Wykorzystanie białek fluorescencyjnych do wizualizacji i ilościowego określenia dynamiki wzrostu wakuoli Chlamydii w żywych komórkach

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja i ilościowe określenie dynamiki wzrostu inkluzji chlamydii w żywych komórkach. Osiąga się to najpierw poprzez wytworzenie fluorescencyjnych komórek gospodarza, które stabilnie ekspresują białko fluorescencyjne, takie jak GFP, w swojej cytoplazmie. Następnie komórki gospodarza są zakażane chlamydiami i poddawane inkubacji.

Następnie zakażone komórki są wizualizowane za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek. Na koniec charakterystyka inkluzji chlamydii jest kwantyfikowana przy użyciu oprogramowania do analizy mikroskopowej; ostatecznie fluorescencyjna mikroskopia żywych komórek służy do wizualizacji inkluzji chlamydii wewnątrz komórki gospodarza oraz do pomiaru parametrów biologicznych inkluzji w celu uzyskania wyników ilościowych. Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak liczenie oparte na przeciwciałach, są możliwość zastosowania tej strategii obrazowania odwrotnego w żywych komórkach, a także we współpracy z innymi znacznikami fluorescencyjnymi w celu ilościowego określenia dynamiki inkluzji wszystkich gatunków chlamydii.

Ponadto, w przeciwieństwie do rutynowych metod znakujących bakterie wewnątrz komórek, podejście to rozświetla błonę inkluzji w żywych komórkach, co pozwala ujawnić istotne właściwości dynamiczne tego przedziału zawierającego patogen. Po wygenerowaniu fluorescencyjnych komórek HeLa, zgodnie z protokołem tekstowym, wysieje się komórki HeLa GFP na odpowiednie naczynie hodowlane, np. szalki z szklanym dnem do obrazowania o wysokiej rozdzielczości lub płytki 24-dołkowe do oznaczenia IFU i przesiewania w wielu dołkach; następnie rozmraża się na lodzie zamrożoną probówkę zawierającą szczep Crich Cotus lub dowolny inny pożądany szczep chlamydii i rozcieńcza w HBSS do pożądanej wielokrotności infekcji (MOI). Aby przeprowadzić statyczną infekcję przy użyciu Crich Cotus, LGV zero VL two, należy odessać medium z dołków i użyć HBSS do przemycia komórek HeLa GFP.

Do dołków dodać rozcieńczone bakterie i inkubować w temperaturze 25 °C przez dwie godziny, następnie aspirować komórki i przemyć je HBSS. Po dodaniu pożywki wzrostowej inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z dwutlenkiem węgla, aby przeprowadzić infekcję wspomaganą wirowaniem szczepem crich serowaru D lub jakimkolwiek innym szczepem chlamydii. Przemyć komórki HeLa GFP za pomocą HBSS i dodać do nich rozcieńczone bakterie.

Następnie umieść szalkę z zainfekowanymi komórkami w uchwycie do płytek wielodołkowych rotora z koszyczkami w wirówce laboratoryjnej. Wiruj komórki przy 900 ×g i 25 °C przez jedną godzinę. Następnie umieść naczynia hodowlane w inkubatorze z CO2 w temperaturze 37 °C na jedną godzinę w komorze z laminarnym przepływem powietrza, odessij komórki, przemyj je dwukrotnie roztworem HBSS i dodaj pożywkę wzrostową.

Inkubować szalkę z zakażonymi komórkami w temperaturze 37 °C. Aby zwizualizować inkluzje chlamydii, wyjąć zakażone chlamydiami komórki GFP HeLa z inkubatora z dwutlenkiem węgla i użyć pożywki RPMI bez czerwieni fenolowej z dodatkiem 5% FBS do wymiany medium. Umieścić szalkę lub płytkę wielodołkową na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym z obiektywem olejowym 20x lub o większym powiększeniu. Za pomocą oprogramowania do obrazowania zidentyfikować zakażone chlamydiami komórki GFP HeLa, które widoczne są jako zielone komórki zawierające duże czarne otwory.

W oknie dialogowym konfiguracji akwizycji ustaw oprogramowanie tak, aby rejestrowało kanał zielony oraz wszelkie inne kanały dodane do próbki. Użyj przycisku capture/record, aby pozyskać obraz w wybranych odstępach czasu. Po infekcji wyjmij z inkubatora komórki HeLa GFP zainfekowane chlamydiami i umieść szalkę na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym.

Należy skupić się na środkowych płaszczyznach komórek, gdzie inkluzje osiągają maksymalną średnicę i wydajność. Obrazy o ostrych krawędziach należy pozyskać z co najmniej 10 pól widzenia na każdą studzienkę. Studzienki zazwyczaj reprezentują powtórzenia lub zmienne eksperymentalne.

Aby odnaleźć komórki HeLa GFP w zakładce pomiarów, należy użyć polecenia find objects i wybrać kanał zielony. Dostosuj intensywność progu w oparciu o względne intensywności komórek. Ręcznie policz liczbę inkluzji lub czarnych przedziałów oraz komórek HeLa GFP lub użyj algorytmów oprogramowania do obrazowania, aby automatycznie zidentyfikować i policzyć inkluzje.

Przefiltruj wybrane obiekty, pozostawiając jedynie te o powierzchni większej niż 5 µm². Oznacz tę grupę jako populacja pierwsza. W odniesieniu do tej populacji zastosuj polecenie wypełniania otworów w obiektach (fill holes in objects); ten krok generuje populację drugą.

Odejmij populację pierwszą od populacji drugiej, aby uzyskać dodatnio oznakowane inkluzje chlamydii określone jako populacja trzecia. Użyj polecenia filter population, aby zastosować filtr wielkości do populacji trzeciej. Na przykład, w przypadku inkluzji w komórkach zainfekowanych przez 24 godziny lub dłużej, zachowaj obiekty o powierzchni większej niż 25 µm², natomiast dla wczesnych etapów infekcji ustaw filtr wielkości tak, aby zachować obiekty o powierzchni większej niż 4 µm².

Ponieważ inkluzje te są znacznie mniejsze, filtr wielkości pozwala na wyodrębnienie populacji obiektów określonych jako inkluzje. Należy użyć oprogramowania do obrazowania w celu obliczenia danych ilościowych z obrazów, takich jak liczba inkluzji, rozmiar inkluzji oraz obwód inkluzji. Po zakażeniu chlamydiami inkluzje są łatwo widoczne jako czarne plamki w komórkach gospodarza lub chlamydie wykazujące ekspresję białka fluorescencyjnego wewnątrz komórek gospodarza, a ich wyraźność może zostać wykorzystana do zautomatyzowanej identyfikacji w wielu polach widzenia i/lub wariantach traktowania.

Jak pokazano na tym wykresie, jednym z głównych zastosowań jest oznaczanie jednostek tworzących inkluzje chlamydii w żywych zakażonych komórkach, co eliminuje potrzebę stosowania procedur immunofluorescencyjnych, które są zarówno czasochłonne, jak i kosztowne. Inną kluczową cechą tej metody obrazowania jest możliwość jej łatwego zastosowania do dowolnego gatunku lub szczepu chlamydii. W tym przykładzie dla każdego z tych gatunków i szczepów przeprowadzono analizę czasową komórek HeLa GFP zakażonych jednym z czterech gatunków lub szczepów chlamydii.

Inkluzje zostały oznakowane i przeanalizowane w celu obliczenia ich średniej powierzchni, długości obwodu oraz liczby w komórce w określonych punktach czasowych. Atrybuty te dostarczają istotnych informacji na temat biologii inkluzji chlamydialnych, w tym sposobu, w jaki oddziałują one z komórką gospodarza. Przedstawiony tutaj film z komórek HeLa mCherry zainfekowanych GFPC, Tracom L two składa się z obrazów time-lapse wykonanych w odstępach pięciominutowych przez 125 minut, począwszy od 48 godzin po infekcji.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykorzystania tej techniki obrazowania odwróconego nie tylko do wizualizacji inkluzji Chlamydiae, ale także do ilościowego określania dynamiki inkluzji, takich jak obwód powierzchni inkluzji oraz liczba inkluzji w komórce. Technika ta jest bardziej efektywna kosztowo w porównaniu do tradycyjnych metod wizualizacji i działa w przypadku wszystkich gatunków oraz szczepów chlamydii.