Name: Szybka synteza i badania przesiewowe chemicznie aktywowanych czynników transkrypcyjnych za pomocą reporterów opartych na GFP (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-26T20:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Poznaj metodę szybkiej syntezy sztucznych czynników transkrypcyjnych w drożdżach z wykorzystaniem reporterów GFP. Technika umożliwia warunkową ekspresję genów i precyzyjną regulację transkrypcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

R.S.M. dziękuje za finansowanie z Stypendium Naukowego dla Absolwentów NSF. M.B.N. dziękuje za finansowanie ze stypendium Lewisa-Siglera i daru Petera Lewisa. D.B. dziękuje za finansowanie z NIH (GM046406) Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych, Centrum Biologii Ilościowej (GM071508). Dziękujemy Christinie DeCoste za pomoc w eksperymentach z cytometrią przepływową.

Rysunek 2 przedstawia schemat sekcji protokołu 1-3.
1. Tworzenie ATF-ów
<ol>
	<li>Stwórz startery do PCR amplifikujące domenę wiązania DNA, która Cię interesuje. Homologia do promotora ACT1 i receptora hormonalnego (jak opisano na rysunkach 3 i 4) jest dodawana za pomocą PCR, aby ułatwić prawidłową rekombinację do szczepu yMN15.</li>
	<li>PCR amplifikuje DBD będący przedmiotem zainteresowania przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności.</li>
	<li>Przekształć >1 μg oczyszczonego produktu PCR w drożdże metodąoctanu litu 13.</li>
	<li>Po transformacji obracaj komórki z maksymalną prędkością przez 15 sekund w mikrowirówce i usuń mieszankę transformacyjną.</li>
	<li>Zawiesić w ~200 μl sterylnej wody i płytce na YPD.</li>
	<li>Następnego dnia replika talerza z YPD na płytkach 5-FOA (płytki 5-FOA są wykonane zgodnie z opisem w Podręczniku drożdży Cold Spring Harbor)13.</li>
	<li>Pozwól rosnąć przez 2-4 dni i umieść co najmniej 5-10 kolonii na YPD. Wykonaj PCR kolonii przy użyciu starterów z Tabeli 1 i sekwencji w celu sprawdzenia włączenia.</li>
</ol>
2. Stworzenie ATF Plasmid Reporter
<ol>
	<li>Określ miejsce wiązania ATF (najprawdopodobniej pochodzące z literatury).</li>
	<li>Uporządkuj żądany region wiązania jako oligonukleotydy (lub ultramery, jeśli to konieczne). Proszę zamawiać jako pasmo górne i dolne z prawidłowymi zwisami dla NotI i XbaI, jak pokazano w tabeli 2.</li>
	<li>Rozcieńczyć oligonukleotyde do stężeń równomolowych (100 μM).</li>
	<li>Fosforylować za pomocą kinazy polinukleotydowej T4, a następnie wyżarzać w termocyklerze. Warunki reakcji przedstawiono w tabeli 3.</li>
	<li>Trawić ~1-2 μg pMN8 za pomocą NotI-HF i XbaI przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C (warunki reakcji w tabeli 4).</li>
	<li>Żel oczyszcza pasmo kręgosłupa.</li>
	<li>Rozcieńczyć oczyszczony szkielet do 10 ng/μl.</li>
	<li>Rozcieńczyć dwuniciowe, ufosforylowane miejsce wiązania do 5-krotności stężenia molowego szkieletu na μl.</li>
	<li>Za pomocą ligazy DNA T4 podwiązywać miejsca wiązania do strawionego szkieletu w temperaturze pokojowej przez 30 minut (Tabela 5).</li>
	<li>W celu przemiany należy dodać połowę reakcji ligacji do 50 μl standardowych, chemicznie kompetentnych Escherichia coli, takich jak XL1-Blue lub DH5-Alpha.</li>
	<li>Ogniwa szoku termicznego przez 45 sekund w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C, a następnie umieścić na lodzie na 2 minuty.</li>
	<li>Dodać 900 μl pożywki SOC do reakcji przemiany.</li>
	<li>Rosnąć w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę na bębnie rolkowym.</li>
	<li>Rozprowadzić 100-200 μl komórek na płytce LB+AMP (100 μg/ml) i inkubować przez noc.</li>
	<li>Wyhoduj E. coli w płynie LB+AMP i zbierz plazmidowe DNA. Sekwencja zweryfikować nowy plazmid reporterowy z kolonii ligacji za pomocą startera 5'-GTACCTTATATTGAATTTTC-3'.</li>
	<li>Przekształć nowy plazmid reporterowy w szczep drożdży zawierający ATF z sekcji 1 za pomocą transformacji octanu litu.</li>
</ol>
3. Ilościowe określenie wpływu indukcji ATF na ekspresję genów za pomocą GFP Reporter
Przygotowanie próbek:
<ol>
	<li>Przygotować 25 mM zapasu β-estradiolu (10 ml etanolu + 0,0681 g β-estradiolu). Przechowywać w lodówce.</li>
	<li>Uprawiaj odmianę zawierającą ATF + Reporter przez noc w 5 ml SC-URA.</li>
	<li>Zaopatrzyć się w dziewięć kolb wstrząsowych o pojemności 250 ml i dodać do każdej z nich 25 ml SC-URA.</li>
	<li>Dodać 0 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μM lub 10 μM β-estradiolu. Najłatwiej to zrobić, wykonując 10-krotne seryjne rozcieńczenia 25 mM zapasu β-estradiolu. Aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM β-estradiolu, dodaj 10 μl 25 mM β-estradiolu do 25 ml SC-URA.</li>
	<li>Dodać 125 μl nocnych kultur do kolb (rozcieńczenie 1:200).</li>
	<li>W przypadku 2 pozostałych kolb należy zaszczepić szczepem wytwarzającym GFP i szczepem pozbawionym GFP. Są one potrzebne do kalibracji cytometru przepływowego.</li>
	<li>Wstrząsać przy 200 obr./min w 30 °C przez 12-18 godz. 
	Uwaga: Optymalny czas inkubacji określa się, określając, kiedy indukcja GFP nie zmienia się już po dodaniu β-estradiolu.</li>
	<li>Weź 500 μl każdej kultury i odwiruj w oddzielnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml.</li>
	<li>Zassać SC-URA.</li>
	<li>Umyć raz w 1 ml PBS+0,1% Tween-20 i aspirat.</li>
	<li>Dodać 1 ml PBS+0,1% Tween-20 i zawiesić ponownie.</li>
	<li>Dodać 1 ml PBS+0,1% Tween-20 do probówek Falcon.</li>
	<li>Dodać zawieszone komórki do probówek o pojemności 5 ml (końcowa objętość = 2 ml) (można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka dni).</li>
	<li>Opcjonalnie: lekko sonikować komórki, aby rozbić wszelkie zlepione komórki. 
	Analiza cytometrii przepływowej: Przegląd: Fluorescencja 10 000-100 000 komórek jest zwykle analizowana na próbkę. Dane mogą być przetwarzane zarówno w FlowJo, jak i za pomocą niestandardowych skryptów w MATLAB lub R. Upewnij się, że kalibrujesz napięcie kanału GFP za pomocą kontroli dodatniej i ujemnej GFP. Po wyeksportowaniu plików FCS do przetworzenia danych można użyć skryptu, takiego jak ten na rysunku 6 wraz z funkcją fca_readfcs (<a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader</a>).</li>
	<li>Wykonaj cytometrię przepływową.
	<ol>
		<li>Użyj rozproszenia do przodu (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC), aby zidentyfikować komórki drożdży.</li>
		<li>Ustaw natężenie przepływu na ~3,000 komórek/sek.</li>
		<li>Pomiar GFP (kanał FITC).</li>
		<li>Po zebraniu danych wyeksportuj plik . Pliki FCS</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj program MATLAB.</li>
	<li>Przesuń plik . FCS, fcs_readfcs.m i skrypt podobny do tego z rysunku 6 do tego samego folderu.</li>
	<li>Zmień bieżący katalog roboczy na folder zawierający dane i skrypty.</li>
	<li>Uruchom skrypt z rysunku 6 (uwaga: legenda została wprowadzona ręcznie w celu uzyskania tego, co pokazano na rysunku 7).</li>
</ol>
4. Ilościowe określenie wpływu indukcji ATF na wzrost komórek
<ol>
	<li>Z zamrożonych wywarów wytrzyj zarówno (1) szczep zawierający ATF, jak i (2) szczep pozbawiony ATF (taki jak yMN15) na oddzielnych płytkach YPD.</li>
	<li>Po 2 dniach wzrostu zaszczepić każdy szczep w oddzielnych probówkach hodowlanych zawierających 5 ml płynu YPD i hodować przez noc w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Wykonaj 10-krotne seryjne rozcieńczenia 0,25 mM roztworu podstawowego β-estradiolu do 10 000 razy (0,025 μM β-estradiolu) w 100% etanolu.</li>
	<li>Dodać 40 μl nocnych kultur do 10 ml płynu YPD (rozcieńczenie 1-250).</li>
	<li>Dla każdego szczepu dodać 96 μl rozcieńczonych komórek do 18 dołków 96-dołkowej płytki.</li>
	<li>Dodaj 4 μl β-estradiolu do komórek. Istotną kwestią jest upewnienie się, że każda studnia ma taką samą ilość etanolu ogółem. (Alternatywnie, można użyć bardziej skoncentrowanego zapasu β-estradiolu, a następnie rozcieńczyć go do punktu, w którym nie można zmierzyć wpływu etanolu na wzrost).</li>
	<li>Wykonać w trzech egzemplarzach. Trzy studzienki dla każdego szczepu powinny być kontrolne wyłącznie na bazie etanolu.</li>
	<li>Przykryj 96-dołkową płytkę membraną przepuszczającą gaz.</li>
	<li>Monitoruj wzrost (OD600) w czytniku płytek.</li>
	<li>Określ ilościowo tempo wzrostu za pomocą dowolnej liczby standardowych metod, takich jak znalezienie maksymalnego nachylenia. 
	Uwaga: Odnieśliśmy duży sukces z pakietem oprogramowania open source grofit14, który działa w środowisku programistycznym R. Warto wspomnieć, że chociaż tempo wzrostu obliczone na podstawie 96-dołkowych testów płytkowych w porównaniu z kolbami wstrząsowymi (25 ml kultur) niekoniecznie jest takie samo (ze względu na różnice zarówno w fizjologii, jak i oprzyrządowaniu), zaobserwowaliśmy, że względne tempo wzrostu jest podobne (choć nie zawsze tak jest).</li>
</ol>
5. Tworzenie indukowalnych alleli genomowych
<ol>
	<li>Otrzymaj pMN10, plazmid niecentromerowy z promotorem reagującym na ATF z pMN8 połączonym z KanMX (w odwrotnej orientacji).</li>
	<li>Ograniczenie trawi szkielet wektora i ekstrakt żelowy, jak w sekcji 2.</li>
	<li>Oligonukleotydy wyżarzające, fosforylowane i ligatowate zawierające odpowiednie miejsca wiązania, jak opisano w sekcji 2.</li>
	<li>Weryfikacja sekwencji. Ten plazmid będzie teraz służył jako matryca DNA do tworzenia indukowalnego allelu.</li>
	<li>Otrzymać szczep drożdży wyrażający odpowiadający mu ATF, który jest przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>PCR amplifikować kasetę KanMX-Promoter (~2 kb) przy użyciu starterów z Tabeli 6.</li>
	<li>Przekształć produkt PCR w szczep wykazujący ekspresję ATF przy użyciu metody octanu litu.</li>
	<li>Tabliczka na YPD i tabliczka repliki na YPD+ G418 następnego dnia.</li>
	<li>Potwierdzić prawidłowe wprowadzenie promotora za pomocą startera do przodu (5'-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3') i startera wstecznego wewnętrznego do genu, którego promotor został zastąpiony. Odwrócony starter jest zwykle projektowany tak, aby znajdował się w zakresie 200-300 pz za pierwszym ATG15. Końcowy produkt PCR to ~1,2 kb.</li>
</ol>

<ol><li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+gene+expression+perturbation+systems+with+rapid%2C+tunable%2C+single-gene+specificity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+res%22%5BJournal%5D)">Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast.</a> Nucleic acids res. 41, e57(2013).</li>
<li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast-acting+and+nearly+gratuitous+induction+of+gene+expression+and+protein+depletion+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+cell%22%5BJournal%5D)">Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Biol. cell. 22, 4447-4459 (2011).</li>
<li>Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+GAL4-VP16+to+a+steroid-binding+domain+provides+a+tool+for+gratuitous+induction+of+galactose-responsive+genes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast.</a> Gene. 131, 129-134 (1993).</li>
<li>Littlewood, T. D., Hancock, D. C., Danielian, P. S., Parker, M. G., Evan, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+oestrogen+receptor+ligand-binding+domain+as+an+improved+switch+for+the+regulation+of+heterologous+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+res%22%5BJournal%5D)">A modified oestrogen receptor ligand-binding domain as an improved switch for the regulation of heterologous proteins.</a> Nucleic acids res. 23, 1686-1690 (1995).</li>
<li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+Analysis+of+mRNA+Molecules+Using+Fluorescence+In+Situ+Hybridization+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Vis. Exp. (76), e50382(2013).</li>
<li>McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation-based+analysis+and+modeling+of+combinatorial+regulation+in+the+yeast+sulfur+assimilation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+cell%22%5BJournal%5D)">Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway.</a> Mol. Biol. cell. 23, 2993-3007 (2012).</li>
<li>Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+activator%2Frepressor+dual+system+allows+tight+tetracycline-regulated+gene+expression+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+res%22%5BJournal%5D)">An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast.</a> Nucleic acids res. 26, 942-947 (1998).</li>
<li>Baron, U., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+repressor-based+system+for+regulated+gene+expression+in+eukaryotic+cells%3A+principles+and+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances.</a> Meth. Enzymol. 327, 401-421 (2000).</li>
<li>Kodama, S., Okada, K., Akimoto, K., Inui, H., Ohkawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+aryl+hydrocarbon+receptors+for+bioassay+of+aryl+hydrocarbon+receptor+ligands+in+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Recombinant aryl hydrocarbon receptors for bioassay of aryl hydrocarbon receptor ligands in transgenic tobacco plants.</a> Plant Biotechnol. J. 7, 119-128 (2009).</li>
<li>Hickman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+regulation+of+sulfur+and+phospholipid+metabolism+reflects+the+importance+of+methylation+in+the+growth+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+cell%22%5BJournal%5D)">Coordinated regulation of sulfur and phospholipid metabolism reflects the importance of methylation in the growth of yeast.</a> Mol. Biol. cell. 22, 4192-4204 (2011).</li>
<li>Taxis, C., Stier, G., Spadaccini, R., Knop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+protein+depletion+by+genetically+controlled+deprotection+of+a+dormant+N-degron%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient protein depletion by genetically controlled deprotection of a dormant N-degron.</a> Mol. Syst. Biol. 5, 267(2009).</li>
<li>Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+auxin-based+degron+system+for+the+rapid+depletion+of+proteins+in+nonplant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+methods%22%5BJournal%5D)">An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells.</a> Nat. methods. 6, 917-922 (2009).</li>
<li>Burke, D. J., Amberg, D. C., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurke%2C+DJ+%22Methods+in+Yeast+Genetics%3A+A+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+Course+Manual%22">Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual</a>. , (2005).</li>
<li>Kahm, M., Hasenbrink, G., Lichtenberg-Frate, H., Ludwig, J., Kschischo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((grofit%3A+Fitting+Biological+Growth+Curves+with+R%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Stat.+Softw%22%5BJournal%5D)">grofit: Fitting Biological Growth Curves with R.</a> J. Stat. Softw. 33, 1-21 (2010).</li>
<li>Rozen, S., Skaletsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods Mol. Biol. 132, 365-386 (2000).</li>
<li>Khalil, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+biology+framework+for+programming+eukaryotic+transcription+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions.</a> Cell. 150, 647-658 (2012).</li>
<li>Chockalingam, K., Chen, Z., Katzenellenbogen, J. A., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+specific+receptor-ligand+pairs+for+use+in+the+creation+of+gene+switches%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of specific receptor-ligand pairs for use in the creation of gene switches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5691-5696 (2005).</li>
<li>McLachlan, M. J., Chockalingam, K., Lai, K. C., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+orthogonal+ligand+specificity+in+a+single+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of orthogonal ligand specificity in a single scaffold.</a> Angewandte Chemie. 48, 7783-7786 (2009).</li>
<li>Jorgensen, P., Nishikawa, J. L., Breitkreutz, B. J., Tyers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+pathways+that+couple+cell+growth+and+division+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of pathways that couple cell growth and division in yeast.</a> Science. 297, 395-400 (2002).</li>
<li>Sopko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+cell%22%5BJournal%5D)">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Mol. cell. 21, 319-330 (2006).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+biotechnol%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nat. biotechnol. 20, 1041-1044 (2002).</li>
<li>Polstein, L. R., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-inducible+spatiotemporal+control+of+gene+activation+by+customizable+zinc+finger+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 16480-16483 (2012).</li>
<li>Losi, A., Gartner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Old+chromophores%2C+new+photoactivation+paradigms%2C+trendy+applications%3A+flavins+in+blue+light-sensing+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Old chromophores, new photoactivation paradigms, trendy applications: flavins in blue light-sensing photoreceptors.</a> Photochem. Photobiol. 87, 491-510 (2011).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+deconstruction+of+parkinsonian+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry.</a> Science. 324, 354-359 (2009).</li>
<li>Milias-Argeitis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+feedback+for+in+vivo+regulation+of+a+gene+expression+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+biotechnol%22%5BJournal%5D)">In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit.</a> Nat. biotechnol. 29, 1114-1116 (2011).</li>
</ol>

McIsaac, Noyes i Botstein (wraz z innymi) przedłożyli część tego systemu jako Ujawnienie Patentu.

Opisane tutaj przełączniki oparte na hormonach mają niezliczone zastosowania, od badania natywnej biologii komórki po testowanie zdolności interesującej nas domeny wiążącej DNA do celowania w sekwencję DNA in vivo. System posiada wiele pożądanych cech, w tym stopniowaną reakcję na induktor, szybkie działanie i ścisłą regulację (tj. brak mierzalnej nieszczelności, patrz rysunek 7). Wciąż jednak jest miejsce na ulepszenia i ekspansję.
Ostatnie prace w dziedzinie biologii syntetycznej kładą nacisk na multipleksowanie systemów syntetycznych i rozszerzanie repertuaru dobrze scharakteryzowanych, programowalnychczęści DNA. Niezależna, warunkowa ekspresja odrębnych genów docelowych wymaga zarówno wielu induktorów, jak i domen wiążących DNA, które nie mają nakładającej się specyficzności. Dostępność zmodyfikowanych i naturalnie występujących receptorów zapewnia duży zestaw części, za pomocą których można opracować nowe sztuczne czynniki transkrypcyjne. Poszerzenie repertuaru wzajemnie ortogonalnych przełączników zostało znacznie ułatwione przez podejścia oparte na ukierunkowanej ewolucji17,18. Obecne wysiłki zmierzające do przeprogramowania swoistości wiążącej ligand naszych sztucznych czynników transkrypcyjnych zostaną przedstawione w przyszłości.
Wcześniej fenotypowe konsekwencje delecji/nadekspresji genów były szeroko badane u drożdży19,20. Jednak nie było łatwo zbadać wpływ ekspresji na różne fenotypy w zakresie poziomów ekspresji. Podstawową cechą przedstawionego tu systemu jest jego stopniowany charakter (rysunek 8). Choć często się zakłada, związek między ekspresją genów a fenotypami będącymi przedmiotem zainteresowania niekoniecznie musi być monotonny. Sztuczne czynniki transkrypcyjne, takie jak Z3EV i Z4EV, ułatwią zadanie oceny odpowiedzi fenotypowych na zmiany w ekspresji genów.
Wreszcie, protokoły omówione w tym manuskrypcie służą do inżynierii i charakteryzowania sztucznych czynników transkrypcyjnych, które reagują na β-estradiol; jednak ważną alternatywą dla domen reagujących chemicznie jest użycie domen reagujących na światło (takich jak PhyB/Pif3, Lov i BLUF), których działanie jest odwracalne bez konieczności zakłócania pożywki hodowlanej21-23. Systemy oparte na świetle ułatwiają czasoprzestrzenną kontrolę ekspresji genów, interakcji białko-białko, transportu jonów i aktywności enzymatycznej, które już okazały się potężne21-26.
Podsumowując, przedstawiono metody szybkiej budowy indufikowalnych, sztucznych czynników transkrypcyjnych w drożdżach. Protokół ten zawiera szablon do ich budowy w połączeniu z pokrewnymi reporterami GFP, a także metody analizy danych reporterowych za pomocą cytometrii przepływowej i oznaczania wpływu aktywacji ATF na wzrost.

Rozwój przełączników genetycznych u drożdży jest bardzo interesujący zarówno w badaniach akademickich, jak i przemysłowych. W idealnym przypadku przełączniki genetyczne mogą być używane do aktywacji określonego genu (lub zestawu genów) tylko wtedy, gdy jest to pożądane przez eksperymentatora. Sekwencja kodująca gen umieszczona za syntetycznym promotorem nie ulega ekspresji pod nieobecność cząsteczki indukującej: po dodaniu induktora gen powinien ulec szybkiej ekspresji. Dopiero niedawno wykazano, że taki przełącznik można zaprojektować u drożdży, gdzie przy braku induktora szczep wykazuje fenotyp delecji, ale w obecności induktora ekspresja jest aktywowana proporcjonalnie do poziomu induktora we wszystkich komórkach1,2. Historycznie rzecz biorąc, systemy ekspresji warunkowej u drożdży w dużym stopniu opierały się na sekwencjach DNA reagujących na składniki odżywcze, w tym promotorach MET, PHO i GAL (których aktywność jest wrażliwa na zewnątrzkomórkowe poziomy metioniny, fosforanu i galaktozy). Chociaż ekspresja warunkowa może być osiągnięta, odbywa się to kosztem znaczących efektów plejotropowych.
Receptory hormonalne, takie jak receptory ludzkiego estrogenu, okazały się skutecznymi przełącznikami u eukariontów3,4. W przypadku braku hormonu białko połączone z receptorem hormonalnym może zostać sekwestrowane w cytoplazmie, gdzie oddziałuje z kompleksem opiekuńczym Hsp90. Po związaniu odpowiedniego liganda receptor ulega zmianie konformacyjnej, powodując jego uwolnienie z kompleksu opiekuńczego Hsp90 i ujawniając sygnał lokalizacji jądrowej. Aby zaobserwować dynamikę lokalizacji określonego białka zawierającego receptor hormonalny, stworzyliśmy C-końcową fuzję Gal4dbd.ER.VP16 (GEV, syntetyczny czynnik transkrypcyjny zawierający domenę wiążącą DNA Gal4p, domenę wiążącą ligand ludzkiego receptora estrogenowego i VP16) z GFP2. Lokalizację jądrową obserwowano w ciągu 8 minut po dodaniu nasyconych ilości induktora, ß-estradiolu, dla którego drożdże typu dzikiego są całkowicie obojętne. W tym czasie większość komórek ma wyraźnie widoczne aktywne miejsca transkrypcji dla docelowych genów GEV (oznaczane za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ), a także w pełni dojrzałe mRNA2,5. Ekspresja docelowych genów GEV wzrosła >2-krotnie w ciągu 2,5 minuty2,6 (mierzonej za pomocą mikromacierzy), co pokazuje, że potrzeba <2,5 minuty, aby chimeryczny aktywator przemieścił się do jądra, związał DNA i aktywował transkrypcję.
Podczas gdy kilka innych przełączników zostało zastosowanych w drożdżach, które wykorzystują różne małe cząsteczki lub leki (w tym klasyczne przełączniki oparte na doksycyklinie z Escherichia coli7,8 i przełącznikna bazie indygo 9 z Arabidopsis thaliana), żaden z nich nie osiągnął szybkości, specyficzności ani szczelności regulacji, jaką wykazują przełączniki oparte na hormonach. Warto wspomnieć, że szybkie wyłączniki zostały również opracowane u drożdży i zazwyczaj działają poprzez fuzję genu z proteazą lub ligazą ubikwityny ukierunkowaną na sekwencję2,10,11,12. Zdolność do szybkiego usuwania białka docelowego z komórki ułatwia badanie niezbędnych genów, a także genów, które są podatne na supresję genetyczną po usunięciu10.
Metody opisane w tym protokole służą do budowy i charakteryzowania syntetycznych przełączników u drożdży. Po pierwsze, pokazujemy, jak szybko generować zintegrowane genomowo białka fuzyjne składające się z domeny wiążącej DNA, domeny wiążącej ligand ludzkiego receptora estrogenowego i VP16 (DBD-EV). Zgodnie z naszym protokołem, białko fuzyjne ulega ekspresji z promotora ACT1. Następnie pokazujemy, jak stworzyć pokrewny plazmid reporterowy dla ATF i testujemy jego funkcjonalność za pomocą cytometrii przepływowej. Chociaż przewidujemy, że te plazmidy reporterowe będą używane z nowymi ATF (ryc. 1), mogą być również używane jako reportery dla natywnego aktywatora transkrypcji. Na koniec przedstawiono szczegółowe informacje dotyczące testowania wpływu aktywacji ATF na wzrost komórek na płytkach 96-dołkowych oraz inżynierii indukowalnych alleli genomowych.

<table><tbody><tr><td>Nazwa firmy odczynnikowej</td><td></td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze&nbsp;</td></tr><tr><td>Rozwiń system PCR o wysokiej wierności</td><td>Roche</td><td>11 732 650 001</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Kompetentny E. coli</td><td>Life Technologies</td><td>18258-012</td><td></td></tr><tr><td>Estradiol</td><td>Tocris Biosciences</td><td>2824</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>T4 Kinaza polinukleotydowa</td><td>NEB</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-23</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>clonNAT</td><td>Jena Bioscience</td><td>AB-102L</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>NotHF</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td></td></tr><tr><td>Bufor CutSmart</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>D15-500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Peptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>BD Biosciences</td><td>210929</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Life Technologies</td><td>11811-031</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny octan litu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6883</td><td></td></tr><tr><td>DNA nasienia łososia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>PEG 3350</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3640</td><td></td></tr><tr><td>Plazmidy pMN8 i pMN10; szczep drożdży yMN15</td><td>Noyes lub Botstein labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bulion Luria</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3397</td><td></td></tr><tr><td>SPRZĘT:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyometr przepływowy LSRII&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Różne modele</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB lub FlowJo</td><td>MATLAB lub FlowJo</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy . Pliki FCS z eksperymentów cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>R</td><td>Open Source</td><td></td><td>Do analizy danych o tempie wzrostu z czytnika płytek.&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki Falcon</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml Eppendorf&nbsp; Probówki</td><td>GeneMate</td><td>C3262-1</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Shake Flask</td><td>Corning</td><td>4446-250</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe, płaskie płytki Czytnik</td> płytek <td>Costar</td><td>3635</td><td></td></tr><tr><td>(wielomodowy czytnik płytek Synergy H1)</td><td>BioTek</td><td>H1MG</td><td></td></tr><tr><td>Oddychające membrany</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z380059-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>różne firmy</td><td>Różne modele</td><td></td></tr><tr><td>SC-Ura w proszku</td><td>MP Biomedicals</td><td>114410622</td><td></td></tr><tr><td>5-FOA</td><td>Zymo Research</td><td>F9001-1</td><td></td></tr></tbody></table>

szybka synteza i badania przesiewowe chemicznie aktywowanych czynników transkrypcyjnych za pomocą reporterów opartych na gfp

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Biologia syntetyczna ma na celu racjonalne projektowanie i budowanie syntetycznych obwodów o pożądanych właściwościach ilościowych, a także dostarczanie narzędzi do badania struktury natywnych obwodów kontrolnych. W obu przypadkach przydatna może być możliwość zaprogramowania ekspresji genów w szybki i dostrajalny sposób, bez efektów niepożądanych. Skonstruowaliśmy szczepy drożdży zawierające promotor ACT1 przed kasetą URA3, a następnie domenę wiążącą ligand ludzkiego receptora estrogenowego i VP16. Przekształcając ten szczep za pomocą liniowego produktu PCR zawierającego domenę wiążącą DNA i selekcjonując pod kątem obecności URA3, w wyniku rekombinacji homologicznej można wygenerować sztuczny czynnik transkrypcyjny (ATF) o konstytutywnej ekspresji. ATF zaprojektowane w ten sposób mogą aktywować unikalny gen docelowy w obecności induktora, eliminując w ten sposób zarówno aktywację poza celem, jak i niefizjologiczne warunki wzrostu występujące w powszechnie stosowanych systemach warunkowej ekspresji genów. Opracowano również prostą metodę szybkiej budowy plazmidów reporterowych GFP, które reagują specyficznie na natywny lub sztuczny czynnik transkrypcyjny będący przedmiotem zainteresowania.

Rycina 5 przedstawia indukcję GFP przez Z3EV, Z4EV lub GEV w funkcji czasu. Zauważalny jest wzrost produkcji GFP w odpowiedzi na ATF zawierające domeny wiążące DNA pochodzenia niedrożdżowego. Niedawno wysunięto hipotezę, że wynika to z faktu, iż czynniki te osiągają swoistość wobec pojedynczego genu w genomie drożdżowym1. Sama indukcja GEV prowadzi do aktywacji/represji setek genów, podczas gdy Z3EV i Z4EV aktywują jedynie ekspresję genu docelowego umieszczonego poniżej syntetycznego promotora zawierającego odpowiednie miejsca wiązania (odpowiednio 5'-GCGTGGGCG-3' i 5'-GCGGCGGAGGAG-3')1. Rycina 7 demonstruje ścisłą regulację systemu (brak induktora skutkuje brakiem wykrywalnego GFP) oraz fakt, że wszystkie komórki ulegają indukcji w odpowiedzi na induktor. Zdolność Z3EV do indukcji GFP w zależności od stężenia β-estradiolu przedstawiono na Rycynie 8.
<img alt="Schemat szlaku sygnałowego hormonów; wiązanie czynnika transkrypcyjnego, aktywacja plazmidu reporterowego, ekspresja GFP." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Sztuczne czynniki transkrypcyjne oddziałują z Hsp90 w obecności β-estradiolu. Po związaniu β-estradiolu z ATF, Hsp90 dysocjuje, co umożliwia ATF wniknięcie do jądra i aktywację ekspresji z plazmidu reporterowego.
<img alt="Proces tworzenia sztucznego czynnika transkrypcyjnego; PCR, konstrukcja plazmidu, cytometria przepływowa; schemat biologiczny." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Schemat protokołu inżynierii szczepów zawierających sztuczne czynniki transkrypcyjne oraz budowy i testowania pokrewnych reporterów GFP.
<img alt="Schemat procesu rekombinacji DNA; dopasowanie sekwencji, homologia starterów PCR dla edycji genów." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Sekwencja ACT1pr-URA3-EV w szczepie yMN15 w locus LEU2.
<img alt="Startery do PCR amplifikujące domenę wiążącą DNA, szczegóły sekwencji, metoda amplifikacji." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Projekt starterów PCR do amplifikacji interesującej domeny wiążącej DNA z dodatkową homolgią sekwencji w celu wygenerowania nowego białka fuzyjnego po udanej transformacji do szczepu yMN15.
<img alt="Wykres ekspresji GFP; czas względem intensywności w trzech warunkach (Z4EV, GEV, Z3EV); wynik eksperymentalny." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Indukcja GFP przez trzy różne pary promotorów ATF w odpowiedzi na 1 µM β-estradiolu.
<img alt="Skrypt MATLAB do analizy histogramu fluorescencji GFP; przetwarzanie danych FCS i generowanie wykresów." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Skrypt MATLAB do przetwarzania danych z cytometrii przepływowej. Skrypt ten został zaadaptowany z <a href="http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data">http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data</a>.
<img alt="Wykres analizy intensywności fluorescencji dla ekspresji GFP przy różnych stężeniach estradiolu." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Indukcja GFP przez Z3EV w odpowiedzi na 0 µM β-estradiolu oraz 1 µM β-estradiolu po 18 hr indukcji. Fluorescencję mierzono również w komórkach pozbawionych GFP, aby zilustrować ścisłą regulację systemu Z3EV. Rycina ta została wygenerowana przy użyciu kodu przedstawionego na Rycynie 6.
<img alt="Odpowiedź fluorescencyjna: wykres w skali logarytmicznej (A), analiza krzywej dawka-odpowiedź (B), dopasowanie dla β-estradiolu." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8. Zależność między stężeniem induktora a poziomem ekspresji ma charakter stopniowy ze współczynnikiem Hilla wynoszącym ~1. (A) Rozkłady ekspresji GFP w funkcji stężenia β-estradiolu. (B) Średnia fluorescencja rozkładów z punktu (A). Dane dopasowano do funkcji G(D) = Gmin + (Gmax−Gmin)Dn/(Kn+Dn), gdzie D to dawka β-estradiolu, Gmin i Gmax to odpowiednio minimalne i maksymalne wartości GFP, n to współczynnik Hilla, a K to dawka β-estradiolu dająca ½ (Gmax + Gmin).
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="176">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sekwencja oligonukleotydów</td>
			<td>Nazwa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5’-TTGAAACCA 
			AACTCGCCTCT-3’</td>
			<td>Kontrola DBD w kierunku przód</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5’-tccagagac 
			ttcagggtgct-3’</td>
			<td>Kontrola DBD Reverse</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Startery służące do potwierdzenia prawidłowej fuzji wybranego DBD z receptorem estrogenowym. Starter przedni (forward) jest homologiczny do promotora ACT1, a starter odwrotny (reverse) jest homologiczny do receptora estrogenowego. Dla typowych DBD (~300 bp) produkt PCR ma wielkość &lt;1,5 kb.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sekwencja oligonukleotydowa</td>
			<td>Nazwa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5'-ggccgc…miejsce wiązania DBD... t-3'</td>
			<td>Górny oligonukleotyd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5’-ctaga…odwrotna sekwencja wiązania DNA…gc-3’  </td>
			<td>Dolny oligonukleotyd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5'-gccgcGTGGGCGTGCGTGGGCGGG 
			CGTGGGCGTGCGTGGGCGGGCGTG 
			GGCGTGCGTGGGCGt-3'</td>
			<td>Górny oligo + 6x miejsc wiązania Zif268</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5’-ctagaCGCCCACGCACGCCCACGCC 
			CGCCCACGCACGCCCACGCCCGCC 
			CACGCACGCCCACgc-3’ </td>
			<td>Dolny oligonukleotyd + 6x miejsc wiązania Zif268</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Tabela 2. Struktura starterów do tworzenia dsDNA zawierającego interesujące miejsca wiązania. Do stworzenia promotora responsywnego na Z3EV wykorzystano oligonukleotydy Top oligo + 6x Zif268 Binding Sites oraz Bottom oligo + 6x Zif268 Binding. Sekwencje służące do tworzenia odpowiednich nawisów DNA zapisano małymi literami. Konsensusowa sekwencja wiązania Zif268, GCGTGGGCG, została podkreślona w górnym oligonukleotydzie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Ilość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do kinazy polinukleotydowej T4</td>
			<td>5 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kinaza polinukleotydowa T4 (@10 000 j./ml)</td>
			<td>1 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Górny oligonukleotyd (100 µM)</td>
			<td>1.5 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolny oligonukleotyd (100 µM)</td>
			<td>1.5 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda</td>
			<td>41 µl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Tabela 3. Przeprowadź fosforylację i wyżarzanie starterów w termocyklerze, używając 50 µl opisanej powyżej mieszaniny reakcyjnej. Proces w termocyklerze składa się z dwóch etapów. Etap 1: 37 °C przez 30 min (fosforylacja) oraz etap 2: 95 °C przez 30 sec (obniżanie temperatury o 1 °C co 30 sec aż do osiągnięcia 4 °C; wyżarzanie).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Ilość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>1 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF</td>
			<td>1 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plazmidowe DNA</td>
			<td>5 µl (1-2 µg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor 10x Cut Smart</td>
			<td>5 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda</td>
			<td>38 µl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Tabela 4. Trawienie restrykcyjne plazmidu pMN8 za pomocą XbaI i NotI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176">
	<tbody>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl65" height="22" style="height:16.5pt;width:66pt" width="88">Odczynnik</td>
			<td class="xl66" style="width:66pt" width="88">Ilość</td>
		</tr>
		<tr height="43" style="height:32.25pt">
			<td>Bufor do ligazy T4</td>
			<td>2 µl</td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td>Ligaza T4</td>
			<td>0.2 µl</td>
		</tr>
		<tr height="43" style="height:32.25pt">
			<td>Szkielet @ 10 ng/µl</td>
			<td>1 µl</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td>Sekwencje wiążące w 5-krotnym stężeniu molowymµl</td>
			<td>1 µl</td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td>Woda</td>
			<td>15.8 µl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Tabela 5. Ligacja miejsc wiązania do DNA plazmidowego.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Starter</td>
			<td>Opis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>~40 bp powyżej ATG + CGCACTTAACTTCGCATCTG-3’</td>
			<td>Starter bezpośredni do amplifikacji promotora KanMX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5’-odwrotna komplementarna sekwencja(ATG + ~37bp) + TATAGTTTTTTCTCCTTGACG-3’</td>
			<td>Starter odwrotny do amplifikacji promotora KanMX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5’-caatttgtctgctcaagaaaataaa 
			ttaaatacaaataaaCGCAC 
			TTAACTTCGCATCTG-3’</td>
			<td>Starter bezpośredni do wytwarzania GCN4 wymiana promotora</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5’-tggatttaaagcaaataaacttgg 
			ctgatattcggacatTATAGTT 
			TTTTCTCCTTGACG-3’</td>
			<td>Starter odwrotny do przygotowania GCN4 wymiana promotora</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Tabela 6. Amplifikacja PCR promotora KanMX w celu stworzenia allelu tytrowalnego.

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę szybkiej budowy sztucznych czynników transkrypcyjnych (ATF) z pokrewnymi reporterami GFP oraz ilościowe określenie zdolności ATF do stymulowania ekspresji GFP za pomocą cytometrii przepływowej.

Szybka synteza i badania przesiewowe chemicznie aktywowanych czynników transkrypcyjnych za pomocą reporterów opartych na GFP

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie, przetestowanie i walidacja genetycznie zakodowanych, indukowalnych sztucznych czynników transkrypcyjnych (ATF) o pożądanej specyficzności. Osiąga się to poprzez wstępne stworzenie ATF za pomocą prostej transformacji drożdży, w której wprowadzenie produktu PCR domeny wiążącej DNA skutkuje powstaniem fuzji w jednej ramce odczytu z ludzkim receptorem estrogenowym oraz VP 16. Drugim krokiem procedury jest stworzenie plazmidu reporterowego GFP dla ATF poprzez zastąpienie miejsc wiązania w plazmidzie PMN eight sekwencjami celowymi TF.Trzecim krokiem procedury jest analiza zdolności ATF do aktywacji reportera GFP oraz ocena jego wpływu na fizjologię drożdży poprzez pomiar tempa wzrostu. Ostatnim krokiem procedury jest wykorzystanie zwalidowanego TF do warunkowej ekspresji natywnego celu genomowego. W rezultacie każdy wybrany gen docelowy może zostać uczyniony warunkowo aktywnym.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak indukcja ekspresji genów za pomocą galaktozy, jest możliwość uzyskania selektywnej indukcji w różnych warunkach odżywczych i fizjologicznych bez efektów plejotropowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii drożdży poprzez szybkie i odwracalne wprowadzanie pożądanych produktów genów, co umożliwia badanie zarówno przyrostu, jak i utraty funkcji. W celu rozpoczęcia procedury, należy przeprowadzić amplifikację PCR domeny wiążącej DNA lub DVD, wykorzystując polimerazę o wysokiej wierności.Przeprowadź transformację drożdży ilością produktu PCR po oczyszczaniu przekraczającą 1 µg, stosując metodę z octanem litu. Po transformacji wiruj komórki z maksymalną prędkością przez 15 sekund w mikrocentry fudze, usuń mieszaninę transformacyjną i resuspenduj komórki w około 200 µL sterylnej wody przed wysianiem na podłoże z ekstraktem drożdżowym, peptone i dekstrozą (YPD). Następnego dnia wykonaj replikację z podłoża YPD na płytki z kwasem 5-fluoroorotowym.Po okresie wzrostu od dwóch do czterech dni, ponownie wysiać co najmniej pięć do 10 kolonii na podłoże YPD. Następnie przeprowadzić kolonialną reakcję PCR z wykorzystaniem starterów opisanych w protokole tekstowym i wykonać sekwencjonowanie w celu weryfikacji włączenia. Rozcieńczyć oligosy dla pożądanego regionu wiążącego do stężeń ekvimolarnych.Przeprowadź fosforylację regionu wiążącego za pomocą T4 polinukleotydowej kinazy, a następnie użyj termocyklera neo zgodnie z warunkami reakcji opisanymi w protokole tekstowym. Następnie poddaj trawieniu około 1–2 µg PMN 8 za pomocą Not1 HF i xb.1 przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C w żelu.Oczyść prążek szkieletu i rozcieńcz oczyszczony szkielet do stężenia 10 nanograms per microliter. Następnie rozcieńcz dwuniciową fosforylowaną sekwencję wiążącą do stężenia pięciokrotnie przekraczającego stężenie molowe szkieletu per microliter. Za pomocą T four DNA Ligase liguj sekwencje wiążące do trawionego szkieletu w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Przeprowadź transformację, dodając połowę reakcji ligacji do 50 µL standardowych chemicznie kompetentnych komórek E. coli szczepu EIA, zgodnie z procedurą opisaną w protokole tekstowym. Po regeneracji komórek, nanieś od 100 do 200 µL zawiesiny komórkowej na każdą płytkę z pożywką Luria-Bertani (LB) z dodatkiem ampicyliny i inkubuj przez noc. Następnego dnia namnóż E. coli w płynnej pożywce LB z ampicyliną i wyizoluj plazmidowy DNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Następnie należy zweryfikować sekwencję nowego plazmidu reporterowego z kolonii po ligacji. Na koniec wprowadzić nowy plazmid reporterowy do szczepu E zawierającego TF A, stosując transformację octanem litu. Aby rozpocząć, należy przez noc hodować szczep zawierający TF oraz reporter w pięciu mililitrach syntetycznego podłoża kompletnego pozbawionego uracylu.Przygotuj 9 kolb Erlenmeyera o pojemności 250 ml i dodaj do każdej z nich 25 ml pożywki SC minus URA. Następnie w siedmiu z kolb przygotuj różne rozcieńczenia beta-estradiolu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, wykonując dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne z roztworu zapasu beta-estradiolu o stężeniu 25 mM; do tych siedmiu kolb dodaj po 125 µL kultur nocnych. Pozostałe dwie kolby zaszczep szczepem konstytutywnie produkującym GFP oraz szczepem pozbawionym GFP. Są one niezbędne do kalibracji cytometru przepływowego.Wstrząsaj kolbę z prędkością 200 RPM w temperaturze 30°C przez 12 do 18 godzin. Następnie pobierz 500 µL z każdej hodowli i odwiruj w oddzielnych probówkach typu einor o pojemności 1,7 ml. Po odessaniu supernatantu jednorazowo przemyj osad komórkowy buforem do cytometrii przepływowej, a następnie resuspenduj komórki w jednym mililitrze tego samego buforu.Następnie dodaj 1 ml buforu do cytometrii przepływowej do dziewięciu probówek typu Falcon. Przenieś resuspenderowane komórki do probówek z buforem, aby uzyskać objętość końcową równą 2 ml. Na koniec przeprowadź analizę w cytometrze przepływowym.Użyj rozproszenia światła w przód (forward scatter) oraz rozproszenia bocznego (side scatter), aby zidentyfikować komórki drożdży. Ustaw szybkość przepływu na około 3000 komórek na sekundę. Zmierz poziom GFP w kanale 50 i postępuj zgodnie z protokołem tekstowym: z mrożonych stoków wykreśl oba szczepy – szczep zawierający A TF oraz szczep pozbawiony A TF – na podłoże YPD. Po dwóch dniach wzrostu zaszczep oddzielne probówki zawierające pięć mililitrów płynnego podłoża YPD i inkubuj każdy szczep przez noc w temperaturze 30 °C.Przeprowadzić dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne 0,25 mM roztworu zapasu beta estradiol do rozcieńczenia 10 000-krotnego w 100% etanolu. Dodać 40 µL każdej nocnej hodowli do 10 mL płynnego medium YPD. Dla każdego szczepu nanieść 96 µL rozcieńczonych komórek do 18 studzienek płytki 96-dołkowej.Następnie dodaj cztery µL beta-estradiolu do komórek. Kluczowym punktem jest upewnienie się, że każda studnia zawiera taką samą całkowitą ilość etanolu. Wykonaj próbę w trzech powtórzeniach, w których dla każdego szczepu trzy studnie będą zawierały tylko etanol.Próbki kontrolne przykrywa się płytkę 96-dołkową membraną przepuszczalną dla gazów. Wzrost monitoruje się, mierząc gęstość optyczną przy 600 nanometrach za pomocą czytnika płytek. Szybkość wzrostu określa się dowolną wybraną metodą, np. poprzez wyznaczenie maksymalnego nachylenia krzywej.Po przygotowaniu plazmidu zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole PCR, należy przeprowadzić amplifikację kasety promotora can MX. Produkt PCR transformuje się do szczepu wykazującego ekspresję A TF, stosując metodę z octanem litu; następnie transformowane komórki wysiewa się na podłoże YPD, a następnego dnia wykonuje się przesianie na podłoże YPD z dodatkiem antybiotyku G 418. Na koniec należy potwierdzić prawidłową insercję promotora, wykorzystując starter forward oraz starter reverse wewnątrz genu, którego promotor został zastąpiony.Końcowy produkt PCR ma wielkość około 1,2 KB. Przedstawiono tutaj indukcję GFP przez trzy różne pary promotorów a TF: Z4EV, Z3EV lub GEV w czasie, w odpowiedzi na 1 µM beta-estradiolu. Zwróć uwagę na zwiększoną produkcję GFP w odpowiedzi na ATF zawierające domeny wiążące DNA niepochodzące z drożdży. Może to wynikać z faktu, że czynniki te osiągają specyficzność względem pojedynczego genu w genomie drożdży.Sama indukcja GEV prowadzi do aktywacji lub represji setek genów, podczas gdy Z three EV i Z four EV aktywują ekspresję jedynie genu docelowego umieszczonego za syntetycznym promotorem zawierającym odpowiednie miejsca wiązania. Tutaj przedstawiono indukcję GFP przez Z three EV w odpowiedzi na 0 nM beta estradiol oraz 1 µM beta estradiol po 18 godzinach indukcji. Pomiar fluorescencji przeprowadzono również w komórkach pozbawionych GFP, aby zilustrować ścisłą regulację systemu Z three EV. Przedstawiono tutaj zdolność Z three EV do indukcji GFP w różnych stężeniach beta estradiol.Średnia fluorescencja rozkładów wykazuje, że zależność między stężeniem induktora a poziomem ekspresji jest stopniowana, z współczynnikiem Hilla wynoszącym około jeden, co wskazuje na niezależne wiązanie Z trzy EV. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak mikromacierze ekspresji genów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład o to, w jaki sposób zmiana ekspresji pojedynczego genu wpływa na genomowe wzorce ekspresji genów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak projektować, testować i weryfikować skuteczność sztucznych czynników transkrypcyjnych. Te sztuczne czynniki transkrypcyjne warunkowo kontrolują ekspresję genów umieszczonych poniżej odpowiednich docelowych sekwencji DNA.

rapid-synthesis-screening-chemically-activated-transcription-factors

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Szybka synteza i przesiewowe badanie chemicznie aktywowanych czynników transkrypcyjnych z reporterami opartymi na GFP

Prezentujemy szybką i tanią metodę przesiewową do identyfikacji regulatorów transkrypcji za pomocą wysokoprzepustowych transfekcji robotycznych i domowego testu lucyferazy o podwójnym świeceniu.  Protokół ten szybko generuje bezpośrednie dane funkcjonalne dla tysięcy genów i można go łatwo modyfikować w celu ukierunkowania na dowolny gen będący przedmiotem zainteresowania.

Wysokoprzepustowe funkcjonalne badania przesiewowe przy użyciu domowego testu lucyferazy o podwójnym blasku

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Uporczywa aktywacja hamujących receptorów sprzężonych z białkiem G powoduje uwrażliwienie na sygnalizację cyklazy adenylowej. Aby zidentyfikować podstawowe szlaki molekularne, konieczne jest bezstronne podejście; jednak strategia ta wymaga opracowania skalowalnego testu uczulającego na cAMP opartego na komórkach. W niniejszym artykule opisujemy test uczulający do badań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA.

Uwrażliwienie cyklazy adenylowej na leki: usprawnienie i miniaturyzacja testów do zastosowań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA

Tutaj opisujemy komórkowy test genu reporterowego jako cenne narzędzie do badania bibliotek chemicznych pod kątem związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej wywieranej przez 3' UTR.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Tutaj prezentujemy ulepszony protokół badań przesiewowych drożdży z jedną hybrydą, aby zidentyfikować czynniki transkrypcyjne (TF), które mogą wiązać się z interesującym nas regionem ludzkiego DNA. Ta metoda wykorzystuje potok przesiewowy o wysokiej przepływności, który może badać wiązanie &gt;1 000 TF w jednym eksperymencie.

Ulepszone badania przesiewowe hybryd drożdży w celu identyfikacji powiązania czynnika transkrypcyjnego z sekwencjami ludzkiego DNA

Aby zidentyfikować nowe regulatory czynników transkrypcyjnych, opracowaliśmy podejście do badania przesiewowego bibliotek RNAi lentiwirusowych lub retrowirusowych za pomocą testu reporterowego opartego na podwójnej lucyferazie. Takie podejście oferuje szybki i stosunkowo niedrogi sposób na przebadanie przesiewowe setek kandydatów w jednym eksperymencie.

Identyfikacja regulatorów czynników transkrypcyjnych za pomocą średnioprzepustowego badania przesiewowego bibliotek tablicowych i reportera opartego na podwójnej lucyferazie

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Badanie opisuje metodę eksperymentów o wysokiej przepustowości z wykorzystą matrycę LED drukowaną w 3D, aby zoptymalizować ekspresję genów indukowanych światłem w HEK293T komórkach.

Szybka optymalizacja systemu indukowalnego światłem do kontroli ekspresji genów ssaków

W tym filmie przedstawiamy generowanie oraz ekspansję ex vivo ludzkich limfocytów B aktywowanych przez CD40 (CD40-B) z mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) poprzez stymulację ligandem CD40 oraz interleukiną-4.

Generowanie ludzkich limfocytów B aktywowanych CD40

Poznaj metodę szybkiej syntezy sztucznych czynników transkrypcyjnych w drożdżach z wykorzystaniem reporterów GFP. Technika umożliwia warunkową ekspresję genów i precyzyjną regulację transkrypcji.

Szybka synteza i badania przesiewowe chemicznie aktywowanych czynników transkrypcyjnych za pomocą reporterów opartych na GFP

Przeglądaj więcej filmów