Zmodyfikowana metoda wytrącania w celu wyizolowania egzosomów moczu

Ogólnym celem tej procedury jest zaprojektowanie zmodyfikowanej metody wytrącania egzosomów, która oferuje szybką, skalowalną i skuteczną alternatywę dla izolacji egzosomów z moczu. Osiąga się to poprzez usunięcie dużych martwych komórek i resztek komórkowych z próbki moczu przez odwirowanie, a następnie naczynie zawierające egzosomy moczu jest przenoszone do świeżej probówki. W drugim etapie osad rozpuszcza się w roztworze izolacyjnym zawierającym naziemną rejestrację cyfrową w celu usunięcia białka TAM końskiego upadku.

Następnie, po dalszym odwirowaniu, supernatant wolny od TP inkubuje się z odczynnikiem egzoszybkim TC przez noc, aby następnego dnia wytrącić egzosomy. Próbki poddane działaniu odczynnika Exo Quick TC są odwirowywane po raz ostatni w celu uzyskania osadu egzosomu. Ostatecznie na egzosomach można przeprowadzić dalsze procesy, takie jak Western blot i QPCR w czasie rzeczywistym, w celu zidentyfikowania interesujących biomarkerów.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ultra centryfikacja, filtracja i wytrącanie, jest to, że metoda ramienia nie wymaga żadnych kroków certyfikacji ultra, jest łatwa do wykonania stosunkowo szybka, a jednocześnie zapewnia wysoką, stosunkowo czystą wydajność egzosomu do późniejszej analizy molekularnej przed pobraniem moczu. Przy 3,125 mililitra świeżo przygotowanego koktajlu inhibitorów proteazy do pustego sterylnego pojemnika, a następnie zebrać około 10 mililitrów pierwszego pustego moczu w pojemniku. Przenieś próbkę do 15-mililitrowych stożkowych probówek.

Należy pamiętać, że pobraną w ciągu 24 godzin próbkę moczu można również wykorzystać do izolacji egzosomu poprzez przechowywanie w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Obracaj probówki przez 10 minut w temperaturze 17 000 GS i 37 stopniach Celsjusza, aby usunąć lub oddzielić resztki komórkowe od egzosomów moczu. Następnie, uważając, aby nie naruszyć osadu, przenieś supernatant do świeżej probówki i ponownie zawieś osad w 500 mikrolitrach roztworu izolacyjnego.

Inkubować osad z naziemną telewizją cyfrową w końcowym stężeniu 200 miligramów na mililitr w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Wirowanie próbki co dwie minuty. Następnie, gdy osad całkowicie się rozpuści, dodaj 500 mikrolitrów roztworu izolacyjnego do próbki i natychmiast odwiruj powstałą zawiesinę.

Połączyć supernatant z poprzednio zebranym supernatantem i ponownie zawiesić nowy osad w 50 mikrolitrach roztworu izolacyjnego. W celu analizy strony SDS w celu wyizolowania egzosomów, najpierw inkubuj 11 mililitrów połączonego supernatantu z 3,3 mililitra odczynnika exo quick TC w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 12 godzin. Po inkubacji odwirować próbkę, a następnie przenieść supernatant do świeżej probówki w celu analizy strony SDS, a osad zawierający egzosomy moczu jest używany do ekstrakcji D-N-A-R-N-A lub białka lub przechowywany w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Użyj spektrofotometru NanoDrop, aby określić stężenia DNA i RNA w każdej ekstrakcji, mierząc chłonność przy 260 i 280 nanometrach z dwoma mikrolitrami próbki. Zmodyfikowaną reprodukcję analizy strony SDS i detekcji biomarkerów za pomocą zachodniej analizy krwi pokazano na torach z nieprzetworzonym moczem i zaobserwowano pierwsze zakazy białka w moczu odpowiadające 90 do 100 kilodaltonów, co wskazuje na obecność i usunięcie białka upadku konia TAM odpowiednio w końcowych pasmach supernatantu i egzosomu. Nie zaobserwowano pasma białkowego TAM upadku konia, co wskazuje na usunięcie białka TAM upadku konia we wcześniejszych etapach i skutkuje zwiększoną wydajnością osadów egzosomów.

W tym eksperymencie biomarkery Alex i TSG 1 0 1 wykryto nawet wtedy, gdy użyto małych ilości próbki, co wskazuje na bardzo czystą osadę egzosomu do analizy biomarkerów i brak obfitych rozpuszczalnych białek, w tym białka upadku konia TAM po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się przewlekłą chorobą nerek do wykorzystania egzosomów izolowanych z moczu do wczesnego wykrywania i diagnozowania nefropatii cukrzycowej.