Szybka synteza i badania przesiewowe chemicznie aktywowanych czynników transkrypcyjnych za pomocą reporterów opartych na GFP

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie, przetestowanie i walidacja genetycznie kodowanych, indukowalnych sztucznych czynników transkrypcyjnych lub ATF o pożądanej swoistości. Osiąga się to poprzez najpierw utworzenie A TF poprzez prostą transformację drożdży, w której włączenie produktu PCR z domeną wiążącą DNA powoduje fuzję w ramce z ludzkim receptorem estrogenowym i VP 16. Drugim krokiem procedury jest stworzenie plazmidu reporterowego GFP dla A TF poprzez zastąpienie miejsc wiązania w plazmidzie PMN osiem sekwencjami ukierunkowanymi na TF.

Trzecim krokiem procedury jest oznaczenie zdolności ATF do aktywacji reportera GFP, a także ocena jego wpływu na fizjologię drożdży poprzez pomiar szybkości wzrostu. Ostatnim krokiem procedury jest użycie zwalidowanego TF do warunkowej ekspresji, natywnego celu genomowego. Ostatecznie każdy gen docelowy, który nas interesuje, może zostać warunkowo aktywowany.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak indukcja ekspresji genów za pośrednictwem galaktozy, jest to, że selektywną indukcję można osiągnąć w różnych warunkach odżywczych i fizjologicznych bez skutków pleotropowych. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w biologii drożdży poprzez szybkie i odwracalne wprowadzenie pożądanych produktów genowych, umożliwiając badanie zarówno przyrostu, jak i utraty funkcji. Na początek PCR amplifikuje domenę wiążącą DNA lub DVD za pomocą polimerazy o wysokiej wierności.

Przekształć więcej niż jeden mikrogram oczyszczonego produktu PCR w drożdże przy użyciu metody octanu litu. Po przemianie wiruj komórki z maksymalną prędkością przez 15 sekund w mikrowirówce, usuń mieszaninę transformacyjną i ponownie zawieś komórki w około 200 mikrolitrach sterylnej wody przed posiewem na ekstrakcie drożdżowym. Dekstroza pepto lub pożywka YPD następnego dnia replika płytki z YPD na pięciu płytkach z kwasem fluoroerotycznym.

Po wzroście przez dwa do czterech dni zreaguj co najmniej pięć do 10 kolonii na YPD. Następnie wykonaj PCR kolonii przy użyciu starterów w protokole tekstowym i sekwencji, aby zweryfikować włączenie. Rozcieńczyć pożądane oligonukleotydy regionu wiązania do stężeń równomolowych.

Fosforyluj obszar wiązania za pomocą kinazy polinukleotydowej T czter, a następnie neotermocyklera zgodnie z warunkami reakcji w protokole tekstowym. Następnie należy strawić około jednego do dwóch mikrogramów PMN osiem bez jednego HF i xb. Jeden na godzinę w żelu o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Oczyść pasmo szkieletowe i rozcieńcz oczyszczony szkielet do 10 nanogramów na mikrolitr. Następnie rozcieńczyć dwuniciowe, fosforylowane miejsce wiązania do pięciokrotności stężenia molowego szkieletu na mikrolitr. Za pomocą ligazy DNA T four ligaz podwiązują miejsca wiązania do strawionego szkieletu w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Przeprowadzić transformację, dodając połowę reakcji ligacji do 50 mikrolitrów standardowych, chemicznie kompetentnych komórek EIA coli i postępując zgodnie z procedurą wymienioną w protokole tekstowym. Po odzyskaniu komórek dodaj od 100 do 200 mikrolitrów komórek na płytkę luria berti lub lb plus ampicylina, inkubuj przez noc. Następnego dnia wyhoduj e. coli i lb plus płyn ampicyliny i zbierz plazmidowe DNA, jak opisano w protokole tekstowym.

Następnie sekwencyjnie zweryfikuj nowy plazmid reporterowy z kolonii ligacji. Na koniec przekształć nowy plazmid reporterowy w szczep A TF zawierający E za pomocą transformacji octanu litu. Aby rozpocząć, należy wyhodować szczep zawierający TF plus reporter przez noc w pięciu mililitrach syntetycznego kompletnego podłoża pozbawionego uracylu.

Uzyskać 9 250 mililitrów, wstrząsnąć kolbą i dodać do każdego 25 mililitrów SC minus URA. Następnie przygotować siedem kolb z różnym rozcieńczeniem beta estradiolu, jak podano w protokole tekstowym, od dziesięciokrotnego seryjnego rozcieńczenia 25-milimolowego materiału wyjściowego beta estradiolu w 125 mikrolitrach kultur nocnych do tych siedmiu kolb dla dwóch pozostałych kolb, zaszczepić składowym szczepem wytwarzającym GFP i szczepem pozbawionym GFP. Są one potrzebne do kalibracji cytometru przepływowego.

Potrząsać kolbą przy 200 obr./min i w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 12 do 18 godzin. Następnie usuń 500 mikrolitrów każdej kultury i odwiruj w oddzielnych 1,7 mililitrowych probówkach einor. Po odessaniu supernatantu przepłukać granulowane komórki raz buforem do cytometrii przepływowej, a następnie ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze tego samego buforu.

Następnie dodaj jeden mililitr buforu cytometrii przepływowej do dziewięciu falcon dwa. Dodaj ponownie zawieszone komórki do buforu zawierającego probówki sokoła do uzyskania końcowej objętości równej dwóm mililitrom. Na koniec wykonaj cytometrię przepływową.

Użyj rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego, aby zidentyfikować komórki drożdży. Ustaw natężenie przepływu na około 3000 komórek na sekundę. Zmierz GFP przez kanał 50 i postępuj jak w protokole tekstowym, z zamrożonych zapasów usuń zarówno szczep zawierający TF A, jak i TF bez szczepu A na YPD Po dwóch dniach wzrostu zaszczepij oddzielne probówki hodowlane zawierające pięć mililitrów płynu YPD i hoduj każdy szczep przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Wykonaj dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia 0,25 milimolowego roztworu podstawowego beta estradiolu do 10 000, poskładaj 100% etanol. Dodaj 40 mikrolitrów każdej nocnej kultury do 10 mililitrów płynu YPD. Dla każdego szczepu dodaj 96 mikrolitrów rozcieńczonych komórek do 18 dołków 96-dołkowej płytki.

Następnie dodaj cztery mikrolitry beta estradiolu do komórek. Istotną kwestią jest upewnienie się, że każda studnia ma taką samą ilość etanolu ogółem. Wykonaj potrójne badanie z trzema studzienkami dla każdego szczepu zawierającego wyłącznie etanol.

Elementy sterujące pokrywają płytkę 96-dołkową w membranie przepuszczającej gaz. Monitoruj wzrost przy gęstości optycznej 600 nanometrów w czytniku płytek. Określ ilościowo tempo wzrostu przy użyciu dowolnej liczby metod, takich jak znalezienie maksymalnego nachylenia.

Po przygotowaniu plazmidu zgodnie z instrukcją w protokole tekstowym PCR, należy amplifikować kasetę promotora MX w puszce. Przekształć produkt PCR w szczep wykazujący ekspresję A TF za pomocą płytki metody octanu litu, komórki transformacyjne na YPD i replikę płytki na YPD plus antybiotyk G four 18 następnego dnia. Na koniec należy potwierdzić właściwą insercję promotora za pomocą startera do przodu i startera wstecznego wewnętrznego do genu, którego promotor został zastąpiony.

Końcowy produkt PCR ma około 1,2 KB, pokazano tutaj, indukcję GFP przez trzy różne pary promotorów TF, Z, cztery, EVZ, trzy EV lub GEV w czasie w odpowiedzi na jeden mikromolowy beta estradiol. Należy zwrócić uwagę na wzrost produkcji GFP w odpowiedzi na ATF zawierające domeny wiążące DNA niezwiązane z drożdżami. Może to wynikać z tego, że czynniki te osiągają swoistość pojedynczego genu w genomie drożdży.

Sama indukcja GEV prowadzi do aktywacji lub represji setek genów, podczas gdy Z 3 EV i Z 4 EV aktywują tylko ekspresję genu docelowego umieszczonego za syntetycznym promotorem zawierającym odpowiednie miejsca wiązania. Tutaj pokazano indukcję GFP przez Z trzy EV w odpowiedzi na zero nanomolowych beta estradiolu i jeden mikromolowy beta estradiol po 18 godzinach indukcji Fluorescencję mierzono również z komórek pozbawionych GFP, aby zilustrować ścisłą regulację układu Z 3 EV. Pokazano tutaj zdolność Z 3 EV do indukowania GFP w zakresie stężeń beta estradiolu.

Średnia fluorescencja rozkładów ujawnia, że związek między stężeniem induktora a wyjściem ekspresji jest oceniany za pomocą współczynnika wzgórza wynoszącego około jeden, co wskazuje na niezależne wiązanie Z 3 EV Zgodnie z tą procedurą, można przeprowadzić inne metody, takie jak mikromacierze ekspresji genów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, jak zmiana ekspresji pojedynczego genu wpływa na wzorce ekspresji genów w genomie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak projektować, testować i weryfikować skuteczność sztucznych czynników transkrypcyjnych. Te sztuczne czynniki transkrypcyjne warunkowo kontrolują ekspresję genów umieszczonych poniżej odpowiednich sekwencji docelowych DNA.