Małoinwazyjne założenie mysich ortotopowych ksenoprzeszczepów pęcherza moczowego

Sprawdzona technika szczepienia pierwotnych inwazyjnych ksenoprzeszczepów raka ortotopowego pęcherza moczowego wymaga laparotomii i mobilizacji pęcherza. Procedura ta powoduje znaczną zachorowalność u myszy, jest technicznie trudna i czasochłonna. W związku z tym opracowaliśmy wysoce precyzyjne, przezskórne podejście wykorzystujące kontrolę ultrasonograficzną.

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie ksenoprzeszczepów ortotopowego raka pęcherza moczowego w szybki, precyzyjny i minimalnie inwazyjny sposób. Osiąga się to poprzez najpierw rozszerzenie określonej linii komórek nowotworowych i zawieszenie komórek nowotworowych w Matrigel. Następnie zwierzę jest umieszczane na platformie obrazowania, a pęcherz moczowy jest wizualizowany za pomocą ultradźwięków.

Następnie warstwy śluzówkowe i mięśniowe w pęcherzu moczowym oddziela się za pomocą iniekcji soli fizjologicznej. Na koniec zawiesina matrigelu komórek nowotworowych jest wstrzykiwana do tej sztucznie utworzonej przestrzeni. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują wzrost guza za pomocą obrazowania ultrasonograficznego i bioluminescencji.

Główną przewagą tej techniki nad innymi istniejącymi metodami, takimi jak zastosowanie laparotomii do inokulacji pierwotnych ksenoprzeszczepów, jest to, że podejście to jest szybkie, precyzyjne i minimalnie inwazyjne. Implikacje tych technik rozciągają się na diagnostykę i terapię raka pęcherza moczowego, ponieważ autoksenografty są złotym standardem w badaniach przedklinicznych nad nowymi terapiami. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy wstrzykiwania są dość trudne do nauczenia, a woda była bardzo rzadka, Demonstracja tej procedury będzie.

Igor Mosca ma asystenta naukowego, a Wolfgang Yeager jest adiunktem. Obaj są urologami po potwierdzeniu tożsamości odpowiednich linii komórkowych ludzkiego raka pęcherza moczowego. W tym badaniu poprzez odciski palców DNA należy użyć konstruktu lentiwirusowego przenoszącego gen lucyferazy świetlika do analizy wzrostu bioluminescencji guzów ksenoprzeszczepu w celu transfekcji linii komórkowych.

Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia zabiegu, rozmrozić i użyć DMEM z 10% FBS do rozszerzenia istniejących linii komórkowych, inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze 5% CO2. Aby przygotować zawiesinę komórkową do wstrzykiwań po rozmrożeniu, matrygelu i trzymaniu na lodzie oczu trypsyny, 70% komórek zbiegu i użyj normalnej pożywki wzrostowej do zawieszenia, a następnie policz komórki i wiruj zawiesinę pod ciśnieniem 200 razy G przez pięć minut. Po usunięciu supernatantu dodać odpowiednią ilość równych objętości D-M-E-M-F-B-S i MATRIGEL, aby osiągnąć pożądane stężenie komórek do wstrzyknięcia objętości 40 mikrolitrów na zwierzę.

Dobrze wymieszaj i unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza z jakiegokolwiek płaskiego, sztywnego tworzywa sztucznego. Wytnij stabilizator pęcherza, dokładnie sprawdź pasek i usuń wszelkie ostre krawędzie przed nałożeniem na myszy. Po znieczuleniu samic myszy 3% izofluranem w tlenie i wykonaniu uszczypnięcia palca u nogi.

Aby zapewnić odpowiednią sedację, zamontuj zwierzę na podgrzewanym stole obrazowym platformy do obrazowania małych zwierząt, stale monitorując jego parametry życiowe za pomocą gumki recepturki. Napraw kończyny dolne i użyj 0,5% glukonianu chlorheksydyny do dezynfekcji brzucha, a następnie użyj sterylnej bawełnianej końcówki do wytarcia skóry. Następnie, za pomocą paska stabilizującego pęcherz, unieruchamić pęcherz, aby uniknąć jego ominięcia podczas iniekcji śródściennej.

Następnie nałóż sterylny żel ultradźwiękowy na dolną część brzucha. Powoli przesuwaj badanie ultrasonograficzne, skieruj się do skóry i uwidocznij pęcherz moczowy na ekranie USG. Jeśli pęcherz jest pusty, użyj 50 mikrolitrów ciepłego PBS w przezcewkowym cewniku angiologicznym o rozmiarze 24, aby go napełnić i oddzielić warstwy ściany pęcherza.

Zacznij od podłączenia strzykawki o pojemności 1,0 mililitra wypełnionej PBS i podłączonej do igły o rozmiarze 30 i średnicy 3/4 cala do zacisku strzykawki. Ustawić igłę w kierunku skóry tuż nad kością łonową. Pod kątem od 30 do 45 stopni wykryj igłę na ekranie ultrasonograficznym, a następnie powoli przebij skórę i mięśnie ściany brzucha.

Następnie obróć skos igły o 180 stopni, tak aby była skierowana do tyłu, i włóż końcówkę igły w ścianę pęcherza moczowego bez penetracji błony śluzowej. Następnie, aby stworzyć sztuczną przestrzeń, powoli wstrzyknij 50 mikrolitrów PBS między warstwę mięśniową a błonę śluzową przed wycofaniem igły. Aby wstrzyknąć komórki raka pęcherza moczowego, podłącz drugą strzykawkę o pojemności 1,0 mililitra wypełnioną zawiesiną matrigelu z komórek rakowych i igłę o rozmiarze 30 o rozmiarze 30 i średnicy 3/4 cala do zacisku strzykawki.

Skierować końcówkę igły do przestrzeni wypełnionej PBS. Właśnie stworzyłem i wstrzyknij 40 mikrolitrów zawiesiny w przestrzeń. Następnie wyjmij igłę po zdemontowaniu myszy z platformy obrazowania.

Przechowuj go w ciepłym i wygodnym środowisku pod ciągłym monitorowaniem. Po odzyskaniu przytomności i normalnym poruszaniu się umieść zwierzę z powrotem w jego domowej klatce. Wstrzyknięcie śródścienne trzech różnych linii komórek nowotworowych przeprowadzono u 50 zwierząt pod kontrolą ultrasonograficzną przez trzy kolejne dni.

Inokulacja została przeprowadzona sprawnie i nie wiązała się z żadnymi powikłaniami intra lub pointerwencyjnymi. Monitorowanie wzrostu guza prowadzono za pomocą obrazowania ultrasonograficznego i bioluminescencji. W trzecim dniu guz można było wykryć za pomocą ultradźwięków w przednim pęcherzu moczowym wszystkich 50 zwierząt, a 98% myszy wykazywało stały wzrost guza w okresie obserwacji po inokulacji uc. Trzy.

U jednej myszy rozwinęło się wewnątrzotrzewnowe rozsiew guza, a guz ewoluował po siódmym dniu u drugiego zwierzęcia. Była to pierwsza grupa myszy zaszczepiona tą nową techniką po inokulacji uc. Trzy. Łukasz uc, jeden Łukasz i uc.

13 Łukasza. Myszy zostały złożone w ofierze odpowiednio w 24, 28 i 37 dniu. Guzy ksenoprzeszczepu pobrano i zbadano za pomocą przekrojów h i d.

Wszystkie nowotwory były inwazyjne dla mięśni, a niektóre infiltrowały tłuszcz przytrzewny, ale nie zaobserwowano inwazji na sąsiednie narządy. 60% uc, 13 Luke'a i 20% uc. U trzech myszy z guzem Luke'a rozwinęły się przerzuty do węzłów chłonnych zaotrzewnowych, które zostały potwierdzone przez barwienie h i e.

Po opanowaniu tej techniki można wykonać w trzy minuty. Znajomość obrazowania ultrasonograficznego jest warunkiem wstępnym do wykonania tej procedury Po zaszczepieniu guzów w ten sposób, ultradźwięki pozwalają nam nie tylko monitorować wzrost guza w czasie, ale także przyjrzeć się perfuzji guza za pomocą mikropęcherzyków. Pozwala nam to również na wykonywanie iniekcji donowotworowych za pomocą nowatorskich środków eksperymentalnych.