Name: Wielowarstwowe mocowanie do długotrwałej mikroskopii świetlnej danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-27T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Poznaj metodę wielowarstwowego mocowania embrionów Danio rerio do długotrwałej mikroskopii świetlnej. Technika umożliwia obserwację rozwoju zarodków przez kilka dni z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Towarzystwu Maxa Plancka, Human Frontier Science Program (HFSP) oraz Boehringer Ingelheim Fonds za finansowanie i wsparcie.

1. Przygotowanie materiałów
<ol>
	<li>Przygotowanie rurek FEP
	<ol>
		<li>Oczyść rurkę FEP (Rysunek 2A), przepłukując ją cieczami (zgodnie z poniższymi krokami) za pomocą strzykawki z przymocowaną kaniulą tępą (Rysunek 2B). Uwaga 1: Przez cały czas trwania procedury należy używać rękawiczek. Uwaga 2: Zaleca się pocięcie rurki na odcinki o długości ok. 1 m i ich równoległe czyszczenie.
		<ol>
			<li>Najpierw kilkakrotnie przepłucz rurkę 1 M NaOH. Następnie przenieś rurkę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml wypełnionej 0,5 M NaOH i poddaj działaniu ultradźwięków przez 10 min.</li>
			<li>Przenieś polimerową rurkę do małej kuwetki z ddH2O. Przepłucz rurkę najpierw ddH2O, a następnie 70% EtOH.</li>
			<li>Następnie przenieś rurkę FEP do nowej probówki wirówkowej z 70% EtOH. Ponownie poddaj tę probówkę działaniu ultradźwięków przez 10 min.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Potnij oczyszczoną rurkę FEP na kawałki o długości około 3 cm (typowa długość stosowana do montażu i obrazowania danio pręgowanego) i w razie potrzeby je wyprostuj. Przechowuj oczyszczone rurki FEP w nowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml wypełnionej ddH2O (Rysunek 2C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu zapasowego trikainy
	<ol>
		<li>Przygotuj 0,4% roztwór zapasowy trikainy, rozpuszczając 400 mg trikainy (MS-222) w 97,9 ml ddH2O. Po całkowitym rozpuszczeniu proszku dostosuj pH do wartości 7,0, używając 2,1 ml 1 M Tris (pH 9,0). Chronić roztwór przed światłem. Alikwoty przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie 3% metylocelulozy
	<ol>
		<li>Przygotuj 3% roztwór metylocelulozy do powlekania wewnętrznej rurek FEP zgodnie z poniższym opisem. Podgrzej E311 w szklanej butelce do temperatury około 60-70 °C i dodaj odpowiednią ilość proszku metylocelulozy. Dodaj mieszadło magnetyczne i mieszaj w temperaturze 4 °C. Gdy tylko roztwór ochłodzi się poniżej 30 °C, dodaj roztwór trikainy do stężenia końcowego 100 mg/L. Mieszać w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie 1,5% i 0,1% agarozy w E3
	<ol>
		<li>Rozpuść odpowiednią ilość agarozy niskotopliwej w określonej objętości E3 w kolbie szklanej. Podgrzewaj mieszaninę w kuchence mikrofalowej i od czasu do czasu wstrząsaj, aż roztwór agarozy stanie się jednorodny i nie będzie w nim widocznych kryształów.</li>
		<li>Przygotuj alikwoty 1 ml 0,1% roztworu agarozy w probówkach reakcyjnych o pojemności 1,5 ml. Alikwoty można przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Użyj 1,5% roztworu do powlekania plastikowej szalki Petriego. Grubość warstwy agarozy powinna wynosić ok. 2 mm. Po zestaleniu agarozy dodaj na wierzch warstwy medium E3, aby zapobiec jej wysychaniu. Powleczoną szalkę można przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie danio pręgowanego
	<ol>
		<li>Dorosłe osobniki i embriony danio pręgowanego (Danio rerio) utrzymuj w temperaturze 28,5 °C i traktuj zgodnie z ustalonymi protokołami11,12.</li>
		<li>Po południu umieść ryby płci męskiej i żeńskiej w jednym zbiorniku i oddziel je przegrodą. Usuń przegrodę następnego ranka, aby kontrolować czas tarła ryb.</li>
		<li>Zbierz embriony do szalki wypełnionej E3 i obejrzyj je pod stereomikroskopem.</li>
		<li>W 24 hpf (lub w interesującym Cię stadium rozwoju) wybierz embriony danio pręgowanego wykazujące ekspresję fluorescencyjną i przenieś osobniki pozytywne do nowej szalki ze świeżym E3.</li>
		<li>Ostrożnie usuń otoczkę jaj z embrionów za pomocą dwóch ostrych pęset (Rysunki 2D i 2E). Pierwszą pęsetą chwyć i przytrzymaj otoczkę, a drugą rozetnij ją i oderwij. Uwaga 1: Krok ten należy wykonać przy użyciu stereomikroskopu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Montowanie wielowarstwowe
<ol>
	<li>Powlekanie rurki FEP
	<ol>
		<li>Przymocuj kaniulę z tępym końcem do strzykawki. Ostrożnie wprowadź kaniulę na głębokość około 3 mm do jednego końca oczyszczonego i dociętego fragmentu rurki FEP (Rycina 2F oraz 2G). Uwaga 1: Należy używać rękawiczek i unikać zginania lub ściskania rurki.</li>
		<li>Zanurz wolny koniec rurki FEP w 3% metylocelulozie i wypełnij rurkę roztworem.</li>
		<li>Powoli usuń metylocelulozę, naciskając tłok strzykawki. Roztwór należy zutylizować.</li>
		<li>Powtórz kroki 2.1.2 i 2.1.3, używając E3. Uwaga 1: Powlekane rurki należy wykorzystać do montażu natychmiast.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenoszenie danio pręgowanego do agarozy
	<ol>
		<li>Podgrzej jedną porcję 0,1% agarozy do 70°C w bloku grzewczym. Krótko wymieszaj probówkę reakcyjną w wirówce typu vortex i przenieś ją do bloku grzewczego ustawionego na 38 °C (Rycina 2H).</li>
		<li>Wyjmij probówkę reakcyjną z bloku grzewczego i pozostaw ją na chwilę do schłodzenia. Dodaj trikainę do stężenia końcowego 133-200 mg/L i ponownie wymieszaj w vortexie (Rycina 2I).</li>
		<li>Wybierz jeden z zdechorionowanych embrionów danio pręgowanego i za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieś go do probówki reakcyjnej z podgrzaną 0,1% agarozą (Ryciny 2J oraz 2K). Uwaga 1: Staraj się przenieść jak najmniejszą ilość dodatkowego E3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż danio pręgowanego
	<ol>
		<li>Pobierz embrion za pomocą rurki FEP przymocowanej do strzykawki (Rycina 2L). Rurka powinna być całkowicie wypełniona 0,1% agarozą, a embrion powinien znajdować się blisko jednego z końców rurki, z głową skierowaną w stronę otworu rurki. Uwaga 1: Pamiętaj, aby pobrać trochę agarozy przed pobraniem ryby. Uwaga 2: Ciągnij tłok strzykawki bardzo delikatnie, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza. Uwaga 3: Trzymaj rurkę w orientacji poziomej, aby uniknąć wycieku jej zawartości (Ryciny 2M oraz 2N).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zatykanie rurki
	 <img alt="Układ do mikroiniekcji polimerów; obejmuje strzykawki, system grzewczy i mikrofluidykę do badań materiałowych." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
	Rycina 2. Wielowarstwowy montaż embrionów danio pręgowanego. A) Rurki z fluoetylenopolipropylenu (FEP) na szpuli przed przygotowaniem. B) Strzykawka z przymocowaną kaniulą z tępym końcem. C) Oczyszczona i docięta rurka FEP. D, E) Dechorionacja embrionów danio pręgowanego w 24 hpf. F) Mocowanie rurki do kaniuli z tępym końcem. G) Strzykawka z przymocowaną kaniulą i rurką. H) Porcja 0,1% agarozy w probówce reakcyjnej podczas przenoszenia do bloku grzewczego. I) Mieszanie roztopionej agarozy w vortexie. J) Pobieranie zdechorionowanego embrionu za pomocą szklanej pipety. K) Przenoszenie embrionu do roztopionej agarozy. L) Pobieranie embrionu wraz z otaczającą go agarozą do rurki FEP. M, N) Embrion danio pręgowanego wewnątrz rurki FEP. O) Odcinanie rurki pomiędzy preparatem a kaniulą. P) Zatykanie rurki za pomocą szalki powlekanej agarozą. Q) Embrion wewnątrz zatkanej rurki. R) Końcowe przygotowanie próbki w uchwycie metalowym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększony obraz.</a> 
	<ol>
		<li>Użyj żyletki, aby odciąć rurkę od kaniuli (Rycina 2O).</li>
		<li>Powoli wsuń koniec rurki zawierający rybę przez całą warstwę 1,5% agarozy w plastikowej szalce, aby zatkać rurkę (Rycina 2P). Uwaga 1: Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza i staraj się uzyskać prostą powierzchnię korka, trzymając rurkę dokładnie prostopadle do powierzchni agarozy. Uwaga 2: Lekko obróć rurkę, aby uzyskać szczelny korek.</li>
		<li>Przechowuj zamontowany preparat w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml z E3, aby zapobiec wysychaniu. Próbka jest teraz gotowa do obrazowania. Przed obrazowaniem sprawdź, czy ryba znajduje się bezpośrednio nad korkiem (Ryciny 2Q oraz 2R). Pamiętaj, aby dodać trikainę do medium w komorze obrazującej w tym samym stężeniu, co w medium montażowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li>
<li>Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+functional+imaging+at+cellular+resolution+using+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy.</a> Nat. Methods. 10 (5), 413-420 (2013).</li>
<li>Swoger, J., Muzzopappa, M., López-Schier, H., Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4D+retrospective+lineage+tracing+using+SPIM+for+zebrafish+organogenesis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophoton%22%5BJournal%5D)">4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies.</a> J. Biophoton. 4 (1-2), 122-134 (2011).</li>
<li>Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+phototoxicity+during+the+development+of+a+zebrafish+craniofacial+bone+using+confocal+and+light+sheet+fluorescence+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophoton%22%5BJournal%5D)">Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques.</a> J. Biophoton. , 1-11 (2012).</li>
<li>Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+microscopy+for+real-time+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Light sheet microscopy for real-time developmental biology.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 566-572 (2011).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKeller%2C+PJ+%22Cold+Spring+Harb.+Prot%22">Cold Spring Harb. Prot</a>. 2010 (5), (2010).</li>
<li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+imaging+of+entire+embryos+with+Digital+Scanned+Laser+Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).</li>
<li>Desmaison, A., Lorenzo, C., Rouquette, J., Ducommun, B., Lobjois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+sample+holder+for+single+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A versatile sample holder for single plane illumination microscopy.</a> J. Microsc. 10, (2013).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li>
<li>Nusslein-Volhard, C., Zebrafish Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J. Vis. Exp. (69), (2012).</li>
<li>Jin, S. -W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. -N., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).</li>
<li>Pauls, S., Geldmacher-Voss, B., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+histone+variant+H2A.F%2FZ+and+a+transgenic+H2A.F%2FZ%3AGFP+fusion+protein+for+in+vivo+studies+of+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">A zebrafish histone variant H2A.F/Z and a transgenic H2A.F/Z:GFP fusion protein for in vivo studies of embryonic development.</a> Dev. Genes Evol. 211 (12), 603-610 (2001).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Frazier, D. T., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricaine+%28MS-222%29%3A+effects+on+ionic+conductances+of+squid+axon+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Tricaine (MS-222): effects on ionic conductances of squid axon membranes.</a> Eur. J. Pharmacol. 33 (2), 313-317 (1975).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zaawansowane techniki mikroskopowe, takie jak mikroskopia arkuszowa światła, umożliwiają nam rejestrowanie danych obrazowych z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w ciągu kilku dni, ale wymagają również poprawy technik mocowania próbek. Przedstawiamy szczegółowy protokół wielowarstwowego montażu do mikroskopii arkuszowej światła rozwoju danio pręgowanego. Metoda jest prosta do wdrożenia i używamy jej w naszym laboratorium na co dzień.
Rury FEP
Kluczowym elementem naszej strategii montażu są rury wykonane z polimeru Fluorowany Etylen Propylen (FEP). Zdecydowaliśmy się na użycie FEP przede wszystkim ze względu na jego współczynnik załamania światła wynoszący 1,338, który jest podobny do wody i dlatego idealnie nadaje się do lekkiej mikroskopii arkuszowej z obiektywami zanurzającymi w wodzie i próbkami wymagającymi mediów wodnych. Rurki o średnicy wewnętrznej 0,8 mm i grubości ścianki 0,4 mm bardzo dobrze pasują do rozwijającego się danio pręgowanego, mogą być używane z typowymi uchwytami na próbki przystosowanymi do kapilar 1,6 mm i są naszym pierwszym wyborem dla prezentowanej metody montażu. Przetestowaliśmy je dokładnie w naszych domowych konfiguracjach, a także w komercyjnym systemie "Lightsheet Z.1" firmy Carl Zeiss Microscopy i stwierdziliśmy, że lampy FEP zapewniają długoterminową stabilność, mają tylko minimalny wpływ na wydajność optyczną i są niefluorescencyjne10. Nie nadają się jednak do zastosowań z próbkami, które wymagają innego współczynnika załamania światła, np. oczyszczoną próbką.
Tuby i folie wykonane z FEP są dostępne w różnych średnicach i grubościach. Ponadto FEP może być topiony w temperaturze 260 °C, co daje praktycznie nieskończone możliwości montażu niestandardowych podpór do próbek. Rurki polimerowe są zwykle dostarczane w stanie niesterylnym, dlatego protokół czyszczenia obejmuje kilka kroków w celu zapewnienia najlepszej jakości optycznej. Powłoka metylocelulozą zapewnia, że żadna część rosnącego zarodka danio pręgowanego nie przykleja się do polimeru.
Medium montażowe
Decyzja o zastosowaniu 0,1% agarozy opiera się na szeroko zakrojonych testach tempa wzrostu i bezruchu w różnych stężeniach agarozy i metylocelulozy10. Stężenia agarozy powyżej 0,1% wykazały już poważny wpływ na tempo wzrostu danio pręgowanego o wartości 24 hpf. Dodatkowo stosujemy niskie dawki leku znieczulającego Trikaina. Trikaina blokuje potencjały czynnościowe, hamując w ten sposób przekazywanie sygnałów między mózgiem a mięśniami i hamując skurcze mięśni16. Stężenie 133-200 mg/L zapewnia wystarczające unieruchomienie danio pręgowanego w zakresie 24-72 hpf. Jednak Trikaina i inne testowane przez nas leki znieczulające wykazują skutki uboczne zależne od dawki, takie jak obrzęk serca. Dodatkowo wymagana dawka Trikainy różni się w zależności od etapu rozwoju zarodka. Dlatego zalecamy zmniejszenie stężenia trikainy do ilości potrzebnej do zobrazowanych etapów rozwojowych. W celu zapewnienia najlepszej wydajności i zapobieżenia tworzeniu się toksycznych produktów ubocznych należy stosować świeżo przygotowany lub rozmrożony roztwór podstawowy trikainy, chroniony przed światłem i nie podgrzewany powyżej 30 °C.
Osadzenie w rurach FEP pozwala również na łatwą modyfikację medium montażowego w celu uwzględnienia konkretnych potrzeb. Do obrazowania poklatkowego serca zalecamy użycie 3% metylocelulozy i 100 mg/L trikainy zamiast 0,1% agarozy i 200 mg/L do montażu. Metyloceluloza jest bardziej lepka niż 0,1% agarozy, dzięki czemu sama w sobie zapewnia większy unieruchomienie i potrzeba mniej trikainy, aby zapewnić uwięzienie zarodka.
Trikaina jest wrażliwa na temperatury powyżej 30 °C i może być również rozcieńczana przez pożywkę w komorze obrazowania, co prowadzi do zmniejszenia wydajności i możliwego drgania zarodka. Dlatego należy upewnić się, że Trikaine jest używana również w podłożu obrazowym, w którym zanurzona jest zamontowana próbka. Jeśli twoje eksperymenty wymagają użycia wyższych temperatur, zalecamy ciągłą wymianę pożywki w komorze obrazowania za pomocą systemu perfuzyjnego lub ręcznie za pomocą rurki i strzykawki między dwoma punktami czasowymi.
Kroki krytyczne
Krytycznymi etapami procesu mocowania próbki jest wprowadzenie próbki do probówki i włożenie korka agarozowego. Wlot określa początkową pozycję zarodka, której późniejsza zmiana jest kłopotliwa. Powinno być dostępnych wiele próbek do zamontowania, a jakość montażu powinna być monitorowana za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Jeśli orientacja próbki nie jest zadowalająca, pomocna może być zmiana szybkości pobierania próbki i unikanie kolejnych ruchów tłoka, ponieważ często powoduje to skręcenie zarodka. Korek 1,5% agarozy jest niezbędny, aby uniknąć wycieku 0,1% agarozy. Powierzchnia korka wewnątrz rurki powinna być płaska, aby nie wpływać na orientację próbki podczas wywoływania. Aby uzyskać dobrą powierzchnię, należy przetestować różne grubości warstw agarozy, a rurkę należy umieścić w agarozie normalnie do powierzchni. Obracając nieco rurkę i wyciągając rurkę, ostrożnie wyjmuje się korek z naczynia. Jakość montażu należy sprawdzić za pomocą mikroskopu stereoskopowego przed obrazowaniem.
Obrazowanie wielowidokowe
Jedną z głównych zalet mikroskopii arkuszy świetlnych jest obrazowanie wielowidokowe, możliwość obracania próbki, pozyskiwania stosów z wielu kątów, a następnie ich rejestracji i łączenia. Uznaną metodą rejestracji stosów z w przestrzeni 3D jest rejestracja oparta na koralikach przy użyciu koralików fluorescencyjnych otaczających próbkę jako znaczników powierniczych 17. Metoda ta opiera się jednak na solidnym medium mocującym, takim jak 1,5% agarozy, a zatem wydaje się być niekompatybilna z przedstawionym tutaj mocowaniem wielowarstwowym. Ale kilka alternatywnych rozwiązań działa w zależności od aplikacji. Po pierwsze, koraliki fluorescencyjne mogą zostać włączone do korka agarozowego, który musi znajdować się w polu widzenia podczas akwizycji. Po drugie, pozycje stolika można skalibrować przed właściwymi eksperymentami za pomocą 1,5% kolumny agarozowej z koralikami fluorescencyjnymi. Po trzecie, alternatywne markery, takie jak jądra fluorescencyjne, mogą być używane do identyfikacji położenia stosów z względem siebie.
Parowanie
Typowe zestawy mikroskopii arkuszowej wykorzystują otwartą komorę na próbkę, co nieuchronnie prowadzi do odparowania pożywki. Ponieważ podłoże ma zasadnicze znaczenie dla przetrwania próbki, ograniczenia parowania medium montażowego i prawidłowego współczynnika załamania światła między optyką a próbką, zalecamy podjęcie co najmniej jednego z poniższych środków w celu zapobieżenia parowaniu. Po pierwsze, medium w komorze może być stale wymieniane przez system perfuzyjny. Po drugie, podłoże można ponownie napełnić ręcznie. Po trzecie, komorę można przykryć pokrywką lub elastyczną folią.
Zaopatrzenie w tlen
Polimer FEP został opracowany tak, aby był odporny na wiele różnych chemikaliów, a zatem jest wytrzymały, chemicznie obojętny i nieprzepuszczalny dla gazów. W przypadku montażu wielowarstwowego tlen może przenikać tylko przez korek agarozowy i granicę faz agaroza-powietrze, ale pozostaje do pokazania, czy dopływ tlenu w montażu wielowarstwowym jest znacznie niższy w porównaniu z montażem w 1,5% agarozie bez podtrzymującej rurki polimerowej. Jednakże, ponieważ montaż w 1,5% agarozie może być używany tylko przez około dwie godziny, zanim morfologia danio pręgowanego zostanie naruszona, montaż wielowarstwowy wydaje się być ogólnie lepszym rozwiązaniem dla długoterminowego obrazowania.
Obrazowanie na wcześniejszych etapach rozwoju
Montaż wielowarstwowy stał się obecnie naszą standardową techniką osadzania w poklatkowej mikroskopii świetlnej danio pręgowanego o mocy powyżej 24 hpf. Oprócz tego używamy również probówek polimerowych do obrazowania zarodków we wczesnym stadium rozwoju. Zarodki pozostają w swoich kosmówkach i są umieszczane w probówce FEP o średnicy wewnętrznej 1 mm i wypełnione E3. Danio pręgowany może swobodnie rozwijać się wewnątrz kosmówki i nadal może być dobrze zobrazowany za pomocą mikroskopii świetlnej.
Programu outlook
Prezentowane wielowarstwowe mocowanie próbek uwalnia pełny potencjał mikroskopii arkuszowej światła do biologii rozwojowej danio pręgowanego w czasie rzeczywistym. Można go łatwo zastosować w innych technikach mikroskopowych, takich jak optyczna tomografia projekcyjna (OPT) i inne organizmy. Wierzymy, że tuby FEP o standardowych rozmiarach to dopiero pierwszy krok w kierunku przykładowych technik montażu dostosowanych do konkretnych potrzeb.

Aby zrozumieć złożone zdarzenia i interakcje zachodzące podczas embriogenezy, badania w biologii rozwoju coraz częściej przechodzą od mikroskopii pojedynczych komórek i organów do obrazowania in vivo całych organizmów. Tradycyjne techniki mikroskopowe zazwyczaj nie zapewniają rozdzielczości przestrzennej i czasowej niezbędnej do śledzenia szybkich zdarzeń przez długi czas, a często powodują blaknięcie (bleaching) lub efekty fototoksyczne w próbce1. My oraz inni badacze uznaliśmy mikroskopię arkusza światła (Rycina 1) za idealną technikę do obrazowania in vivo danio pręgowanego2-4. Oświetlenie próbki cienkim arkuszem światła laserowego, prostopadłym do osi detekcji, zapewnia szybkie sekcjonowanie optyczne z wysoką rozdzielczością przestrzenną oraz zminimalizowaną fototoksycznością5. Jednocześnie, ze względu na ten unikalny układ optyczny, tradycyjne techniki montowania próbek z wykorzystaniem szalek Petriego lub komór hodowlanych nie są odpowiednie. W typowym mikroskopie arkusza światła trzy silniki translacyjne i jeden silnik obrotowy utrzymują próbkę w taki sposób, aby można ją było precyzyjnie ustawić, obrócić i oglądać z dowolnego kierunku. W przeszłości preparaty do mikroskopii arkusza światła często zatapiano w 1-2% agarozie wewnątrz szklanej kapilary6,7. W takim przypadku stwardniały cylinder agarozy z zatopionym preparatem jest wysuwany z kapilary szklanej do komory z próbką wypełnionej medium zbliżonym do wody w celu obrazowania. Agaroza ma współczynnik załamania światła zbliżony do wody, przez co doskonale nadaje się do mikroskopii arkusza światła in vivo, co ułatwia zastosowanie optyki oświetleniowej i detekcyjnej korygowanej do wody. Próbka jest unieruchomiona w sztywnej agarozie i może być dobrze obrazowana przez krótki czas, jednak zmiany morfogenetyczne i wzrost zarodka są silnie upośledzone podczas obrazowania trwającego kilka godzin7,8. Chociaż opracowano rozwiązania dla innych zastosowań9, potencjał mikroskopii arkusza światła w zakresie nieinwazyjnego, długoterminowego obrazowania time-lapse danio pręgowanego nie może zostać w pełni wykorzystany przy zastosowaniu konwencjonalnego zatapiania w 1,5% agarozie.
Opracowaliśmy zatem nową strategię montażu dla mikroskopii arkusza światła in vivo embrionów ryb danio10. Próbkę montuje się w 0,1% agarozie z 200 mg/L trikainy wewnątrz rurki wykonanej z optycznie przezroczystego polimeru – perfluor乙ylenu propylenu (FEP). Osadzony embrion rozwija się prawidłowo dzięki niskiej lepkości medium. Jednocześnie rurka FEP ogranicza medium i próbkę przez cały czas trwania eksperymentu. W niniejszym materiale przedstawiamy szczegółowy protokół nowej techniki montażu oraz prezentujemy dane odzwierciedlające jej zalety w porównaniu z konwencjonalnym protokołem. Wykazujemy, że dzięki naszej metodzie rozwój ryb danio może być obrazowany w sposób ciągły z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową przez okres ponad dwóch dni.
<img alt="Schemat mikroskopii arkusza światła; danio pręgowany w probówce FEP, obiektywy oświetlające i detekcyjne." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Zasada działania mikroskopii arkusza światła. Danio pręgowany umieszczony w probówce wykonanej z fluorowanego etylenu propylenu (FEP) może być przesuwany i obracany w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu detekcyjnego. Cienka warstwa światła laserowego (arkusz światła) jest rzutowana przez obiektyw oświetlający w płaszczyznę ogniskową obiektywu detekcyjnego, oświetlając jedynie cienki przekrój optyczny preparatu. Emitowany sygnał fluorescencyjny jest zbierany przez obiektyw detekcyjny i rejestrowany na matrycy kamery.

<table><tbody><tr><td>Rurki z fluorowanym etylenem i propylenem (FEP)</td><td>Bola</td><td>S 1815-04</td><td>0,8/1,6 mm średnica wewnętrzna/zewnętrzna, dostępne inne rozmiary</td></tr><tr><td>Strzykawka Omnifix-F Solo 1 ml</td><td>B. Jednorazowa kaniula Braun Melsungen AG</td><td>9161406 V</td><td></td></tr><tr><td>Sterican,</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9180109</td><td>0,8 mm x 22 mm, dostępne inne rozmiary, średnica zewnętrzna kaniuli musi pasować do wewnętrznej średnicy rurki</td></tr> <tr><td>FEP50 ml Polipropylenowa probówka wirówkowa</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>1 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 M NaOH&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td>dostarczana w postaci proszku</td></tr><tr><td>Pożywka E3 (dla zarodków danio pręgowanego)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówka reakcyjna</td><td>Eppendorf</td><td>3810X</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza, niska temperatura żelowania</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td>dostarczana w postaci proszku</td></tr><tr><td>Szalka</td> <td>PetriegoGreiner</td><td>633180</td><td>tworzywo sztuczne, 94 mm x 16 mm</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td>synonimy:&nbsp; 3-aminobenzoesan etylu metanosulfonian, MS-222, TS 222, metanosulfonian trikainy&nbsp;</td></tr><tr><td>Obiektyw mikroskopowy 10x/0,3 W Leica</td><td></td><td>HCX APO L</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Kamera</td><td>Andor Technology</td><td>iXon 885 EMCCD</td><td></td></tr></tbody></table>

wielowarstwowe mocowanie do długotrwałej mikroskopii świetlnej danio pręgowanego

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Mikroskopia z użyciem lekkich arkuszy jest idealną techniką obrazowania do badania rozwoju embrionalnego danio pręgowanego. Ze względu na minimalną fototoksyczność i wybielanie, nadaje się szczególnie do długotrwałego obrazowania poklatkowego przez wiele godzin do kilku dni. Potrzebna jest jednak odpowiednia strategia mocowania próbki, która zapewnia zarówno uwięzienie, jak i normalny rozwój próbki. Montaż wielowarstwowy, nowa technika osadzania wykorzystująca agarozę o niskim stężeniu w optycznie przezroczystych probówkach, pokonuje teraz to ograniczenie i uwalnia pełny potencjał mikroskopii arkuszowej światła w biologii rozwoju w czasie rzeczywistym.

Wielodniowe obrazowanie rozwoju układu naczyniowego danio pręgowanego
Wykorzystujemy 1-dniowe (1 dpf) danio pręgowane Tg(kdrl:GFP)13, aby zademonstrować zalety strategii montażu wielowarstwowego w długoterminowej mikroskopii arkusza światła. Celem jest obrazowanie rozwoju naczyń krwionośnych w całym organizmie danio pręgowanego w ciągu 2 dni. Zarodek danio pręgowanego zamocowano w 0,1% agarozie wewnątrz polimerowej rurki powleczonej metylocelulozą. W tym układzie danio pręgowany nie jest ograniczany przez medium montażowe i może rozwijać się normalnie. Głowa unosi się, ogon wydłuża, a kiełkowanie naczyń krwionośnych przebiega bez przeszkód (Rycina 3).
<img alt="Etapy rozwoju kręgosłupa danio pręgowanego, oś czasu 24-78 hpf, mikroskopia fluorescencyjna, analiza wzrostu." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Wielodniowe obrazowanie rozwoju układu naczyniowego danio pręgowanego. Układ naczyniowy danio pręgowanego linii Tg(kdrl:GFP) 13 w wieku 1 dpf, zamontowanego w wielowarstwowym preparacie, rozwija się bez zakłóceń w mikroskopie arkusza światła w ciągu dwóch dni. Fluorescencja była wzbudzana arkuszem światła lasera o długości fali 488 nm, a sygnał wykrywano za pomocą obiektywu 10X/0.3 W i kamery EMCCD. Serie obrazów Z (Z-stacks) pozyskiwano w czterech sąsiednich pozycjach co 10 min, a następnie łączono za pomocą oprogramowania Fiji 15. Przedstawiono projekcje maksymalnej intensywności dla wybranych punktów czasowych. Pasek skali: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
Obrazowanie wczesnego embrionogenezy danio pręgowanego
W niniejszej pracy demonstrujemy możliwość wykorzystania probówek z FEP jako podłoża montażowego w mikroskopii arkusza światła do badania wczesnej embriogenezy danio pręgowanego w ciągu pierwszej doby po zapłodnieniu. Zarodek danio pręgowanego Tg(H2A:GFP)14 w 8 hpf zamontowano wraz z nienaruszoną otoczką w probówce wypełnionej medium E3 o średnicy wewnętrznej 1 mm. Powoduje to niewielki ucisk otoczki. Wszystkie procesy rozwojowe podczas embriogenezy nie są zaburzone przez sposób montażu i mogą być optymalnie wizualizowane za pomocą mikroskopii arkusza światła. W tym przykładzie obrazowano preparat przez okres 12 h (Rycina 4). Typowe zmiany kształtu podczas wczesnej embriogenezy, takie jak zwiększone wydłużenie żółtka i pogrubienie tkanki wzdłuż linii środkowej, zostałyby stłumione przy zastosowaniu tradycyjnego montażu bez otoczki w 1,5% agarozie.
<img alt="Etapy rozwoju embrionalnego w 8-19 hpf; mikroskopia time-lapse, obserwacja wzrostu danio pręgowanego." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Obrazowanie wczesnej embriogenezy danio pręgowanego. Ryba danio pręgowany Tg(H2A:GFP)14 przechodzi przez wczesną embriogenezę. Arkusz światła lasera 488 nm wzbudzał GFP, a sygnał fluorescencyjny był wykrywany za pomocą obiektywu 10X/0,3 W i kamery EMCCD. Serie obrazów Z (Z-stacks) pod dwoma kątami były pozyskiwane co 3 min przez okres 12 hr. Przedstawiono znormalizowane maksymalne projekcje intensywności dla wybranego fragmentu sekwencji time-lapse. Widoczne rozmycie ruchu w 19 hpf wynika z drgań embrionu podczas akwizycji, ponieważ nie stosowano środków znieczulających. Pasek skali: 150 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>

Rozwój danio pręgowanego można obserwować przez wiele dni za pomocą mikroskopii z lekkim arkuszem, gdy zarodki są umieszczane w optycznie przezroczystych rurkach polimerowych z agarozą o niskim stężeniu.

Wielowarstwowe mocowanie do długotrwałej mikroskopii świetlnej danio pręgowanego

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest unieruchomienie zarodka danio pręgowanego do długoterminowej mikroskopii arkusza światła in vivo. Osiąga się to poprzez uprzednie oczyszczenie rurki z fluoretylowego propylenu (FEP), a następnie pokrycie jej metylocelulozą. Następnie pokrywa się wybrany zarodek danio pręgowanego.Następnie zarodek przenosi się najpierw do stopionej agarozy, a potem do powlekanej rurki FEP. Na koniec dno rurki zamyka się korkiem z arosu i dokładnie sprawdza orientację zamocowanego zarodka. W rezultacie można uzyskać obrazy pokazujące niezakłócony rozwój zarodków zebra fish przez kilka dni z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową przy użyciu mikroskopii arkuszowej światła in vivo.Główną zaletą w porównaniu z istniejącymi technikami jest to, że możemy teraz obserwować embriony ryb przez kilka dni, a nie tylko przez kilka godzin. Metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat długoterminowej embriogenezy danio pręgowanego z wykorzystaniem mikroskopii arkusza światła. Może ona zostać zastosowana również do innych małych organizmów, takich jak drobne organizmy morskie.Można go również stosować w połączeniu z innymi technikami mikroskopowymi, takimi jak optyczna tomografia projekcyjna, mikroskopia szerokopolowa lub mikroskopia konfokalna. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ protokół obejmuje kroki krytyczne czasowo, a określenie ostatecznego położenia embrionu wymaga pewnego doświadczenia. Aby przygotować probówkę z FEP, należy najpierw oczyścić ją, wielokrotnie przepłukując 1 M wodorotlenkiem sodu. Następnie probówkę przenosi się do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml wypełnionej 0,5 M wodorotlenkiem sodu i poddaje działaniu ultradźwięków przez 10 minut.Przenieś polimerową rurkę do niewielkiej kuwety z destylowaną wodą dejonizowaną i przemyj ją. Następnie przemyj rurkę 70% etanolem, przed przeniesieniem jej do nowej probówki do wirowania. Zastosuj sonikację w etanolu.Sonicuj probówkę przez 10 minut, a następnie przenieś ją do małej miedniczki z wodą destylowaną i dejonizowaną w celu wypłukania. Powtórz tę czynność. Potnij czystą probówkę FEB na odcinki o długości trzech centymetrów i w razie potrzeby je wyprostuj. Przechowuj oczyszczone probówki w nowej probówce o pojemności 50 ml wypełnionej wodą destylowaną i dejonizowaną.Przygotuj roztwór zapasowy Trica. 3% metylocelulozę oraz roztwory Aros w stężeniach 1,5% i 0,1% zgodnie z protokołem tekstowym. Roztop 1,5% agarro i wlej go do szalki Petriego, aby utworzyć warstwę o grubości około dwóch milimetrów.Zebrał zarodki danio pręgowanego na pożądanym etapie rozwoju, które wykazują pozytywną ekspresję wybranego genu fluorescencyjnego, i za pomocą stereomikroskopu przenieś je do nowej szalki z roztworem E3. Używając dwóch ostrych pęset, ostrożnie usuń chorion: jedną pęsetą przytrzymaj chorion, a drugą przerwij go i odciągnij, aby umożliwić montaż wielowarstwowy. W rękawiczkach przymocuj kaniulę z tępym końcem do strzykawki.Ostrożnie wprowadź kaniulę na około trzy milimetry do jednego końca oczyszczonego odcinka rurki FEP. Następnie zanurz wolny koniec rurki FEP w 3% metylocelulozie i wypełnij rurkę roztworem. Potem powoli naciskaj strzykawkę, aby wypchnąć metylocelulozę za pomocą medium E three, powtarzając kroki zanurzania i wypychania.W tym czasie w bloku grzewczym podgrzać jedną alikwot 0,1%aros do 70 °C. Krótko wymieszać probówkę z reakcją w wstrząsarze typu vortex przed przeniesieniem jej do bloku grzewczego ustawionego na 38 °C. Po podgrzaniu pozwolić probówce krótko ostygnąć, dodać trica do stężenia końcowego od 133 do 200 mg/L i wymieszać w wstrząsarze typu vortex.Ponownie, używając szklanej pipety pasterskiej, przenieś powleczony embrion do probówki reakcyjnej z podgrzanym roztworem aros, przenosząc jak najmniejszą ilość E trzy. Za pomocą probówki FEP z przymocowaną strzykawką delikatnie pobierz niewielką ilość aros przed pobraniem embrionu, a następnie całkowicie wypełnij probówkę roztworem aros.Zarodek należy umieścić na jednym z końców probówki, tak aby głowa była skierowana w stronę otworu. Aby zapobiec wyciekowi zawartości, probówkę należy trzymać w pozycji poziomej, aby ją zatkać. Do odcięcia zarodka od kaniuli należy użyć żyletki.Następnie, trzymając probówkę prostopadle, powoli wbijamy jej koniec przez całą warstwę 1,5% agarozy i lekko obracamy. Aby zapobiec wysychaniu, przed obrazowaniem należy przechowywać zamocowany preparat w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml wypełnionej pożywką E3. Należy upewnić się, że ryba w probówce FEP jest ustawiona prosto, a jej głowa spoczywa bezpośrednio na zatyczce w celu przeprowadzenia obrazowania.Dodaj tricaine do medium wewnątrz komory obrazowania. Przedstawiony tutaj jest transgeniczny embrion zebrafish K-G-R-L-G-F-P jeden dzień po zapłodnieniu, obrazowany przez dwa dni w celu obserwacji rozwoju naczyń krwionośnych.Danio pręgowany nie jest ograniczany przez medium montażowe i może rozwijać się prawidłowo. Na przykład, jego głowa unosi się. Ogon wydłuża się, a wypustki naczyniowe pojawiają się bez przeszkód.Tę technikę można przeprowadzić w 10 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo i wszystkie materiały są łatwo dostępne. Należy pamiętać, aby wszystkie główne kroki wykonywać bez zbędnej zwłoki. Wszystkie roztwory muszą pozostać czyste, ponieważ zanieczyszczenia mogą pogorszyć końcową jakość obrazu.

multilayer-mounting-for-long-term-light-sheet-microscopy-of-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wielowarstwowe Montowanie na długoterminowe Mikroskopowanie Arkuszy Światła Rybki Zebra

Ten artykuł opisuje przygotowanie próbki do mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkuszy świetlnych. Zademonstrowano również metodę montowania żywych zarodków danio pręgowanego w celu długoterminowego obrazowania, co pozwala na nagrywanie długich filmów poklatkowych żywych zarodków w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

Przygotowanie próbki do mikroskopii świetlnej: montaż żywych zarodków danio pręgowanego do długoterminowego obrazowania

Ten artykuł opisuje metodę montowania żywych zarodków danio pręgowanego do długoterminowego obrazowania. Metoda ta jest opłacalna i łatwa do wykonania przy użyciu zwykłych naczyń mikroskopowych ze szklanym dnem do obrazowania pod mikroskopem odwróconym. Montaż odbywa się w warstwach agarozy w różnych stężeniach.

Warstwowy montaż agaru: przygotowanie żywych zarodków danio pręgowanego do długoterminowego obrazowania za pomocą odwróconego mikroskopu

Prezentujemy protokół do uchwycenia dynamiki regeneracji płetw ogonowych larw danio pręgowanego w skali całej tkanki za pomocą stereomikroskopii opartej na jasnym polu. Technika ta umożliwia uchwycenie dynamiki regeneracji z rozdzielczością pojedynczej komórki. Metodologię tę można dostosować do każdego mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w kamerę CCD i oprogramowanie do filmów poklatkowych.

Uchwycenie naprawy tkanek u larw danio pręgowanego za pomocą stereomikroskopii poklatkowej w jasnym polu

Mikroskopia fluorescencyjna z lekkim arkuszem jest doskonałym narzędziem do obrazowania rozwoju embrionalnego. Pozwala na nagrywanie długich filmów poklatkowych żywych zarodków w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Demonstrujemy jego zastosowanie do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego w szerokich skalach czasoprzestrzennych i przedstawiamy potok do fuzji i dekonwolucji zestawów danych multiview.

Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy uniwersalną metodę montażu, która pozwala na długoterminowe obrazowanie poklatkowe rozwoju tylnej części ciała żywych zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnego rozwoju.

Uniwersalna metoda montażu do długoterminowego obrazowania rozwoju danio pręgowanego

Ten artykuł opisuje metodę montowania delikatnych zarodków danio pręgowanego do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Ta tania metoda jest łatwa do wykonania przy użyciu zwykłych naczyń mikroskopowych ze szklanym dnem do obrazowania pod dowolnym mikroskopem odwróconym. Montaż odbywa się w warstwach agarozy w różnych stężeniach.

Warstwowa metoda mocowania do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej całych zarodków danio pręgowanego

Opisujemy zoptymalizowane narzędzia do badania serca danio pręgowanego in vivo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego. W szczególności sugerujemy jasne transgeniczne linie serca i prezentujemy nowe techniki delikatnego osadzania i unieruchamiania, które pozwalają uniknąć wad rozwojowych i wad serca. Przewidziano również możliwy potok pozyskiwania i analizy danych dostosowany do obrazowania serca.

Mikroskopia świetlna szybkiej dynamiki serca w zarodkach danio pręgowanego

Opisano strategię przygotowania próbki do obrazowania wczesnych zarodków danio pręgowanego w nienaruszonym kosmówce za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi. Analizuje różne orientacje, jakie zarodki nabywają w kosmówce na 70% etapie epibolii i pąków, a także szczegółowo opisuje strategie obrazowania w celu uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej w całym zarodku przy użyciu systemu arkuszy świetlnych.

Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego

Długoterminowe Imaging komórkach ssaków przy dużym polu Mikroskopia

W niniejszym raporcie proponujemy nowe zastosowanie światłoutwardzalnych żywic stomatologicznych do mocowania podstawy elektrod lub sond do mikrodializy w eksperymentach chronicznych. Materiał ten umożliwia bezpośrednie wiązanie z czaszką.

Zastosowanie światlutowalnej żywicy do wiązania stomatologicznego do mocowania elektrod lub sond mikrodializacyjnych w eksperymentach przewlekłych

Poznaj metodę wielowarstwowego mocowania embrionów Danio rerio do długotrwałej mikroskopii świetlnej. Technika umożliwia obserwację rozwoju zarodków przez kilka dni z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Wielowarstwowe mocowanie do długotrwałej mikroskopii świetlnej danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów