Małoinwazyjne założenie mysich ortotopowych ksenoprzeszczepów pęcherza moczowego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest szybkie, precyzyjne i małoinwazyjne tworzenie ortotopowych ksenoprzeszczepów raka pęcherza moczowego. Osiąga się to poprzez uprzednie namnożenie konkretnej linii komórkowej nowotworu i przygotowanie zawiesiny komórek nowotworowych w Matrigelu. Następnie zwierzę zostaje umieszczone na platformie obrazującej, a pęcherz moczowy zostaje zlokalizowany za pomocą ultradźwięków.

Następnie warstwa śluzowa i mięśniowa pęcherza są rozdzielane za pomocą wstrzyknięcia soli fizjologicznej. Na koniec do tej sztucznie stworzonej przestrzeni wstrzykuje się zawiesinę komórek nowotworowych w Matrigelu. W efekcie można uzyskać wyniki wykazujące wzrost guza za pomocą obrazowania ultradźwiękowego oraz bioluminescencji.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak stosowanie laparotomii do inokulacji pierwotnych ksenograftów, jest to, że podejście to jest szybkie, precyzyjne i małoinwazyjne. Znaczenie tych technik rozciąga się na diagnostykę i terapię raka pęcherza moczowego, ponieważ autoksenografty stanowią złoty standard w badaniach przedklinicznych nowych metod leczenia. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy wstrzykiwania są trudne do opanowania, a ściana pęcherza jest bardzo cienka. Przedstawienie tej procedury będzie.

Igor Mosca współpracuje z asystentem badawczym oraz Wolfgangiem Yeagerem, stażystą podoktorskim. Obaj są urologami. Po potwierdzeniu tożsamości odpowiednich ludzkich linii komórkowych raka pęcherza moczowego, w ramach niniejszego badania, w celu analizy wzrostu guzów ksenoprzeszczepionych za pomocą bioluminescencji, do transfekcji linii komórkowych należy wykorzystać konstrukt lentiwirusem niosący gen lucyferazy świetlika.

Po przygotowaniu do rozpoczęcia procedury, rozmrozić i użyć DMEM z 10% FBS w celu namnożenia istniejących linii komórkowych, inkubując je w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2. Aby przygotować zawiesinę komórkową do wstrzyknięcia po rozmrożeniu, matrigelu i utrzymywaniu na lodzie, użyć trypsyny, komórek o 70% konfluencji oraz standardowej pożywki wzrostowej do zawieszenia, a następnie policzyć komórki i odwirować zawiesinę z prędkością 200 ×g przez pięć minut. Po usunięciu supernatantu dodać odpowiednią ilość równych objętości DMEM-FBS i MATRIGEL, aby osiągnąć pożądane stężenie komórek do wstrzyknięcia w objętości 40 µL na zwierzę.

Wymieszać dokładnie, unikając powstawania pęcherzyków powietrza, używając dowolnego płaskiego i sztywnego materiału plastikowego. Ostrożnie wyciąć stabilizator pęcherza, dokładnie sprawdzić pasek i usunąć wszelkie ostre krawędzie przed zastosowaniem u myszy. Po znieczuleniu samic myszy 3% isoflurane w tlenie i wykonaniu testu uszczypnięcia palca.

Aby zapewnić odpowiednią sedację, umieść zwierzę na podgrzewanym stole obrazującym platformy do obrazowania małych zwierząt, stale monitorując jego oznaki życiowe za pomocą gumki recepturki. Unieruchom kończyny dolne i odkaź brzuch, używając 0,5% glukonianu chlorheksydyny, a następnie przetrzyj skórę sterylnym patyczkiem bawełnianym. Następnie, za pomocą paska do stabilizacji pęcherza, unieruchom pęcherz moczowy, aby zapobiec jego przesunięciu podczas wstrzyknięcia domuralnego.

Następnie nanieś sterylny żel do badań ultrasonograficznych na dolną część brzucha. Powoli przesuwaj głowicę skanera ultradźwiękowego po skórze i zwizualizuj pęcherz moczowy na ekranie USG. Jeśli pęcherz jest pusty, użyj 50 µL ciepłego PBS i cewnika angiograficznego 24G wprowadzanego przez cewkę moczową, aby go napełnić i oddzielić warstwy ściany pęcherza.

Zacznij od przymocowania do zacisku strzykawki strzykawki o pojemności 1,0 mililitra wypełnionej PBS i połączonej z igłą o rozmiarze 30 G i długości trzy czwarte cala. Ustaw igłę w stronę skóry, tuż nad kością łonową. Pod kątem od 30 do 45 stopni zlokalizuj igłę na ekranie USG, a następnie powoli przebij skórę i mięśnie ściany brzusznej.

Następnie obróć ścięcie igły o 180 stopni tak, aby było skierowane ku tyłowi, i wprowadź końcówkę igły w ścianę pęcherza, nie przebijając śluzówki. Aby stworzyć sztuczną przestrzeń, powoli wstrzyknij 50 µL PBS pomiędzy warstwę mięśniową a śluzówkę, a następnie wyjmij igłę. W celu wstrzyknięcia komórek raka pęcherza moczowego, do zacisku strzykawki przymocuj drugą strzykawkę o pojemności 1,0 mL wypełnioną zawiesiną komórek rakowych w Matrigelu oraz igłę 30G o długości 3/4 cala.

Kieruj końcówkę igły do przestrzeni wypełnionej PBS. Następnie wstrzyknij 40 µL zawiesiny do tej przestrzeni. Po zakończeniu procedury wyjmij igłę, a następnie zdejmij mysz z platformy obrazującej.

Utrzymuj zwierzę w ciepłym i komfortowym środowisku pod stałym nadzorem. Po odzyskaniu przytomności i powrocie do normalnej lokomocji, umieść zwierzę z powrotem w klatce domowej. W ciągu trzech kolejnych dni wykonano wewnątrzścienne wstrzyknięcia trzech różnych linii komórek nowotworowych u 50 zwierząt pod kontrolą ultradźwięków.

Inokulacja została przeprowadzona sprawnie i nie wiązała się z żadnymi powikłaniami wewnątrz- ani pointerwencyjnymi. Monitorowanie wzrostu guza odbywało się za pomocą obrazowania ultrasonograficznego oraz bioluminescencji. W trzecim dniu za pomocą USG w przedniej części pęcherza u wszystkich 50 zwierząt wykryto guza, a u 98% myszy odnotowano stały wzrost guza w okresie obserwacji po inokulacji uc.Three.

U jednej myszy doszło do rozsiania nowotworu do jamy otrzewnej, natomiast u drugiego zwierzęcia guz uległ regresji po siódmym dniu. Była to pierwsza grupa myszy inokulowana tą nową techniką po inokulacji uc.Three. Luke uc, one Luke, and uc.

13 Luke. Myszy uśmiercono odpowiednio w dniach 24, 28 i 37. Guzy ksenoprzeszczepowe pobrano i poddano badaniu w przekrojach h i d.

Wszystkie guzy były naciekające do mięśni, a niektóre infiltrowały tłuszcztrawienny, jednak nie zaobserwowano naciekania do sąsiednich narządów. 60% uc, 13 Luke i 20% uc. U trzech myszy z nowotworami Luke rozwinęły się przerzuty do węzłów chłonnych zaotrzewnowych, co potwierdzono barwieniem H&E.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w trzy minuty. Znajomość obrazowania ultrasonograficznego jest warunkiem wstępnym do przeprowadzenia tej procedury. Po inokulacji guzów w ten sposób, ultrasonografia pozwala nie tylko na monitorowanie wzrostu guza w czasie, ale także na ocenę perfuzji guza z użyciem mikropęcherzyków. Umożliwia ona również wykonywanie wewnątrznowotworowych iniekcji nowych czynników eksperymentalnych.