Name: Wykorzystanie białek fluorescencyjnych do wizualizacji i ilościowego określenia dynamiki wzrostu wakuoli Chlamydii w żywych komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Naucz się wizualizować i ilościowo określać dynamikę wzrostu wakuoli Chlamydii w żywych komórkach za pomocą fluorescencyjnych białek. Ta metoda umożliwia analizę w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Ianowi Clarke'owi i P. Scottowi Hefty'emu za plazmidy pGFP-SW2 i pASK-GFP-mKate2-L2. Dziękujemy Paulowi Millerowi za pomoc techniczną i Richardowi Stephensowi za inne zasoby. Praca ta została sfinansowana z grantu NIH AI095603 (KH).

1. Generowanie fluorescencyjnych linii komórkowych gospodarza
<ol>
	<li>Dzień 1. Umieść komórki 293T (lub inną retrowirusową linię pakującą) na płytkach 6-dołkowych w 2 x 106 komórek / dołek, aby następnego dnia były zlewające się ~ 75%. W razie potrzeby należy wykonać zduplikowane studzienki dla każdego retrowirusa, który ma być użyty.</li>
	<li>Dzień 2. Odessać komórki i dodać 2 ml świeżej pożywki wzrostowej (DMEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamina). Komórki transfekcyjne z 5–8 μg każda z wektorem retrowirusowym (zawierającym GFP) i wektorem opakowania (np. pVSVg) przy użyciu Lipofectamine 2000 lub podobnego odczynnika i zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Inkubować komórki z DNA przez 4–6 godzin w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C, a następnie zastąpić pożywkę pożywką o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 48 godzin w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dzień 3. Płytki docelowe komórek (np. HeLa) na płytkach 6-dołkowych o przybliżonej gęstości 105 komórek / dołek, aby następnego dnia były ~ 50% zlewane. Sprawdź dodatnią transfekcję w komórkach 293T, monitorując fluorescencję GFP pod odwróconym mikroskopem.</li>
	<li>Dzień 4. Zebrać supernatanty zawierające retrowirusy z komórek 293T za pomocą pipety i przefiltrować supernatant przez filtr strzykawkowy z octanu celulozy 0,45 μm.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z komórek HeLa i dodać 0,5 ml pożywki wzrostowej zawierającej 16 μg/ml polibrenu. Dodać ~0,5 ml przefiltrowanego retrowirusa do komórek kroplami i inkubować komórki w inkubatorze CO 2 o temperaturze 37 °Cprzez 24 godziny. Przechowywać pozostałego retrowirusa (tj. z duplikatu studzienki) w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dzień 5. Jeśli zduplikowane studzienki zostały wykonane w celu wygenerowania dodatkowego retrowirusa, powtórz krok 1.7, aby seryjnie zainfekować pozostałymi cząstkami retrowirusa.</li>
	<li>Dzień 6. Pasaż transfekował komórki HeLa w stosunku 1:1 do 10 cm naczynia zawierającego antybiotyk selekcyjny (np. 500 μg/ml neomycyny).</li>
	<li>Odczekaj wystarczająco dużo czasu, aż transdukowane komórki odrosną w obecności antybiotyku selekcyjnego, po czym komórki mogą być rozmnażane za pomocą standardowych technik z niższym stężeniem antybiotyku selekcyjnego (np. 200 μg/ml neomycyny). 
	Uwaga: W razie potrzeby komórki mogą być również wybierane klonalnie w celu uzyskania idealnej jasności w tym czasie.</li>
</ol>
2. Generacja Chlamydia trachomatis wykazująca ekspresję GFP
<ol>
	<li>Przygotować 2x bufor CaCl2 (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM CaCl2) i bufor 4SP (0,4 M sacharozy, 16 mM Na2HPO4).</li>
	<li>Dzień 1. Zamrożony bulion C. trachomatis rozmrozić na lodzie i natychmiast rozcieńczyć 10 μl bakterii w 50 μl buforu 2x CaCl2. Dodać 3 μg plazmidowego DNA (np. pASK-GFP-mKate2-L2), dobrze wymieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Na tym etapie należy przygotować komórki gospodarza, trypsynizując kolbę T-75 z komórkami McCoya do probówki wirówkowej. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 50 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości 1x buforu CaCl2, aby uzyskać końcowe stężenie 4 x 10 7 komórek/ml.</li>
	<li>Po 30-minutowej inkubacji (od kroku 2.2) dodać 100 μl przygotowanych komórek McCoya do probówki z mieszaniną transformacyjną (całkowita objętość 200 μl) i inkubować przez dodatkowe 20 minut w temperaturze 25 °C. Dodać 100 μl tej mieszaniny przekształconych komórek do pojedynczego dołka z płytki 6-dołkowej i nałożyć 2 ml pożywki wzrostowej. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 przez 2 dni.</li>
	<li>Dzień 3. Lizuj komórki McCoya zakażone C. trachomatis poprzez zastąpienie pożywki 1 ml dH2O i zeskrobanie komórek z wygiętą końcówką pipety o pojemności 1000 μl. Dodać 1 ml buforu 4SP i przepuścić zawiesinę przez igłę 27,5 G ~ 5 razy w celu skutecznej lizy komórek i uwolnienia C. trachomatis.</li>
	<li>Przenieść 2 ml lizatu komórkowego zawierającego C. trachomatis do kolby T-75 zawierającej zlewającą się monowarstwę świeżo posianych komórek McCoya; dodać 8 ml DMEM (bez FBS) i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 25 °C, aby C. trachomatis mógł przylegać do komórek.</li>
	<li>Odessać komórki i dodać świeżą pożywkę wzrostową uzupełnioną 10 j./ml penicyliny G i 1 μg/ml cykloheksymidu. Inkubować kolbę przez 48 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °CCO 2 .</li>
	<li>Dzień 4. Sprawdź za pomocą mikroskopii świetlnej, czy komórki są zakażone, a inkluzje zawierają nieprawidłową chlamydię. Zidentyfikuj inkluzje jako jasne wakuole pod standardowym mikroskopem świetlnym, a nieprawidłowe ciała Chlamydii jako obiekty przypominające pierścienie w inkluzjach o średnicy większej niż 2 μm.</li>
	<li>Dzień 5. Poddać hodowli lizę, zastępując pożywkę 2 mldH 2O i zeskrobać komórki do zawiesiny. Dodać 2 ml buforu 4SP i przepuścić zawiesinę przez igłę 27,5 G ~5 razy.</li>
	<li>Użyj 2 ml lizatu komórkowego, aby zainfekować świeżą monowarstwę komórek McCoya w pojedynczym dołku na płytce 6-dołkowej. Inkubować komórki z lizatem przez 2 godziny w temperaturze 25 °C, odsysać i dodawać świeżą pożywkę wzrostową zawierającą penicylinę G i cykloheksymid.</li>
	<li>Inkubować komórki w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez 3–5 dni, w zależności od ogólnego stanu zdrowia komórek.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.9–2.10 jeden lub więcej razy, w razie potrzeby, pasując kultury do świeżych studzienek na płytce 6-dołkowej, aż pojawią się normalnie wyglądające inkluzje (pozbawione nieprawidłowych ciał). W tym czasie użyj odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, aby sprawdzić, czy C. trachomatis wyraża mKate2 (czerwony).</li>
	<li>Zwiększenie skali zakażonych kultur w celu wytworzenia stad chlamydiów o wysokim mianie, na przykład poprzez zbieranie transformantów Chlamydia z zakażonych komórek McCoya lub HeLa hodowanych w kolbach T-150.</li>
</ol>
3. Zakażenie komórek chlamydią
<ol>
	<li>Umieść komórki GFP-HeLa w żądanym naczyniu hodowlanym, na przykład w naczyniach ze szklanym dnem lub szkiełkach komorowych do obrazowania w wysokiej rozdzielczości lub na płytkach 24-dołkowych do oznaczania IFU i badań przesiewowych wielodołkowych.</li>
	<li>Rozmrozić zamrożoną probówkę zawierającą C. trachomatis, C. muridarum lub C. pneumoniae na lodzie i rozcieńczyć w HBSS do pożądanej liczby infekcji (MOI), na przykład MOI = 1.</li>
	<li>Wykonaj infekcje statyczne lub wspomagane wirowaniem w oparciu o konkretny szczep Chlamydia, który zostanie użyty.
	<ol>
		<li>W przypadku zakażeń seroliferem L2 lub C. muridarum C. trachomatis LGV należy przemyć komórki GFP-HeLa HBSS i inkubować z rozcieńczonymi bakteriami przez 2 godziny w temperaturze 25 °C. Odessać i przemyć komórki HBSS, a następnie inkubować komórki w pożywce wzrostowej w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>W przypadku zakażeń C. trachomatis serowar D lub C. pneumoniae należy przemyć komórki GFP-HeLa HBSS i dodać rozcieńczone bakterie do komórek. Umieścić płytkę wielodołkową lub naczynie ze szklanym dnem (zabezpieczone taśmą w pokrywie płytki wielodołkowej) w uchwycie na płytki wielodołkowe w wahadłowym wirniku kubełkowym w wirówce stołowej.</li>
		<li>Odwirować komórki w temperaturze 900 x g w temperaturze 25 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Wyjąć naczynia hodowlane z wirówki i umieścić w inkubatorze CO 2 o temperaturze 37 °Cna 1 godzinę.</li>
		<li>Odessać komórki w komorze bezpieczeństwa biologicznego, dwukrotnie umyć komórki HBSS i dodać świeżą pożywkę wzrostową. Umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °CCO 2 .</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wizualizacja inkluzji chlamydii na żywo
<ol>
	<li>Usuń zakażone Chlamydią komórki GFP-HeLa z inkubatora CO2 i zastąp pożywkę RPMI bez czerwieni fenolowej + 5% FBS.</li>
	<li>Zamontuj komórki w odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym (Nikon Eclipse Ti-E lub podobny) za pomocą obiektywu olejowego 20X lub wyższego.</li>
	<li>Korzystając z oprogramowania do obrazowania (Volocity 6 lub podobnego), skoncentruj się i zidentyfikuj komórki GFP-HeLa zakażone Chlamydią: zielone komórki zawierające duże czarne (inkluzje Chlamydia).</li>
	<li>Zaznacz lokalizacje xyz regionów zawierających komórki zakażone chlamydią za pomocą oprogramowania do obrazowania (Volocity 6 lub podobnego). Zrób to, ręcznie 'Dodawanie punktów' w trybie widoku stołu montażowego XY. W ten sposób współrzędne xyz są zapisywane dla każdej zaznaczonej lokalizacji.</li>
	<li>W oknie dialogowym Konfiguracja akwizycji skonfiguruj oprogramowanie tak, aby pobierało kanały zielone (GFP, cytozol HeLa) i czerwone (mKate2, C. trachomatis) oraz z szybkością nowych klatek na kanał co 5 minut.</li>
	<li>Uzyskaj sekwencję obrazów za pomocą protokołu akwizycji wprowadzonego powyżej, klikając przycisk "Przechwyć/Nagraj".</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja parametrów wzrostu inkluzji w żywych komórkach
<ol>
	<li>W pożądanym czasie po zakażeniu (np. 24, 48 hpi) należy usunąć zakażone Chlamydią komórki GFP-HeLa z inkubatora i umieścić na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym. Uwaga: Obiektyw powietrzny 20X lub 40X z wysokim NA najlepiej nadaje się do płytek 24-dołkowych, a obiektyw olejowy 40X jest zalecany do szkiełek komorowych. Hoduj komórki na dowolnym podłożu do tego testu.</li>
	<li>Skoncentruj się na płaszczyznach środkowych komórek, gdzie inkluzje mają maksymalną średnicę i dają ostre krawędzie.</li>
	<li>Zdobądź obrazy dla wielu pól w każdym dołku (co najmniej 10 na odwiert); studzienki zazwyczaj reprezentują powtórzenia lub zmienne eksperymentalne.</li>
	<li>Policz liczbę inkluzji ręcznie, na oko (inkluzje to czarne przedziały w komórkach GFP-HeLa) lub użyj algorytmów oprogramowania do obrazowania, aby automatycznie zidentyfikować i zliczyć inkluzje.
	<ol>
		<li>Znajdź komórki GFP-HeLa według intensywności fluorescencji (polecenie "Znajdź obiekty") i dostosuj intensywność progu fluorescencji w oparciu o względne intensywności komórek.</li>
		<li>Filtruj wybrane obiekty, korzystając ze wskazówek dotyczących rozmiaru, aby były one większe niż 5 μm2. To jest "populacja 1".</li>
		<li>Zastosuj polecenie "Wypełnij otwory w obiektach", używając "populacji 1" jako danych wejściowych. Ten krok generuje "populację 2".</li>
		<li>Odejmij "populację 1" od "populacji 2", aby uzyskać dodatnio oznaczone inkluzje Chlamydii, oznaczone jako "populacja 3".</li>
		<li>Zastosuj filtr rozmiaru do "populacji 3" (polecenie "Filtruj populację"), na przykład utrzymując obiekty większe niż 25 μm2 dla inkluzji w zainfekowanych komórkach przez 24 godziny lub dłużej. W przypadku wczesnych czasów infekcji, takich jak przed 18 godziną, należy ustawić filtr o rozmiarze tak, aby utrzymywał obiekty większe niż 4 μm2, ponieważ wtrącenia te są znacznie mniejsze. Filtrowanie rozmiaru powoduje populację obiektów oznaczonych jako "inkluzje".</li>
		<li>Obliczanie danych ilościowych na podstawie obrazów, na przykład liczby inkluzji, wielkości inkluzji i obwodu inkluzji, za pomocą oprogramowania do obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+infections%3A+progress+and+problems%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis infections: progress and problems.</a> The Journal of Infectious Diseases. 179, Suppl 2. S380-S383 (1999).</li>
<li>Schachter, J. Infection and disease epidemiology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchachter%2C+J+%22Chlamydia%3A+Intracellular+Biology%2C+Pathogenesis%2C+and+Immunity%22">Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity</a>. Stephens, R. S. , ASM Press. 139-169 (1999).</li>
<li>Campbell, L. A., Kuo, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+pneumoniae--an+infectious+risk+factor+for+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Chlamydia pneumoniae--an infectious risk factor for atherosclerosis.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (1), 23-32 (2004).</li>
<li>Darville, T., Hiltke, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+genital+tract+disease+due+to+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of genital tract disease due to Chlamydia trachomatis.</a> The Journal of Infectious Diseases. 201, Suppl 2. S114-S125 (2010).</li>
<li>Hackstadt, T. Cell biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHackstadt%2C+T+%22Chlamydia%3A+Intracellular+Biology%2C+Pathogenesis%2C+and+Immunity%22">Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity</a>. Stephens, R. S. , ASM Press. 101-138 (1999).</li>
<li>Wang, Y., Kahane, S., Cutcliffe, L. T., Skilton, R. J., Lambden, P. R., Clarke, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+transformation+system+for+Chlamydia+trachomatis%3A+restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector).</a> PLoS Pathogens. 7 (9), e1002258(2011).</li>
<li>Hackstadt, T., Scidmore, M. A., Rockey, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+in+Chlamydia+trachomatis-infected+cells%3A+directed+trafficking+of+Golgi-derived+sphingolipids+to+the+chlamydial+inclusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids to the chlamydial inclusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).</li>
<li>Boleti, H., Ojcius, D. M., Dautry-Varsat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labelling+of+intracellular+bacteria+in+living+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labelling of intracellular bacteria in living host cells.</a> Journal of Microbiological Methods. 40 (3), 265-274 (2000).</li>
<li>Hybiske, K., Stephens, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+host+cell+exit+by+the+intracellular+bacterium+Chlamydia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11430-11435 (2007).</li>
<li>Heinzen, R. A., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chlamydia+trachomatis+parasitophorous+vacuolar+membrane+is+not+passively+permeable+to+low-molecular-weight+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuolar membrane is not passively permeable to low-molecular-weight compounds.</a> Infection and Immunity. 65 (3), 1088-1094 (1997).</li>
<li>Wickstrum, J., Sammons, L. R., Restivo, K. N., Hefty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+expression+in+Chlamydia+trachomatis+using+the+tet+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conditional gene expression in Chlamydia trachomatis using the tet system.</a> PLoS One. 8 (10), 10-1371 (2013).</li>
<li>Chin, E., Kirker, K., Zuck, M., James, G., Hybiske, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+recruitment+to+the+Chlamydia+inclusion+is+spatiotemporally+regulated+by+a+mechanism+that+requires+host+and+bacterial+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Actin recruitment to the Chlamydia inclusion is spatiotemporally regulated by a mechanism that requires host and bacterial factors.</a> PLoS One. 7 (10), e46949(2012).</li>
<li>Agaisse, H., Derré, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+trachomatis+cloning+vector+and+the+generation+of+C.+trachomatis+strains+expressing+fluorescent+proteins+under+the+control+of+a+C.+trachomatis+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A C. trachomatis cloning vector and the generation of C. trachomatis strains expressing fluorescent proteins under the control of a C. trachomatis promoter.</a> PLoS One. 8 (2), e57090(2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym miejscu opisujemy eksperymentalną strategię generowania fluorescencyjnych komórek gospodarza do wizualizacji i analizy inkluzji Chlamydii w czasie rzeczywistym. To podejście do wizualizacji wakuoli daje potężną zdolność do oświetlania, śledzenia i ilościowego pomiaru dynamicznych właściwości inkluzji chlamydii w populacjach komórek lub w pojedynczych komórkach w czasie. Inkluzje chlamydii w komórkach znakowanych białkiem fluorescencyjnym są uderzająco dobrze zdefiniowane, dzięki czemu można je łat...

Choroby zakaźne wywoływane przez gatunki wewnątrzkomórkowej bakterii Chlamydia stanowią poważne obciążenie dla zdrowia na całym świecie, w tym choroby przenoszone drogą płciową, zapalenie miednicy, ślepota, zapalenie płuc i prawdopodobnie miażdżyca1-4. Zdolność chlamydii do interakcji z komórką gospodarza z wnętrza wakuoli (zwanej inkluzją) jest krytycznym wyznacznikiem pomyślnej infekcji komórek i gospodarza. Inkluzja jest nowym patogennym kompartmentem, który umożliwia wzrost chlamydii i jest dynamicznie modyfikowany przez cały 2-3 dniowy cykl rozwojowy Chlamydia5. Obligatoryjny wewnątrzkomórkowy charakter chlamydii stawia przed społecznością naukową liczne wyzwania, w szczególności w zakresie bezpośredniego badania unikalnej biologii inkluzji. Główną przeszkodą była niemożność skutecznego uwidocznienia zarówno wewnątrzkomórkowej chlamydii, jak i jej włączenia za pomocą metod fluorescencyjnych do żywych komórek. Niedawne odkrycie w końcu ujawniło sposoby generowania GFP eksprymującego C. trachomatis6; Odkrycie to nie doprowadziło jednak jeszcze do konkretnego oznakowania włączenia. Opisano niektóre techniki znakowania bakterii i inkluzji7,8, ale mają one wady, takie jak niespecyficzność, przemijalność i podatność na fotowybielanie. Kluczowe odkrycie dokonane przez naszą grupę ustanowiło nową strategię wyjaśniania inkluzji za pomocą GFP wyrażającego komórki gospodarza9. Strategia ta racjonalnie wykorzystuje wewnętrzną nieprzepuszczalność błony inkluzyjnej dla cząsteczek większych niż 520 Da10. Kiedy komórki są modyfikowane tak, aby stabilnie wyrażały określone cytozolowe białko fluorescencyjne (np. GFP lub mCherry), inkluzje Chlamydii są widoczne z niezwykłą wyrazistością dzięki całkowitemu wykluczeniu fluorescencji. Ta strategia odwrotnego obrazowania umożliwia natychmiastową wizualizację inkluzji dla wszystkich gatunków Chlamydia i może być łatwo dostosowana do większości komórek gospodarza będących przedmiotem zainteresowania. Aby zademonstrować jej użyteczność, metoda ta została wykorzystana wcześniej do ujawnienia i zdefiniowania komórkowych ścieżek wyjścia dla Chlamydia spp9.
Tutaj pokazujemy dalej, jak ta metoda jest wykonywana i może być wykorzystana do uzyskania kluczowych danych ilościowych na temat dynamiki wzrostu integracji. Co więcej, może skutecznie zastąpić kosztowne metody liczenia oparte na przeciwciałach i może być stosowany w połączeniu z innymi znacznikami fluorescencyjnymi, takimi jak Chlamydia11 wykazująca ekspresję mKate2. Ta potężna kombinacja narzędzi umożliwia badanie właściwości fizycznych błony inkluzyjnej chlamydii wewnątrz żywych komórek gospodarza.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Mem</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &micro; m filtry</td><td>Fisher</td><td>09-719D</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Invitrogen</td><td>10131</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 w/o czerwień fenolowa</td><td>Cellgro</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina G</td><td>Sigma</td><td>13752</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia ze szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka komorowe, Lab-Tek II</td><td>Nunc</td><td>154526, 154534</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie białek fluorescencyjnych do wizualizacji i ilościowego określenia dynamiki wzrostu wakuoli chlamydii w żywych komórkach

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Nieodzowna wewnątrzkomórkowa bakteria Chlamydia stanowi ogromne obciążenie dla globalnego zdrowia publicznego. C. trachomatis jest główną bakteryjną przyczyną infekcji przenoszonych drogą płciową, a także główną przyczyną możliwej do uniknięcia ślepoty na świecie. Istotnym wyznacznikiem udanego zakażenia komórek gospodarza przez Chlamydię jest zdolność bakterii do manipulowania sygnalizacją komórek gospodarza z wnętrza nowego, wakuolarnego przedziału zwanego inkluzją. Z wnętrza inkluzji Chlamydia pozyskuje składniki odżywcze niezbędne do ich 2-3 dniowego wzrostu rozwojowego, a dodatkowo wydzielają panel białek efektorowych na cytozolową powierzchnię błony wakuoli i do cytozolu gospodarza. Luki w naszej wiedzy na temat biologii Chlamydii stanowią jednak poważne wyzwanie dla wizualizacji i analizy tego wewnątrzkomórkowego przedziału. Niedawno opisano strategię odwrotnego obrazowania do wizualizacji inkluzji za pomocą ekspresji komórek gospodarza GFP. Podejście to racjonalnie wykorzystuje wewnętrzną nieprzepuszczalność błony inkluzyjnej dla dużych cząsteczek, takich jak GFP. W tej pracy opisujemy, w jaki sposób generowane są komórki gospodarza wykazujące ekspresję GFP lub mCherry w celu późniejszej wizualizacji inkluzji chlamydii. Co więcej, wykazano, że metoda ta skutecznie zastępuje kosztowne metody liczenia oparte na przeciwciałach, może być stosowana w połączeniu z innymi znacznikami fluorescencyjnymi, takimi jak chlamydia wykazująca ekspresję GFP, i może być wykorzystywana do uzyskania kluczowych danych ilościowych na temat wzrostu błony inkluzyjnej u szeregu gatunków i szczepów Chlamydia.

Komórki ssaków wykazujące ekspresję cytozolowych białek fluorescencyjnych (np. GFP) mogą zostać zmodyfikowane tak, aby umożliwić doświetlenie inkluzji Chlamydia w żywych, zainfekowanych kulturach komórkowych. Po infekcji Chlamydia inkluzje są łatwo widoczne jako czarne punkty w komórkach gospodarza (Rysunek 1). Wyraźny kontrast inkluzji pozbawionych fluorescencji może zostać wykorzystany do automatycznej identyfikacji inkluzji w wielu polach widzenia i/lub wariantach traktowani...

Opisana jest metoda oparta na białku fluorescencyjnym żywych komórek do oświetlania wakuoli komórkowych (inkluzji) zawierających Chlamydię. Strategia ta umożliwia szybkie, zautomatyzowane określenie zakaźności Chlamydii w próbkach i może być wykorzystana do ilościowego badania dynamiki wzrostu inkluzji.

Wykorzystanie białek fluorescencyjnych do wizualizacji i ilościowego określenia dynamiki wzrostu wakuoli Chlamydii w żywych komórkach

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja i ilościowe określenie dynamiki wzrostu inkluzji chlamydii w żywych komórkach. Osiąga się to najpierw poprzez wytworzenie fluorescencyjnych komórek gospodarza, które stabilnie ekspresują białko fluorescencyjne, takie jak GFP, w swojej cytoplazmie. Następnie komórki gospodarza są zakażane chlamydiami i poddawane inkubacji.Następnie zakażone komórki są wizualizowane za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek. Na koniec charakterystyka inkluzji chlamydii jest kwantyfikowana przy użyciu oprogramowania do analizy mikroskopowej; ostatecznie fluorescencyjna mikroskopia żywych komórek służy do wizualizacji inkluzji chlamydii wewnątrz komórki gospodarza oraz do pomiaru parametrów biologicznych inkluzji w celu uzyskania wyników ilościowych. Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak liczenie oparte na przeciwciałach, są możliwość zastosowania tej strategii obrazowania odwrotnego w żywych komórkach, a także we współpracy z innymi znacznikami fluorescencyjnymi w celu ilościowego określenia dynamiki inkluzji wszystkich gatunków chlamydii.Ponadto, w przeciwieństwie do rutynowych metod znakujących bakterie wewnątrz komórek, podejście to rozświetla błonę inkluzji w żywych komórkach, co pozwala ujawnić istotne właściwości dynamiczne tego przedziału zawierającego patogen. Po wygenerowaniu fluorescencyjnych komórek HeLa, zgodnie z protokołem tekstowym, wysieje się komórki HeLa GFP na odpowiednie naczynie hodowlane, np. szalki z szklanym dnem do obrazowania o wysokiej rozdzielczości lub płytki 24-dołkowe do oznaczenia IFU i przesiewania w wielu dołkach; następnie rozmraża się na lodzie zamrożoną probówkę zawierającą szczep Crich Cotus lub dowolny inny pożądany szczep chlamydii i rozcieńcza w HBSS do pożądanej wielokrotności infekcji (MOI). Aby przeprowadzić statyczną infekcję przy użyciu Crich Cotus, LGV zero VL two, należy odessać medium z dołków i użyć HBSS do przemycia komórek HeLa GFP.Do dołków dodać rozcieńczone bakterie i inkubować w temperaturze 25 °C przez dwie godziny, następnie aspirować komórki i przemyć je HBSS. Po dodaniu pożywki wzrostowej inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z dwutlenkiem węgla, aby przeprowadzić infekcję wspomaganą wirowaniem szczepem crich serowaru D lub jakimkolwiek innym szczepem chlamydii. Przemyć komórki HeLa GFP za pomocą HBSS i dodać do nich rozcieńczone bakterie.Następnie umieść szalkę z zainfekowanymi komórkami w uchwycie do płytek wielodołkowych rotora z koszyczkami w wirówce laboratoryjnej. Wiruj komórki przy 900 ×g i 25 °C przez jedną godzinę. Następnie umieść naczynia hodowlane w inkubatorze z CO2 w temperaturze 37 °C na jedną godzinę w komorze z laminarnym przepływem powietrza, odessij komórki, przemyj je dwukrotnie roztworem HBSS i dodaj pożywkę wzrostową.Inkubować szalkę z zakażonymi komórkami w temperaturze 37 °C. Aby zwizualizować inkluzje chlamydii, wyjąć zakażone chlamydiami komórki GFP HeLa z inkubatora z dwutlenkiem węgla i użyć pożywki RPMI bez czerwieni fenolowej z dodatkiem 5% FBS do wymiany medium. Umieścić szalkę lub płytkę wielodołkową na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym z obiektywem olejowym 20x lub o większym powiększeniu. Za pomocą oprogramowania do obrazowania zidentyfikować zakażone chlamydiami komórki GFP HeLa, które widoczne są jako zielone komórki zawierające duże czarne otwory.W oknie dialogowym konfiguracji akwizycji ustaw oprogramowanie tak, aby rejestrowało kanał zielony oraz wszelkie inne kanały dodane do próbki. Użyj przycisku capture/record, aby pozyskać obraz w wybranych odstępach czasu. Po infekcji wyjmij z inkubatora komórki HeLa GFP zainfekowane chlamydiami i umieść szalkę na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym.Należy skupić się na środkowych płaszczyznach komórek, gdzie inkluzje osiągają maksymalną średnicę i wydajność. Obrazy o ostrych krawędziach należy pozyskać z co najmniej 10 pól widzenia na każdą studzienkę. Studzienki zazwyczaj reprezentują powtórzenia lub zmienne eksperymentalne.Aby odnaleźć komórki HeLa GFP w zakładce pomiarów, należy użyć polecenia find objects i wybrać kanał zielony. Dostosuj intensywność progu w oparciu o względne intensywności komórek. Ręcznie policz liczbę inkluzji lub czarnych przedziałów oraz komórek HeLa GFP lub użyj algorytmów oprogramowania do obrazowania, aby automatycznie zidentyfikować i policzyć inkluzje.Przefiltruj wybrane obiekty, pozostawiając jedynie te o powierzchni większej niż 5 µm². Oznacz tę grupę jako populacja pierwsza. W odniesieniu do tej populacji zastosuj polecenie wypełniania otworów w obiektach (fill holes in objects); ten krok generuje populację drugą.Odejmij populację pierwszą od populacji drugiej, aby uzyskać dodatnio oznakowane inkluzje chlamydii określone jako populacja trzecia. Użyj polecenia filter population, aby zastosować filtr wielkości do populacji trzeciej. Na przykład, w przypadku inkluzji w komórkach zainfekowanych przez 24 godziny lub dłużej, zachowaj obiekty o powierzchni większej niż 25 µm², natomiast dla wczesnych etapów infekcji ustaw filtr wielkości tak, aby zachować obiekty o powierzchni większej niż 4 µm².Ponieważ inkluzje te są znacznie mniejsze, filtr wielkości pozwala na wyodrębnienie populacji obiektów określonych jako inkluzje. Należy użyć oprogramowania do obrazowania w celu obliczenia danych ilościowych z obrazów, takich jak liczba inkluzji, rozmiar inkluzji oraz obwód inkluzji. Po zakażeniu chlamydiami inkluzje są łatwo widoczne jako czarne plamki w komórkach gospodarza lub chlamydie wykazujące ekspresję białka fluorescencyjnego wewnątrz komórek gospodarza, a ich wyraźność może zostać wykorzystana do zautomatyzowanej identyfikacji w wielu polach widzenia i/lub wariantach traktowania.Jak pokazano na tym wykresie, jednym z głównych zastosowań jest oznaczanie jednostek tworzących inkluzje chlamydii w żywych zakażonych komórkach, co eliminuje potrzebę stosowania procedur immunofluorescencyjnych, które są zarówno czasochłonne, jak i kosztowne. Inną kluczową cechą tej metody obrazowania jest możliwość jej łatwego zastosowania do dowolnego gatunku lub szczepu chlamydii. W tym przykładzie dla każdego z tych gatunków i szczepów przeprowadzono analizę czasową komórek HeLa GFP zakażonych jednym z czterech gatunków lub szczepów chlamydii.Inkluzje zostały oznakowane i przeanalizowane w celu obliczenia ich średniej powierzchni, długości obwodu oraz liczby w komórce w określonych punktach czasowych. Atrybuty te dostarczają istotnych informacji na temat biologii inkluzji chlamydialnych, w tym sposobu, w jaki oddziałują one z komórką gospodarza. Przedstawiony tutaj film z komórek HeLa mCherry zainfekowanych GFPC, Tracom L two składa się z obrazów time-lapse wykonanych w odstępach pięciominutowych przez 125 minut, począwszy od 48 godzin po infekcji.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykorzystania tej techniki obrazowania odwróconego nie tylko do wizualizacji inkluzji Chlamydiae, ale także do ilościowego określania dynamiki inkluzji, takich jak obwód powierzchni inkluzji oraz liczba inkluzji w komórce. Technika ta jest bardziej efektywna kosztowo w porównaniu do tradycyjnych metod wizualizacji i działa w przypadku wszystkich gatunków oraz szczepów chlamydii.

using-fluorescent-proteins-to-visualize-quantitate-chlamydia-vacuole

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Stosowanie białek fluorescencyjnych do wizualizacji i ilościowego określania dynamiki wzrostu wakuoli Chlamydia w żywych komórkach

W niniejszym materiale prezentujemy protokoły przeprowadzania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek na żywych komórkach bakteryjnych, co umożliwia wykrywanie, śledzenie i kwantyfikację funkcjonalnych kompleksów molekularnych.

Wizualizacja pojedynczych kompleksów molekularnych In vivo Wykorzystanie zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Źródło: Chetrit, D. i in. Zastosowanie obrazowania żywych komórek oraz tomografii krioelektronowej w celu wyróżnienia cech przestrzenno-skroniowych systemu sekrecji kropkowej/icm Legionella pneumophila . J. Vis. Exp. (2020).Ten film pokazuje przygotowanie i obrazowanie bakterii patogennych znakowanych fluorescencjonie. Agarozowe podkładki są najpierw przygotowywane i umieszczane w ramie klejącej. Na podkład aplikowana jest zawiesina genetycznie modyfikowanych bakterii ekspresujących...

Przygotowanie próbek i obrazowanie bakterii znakowanych fluorescencją

Opisujemy metody obrazowania, których używamy do badania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych rezydujących w retikulum endoplazmatycznym (ER) za pomocą konfokalnego obrazowania żywych komórek. Analizujemy również ultrastrukturalnie wpływ ich ekspresji na architekturę tego przedziału subkomórkowego.

Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Dokładna kwantyfikacja zdarzeń związanych z transportem pęcherzykowym często dostarcza kluczowych informacji na temat ról poszczególnych białek i skutków mutacji. W pracy przedstawiono metody wykorzystania superekliptycznej pHluoryny, wrażliwego na pH wariantu GFP, jako narzędzia do ilościowego oznaczania zdarzeń endocytarnych w żywych komórkach za pomocą ilościowej mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej.

Zastosowania pHluorin do ilościowej, kinetycznej i wysokoprzepustowej analizy endocytozy u pączkujących drożdży

Zrozumienie funkcji podstawowych procesów zachodzących w bakteriach jest wyzwaniem. Mikroskopia fluorescencyjna z barwnikami specyficznymi dla celu może dostarczyć kluczowych informacji na temat wzrostu komórek drobnoustrojów i progresji cyklu komórkowego. W tym przypadku Agrobacterium tumefaciens jest używany jako bakteria modelowa w celu podkreślenia metod obrazowania żywych komórek w celu scharakteryzowania podstawowych procesów.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu obserwacji podstawowych procesów podczas wzrostu komórek drobnoustrojów

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku do badania dynamiki lokalizacji subkomórkowej białek i monitorowania zmian morfologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości u Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii

Niezbędne barwniki fluorescencyjne są niezbędnymi narzędziami do analiz obrazowania żywych komórek w nowoczesnej biologii komórek grzybów. W artykule szczegółowo opisano zastosowanie znanych i mniej znanych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamiki błony plazmatycznej, endo-/egzocytozy i morfogenezy ściany komórkowej u grzybów strzępkowych.

Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ścian komórkowych do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Ten protokół wykorzystuje fluorescencyjne promotory-reportery, mikroskopię żywych komórek i ekstrakcję indywidualnych inkluzji w ukierunkowanym podejściu genetycznym do identyfikacji i izolacji mutantów rozwojowych Chlamydia trachomatis.

Genetyczne podejście oparte na żywych komórkach w celu identyfikacji i izolacji mutantów rozwojowych w Chlamydia trachomatis

Naucz się wizualizować i ilościowo określać dynamikę wzrostu wakuoli Chlamydii w żywych komórkach za pomocą fluorescencyjnych białek. Ta metoda umożliwia analizę w czasie rzeczywistym.

Wykorzystanie białek fluorescencyjnych do wizualizacji i ilościowego określenia dynamiki wzrostu wakuoli Chlamydii w żywych komórkach (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie białek fluorescencyjnych do wizualizacji i ilościowego określenia dynamiki wzrostu wakuoli Chlamydii w żywych komórkach

Przeglądaj więcej filmów