakcyjnej wypełnionej pożywką E trzy. Sprawdź, czy ryba wewnątrz rurki FEP jest ustawiona prosto, a następnie jej głowa znajduje się bezpośrednio na wtyczce w celu obrazowania.

Dodać trikę do pożywki znajdującej się w komorze obrazowania. Pokazany tutaj jest transgeniczny jeden dzień po zapłodnieniu. Zarodek danio pręgowanego K-G-R-L-G-F-P obrazowany w ciągu dwóch dni w celu obserwacji rozwoju układu krwionośnego.

Danio pręgowany nie jest ograniczony przez podłoże montażowe i może się normalnie rozwijać. Na przykład jego głowa podnosi się. Ogon rozciąga się, a kiełkowanie naczyń krwionośnych wydaje się niezakłócone.

Tę technikę można wykonać w 10 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo, a cały materiał jest łatwo dostępny. Pamiętaj, aby wykonać wszystkie główne kroki bez zwłoki. Utrzymuj wszystkie roztwory w czystości, ponieważ brud może pogorszyć końcową jakość obrazu.