Systemowe wstrzykiwanie nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych u myszy z przewlekłym EAE

Ogólnym celem tego protokołu jest dostarczenie nerwowych komórek progenitorowych macierzystych do OUN poprzez wstrzyknięcie dożylne myszom dotkniętym eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia, modelem choroby naśladującym stwardnienie rozsiane. Osiąga się to poprzez pierwsze wyprowadzenie nerwowych komórek progenitorowych lub NPC ze strefy podkomorowej mózgu od dorosłych myszy. Drugim krokiem jest genetyczne znakowanie NPC za pomocą technologii wektorów wirusowych w celu identyfikacji i śledzenia komórek in vivo.

Następnie proliferujące neurosfery są dysocjowane do zawiesiny pojedynczej komórki, ponownie zawieszane w pożądanej gęstości i wstrzykiwane do żyły ogonowej myszy EAE w szczytowym momencie choroby. Ostatecznie przeprowadza się pośmiertną patologię narządów i tkanek oraz immunohistochemię w celu zidentyfikowania i scharakteryzowania przeżycia, rozkładu i integracji wstrzykniętych komórek macierzystych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia minimalnie inwazyjną, bezpieczną i skuteczną metodę przeszczepiania komórek macierzystych i progenitorowych do zapalnego układu nerwowego.

Metoda ta pomaga odpowiedzieć na trzy kluczowe pytania związane z bezpieczeństwem i skutecznością komórek macierzystych wstrzykiwanych ogólnoustrojowo w modelach chorób zapalnych układu nerwowego. Wizualna demonstracja tej metody jest przydatna szczególnie dla młodych naukowców, ponieważ pomaga w zrozumieniu krytycznych etapów eksperymentalnych od izolacji komórek macierzystych mózgu do przygotowania do wstrzyknięcia ogólnoustrojowego w mysim modelu stwardnienia rozsianego. Przy użyciu odpowiedniej sterylnej techniki.

Umieść świeżo wyizolowany mózg na macierzy fragmentatora mózgu. Użyj dwóch żyletek, aby wykonać przekroje koronalne, dwa milimetry od przedniego bieguna mózgu, z wyłączeniem ścieżek wzrokowych i trzy milimetry za poprzednim cięciem. Umieść plastry mózgu na czystej szalce Petriego i pracuj pod mikroskopem preparacyjnym, aby wyizolować tkankę strefy podkomorowej.

Po rozdrobnieniu tkanki dodaj ją do 30 mililitrów wcześniej przygotowanego i przefiltrowanego roztworu trawiącego. Delikatnie wstrząśnij i inkubuj przez 30 minut, wstrząsając co 15 minut. Po odwirowaniu usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach całkowitego wzrostu.

Pożywka lub CGM przez pipetowanie. Najpierw pipetą P 1000, a następnie pipetą P 200. Po osiągnięciu zawiesiny jednokomórkowej należy ją zwiększyć do pięciu mililitrów za pomocą CGM i przenieść do nowej kolby.

Umieść komórki w inkubatorze i pozwól neurosferom uformować się przez pięć do siedmiu dni. Gdy będziesz gotowy, zbierz zawiesinę do 15-mililitrowej probówki i odwiruj. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić podniebienie w 200 mikrolitrach CGM.

Oddziel neurosfery mechanicznie, przepuszczając je przez końcówkę pipety P 200 od 100 do 150 razy. Doprowadź zawieszenie do jednego mililitra za pomocą CGM. Następnie dokładnie rozcieńczyć zawiesinę.

Wymieszaj odpowiednią objętość z życiodajnym barwnikiem i napełnij hemocytometrem, aby określić liczbę komórek. Zawiesić komórki w odpowiednim stężeniu i przenieść do nowej kolby. Powtarzaj te kroki co cztery do pięciu dni, aby pomóc w identyfikacji przeszczepionych komórek in vivo.

NPC są transdukowane wektorami wirusowymi kodującymi geny reporterowe 72 godziny po transdukcji NPC. Ekspresję fluorescencyjnych genów reporterowych można zweryfikować za pomocą immunofluorescencji lub cytometrii przepływowej. Gdy będzie gotowy, zbierz neurosfery wykazujące ekspresję GFP przez odwirowanie i usuń supernatant.

Następnie dodaj 200 mikrolitrów roztworu dysocjacji agregatu komórkowego i inkubuj przez 10 minut. Pobrać komórki i delikatnie zawiesić je ponownie, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Uważaj, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.

Po policzeniu i rozcieńczeniu komórek, zawiesinę komórek należy przechowywać na lodzie do momentu przygotowania jej do użycia. Gdy neurosfery będą gotowe, pobierz myszy, które wcześniej były przygotowane do służenia jako mysi model dla OUN. Leczenie uszkodzeń powinno nastąpić w szczytowym momencie ekspresji choroby.

Zacznij od umieszczenia myszy w pudełku rozgrzewającym na około 10 minut, aby żyła ogonowa mogła się rozszerzyć. Gdy będziesz gotowy, przenieś jedną mysz z pudełka do podgrzewania do urządzenia do ograniczania myszy. Zamknij ogranicznik, aby ograniczyć ruch i odizolować ogon.

Wysterylizuj obszar wstrzyknięcia na ogonie odpowiednim roztworem do stosowania miejscowego. Napełnij jednomililitrową strzykawkę insulinową 150 mikrolitrami zawiesiny komórkowej i upewnij się, że usunąłeś wszystkie pęcherzyki. Zlokalizuj żyłę na grzbietowej powierzchni ogona i umieść igłę równolegle do żyły w środkowej dolnej części ogona.

Tutaj żyła jest bliżej powierzchni skóry. Ułatwiając w ten sposób procedurę. Delikatnie wprowadzić igłę do żyły, upewniając się o jej prawidłowym położeniu, pobierając kilka mikrolitrów krwi.

Następnie powoli wstrzyknąć roztwór do żyły ogonowej Po wstrzyknięciu należy wyjąć igłę i uciskać przez kilka sekund, aby spowolnić krwawienie. Umieść mysz w nowej klatce i monitoruj, aż wyzdrowieje. Powtórz tę samą procedurę dla wszystkich myszy w określonych punktach czasowych eksperymentu.

Próbki są pobierane od zwierząt poddanych działaniu substancji i kontrolnych i analizowane w celu określenia infiltracji i integracji NPC z OUN i innymi tkankami podczas proliferacji jako neurosfery, NPC wyrażają markery aktywności mitotycznej, takie jak fosfo hison H, trzy, pokazany na zielono i niezróżnicowanych komórek nerwowych, takich jak gniazdo pokazane na czerwono, gdy są posiewane w odpowiednich warunkach różnicowania, NPC wyrażają markery typowe dla trzech linii nerwowych, takich jak marker astrogleju, GFAP, marker neuronalny, białko związane z mikrokanalikami dwa i oligo dyl glial markery O four i jądra podstawowego białka mielinowego są barwione przeciwstawnie niezróżnicowanymi MPC dpi, które mają być skuteczne terapeutycznie po przeszczepie, muszą wyrażać cząsteczki adhezyjne powierzchni komórki, które obejmują CD 44 i podjednostkę alfa cztery bardzo późnego antygenu cztery. Przykłady te pokazują, że transdukowane NPC wyrażają GFP, zarówno jako proliferujące neurosfery, jak i podczas różnicowania in vitro po odstawieniu czynnika wzrostu. Syngeniczne NPC wstrzykiwane ogólnoustrojowo myszom EAE znajdują się prawie wyłącznie w okołonaczyniowych obszarach uszkodzenia OUN, na które wskazują strzałki, zarówno w mózgu, jak i rdzeniu kręgowym, do 45 dni po przeszczepie.

Kluczowym etapem tej procedury jest dysocjacja komórek. W rzeczywistości przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki ma zasadnicze znaczenie dla uniknięcia zacisków lub agregatów, które mogą prowadzić do niedrożności naczyń po jego rozwojeniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny medycyny regeneracyjnej, którzy badali minimalnie inwazyjne protokoły skutecznego dostarczania nieokresowych komórek macierzystych do mózgu małych zwierząt laboratoryjnych, a w bliskiej perspektywie ludzi dotkniętych zapalnymi chorobami neurologicznymi.

Miejmy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu będziesz miał jasne zrozumienie rozwiązywania problemów związanych z izolacją, przygotowaniem i ogólnoustrojowym wstrzykiwaniem postaw specyficznych dla tkanek u zwierząt laboratoryjnych z chorobami mózgu.