Test chemotaksji C. elegans

Ruch komórki lub organizmu w odpowiedzi na bodziec chemiczny to zachowanie nazywane chemotaksją. W tym filmie dowiemy się, jak przeprowadzić test chemotaksji z wykorzystaniem nicienia C. elegans. Omówimy również, w jaki sposób testy chemotaksji u C. elegans są stosowane w badaniach nad uczeniem się i pamięcią, adaptacją węchową oraz chorobą Alzheimera.

Omówmy najpierw dwa różne rodzaje chemotaksji. Ruch w stronę bodźca chemicznego nazywamy chemotaksją dodatnią. Z kolei ruch oddalający od bodźca chemicznego to chemotaksja ujemna, która pozwala organizmom unikać szkodliwych substancji chemicznych.

Chemotaksja może zachodzić na poziomie całego organizmu, gdy dąży on do źródła pożywienia. Chemotaksja zachodzi również na poziomie komórkowym, wewnątrz organizmów. Na przykład komórki odpornościowe migrują w stronę patogenów lub miejsc stanu zapalnego. W innym przykładzie plemniki poruszają się w stronę komórki jajowej w odpowiedzi na chemoatraktant wydzielany przez jajeczko. Chemotaksja jest również istotnym procesem podczas rozwoju, w którym komórki migrują w odpowiedzi na bodziec chemiczny, tworząc tkanki i narządy w rozwijającym się organizmie.

Dla dzikich, bytujących w glebie C. elegans, chemotaksja jest kluczowa dla wykrywania i poruszania się w stronę bakterii, które stanowią ich główne źródło pożywienia. Z kolei C. elegans są odpychane przez metale ciężkie, substancje o niskim pH oraz detergenty, które są toksyczne dla tego organizmu.

Testy chemotaksji zazwyczaj rozpoczyna się od przygotowania płytek do chemotaksji. Za pomocą linijki i markera podziel płytkę o średnicy 5 cm z pożywką NGM na cztery równe ćwiartki. Następnie narysuj okrąg o promieniu 0,5 cm wokół środka ćwiartki. Będzie to punkt startowy dla nicieni. Zaznacz i opisz punkt w każdej ćwiartce w taki sposób, aby każdy punkt znajdował się w tej samej odległości od środka oraz od siebie nawzajem.

Przygotowując nicienie do testu, krytyczne jest użycie młodych dorosłych osobników zsynchronizowanych pod względem wieku, aby różnice w chemotaksji nie były artefaktem stadium rozwojowego. Po synchronizacji nicieni zbierz je, pipetując najpierw 2 ml buforu S-basal na płytkę zawierającą młode dorosłe osobniki. Obracaj i przechylaj szalkę, aby spłukać nicienie z płytki.

Następnie przenieś zawiesinę nicieni w buforze S-basal do probówki do mikrocentryfugi. Przemyj nicienie, krótko wirując zawiesinę, usuwając nadsącz i dodając kolejny mililitr roztworu S-basal do osadu z nicieniami. Odwróć probówkę i powtórz przemywanie jeszcze dwa razy. Po przemyciu usuń cały roztwór S-basal, pozostawiając około 100 μl. Następnie nanieś 2 μl mieszaniny nicieni i buforu S-basal na płytkę NGM. Za pomocą mikroskopu policz liczbę obecnych nicieni. Idealnie powinno być od 50 do 250 nicieni w 2 μl buforu S-basal.

Po przygotowaniu płytek do chemotaksji oraz nicieni można przystąpić do przeprowadzenia testu chemotaksji. Najpierw wymieszaj równe objętości roztworu testowego z 0,5 M azydkiem sodu, środkiem anestetycznym, który sparaliżuje nicienie po dotarciu do celu. Postąp analogicznie z roztworem kontrolnym. Następnie nanieś pipetą 2 μl mieszaniny nicieni z podłożem S-basal na środek płytki do chemotaksji. Potem nanieś 2 μl roztworu testowego lub kontrolnego w odpowiednio oznakowane punkty na płytce. Po wchłonięciu roztworów testowego i kontrolnego załóż pokrywkę, odwróć płytkę do góry dnem i ustaw czasomierz na 1 godzinę.

Po upływie godziny, w której nicienie miały czas na reakcję na bodźce chemiczne na płytce, można przystąpić do analizy danych. Należy ręcznie policzyć liczbę nicieni w każdym kwadrancie. Jeśli nicienie są przyciągane przez testowaną substancję chemiczną, w tych kwadrantach będzie obecna większa liczba osobników. W przypadku braku reakcji na tę substancję, nicienie będą rozmieszczone równomiernie w każdym kwadrancie.

Wykorzystaj te dane do obliczenia indeksu chemotaktycznego, który stanowi różnicę między liczbą nicieni w kwadrantach testowych a liczbą nicieni w kwadrancie kontrolnym, podzieloną przez całkowitą liczbę nicieni. Indeks chemotaktyczny bliski +1 sugeruje przyciąganie, natomiast indeks bliski -1 wskazuje na odpychanie.

Po zapoznaniu się ze sposobem przygotowania testu chemotaksji, przyjrzyjmy się temu, w jaki sposób eksperymenty te są wykorzystywane do odpowiadania na pytania naukowe.

Jednym ze sposobów przeprowadzania testów chemotaksji w C. elegans zostały zastosowane do badania uczenia się i pamięci. Na przykład nicienie mogą zostać uwarunkowane tak, aby kojarzyły bodziec chemiczny ze źródłem pożywienia. Syte nicienie są poddawane głodzeniu przez jedną godzinę, a następnie są uwarunkowane przy użyciu pożywienia oraz substancji chemicznej, takiej jak butanon.

Następnie nicienie są utrzymywane na płytce z pożywką, ale bez dodatku butanonu. Przeprowadzenie testu chemotaksji pozwoli określić, czy nicienie nauczyły się kojarzyć butanon z pożywieniem. Można przeprowadzić wiele wariantów tego eksperymentu, aby uzyskać inne informacje, na przykład dotyczące tego, które geny lub neurony są istotne dla procesów uczenia się i pamięci.

Adaptacja węchowa to zjawisko polegające na zmniejszeniu odpowiedzi neuronów sensorycznych na bodziec w czasie, co pozwala zwierzęciu reagować na inne, potencjalnie ważniejsze bodźce. Na przykład w przypadku typu dzikiego C. elegans po ekspozycji na dany zapach przez pewien czas, organizmy będą go ignorować podczas testu chemotaksji z powodu adaptacji węchowej, zamiast być przez niego przyciągane. W związku z tym możliwe jest przeprowadzenie wysokoprzepustowych przesiewów genetycznych w celu ujawnienia genetycznych regulatorów adaptacji węchowej, takich jak egl-4. Ponadto u transgenicznych nicieni wykazujących ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie można obserwować zmiany w ich lokalizacji podczas adaptacji węchowej.

Wreszcie, testy chemotaksji mogą być wykorzystane w C. elegans do badania choroby Alzheimera. Naukowcy mogą wyexpronować w neuronach C. elegans ludzki peptyd beta-amyloid z fluorescencyjną etykietą, który jest charakterystycznym markerem choroby Alzheimera. Co ciekawe, testy chemotaksji wykazały, że nicienie wyexpronowujące beta-amyloid w populacji neuronów wykazują zmniejszoną chemotaksję w kierunku chemoatraktanta w porównaniu z grupą kontrolną. Można przeprowadzić wiele wariantów tego eksperymentu, w tym ekspresję beta-amyloidu w innych populacjach neuronów lub tkankach, a także określić, czy istnieją związki mogące łagodzić skutki ekspresji beta-amyloidu, co w ostateczności może doprowadzić do opracowania potencjalnej terapii.

Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do chemotaksji u C. elegans. Najpierw zdefiniowaliśmy, czym jest chemotaksja i dlaczego jest ona ważna w naturze dla organizmów oraz komórek. Następnie zademonstrowaliśmy, jak przeprowadzić test chemotaksji z użyciem C. elegans. Na koniec omówiliśmy, w jaki sposób chemotaksja może zostać wykorzystana do zrozumienia procesów uczenia się i pamięci, adaptacji węchowej oraz choroby Alzheimera. Dziękujemy za uwagę!