Wielowarstwowe mocowanie do długotrwałej mikroskopii świetlnej danio pręgowanego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest unieruchomienie zarodka danio pręgowanego do długoterminowej mikroskopii arkusza światła in vivo. Osiąga się to poprzez uprzednie oczyszczenie rurki z fluoretylowego propylenu (FEP), a następnie pokrycie jej metylocelulozą. Następnie pokrywa się wybrany zarodek danio pręgowanego.

Następnie zarodek przenosi się najpierw do stopionej agarozy, a potem do powlekanej rurki FEP. Na koniec dno rurki zamyka się korkiem z arosu i dokładnie sprawdza orientację zamocowanego zarodka. W rezultacie można uzyskać obrazy pokazujące niezakłócony rozwój zarodków zebra fish przez kilka dni z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową przy użyciu mikroskopii arkuszowej światła in vivo.

Główną zaletą w porównaniu z istniejącymi technikami jest to, że możemy teraz obserwować embriony ryb przez kilka dni, a nie tylko przez kilka godzin. Metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat długoterminowej embriogenezy danio pręgowanego z wykorzystaniem mikroskopii arkusza światła. Może ona zostać zastosowana również do innych małych organizmów, takich jak drobne organizmy morskie.

Można go również stosować w połączeniu z innymi technikami mikroskopowymi, takimi jak optyczna tomografia projekcyjna, mikroskopia szerokopolowa lub mikroskopia konfokalna. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ protokół obejmuje kroki krytyczne czasowo, a określenie ostatecznego położenia embrionu wymaga pewnego doświadczenia. Aby przygotować probówkę z FEP, należy najpierw oczyścić ją, wielokrotnie przepłukując 1 M wodorotlenkiem sodu. Następnie probówkę przenosi się do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml wypełnionej 0,5 M wodorotlenkiem sodu i poddaje działaniu ultradźwięków przez 10 minut.

Przenieś polimerową rurkę do niewielkiej kuwety z destylowaną wodą dejonizowaną i przemyj ją. Następnie przemyj rurkę 70% etanolem, przed przeniesieniem jej do nowej probówki do wirowania. Zastosuj sonikację w etanolu.

Sonicuj probówkę przez 10 minut, a następnie przenieś ją do małej miedniczki z wodą destylowaną i dejonizowaną w celu wypłukania. Powtórz tę czynność. Potnij czystą probówkę FEB na odcinki o długości trzech centymetrów i w razie potrzeby je wyprostuj. Przechowuj oczyszczone probówki w nowej probówce o pojemności 50 ml wypełnionej wodą destylowaną i dejonizowaną.

Przygotuj roztwór zapasowy Trica. 3% metylocelulozę oraz roztwory Aros w stężeniach 1,5% i 0,1% zgodnie z protokołem tekstowym. Roztop 1,5% agarro i wlej go do szalki Petriego, aby utworzyć warstwę o grubości około dwóch milimetrów.

Zebrał zarodki danio pręgowanego na pożądanym etapie rozwoju, które wykazują pozytywną ekspresję wybranego genu fluorescencyjnego, i za pomocą stereomikroskopu przenieś je do nowej szalki z roztworem E3. Używając dwóch ostrych pęset, ostrożnie usuń chorion: jedną pęsetą przytrzymaj chorion, a drugą przerwij go i odciągnij, aby umożliwić montaż wielowarstwowy. W rękawiczkach przymocuj kaniulę z tępym końcem do strzykawki.

Ostrożnie wprowadź kaniulę na około trzy milimetry do jednego końca oczyszczonego odcinka rurki FEP. Następnie zanurz wolny koniec rurki FEP w 3% metylocelulozie i wypełnij rurkę roztworem. Potem powoli naciskaj strzykawkę, aby wypchnąć metylocelulozę za pomocą medium E three, powtarzając kroki zanurzania i wypychania.

W tym czasie w bloku grzewczym podgrzać jedną alikwot 0,1%aros do 70 °C. Krótko wymieszać probówkę z reakcją w wstrząsarze typu vortex przed przeniesieniem jej do bloku grzewczego ustawionego na 38 °C. Po podgrzaniu pozwolić probówce krótko ostygnąć, dodać trica do stężenia końcowego od 133 do 200 mg/L i wymieszać w wstrząsarze typu vortex.

Ponownie, używając szklanej pipety pasterskiej, przenieś powleczony embrion do probówki reakcyjnej z podgrzanym roztworem aros, przenosząc jak najmniejszą ilość E trzy. Za pomocą probówki FEP z przymocowaną strzykawką delikatnie pobierz niewielką ilość aros przed pobraniem embrionu, a następnie całkowicie wypełnij probówkę roztworem aros.

Zarodek należy umieścić na jednym z końców probówki, tak aby głowa była skierowana w stronę otworu. Aby zapobiec wyciekowi zawartości, probówkę należy trzymać w pozycji poziomej, aby ją zatkać. Do odcięcia zarodka od kaniuli należy użyć żyletki.

Następnie, trzymając probówkę prostopadle, powoli wbijamy jej koniec przez całą warstwę 1,5% agarozy i lekko obracamy. Aby zapobiec wysychaniu, przed obrazowaniem należy przechowywać zamocowany preparat w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml wypełnionej pożywką E3. Należy upewnić się, że ryba w probówce FEP jest ustawiona prosto, a jej głowa spoczywa bezpośrednio na zatyczce w celu przeprowadzenia obrazowania.

Dodaj tricaine do medium wewnątrz komory obrazowania. Przedstawiony tutaj jest transgeniczny embrion zebrafish K-G-R-L-G-F-P jeden dzień po zapłodnieniu, obrazowany przez dwa dni w celu obserwacji rozwoju naczyń krwionośnych.

Danio pręgowany nie jest ograniczany przez medium montażowe i może rozwijać się prawidłowo. Na przykład, jego głowa unosi się. Ogon wydłuża się, a wypustki naczyniowe pojawiają się bez przeszkód.

Tę technikę można przeprowadzić w 10 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo i wszystkie materiały są łatwo dostępne. Należy pamiętać, aby wszystkie główne kroki wykonywać bez zbędnej zwłoki. Wszystkie roztwory muszą pozostać czyste, ponieważ zanieczyszczenia mogą pogorszyć końcową jakość obrazu.