Name: Systemowe wstrzykiwanie nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych u myszy z przewlekłym EAE (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-15T18:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Poznaj metodę wstrzykiwania nerwowych komórek macierzystych do OUN u myszy z EAE, modelu stwardnienia rozsianego. Technika ta umożliwia minimalnie inwazyjną transplantację i śledzenie komórek w układzie nerwowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Jaydenowi Smithowi za krytyczne recenzowanie i korektę redakcyjną manuskryptu. Prace te otrzymały wsparcie od Krajowego Towarzystwa Stwardnienia Rozsianego (NMSS, częściowe granty RG-4001-A1), Włoskiego Stowarzyszenia Stwardnienia Rozsianego (AISM, grant 2010/R/31), włoskiego Ministerstwa Zdrowia (GR08-7), Wings for Life, Banca Agricola Popolare di Ragusa (BAPR), Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERBN) w ramach umowy o grant ERC-2010-StG nr 260511-SEM_SEM oraz 7. programu ramowego Wspólnoty Europejskiej (EC) (FP7/2007-2013) na podstawie umowy o grant n*deg; 280772- iONE.

<ol><li>Ben-Hur, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+multipotential+neural+precursor+cells+migrate+into+the+inflamed+white+matter+in+response+to+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Transplanted multipotential neural precursor cells migrate into the inflamed white matter in response to experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Glia. 41, 73-80 (2003).</li>
<li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+adult+neurospheres+induces+recovery+in+a+chronic+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis.</a> Nature. 422, 688-694 (2003).</li>
<li>Chu, K., Kim, M., Jeong, S. W., Kim, S. U., Yoon, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+stem+cells+can+migrate%2C+differentiate%2C+and+integrate+after+intravenous+transplantation+in+adult+rats+with+transient+forebrain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Human neural stem cells can migrate, differentiate, and integrate after intravenous transplantation in adult rats with transient forebrain ischemia.</a> Neurosci. Lett. 343, 129-133 (2003).</li>
<li>Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability-dependent+promoting+action+of+adult+neural+precursors+in+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury.</a> Mol. Med. 14, 634-644 (2008).</li>
<li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosphere-derived+multipotent+precursors+promote+neuroprotection+by+an+immunomodulatory+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurosphere-derived multipotent precursors promote neuroprotection by an immunomodulatory mechanism.</a> Nature. 436, 266-271 (2005).</li>
<li>Einstein, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraventricular+transplantation+of+neural+precursor+cell+spheres+attenuates+acute+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intraventricular transplantation of neural precursor cell spheres attenuates acute experimental allergic encephalomyelitis.</a> Mol. Cell Neurosci. 24, 1074-1082 (2003).</li>
<li>Chu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+stem+cell+transplantation+reduces+spontaneous+recurrent+seizures+following+pilocarpine-induced+status+epilepticus+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Human neural stem cell transplantation reduces spontaneous recurrent seizures following pilocarpine-induced status epilepticus in adult rats.</a> Brain Res. 1023, 213-221 (2004).</li>
<li>Jeong, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+stem+cell+transplantation+promotes+functional+recovery+in+rats+with+experimental+intracerebral+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Human neural stem cell transplantation promotes functional recovery in rats with experimental intracerebral hemorrhage.</a> Stroke. 34, 2258-2263 (2003).</li>
<li>Aboody, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+display+extensive+tropism+for+pathology+in+adult+brain%3A+evidence+from+intracranial+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain: evidence from intracranial gliomas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12846-12851 (2000).</li>
<li>Muller, F. J., Snyder, E. Y., Loring, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy%3A+can+neural+stem+cells+deliver%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gene therapy: can neural stem cells deliver.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 75-84 (2006).</li>
<li>Martino, G., Pluchino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of neural stem cells.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 395-406 (2006).</li>
<li>Deckert-Schluter, M., Schluter, D., Hof, H., Wiestler, O. D., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+ICAM-1%2C+VCAM-1+and+their+ligands+LFA-1%2C+Mac-1%2C+CD43%2C+VLA-4%2C+and+MHC+class+II+antigens+in+murine+Toxoplasma+encephalitis%3A+a+light+microscopic+and+ultrastructural+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of ICAM-1, VCAM-1 and their ligands LFA-1, Mac-1, CD43, VLA-4, and MHC class II antigens in murine Toxoplasma encephalitis: a light microscopic and ultrastructural immunohistochemical study.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 457-468 (1994).</li>
<li>Hemmer, B., Archelos, J. J., Hartung, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+in+the+immunopathogenesis+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">New concepts in the immunopathogenesis of multiple sclerosis.</a> Nat. Rev. Neurosci. 3, 291-301 (2002).</li>
<li>Butcher, E. C., Picker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+homing+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte homing and homeostasis.</a> Science. 272, 60-66 (1996).</li>
<li>Rampon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+systemic+delivery+of+neural+precursor+cells+to+the+brain%3A+assembly+of+brain+endothelial+apical+cups+and+control+of+transmigration+by+CD44%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of systemic delivery of neural precursor cells to the brain: assembly of brain endothelial apical cups and control of transmigration by CD44.</a> Stem Cells. 26, 1673-1682 (2008).</li>
<li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+stem+cells+ameliorate+autoimmune+encephalomyelitis+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Human neural stem cells ameliorate autoimmune encephalomyelitis in non-human primates.</a> Ann. Neurol. 66, 343-354 (2009).</li>
<li>Martino, G., Pluchino, S., Bonfanti, L., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+regeneration+in+physiology+and+pathology%3A+the+immune+signature+driving+therapeutic+plasticity+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Brain regeneration in physiology and pathology: the immune signature driving therapeutic plasticity of neural stem cells.</a> Physiol. Rev. 91, 1281-1304 (2011).</li>
<li>Aharonowiz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effect+of+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursors+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursors in an animal model of multiple sclerosis.</a> PLoS ONE. 3, e3145(2008).</li>
<li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+regulatory+neural+stem%2Fprecursor+cells+protect+from+central+nervous+system+autoimmunity+by+restraining+dendritic+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Immune regulatory neural stem/precursor cells protect from central nervous system autoimmunity by restraining dendritic cell function.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Einstein, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+precursors+attenuate+autoimmune+encephalomyelitis+by+peripheral+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neural precursors attenuate autoimmune encephalomyelitis by peripheral immunosuppression.</a> Ann. Neurol. 61, 209-218 (2007).</li>
<li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotential+stem+cells+from+the+adult+mouse+brain+proliferate+and+self-renew+in+response+to+basic+fibroblast+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor.</a> J. Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).</li>
<li>Furlan, R., Pluchino, S., Marconi, P. C., Martino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+gene+delivery+into+the+central+nervous+system+using+intrathecally+injected+nonreplicative+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine gene delivery into the central nervous system using intrathecally injected nonreplicative viral vectors.</a> Methods Mol. Biol. 215, 279-289 (2003).</li>
<li>Constantin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+analysis+of+adhesive+events+in+brain+microvessels+by+using+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization and analysis of adhesive events in brain microvessels by using intravital microscopy.</a> Methods Mol. Biol. 239, 189-198 (2004).</li>
<li>Politi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic-resonance-based+tracking+and+quantification+of+intravenously+injected+neural+stem+cell+accumulation+in+the+brains+of+mice+with+experimental+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Magnetic-resonance-based tracking and quantification of intravenously injected neural stem cell accumulation in the brains of mice with experimental multiple sclerosis.</a> Stem Cells. 25, 2583-2592 (2007).</li>
<li>Melzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-graft+of+allogeneic+immune+regulatory+neural+stem+cells+%28NPC%29+and+pancreatic+islets+mediates+tolerance%2C+while+inducing+NPC-derived+tumors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Co-graft of allogeneic immune regulatory neural stem cells (NPC) and pancreatic islets mediates tolerance, while inducing NPC-derived tumors in mice.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Amariglio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-derived+brain+tumor+following+neural+stem+cell+transplantation+in+an+ataxia+telangiectasia+patient%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient.</a> PLoS Med. 6, (2009).</li>
<li>Ben-Hur, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+proinflammatory+cytokines+on+the+growth%2C+fate%2C+and+motility+of+multipotential+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Effects of proinflammatory cytokines on the growth, fate, and motility of multipotential neural precursor cells.</a> Mol. Cell Neurosci. 24, 623-631 (2003).</li>
<li>Giusto, E., Donega, M., Cossetti, C., Pluchino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuro-immune+interactions+of+neural+stem+cell+transplants%3A+From+animal+disease+models+to+human+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuro-immune interactions of neural stem cell transplants: From animal disease models to human trials.</a> Exp. Neurol. , (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Terapie oparte na somatycznych komórkach macierzystych stają się jedną z najbardziej obiecujących strategii leczenia przewlekłych chorób zapalnych OUN, takich jak MS211. Podczas gdy mechanizmy podtrzymujące ich efekty terapeutyczne nadal wymagają pełnego wyjaśnienia, znaczący wpływ przeszczepiania NPC na różne eksperymentalne modele chorób neurodegeneracyjnych zrodził nieco prowokacyjne przekonanie, że komórki macierzyste mogą wkrótce znaleźć zastosowanie w badaniach na ludziach. Zanim jednak zaczniemy rozważa...

Z badań in vivo powstały mocne dowody potwierdzające skuteczność terapeutyczną przeszczepu somatycznych nerwowych komórek macierzystych/prekursorowych (NPC) w modelach zwierzęcych zaburzeń OUN1-8. Niemniej jednak szereg kwestii związanych z dostarczaniem komórek macierzystych do gospodarza wymaga starannego rozważenia, zanim wyniki tych eksperymentów będzie można przełożyć na zastosowania kliniczne. Szczególnie istotną przeszkodą na drodze do rozwoju (niehematopoetycznych) terapii regenerującymi komórkami macierzystymi w wieloogniskowych, przewlekłych chorobach zapalnych mózgu jest określenie idealnej drogi iniekcji NPC. Dokładne zrozumienie patofizjologii choroby docelowej (ogniskowej lub wieloogniskowej; pierwotna choroba zapalna lub pierwotna choroba zwyrodnieniowa) oraz ostrożna analiza wykonalności i kwestii ryzyka związanych z technikami dostarczania są w identyfikacji optymalnego protokołu dostarczania komórek macierzystych.
Podczas gdy ogniskowy (np. do miąższu układu nerwowego) przeszczep komórek macierzystych jest logicznym podejściem do leczenia chorób OUN charakteryzujących się przestrzennie ograniczonymi obszarami uszkodzeń (np. choroba Parkinsona i Huntingtona, urazy mózgu i rdzenia kręgowego oraz udar), to samo podejście może okazać się praktycznie niewykonalne w stanach takich jak stwardnienie rozsiane, gdzie wieloogniskowe, przewlekłe i przestrzennie rozproszone uszkodzenie OUN kumuluje się z czasem. W tym ostatnim przypadku ukierunkowanie iniekcji komórek ogniskowych na poszczególne zmiany chorobowe jest również utrudnione ze względu na ograniczoną zdolność przeszczepionych NPC do migracji na duże odległości w obrębie miąższu OUN, co skłania do identyfikacji alternatywnych, bardziej odpowiednich metod celowania w OUN z mniej inwazyjnymi przeszczepami NPC.
Wielka obietnica wynikała z obserwacji, że NPC celują w nowotwór wewnątrzczaszkowy (np. glejak) u myszy, gdy wstrzykuje się go donaczyniowo poza OUN9. W związku z tymi przełomowymi dowodami in vivo na patotrofizm komórek macierzystych10 zgromadzono obszerne dane dotyczące wykonalności i skuteczności terapeutycznej ogólnoustrojowego przeszczepiania NPC u zwierząt laboratoryjnych z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), jako modelu zapalnego uszkodzenia OUN, za pomocą dożylnego (iv) lub domózgowo-komorowego (i.c.v.) Wstrzyknięcie NPC1,2,5,6,8.. Po raz pierwszy wykazaliśmy, że zależy to od zdolności przeszczepionych NPC do celowania i wnikania do zapalnego OUN, a następnie do angażowania wielu programów komunikacji międzykomórkowej w określonych mikrośrodowiskach in vivo11. W celu specyficznego celowania w OUN, NPC są dostarczane bezpośrednio do krążenia płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) przez wstrzyknięcie dożylne lub do krwiobiegu przez wstrzyknięcie dożylne. Po dostaniu się do krwiobiegu lub płynu mózgowo-rdzeniowego przeszczepione NPC aktywnie oddziałują z barierami krew-mózg (BBB) lub płyn mózgowo-rdzeniowy krwi (BCSFB) i dostają się do miąższu OUN. Ta interakcja między przeszczepem NPC a BBB (lub BCSFB) jest regulowana przez specyficzny zestaw cząsteczek adhezyjnych komórek powierzchniowych NPC (CAM) i ułatwiana przez ekspresję wysokich poziomów przeciwligandów CAM na aktywowanych komórkach śródbłonka / wyściółki12-14. Przykładami tych CAM są receptor hialuronianu, CD44, oraz międzykomórkowa cząsteczka adhezyjna (ICAM)-1 ligand bardzo późny antygen (VLA)-45,15,16 (które w leukocytach są odpowiedzialne za interakcję z aktywowanymi komórkami wyściółki i śródbłonka), a w znacznie mniejszym stopniu antygen związany z funkcją limfocytów (LFA)-1 i ligand glikoproteiny selektyny P (PSGL)-1. NPC wyrażają również szeroki zakres receptorów chemokin, w tym CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3 i CXCR4 (ale nie wyrażają CCR3 i CCR7), które są funkcjonalnie aktywne, zarówno in vitro, jak i in vivo5,16. W związku z tym NPC, którym wstrzykuje się ogólnoustrojowo, wykorzystują te CAM, wraz z receptorem sprzężonym z białkiem G (GPCR), do akumulacji na poziomie zapalnego OUN. I odwrotnie, NPC wstrzykiwane ogólnoustrojowo zdrowym myszom nie dostają się do OUN przez drogi przestrzeni naczyniowej lub płynu mózgowo-rdzeniowego2. Zapalenie OUN lub aktywacja komórek śródbłonka/wyściółki po wstrzyknięciu cytokin ogólnoustrojowych lub lipopolisacharydów (LPS) jako model chemicznie wywołanego zapalenia mózgu jest zatem konieczne do akumulacji ogólnoustrojowo wstrzykiwanych NPC do mózgu i rdzenia kręgowego2. Tak więc skuteczne celowanie w OUN za pomocą ogólnoustrojowych terapii NPC zależy od identyfikacji specyficznego dla choroby okna Opportunity (WoO), w którym środowisko mózgu i rdzenia kręgowego sprzyja akumulacji i transśródbłonkowej migracji NPC. Takie stany występują na ogół w kontekście ostrego i podostrego zapalenia17. Wykazano, że po wejściu do OUN przeszczepione niezróżnicowane NPC poprawiają kliniczno-patologiczne cechy myszy oraz większych, niebędących ludźmi naczelnych z EAE. Opisano to jako zależne od minimalnej wymiany komórek2 i niezwykłego wydzielania immunologicznych regulacyjnych i neuroprotekcyjnych czynników parakrynnych w okołonaczyniowym OUN2,5,6,18 w porównaniu z obszarami nieobjętymi stanem zapalnymOUN 19,20 (np. węzły chłonne) w odpowiedzi na sygnalizację komórek zapalnych wywołaną przez naciekające komórki odpornościowe5.
Tutaj opisujemy kluczowe aspekty metodologiczne systemowego wstrzykiwania somatycznych NPC do mysiego modelu przewlekłego EAE. Dokładniej mówiąc, definiujemy protokoły, które ustanowiliśmy, aby (i) uzyskać, rozszerzyć i przygotować do przeszczepu somatyczne NPC ze strefy podkomorowej (SVZ) dorosłych myszy C57BL / 6; (ii) indukować przewlekłe EAE u takich myszy i (iii) przeprowadzać terapeutycznie skuteczne ogólnoustrojowe (i.v. lub i.c.v) przeszczepienie NPC myszom EAE.

<table><tbody><tr><td>Cell culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Sigma</td><td>E2888</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>30H11965</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>D/0700/50</td><td></td></tr><tr><td>Mysz NeuroCult bazalne podłoże</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>05700</td><td></td></tr><tr><td>Suplementy proliferacyjne NeuroCult</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05701</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów</td><td>Peprotech</td><td>100-18B-1000</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15-1000</td><td></td></tr><tr><td>Długopis/Paciorkowiec</td><td>Invitrogen</td><td>1514012</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (roztwór powlekający)</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>NeuroCult&reg; Zestaw różnicujący (mysz)</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>05704</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>eBioscience</td><td>00-4666-56</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) bez Ca i Mg</td><td>PAA Laboratories</td><td>H15-011</td><td></td></tr><tr><td>Myco trace</td><td>PAA Laboratories</td><td>Q052-020</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td> Immunofluorescencja< / silna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>normalna surowica kozia</td><td>PAA Laboratories</td><td>B11-035</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy p-(1,1,3,3-tetrametylobutylo)-eter fenylowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty Nestin</td><td>Abcam</td><td>ab11306</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty GFAP</td><td>DAKO</td><td>203344</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty histon H3 (fosfo S10)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab14955</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty MAP-2</td><td>Abcam</td><td>ab32454</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty MBP</td><td>AbD SEROTEC</td><td>MCA409S</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-O4, klon 81 | MAB345</td><td>Millipore</td><td>MAB345</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie montażowe</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>EAE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freund's Adjuwant Incomplete</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F5506</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis</td><td>DIFCO</td><td>H37Ra</td><td></td></tr><tr><td>MOG(35&ndash; 55)&nbsp;</td><td>Espikem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lista toksyn krztuśca</td><td>Laboratoria biologiczne</td><td>181</td><td></td></tr><tr><td>Przetwarzanie tkanek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iris nożyczki proste</td><td>Narzędzia do nauk pięknych</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze/zgięte</td><td>Narzędzia do nauk pięknych</td><td>11080-02</td><td></td></tr><tr><td>Krajalnica do mózgu</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS005-1</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza chirurgiczne</td><td>Pipety</td><td></td> Swann-Morton 324 <td></td></tr><tr><td>P200, P1000</td> Ketamina (Vetalar)Boehringer Ingelheim 01LC0030 Ksylazyna (Rompun)Bayer 32371 Ramka stereotaktyczna KOPF Model 900 Strzykawka Hamilton <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>7762-04</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr></tbody></table>

systemowe wstrzykiwanie nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych u myszy z przewlekłym eae

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Neuronalne komórki macierzyste/prekursorowe (NPC) są obiecującym źródłem komórek macierzystych dla metod transplantacji mających na celu naprawę lub odbudowę mózgu w neurologii regeneracyjnej. Dyrektywa ta powstała w oparciu o obszerne dowody na to, że naprawa mózgu jest osiągana po ogniskowym lub ogólnoustrojowym przeszczepie NPC w kilku przedklinicznych modelach chorób neurologicznych.
Te dane eksperymentalne zidentyfikowały drogę dostarczania komórek jako jedną z głównych przeszkód w terapii regeneracyjnymi komórkami macierzystymi w chorobach mózgu, która wymaga pilnej oceny. Przeszczep intraparenchymalnych komórek macierzystych stanowi logiczne podejście do tych patologii, które charakteryzują się izolowanymi i dostępnymi zmianami w mózgu, takimi jak urazy rdzenia kręgowego i choroba Parkinsona. Niestety, zasada ta nie ma zastosowania w przypadku schorzeń charakteryzujących się wieloogniskowym, zapalnym i rozsianym (zarówno w czasie, jak i przestrzeni), w tym stwardnienia rozsianego (SM). W związku z tym celowanie w mózg poprzez ogólnoustrojowe dostarczanie NPC stało się mało inwazyjnym i skutecznym terapeutycznie protokołem dostarczania komórek do mózgu i rdzenia kręgowego gryzoni i naczelnych innych niż ludzie dotkniętych eksperymentalnym przewlekłym uszkodzeniem zapalnym ośrodkowego układu nerwowego (OUN).
Ta alternatywna metoda dostarczania komórek opiera się na patotropizmie NPC, a konkretnie na ich wrodzonej zdolności do (i) wyczuwania otoczenia za pomocą funkcjonalnych cząsteczek adhezyjnych komórek oraz zapalnych receptorów cytokin i chemokin; (ii) przekroczyć nieszczelne bariery anatomiczne po wstrzyknięciu dożylnym (i.v.) lub domózgowym (i.c.v.); (iii) kumulują się na poziomie wielu miejsc okołonaczyniowych zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego; oraz (iv) wywierają niezwykłe efekty troficzne i regulacyjne immunologiczne na różne komórki docelowe gospodarza in vivo.
Tutaj opisujemy metody, które opracowaliśmy dla dostarczania dożylnie i i.c.v. syngenicznych NPC u myszy z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia (EAE), jako model przewlekłej demielinizacji zapalnej OUN, i przewidujemy systemiczne dostarczanie komórek macierzystych jako cenną technikę selektywnego kierowania na mózg w stanie zapalnym w neurologii regeneracyjnej.

Izolacja i charakterystyka NPC 
Disekcję SVZ przeprowadza się na grupach (n= 5-7 myszy/grupa) myszy C57Bl/6 w wieku 6-8 tygodni poprzez dysocjację mechaniczną i enzymatyczną (Rysunek 1A). Po kilku dniach hodowli w CGM zaczynają tworzyć się swobodnie pływające neurosfery (Rysunki 1A i 1B). Pierwotne sfery są zbierane i poddawane pasażowaniu mechanicznemu co 4-5 DIV. Podczas pasażowania określa się liczbę żywych i martwych komórek, a skumulowaną liczbę komórek nanosi si...

Przeszczep komórek macierzystych/progenitorowych (NPC) jest bardzo obiecujący w neurologii regeneracyjnej. Systemowe dostarczanie NPC przekształciło się w skuteczny, mało inwazyjny i bardzo skuteczny terapeutycznie protokół dostarczania komórek macierzystych do mózgu i rdzenia kręgowego gryzoni i naczelnych dotkniętych eksperymentalnym przewlekłym uszkodzeniem zapalnym ośrodkowego układu nerwowego.

Systemowe wstrzykiwanie nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych u myszy z przewlekłym EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest dostarczenie neuralnych komórek macierzystych i progenitorowych do OUN poprzez wstrzyknięcie dożylne u myszy z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia, modelu choroby naśladującego stwardnienie rozsiane. Jest to realizowane poprzez uprzednie pozyskanie neuralnych komórek macierzystych i progenitorowych (NPC) z strefy podkomorowej mózgu dorosłych myszy. Drugim krokiem jest genetyczne znakowanie NPC za pomocą technologii wektorów wirusowych w celu identyfikacji i śledzenia komórek in vivo.Następnie proliferujące neurosfery rozdrabnia się do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, resuspenduje do pożądanej gęstości i wstrzykuje do ogonowej żyły myszy z EAE w szczycie przebiegu choroby. Ostatecznie przeprowadza się pośmiertną analizę patologiczną organów i tkanek oraz immunohistochemię, aby zidentyfikować i scharakteryzować rozkład przeżywalności oraz integrację wstrzykniętych komórek macierzystych. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona małoinwazyjną, bezpieczną i skuteczną metodę transplantacji komórek macierzystych i progenitorowych do zapalonego układu nerwowego.Niniejsza metoda pozwala odpowiedzieć na trz

systemic-injection-neural-stemprogenitor-cells-mice-with-chronic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wstrzyknięcie ogólnoustrojowe komórek macierzystych/przodkowych neuronów u myszy z przewlekłym EAE

Niektóre szczepy myszy są odporne na indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mielnowodnego (EAE) za pomocą podstawowego białka mieliny. Opisano tutaj prosty protokół immunizacji, który przełamuje tę brak reakcji i indukuje chorobę porażenną u kilku typowych szczepów myszy odpornych na EAE.

Przełamanie braku reakcji u szczepów myszy odpornych na eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) poprzez transfer adopcyjny i stymulację antygenową

Ten film demonstruje metodę wywoływania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) poprzez wstrzykiwanie peptydów pochodzących z mieliny z adiuwantem w celu aktywacji autoreaktywnych limfocytów T, które migrują do mózgu. Toksyna krztuścowa jest podawana w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając tym limfocytom T i innym komórkom odpornościowym przedostanie się do mózgu. Te komórki odpornościowe powodują demielinizację, co prowadzi do...

Generowanie eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

W tym filmie mysi model stwardnienia rozsianego jest tworzony za pomocą eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). Myszowi wstrzykuje się emulsję zawierającą peptyd neuronalny i adiuwant, wywołując odpowiedź immunologiczną, która aktywuje autoreaktywne limfocyty T. Następnie podaje się wstrzyknięcie toksyny krztuścowej (PTX) w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając autoreaktywnym limfocytom T infiltrację mózgu. Ten naciek inicjuje kaskadę...

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

Opisujemy metodę wszczepiania i utrzymywania szklanych okien nad odsłoniętymi rdzeniami kręgowymi dorosłych myszy do badania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia. Okna te zapewniają przewlekły dostęp optyczny do rdzenia kręgowego w celu monitorowania dynamiki komórek na poziomie subkomórkowym u żywych zwierząt za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Wszczepianie szklanych okien rdzenia kręgowego dorosłym myszom z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) jest uznanym zwierzęcym modelem stwardnienia rozsianego. Myszy C57BL/6 są immunizowane peptydem 35-55 (MOG) glikoproteiny oligodendrocytów mieliny (MOG) (MOG35-55), co powoduje narastający porażenie wiotkie spowodowane przez autoreaktywne komórki odpornościowe w ośrodkowym układzie nerwowym. Omówione zostaną protokoły indukcji i monitorowania choroby.

Glikoproteina oligodendrocytów mielinowych (MOG35-55) indukowana eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) u myszy C57BL / 6

Ten manuskrypt opisuje metody indukcji i oceny eksperymentalnego modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), wraz z oceną rozmieszczenia komórek odpornościowych i poziomów cytokin mRNA w węzłach chłonnych, śledzionie, krwi i rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej i ilościowego PCR, odpowiednio, w różnych fazach choroby.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego u myszy i ocena zależnej od choroby dystrybucji komórek odpornościowych w różnych tkankach

Pokazujemy technikę obrazowania in vivo na żywo bioluminescencji i bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w eksperymentalnym modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) dla stwardnienia rozsianego u myszy SJL/J.

Bioluminescencja i obrazowanie w bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w modelu EAE stwardnienia rozsianego u myszy

Tutaj prezentujemy protokoły do badania upośledzenia jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia in vivo. W szczególności zajmujemy się tym, jak określić przepuszczalność bariery krew-mózg i aktywność żelatynazy zaangażowaną w migrację leukocytów przez limity gleju.

Wizualizacja upośledzenia barier śródbłonkowych i glejowych jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia mięśniowego in vivo

Niniejszy protokół opisuje indukcję eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia w modelu mysim przy użyciu glikoproteiny oligodendrocytów mieliny i monitorowanie procesu chorobowego za pomocą systemu punktacji klinicznej. Eksperymentalne objawy związane z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego są analizowane za pomocą analizy mikrotomografii komputerowej kości udowej myszy i testu terenowego w celu kompleksowej oceny procesu chorobowego.

Indukcja i zróżnicowane wskaźniki oceny eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Do tej pory, protokoły jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od tej samej myszy są niezaspokojonym wymaganiem. Protokół przedstawia procedurę mającą zastosowanie u myszy z nieleczonym i eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia w celu zbadania złożonych sieci komórkowych podczas zapalenia nerwów i jednoczesnego zmniejszenia wymaganej liczby myszy.

Jednoczesna izolacja głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od dorosłych myszy z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) służy jako zwierzęcy model stwardnienia rozsianego. W tym artykule opisano podejście do oceny zapalenia rdzenia kręgowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w EAE. Dodatkowo przedstawiono metodę ilościowego określania poziomu rozpuszczalnego światła neurofilamentów w surowicy myszy, ułatwiającą ocenę uszkodzenia aksonów u żywych myszy.

Ocena zapalenia ośrodkowego układu nerwowego, demielinizacji i uszkodzenia aksonów w eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia

Poznaj metodę wstrzykiwania nerwowych komórek macierzystych do OUN u myszy z EAE, modelu stwardnienia rozsianego. Technika ta umożliwia minimalnie inwazyjną transplantację i śledzenie komórek w układzie nerwowym.

Systemowe wstrzykiwanie nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych u myszy z przewlekłym EAE

Przeglądaj więcej filmów