Szybka synteza i badania przesiewowe chemicznie aktywowanych czynników transkrypcyjnych za pomocą reporterów opartych na GFP

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie, przetestowanie i walidacja genetycznie zakodowanych, indukowalnych sztucznych czynników transkrypcyjnych (ATF) o pożądanej specyficzności. Osiąga się to poprzez wstępne stworzenie ATF za pomocą prostej transformacji drożdży, w której wprowadzenie produktu PCR domeny wiążącej DNA skutkuje powstaniem fuzji w jednej ramce odczytu z ludzkim receptorem estrogenowym oraz VP 16. Drugim krokiem procedury jest stworzenie plazmidu reporterowego GFP dla ATF poprzez zastąpienie miejsc wiązania w plazmidzie PMN eight sekwencjami celowymi TF.

Trzecim krokiem procedury jest analiza zdolności ATF do aktywacji reportera GFP oraz ocena jego wpływu na fizjologię drożdży poprzez pomiar tempa wzrostu. Ostatnim krokiem procedury jest wykorzystanie zwalidowanego TF do warunkowej ekspresji natywnego celu genomowego. W rezultacie każdy wybrany gen docelowy może zostać uczyniony warunkowo aktywnym.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak indukcja ekspresji genów za pomocą galaktozy, jest możliwość uzyskania selektywnej indukcji w różnych warunkach odżywczych i fizjologicznych bez efektów plejotropowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii drożdży poprzez szybkie i odwracalne wprowadzanie pożądanych produktów genów, co umożliwia badanie zarówno przyrostu, jak i utraty funkcji. W celu rozpoczęcia procedury, należy przeprowadzić amplifikację PCR domeny wiążącej DNA lub DVD, wykorzystując polimerazę o wysokiej wierności.

Przeprowadź transformację drożdży ilością produktu PCR po oczyszczaniu przekraczającą 1 µg, stosując metodę z octanem litu. Po transformacji wiruj komórki z maksymalną prędkością przez 15 sekund w mikrocentry fudze, usuń mieszaninę transformacyjną i resuspenduj komórki w około 200 µL sterylnej wody przed wysianiem na podłoże z ekstraktem drożdżowym, peptone i dekstrozą (YPD). Następnego dnia wykonaj replikację z podłoża YPD na płytki z kwasem 5-fluoroorotowym.

Po okresie wzrostu od dwóch do czterech dni, ponownie wysiać co najmniej pięć do 10 kolonii na podłoże YPD. Następnie przeprowadzić kolonialną reakcję PCR z wykorzystaniem starterów opisanych w protokole tekstowym i wykonać sekwencjonowanie w celu weryfikacji włączenia. Rozcieńczyć oligosy dla pożądanego regionu wiążącego do stężeń ekvimolarnych.

Przeprowadź fosforylację regionu wiążącego za pomocą T4 polinukleotydowej kinazy, a następnie użyj termocyklera neo zgodnie z warunkami reakcji opisanymi w protokole tekstowym. Następnie poddaj trawieniu około 1–2 µg PMN 8 za pomocą Not1 HF i xb.1 przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C w żelu.

Oczyść prążek szkieletu i rozcieńcz oczyszczony szkielet do stężenia 10 nanograms per microliter. Następnie rozcieńcz dwuniciową fosforylowaną sekwencję wiążącą do stężenia pięciokrotnie przekraczającego stężenie molowe szkieletu per microliter. Za pomocą T four DNA Ligase liguj sekwencje wiążące do trawionego szkieletu w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Przeprowadź transformację, dodając połowę reakcji ligacji do 50 µL standardowych chemicznie kompetentnych komórek E. coli szczepu EIA, zgodnie z procedurą opisaną w protokole tekstowym. Po regeneracji komórek, nanieś od 100 do 200 µL zawiesiny komórkowej na każdą płytkę z pożywką Luria-Bertani (LB) z dodatkiem ampicyliny i inkubuj przez noc. Następnego dnia namnóż E. coli w płynnej pożywce LB z ampicyliną i wyizoluj plazmidowy DNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Następnie należy zweryfikować sekwencję nowego plazmidu reporterowego z kolonii po ligacji. Na koniec wprowadzić nowy plazmid reporterowy do szczepu E zawierającego TF A, stosując transformację octanem litu. Aby rozpocząć, należy przez noc hodować szczep zawierający TF oraz reporter w pięciu mililitrach syntetycznego podłoża kompletnego pozbawionego uracylu.

Przygotuj 9 kolb Erlenmeyera o pojemności 250 ml i dodaj do każdej z nich 25 ml pożywki SC minus URA. Następnie w siedmiu z kolb przygotuj różne rozcieńczenia beta-estradiolu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, wykonując dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne z roztworu zapasu beta-estradiolu o stężeniu 25 mM; do tych siedmiu kolb dodaj po 125 µL kultur nocnych. Pozostałe dwie kolby zaszczep szczepem konstytutywnie produkującym GFP oraz szczepem pozbawionym GFP. Są one niezbędne do kalibracji cytometru przepływowego.

Wstrząsaj kolbę z prędkością 200 RPM w temperaturze 30°C przez 12 do 18 godzin. Następnie pobierz 500 µL z każdej hodowli i odwiruj w oddzielnych probówkach typu einor o pojemności 1,7 ml. Po odessaniu supernatantu jednorazowo przemyj osad komórkowy buforem do cytometrii przepływowej, a następnie resuspenduj komórki w jednym mililitrze tego samego buforu.

Następnie dodaj 1 ml buforu do cytometrii przepływowej do dziewięciu probówek typu Falcon. Przenieś resuspenderowane komórki do probówek z buforem, aby uzyskać objętość końcową równą 2 ml. Na koniec przeprowadź analizę w cytometrze przepływowym.

Użyj rozproszenia światła w przód (forward scatter) oraz rozproszenia bocznego (side scatter), aby zidentyfikować komórki drożdży. Ustaw szybkość przepływu na około 3000 komórek na sekundę. Zmierz poziom GFP w kanale 50 i postępuj zgodnie z protokołem tekstowym: z mrożonych stoków wykreśl oba szczepy – szczep zawierający A TF oraz szczep pozbawiony A TF – na podłoże YPD. Po dwóch dniach wzrostu zaszczep oddzielne probówki zawierające pięć mililitrów płynnego podłoża YPD i inkubuj każdy szczep przez noc w temperaturze 30 °C.

Przeprowadzić dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne 0,25 mM roztworu zapasu beta estradiol do rozcieńczenia 10 000-krotnego w 100% etanolu. Dodać 40 µL każdej nocnej hodowli do 10 mL płynnego medium YPD. Dla każdego szczepu nanieść 96 µL rozcieńczonych komórek do 18 studzienek płytki 96-dołkowej.

Następnie dodaj cztery µL beta-estradiolu do komórek. Kluczowym punktem jest upewnienie się, że każda studnia zawiera taką samą całkowitą ilość etanolu. Wykonaj próbę w trzech powtórzeniach, w których dla każdego szczepu trzy studnie będą zawierały tylko etanol.

Próbki kontrolne przykrywa się płytkę 96-dołkową membraną przepuszczalną dla gazów. Wzrost monitoruje się, mierząc gęstość optyczną przy 600 nanometrach za pomocą czytnika płytek. Szybkość wzrostu określa się dowolną wybraną metodą, np. poprzez wyznaczenie maksymalnego nachylenia krzywej.

Po przygotowaniu plazmidu zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole PCR, należy przeprowadzić amplifikację kasety promotora can MX. Produkt PCR transformuje się do szczepu wykazującego ekspresję A TF, stosując metodę z octanem litu; następnie transformowane komórki wysiewa się na podłoże YPD, a następnego dnia wykonuje się przesianie na podłoże YPD z dodatkiem antybiotyku G 418. Na koniec należy potwierdzić prawidłową insercję promotora, wykorzystując starter forward oraz starter reverse wewnątrz genu, którego promotor został zastąpiony.

Końcowy produkt PCR ma wielkość około 1,2 KB. Przedstawiono tutaj indukcję GFP przez trzy różne pary promotorów a TF: Z4EV, Z3EV lub GEV w czasie, w odpowiedzi na 1 µM beta-estradiolu. Zwróć uwagę na zwiększoną produkcję GFP w odpowiedzi na ATF zawierające domeny wiążące DNA niepochodzące z drożdży. Może to wynikać z faktu, że czynniki te osiągają specyficzność względem pojedynczego genu w genomie drożdży.

Sama indukcja GEV prowadzi do aktywacji lub represji setek genów, podczas gdy Z three EV i Z four EV aktywują ekspresję jedynie genu docelowego umieszczonego za syntetycznym promotorem zawierającym odpowiednie miejsca wiązania. Tutaj przedstawiono indukcję GFP przez Z three EV w odpowiedzi na 0 nM beta estradiol oraz 1 µM beta estradiol po 18 godzinach indukcji. Pomiar fluorescencji przeprowadzono również w komórkach pozbawionych GFP, aby zilustrować ścisłą regulację systemu Z three EV. Przedstawiono tutaj zdolność Z three EV do indukcji GFP w różnych stężeniach beta estradiol.

Średnia fluorescencja rozkładów wykazuje, że zależność między stężeniem induktora a poziomem ekspresji jest stopniowana, z współczynnikiem Hilla wynoszącym około jeden, co wskazuje na niezależne wiązanie Z trzy EV. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak mikromacierze ekspresji genów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład o to, w jaki sposób zmiana ekspresji pojedynczego genu wpływa na genomowe wzorce ekspresji genów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak projektować, testować i weryfikować skuteczność sztucznych czynników transkrypcyjnych. Te sztuczne czynniki transkrypcyjne warunkowo kontrolują ekspresję genów umieszczonych poniżej odpowiednich docelowych sekwencji DNA.