Wykorzystanie białek fluorescencyjnych do wizualizacji i ilościowego określenia dynamiki wzrostu wakuoli Chlamydii w żywych komórkach

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja i ilościowe określenie dynamiki wzrostu inkluzji chlamydii w żywych komórkach. Osiąga się to poprzez najpierw wygenerowanie fluorescencyjnych komórek gospodarza, które stabilnie wyrażają białko fluorescencyjne, takie jak GFP, w swojej cytoplazmie. Następnie komórki gospodarza są zakażane chlamydią i pozostawione do inkubacji.

Następnie zainfekowane komórki są wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej na żywo. Wreszcie, charakterystyka inkluzji chlamydii jest określana ilościowo za pomocą oprogramowania do analizy mikroskopowej, ostatecznie mikroskopia fluorescencyjna na żywo jest wykorzystywana do wizualizacji wtrąceń chlamydii w komórce gospodarza i do pomiaru parametrów biologicznych inkluzji w celu uzyskania wyników ilościowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak liczenie oparte na przeciwciałach, jest to, że ta strategia odwrotnego obrazowania może być stosowana na żywych komórkach, a także we współpracy z innymi znacznikami fluorescencyjnymi do ilościowego określania dynamiki inkluzji wszystkich gatunków chlamydii.

Ponadto, w przeciwieństwie do rutynowych metod, które znakują bakterie w komórkach, podejście to rzuca światło na błonę inkluzyjną w żywych komórkach, a tym samym może ujawnić ważne właściwości dynamiczne tego patogenu zawierającego przedział. Po wygenerowaniu fluorescencyjnych komórek hela, zgodnie z tabliczką protokołu tekstowego, komórki GFP Hela na pożądanym naczyniu hodowlanym, takim jak szklane naczynia denne do obrazowania w wysokiej rozdzielczości 4 24-dołkowe płytki do oznaczania IFU i wielodołkowego badania przesiewowego rozmrażają zamrożoną probówkę zawierającą chrichcous lub dowolny inny pożądany szczep chlamydii na lodzie i rozcieńczają w HBSS do pożądanej wielokrotności infekcji. Aby przeprowadzić statyczną infekcję Crich Cotus, LGV zero VL dwa odessać pożywkę ze studzienek i użyć HBSS do przemycia komórek hela GFP.

Dodaj rozcieńczone bakterie do studzienek i inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez dwie godziny, odessać komórki i przemyć HBSS. Następnie, po dodaniu pożywki wzrostowej, inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla, aby przeprowadzić infekcję wspomaganą wirowaniem wzbogacaczem w serowar D lub inny szczep chlamydii. Użyj HBSS do przemycia komórek hela GFP i dodaj rozcieńczone bakterie do komórek.

Następnie umieść naczynie z zainfekowanymi komórkami w wielodołkowym uchwycie na płytkę wahadłowego wirnika kubełkowego w wirówce stołowej. Odwiruj komórki w temperaturze 900 razy G i 25 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie umieść naczynia hodowlane w inkubatorze dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę w komorze bezpieczeństwa biologicznego, odessaj komórki, dwukrotnie przemyj je HBSS i dodaj pożywkę wzrostową.

Inkubuj naczynie z zainfekowanych komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby uwidocznić inkluzje chlamydii, usuń zakażone chlamydią komórki hela GFP z inkubatora dwutlenku węgla i użyj RPMI bez czerwieni fenolowej i 5% FBS Aby wymienić pożywkę, umieść naczynie lub płytkę wielodołkową na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym z obiektywem olejowym 20 x lub wyższym. Korzystając z oprogramowania do obrazowania, zidentyfikuj zakażone chlamydią komórki hela GFP, które wyglądają jak zielone komórki zawierające duże czarne.

W oknie dialogowym konfiguracji pobierania skonfiguruj oprogramowanie tak, aby pobierało zielony kanał i każdy inny kanał dodany w próbce. Użyj przycisku nagrywania z ukośnikiem przechwytywania, aby uzyskać obraz w żądanym czasie. Po zakażeniu. Usuń zakażone chlamydią komórki hela GFP z inkubatora i umieść czaszę na inwerterowym mikroskopie fluorescencyjnym.

Skoncentruj się na środkowych równinach komórek, w których inkluzje osiągają maksymalną średnicę i wydajność. Ostre krawędzie uzyskują obrazy w co najmniej 10 polach na dołek. Studnie zazwyczaj reprezentują powtórzenia lub zmienne eksperymentalne.

Aby znaleźć komórki hela GFP na karcie pomiarów, użyj polecenia znajdź obiekty i wybierz zielony kanał. Dostosuj intensywność progu na podstawie względnej intensywności komórek. Ręczne liczenie inkluzji lub czarnych komór i komórek hela GFP na oko lub użycie algorytmów oprogramowania do obrazowania w celu automatycznej identyfikacji i zliczania inkluzji.

Filtruj wybrane obiekty, zachowując tylko te większe niż pięć mikrometrów kwadratowych. Nazywamy to populacją pierwszą. Korzystając z tego populowania, zastosuj polecenie Wypełnij otwory w obiektach jako dane wejściowe w tym kroku generujące populację drugą.

Odejmij populację pierwszą od populacji drugiej, aby uzyskać dodatnio oznaczone inkluzje chlamydii oznaczone jako populacja trzecia. Użyj polecenia filtruj populację, aby zastosować filtr rozmiaru do populacji trzeciej. Na przykład, trzymanie obiektów większych niż 25 mikrometrów kwadratowych w przypadku inkluzji w komórkach, zainfekowanych przez 24 godziny lub dłużej w przypadku wczesnej infekcji ustawia filtr rozmiaru tak, aby obiekty były większe niż cztery mikrometry kwadratowe.

Ponieważ te inkluzje są znacznie mniejsze, filtr rozmiaru powoduje utworzenie populacji obiektów oznaczonych jako inkluzje. Użyj oprogramowania do obrazowania, aby obliczyć dane ilościowe na podstawie obrazów, takie jak liczba inkluzji, inkluzja, rozmiar i włączenie. Obwód po zakażeniu inkluzjami chlamydii jest łatwo widoczny jako czarne plamy i komórki gospodarza lub białko fluorescencyjne wyrażające chlamydię w komórkach gospodarza, a ich przejrzystość może być wykorzystana do automatycznej identyfikacji w wielu polach widzenia i/lub leczeniach.

Jak pokazano na tym wykresie, jednym z głównych zastosowań jest oznaczanie jednostek tworzących inkluzję chlamydii w żywych zakażonych komórkach, co eliminuje potrzebę procedur immunofluorescencyjnych, które są zarówno czasochłonne, jak i kosztowne. Inną kluczową cechą tego podejścia do obrazowania jest to, że można je łatwo zastosować do dowolnego gatunku lub szczepu chlamydii. W tym przykładzie przeprowadzono analizę przebiegu w czasie komórek hela GFP zakażonych jednym z czterech gatunków lub szczepów chlamydii dla każdego z tych gatunków i szczepów.

Inkluzje oznaczono i przeanalizowano w celu obliczenia ich średniego obszaru, obwodu, długości i liczby na komórkę we wskazanych momentach. Atrybuty te dostarczają ważnych informacji na temat biologii inkluzji chlamydii, w tym sposobu ich interakcji z komórką gospodarza. Pokazano tutaj film przedstawiający komórki m cherry hela zakażone GFPC, Tracom L dwa składający się ze zdjęć poklatkowych wykonanych w pięciominutowych odstępach przez 125 minut, począwszy od 48 godzin po infekcji.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać tej techniki odwróconego obrazowania, aby nie tylko wizualizować inkluzje chlamydii, ale także określać ilościowo dynamikę inkluzji, taką jak obwód obszaru inkluzji i liczba inkluzji na komórkę. Technika ta jest opłacalna w porównaniu z bardziej tradycyjnymi technikami wizualizacji i działa ze wszystkimi gatunkami i szczepami chlamydii.