Name: Zmodyfikowana metoda wytrącania w celu wyizolowania egzosomów moczu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną metodę wytrącania egzosomów z moczu, która oferuje szybkie, skalowalne i skuteczne izolowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Ta technika umożliwia analizę biomarkerów metodami Western blot i qPCR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Fundacji Rodziny Roney za wsparcie tego badania. Doceniamy wkład dr M. Lucrecii Alvarez w planowanie i realizację eksperymentów opisanych w tej pracy.

UWAGA: Etapy związane z izolacją egzosomów moczu przy użyciu zmodyfikowanej metody wytrącania są zilustrowane na rysunku 1. Początkowe etapy polegają na usunięciu dużych martwych komórek i resztek komórkowych poprzez odwirowanie. Końcowy osad uzyskany z supernatantu pobranego z każdego kolejnego etapu odpowiada egzosomowi, który rozpuszcza się w roztworze izolacyjnym w celu dalszej ekstrakcji białka, RNA i DNA.
1. Zbieranie moczu
<ol>
	<li>Przed pobraniem moczu należy przygotować koktajl inhibitorów proteazy zgodnie z zaleceniami producenta i dodać 3,125 ml tego koktajlu do pustego sterylnego pojemnika. Probówka zawierająca koktajl inhibitorów proteazy może być następnie rozdana ochotnikom w celu pobrania moczu. 
	UWAGA: Powodem dodania inhibitora proteazy jest zminimalizowanie degradacji białka w próbce moczu. Chociaż specjalnie użyliśmy koktajlu inhibitorów proteazy firmy Sigma, inne dostępne na rynku inhibitory proteazy można zastąpić.</li>
	<li>Zebrać około 10 ml moczu z pierwszej mikcji. Przetwarzaj mocz natychmiast po pobraniu bez przechowywania lub chłodzenia. Wyizolować egzosomy moczu w dwóch egzemplarzach przy użyciu zmodyfikowanej metody wytrącania; jeden z duplikatów służy do ekstrakcji DNA, całkowitego RNA i białek, podczas gdy drugi służy do ilościowego oznaczania cząstek egzosomów w moczu. 
	UWAGA: Próbkę moczu można pobrać w ciągu 24 godzin w celu izolacji egzosomu poprzez przechowywanie w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Usuwanie resztek komórkowych i białka Tamm-Horsfall (THP)
<ol>
	<li>Przenieść próbki moczu do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml. Odwirować 10 ml moczu o sile 17 000 x g przez 10 minut w temperaturze 37 °C w celu wyeliminowania komórek i resztek komórkowych (ryc. 1).</li>
	<li>Za pomocą pipety przenieść supernatant do świeżej probówki w celu dalszego przetwarzania. Zawiesić osad w 500 μl roztworu izolacyjnego (250 mM sacharozy, 10 mM trietanoloaminy, pH 7,6), a następnie przeprowadzić 10-minutową inkubację z DL-ditiotreitolem (DTT: stężenie końcowe 200 mg/ml) w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: DTT jest dodawany w celu degradacji THP, który zatrzymuje egzosomy, prowadząc do zmniejszenia wydajności. Należy upewnić się, że osad nie został naruszony podczas przenoszenia supernatantu i upewnić się, że supernatant jest wolny od osadu.</li>
	<li>Próbki granulek wirowych należy pobierać co 2 minuty, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu. Następnie do rozpuszczonego osadu dodać 500 μl roztworu izolacyjnego.</li>
	<li>Natychmiast po dodaniu roztworu izolacyjnego do osadu, odwirować przy 17 000 x g przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Odpipetować supernatant i połączyć z pobranym wcześniej supernatantem.</li>
	<li>Zawiesić osad w 50 μl roztworu izolacyjnego do analizy SDS-PAGE. 
	UWAGA: PBS lub TBS mogą być używane zamiast roztworu izolacyjnego do ponownego zawieszenia osadu.</li>
</ol>
3. Izolacja osadu egzosomu
<ol>
	<li>Do 11 ml zebranego supernatantu dodać 3,3 ml odczynnika ExoQuick-TC i inkubować w temperaturze 4 °C przez co najmniej 12 godzin. 
	UWAGA: Stosunek objętości supernatantu do odczynnika ExoQuick-TC można dostosować w celu zwiększenia lub zmniejszenia wydajności egzosomalnej. Zaobserwowaliśmy, że mniejsze objętości dodanego odczynnika powodują mniejszą wydajność egzosomów.</li>
	<li>Po inkubacji odwirować próbkę i mieszaninę ExoQuick-TC przy 10 000 x g przez 30 minut w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki w celu analizy SDS-PAGE.</li>
	<li>Osad egzosomu może być przechowywany w temperaturze -80 °C w celu ekstrakcji DNA, RNA i białek oraz ilościowego oznaczania cząstek egzosomu za pomocą CD9 ELISA11, 
	UWAGA: Granulat egzosomu można przechowywać w temperaturze -80 °C przez 1 rok z ograniczonym zamrażaniem i rozmrażaniem.</li>
</ol>
4. Wykrywanie i analiza biomarkerów osadu egzosomu
<ol>
	<li>Do dalszych analiz należy wyekstrahować DNA, RNA i białko z osadu egzosomu za pomocą zestawu do izolacji DNA/RNA/białka i zestawu do izolacji RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Oznaczyć stężenia za pomocą spektrofotometru Nanodrop, mierząc absorbancję przy 260 i 280 nm z 2 μl próbki.</li>
	<li>Wykonaj ilościowe testy RT-PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) przy użyciu testów mikroRNA TaqMan (w naszym przypadku użyliśmy ludzkich testów specyficznych dla miR-192 i miR-1207-5p) lub starterów specyficznych dla miRNA.</li>
	<li>Do analizy SDS-PAGE należy użyć 4-12% żelu Bis-Tris i oddzielić próbki białek za pomocą jednowymiarowej elektroforezy. Wizualizację żeli za pomocą zestawu do barwienia srebra zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przeprowadzić analizę western blot przy użyciu membran PVDF zgodnie z instrukcją dostarczoną przez producenta. Użyj króliczego przeciwciała poliklonalnego przeciwko białku X oddziałującemu z genem 2 sprzężonym z apoptozą lub ALIX oraz mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko białku genu podatności na nowotwór 101 lub TSG101 w wykrywaniu western blot. Określ ilościowo gęstość pasm za pomocą otwartego oprogramowania NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) lub podobnego programu.</li>
	<li>Określ ilościowo liczbę cząstek egzosomu moczu uzyskanych za pomocą zestawu CD9 ELISA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acids+within+urinary+exosomes%2Fmicrovesicles+are+potential+biomarkers+for+renal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease.</a> Kidney Int. 78, 191-199 (2010).</li>
<li>Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+proteomic+profiling+of+exosomes+in+human+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).</li>
<li>Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+quantitative+proteomics+strategy+for+protein+biomarker+studies+in+urinary+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes.</a> Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).</li>
<li>Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+systems+biology+principles+to+protein+biomarker+discovery%3A+urinary+exosomal+proteome+in+renal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation.</a> Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).</li>
<li>Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+exosomes+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of exosomes in urine.</a> Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).</li>
<li>Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection%2C+storage%2C+preservation%2C+and+normalization+of+human+urinary+exosomes+for+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery.</a> Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).</li>
<li>Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Prot+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).</li>
<li>Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).</li>
<li>Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+proteomics+and+phosphoproteomics+of+urinary+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes.</a> J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).</li>
<li>Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+methods+for+isolation+of+urinary+microvesicles+to+identify+biomarkers+of+nephrotic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome.</a> Kidney Int. 78, 810-816 (2010).</li>
<li>Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+protein%2C+microRNA%2C+and+mRNA+yields+using+different+methods+of+urinary+exosome+isolation+for+the+discovery+of+kidney+disease+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int.+Nov%22%5BJournal%5D)">Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers.</a> Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).</li>
<li>Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+association+of+-667+aquaporin-2+%28AQP-2%29+A%2FG+promoter+polymorphism+with+the+incidence+and+clinical+course+of+chronic+kidney+disease+in+Korea%5BTitle%5D)+AND+%22Renal+Fail%22%5BJournal%5D)">Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea.</a> Renal Fail. 29, 693-698 (2007).</li>
</ol>

Opłaty za publikację tego artykułu zostały opłacone przez SBI Biosciences.

Większość metod polegających na wytrącaniu egzosomów z moczu nie zajmuje się usuwaniem sieci polimerowej utworzonej przez białko Tamm-Horsfall (THP). Białko to jest obecne w dużych ilościach w moczu, gdzie przypuszczalnie zatrzymuje egzosomy podczas początkowego wirowania na niskiej prędkości. W naszej zmodyfikowanej metodzie zredukowaliśmy THP za pomocą DTT przed wytrącaniem egzosomów. Jak pokazano na rycinie 2, większą ilość THP zaobserwowano w nieprzetworzonym moczu i osadzie, bez THP w końcowym super...

Egzosomy moczu to małe wewnętrzne pęcherzyki o długości 100 nm ciał wielopęcherzykowych (MVB) pochodzące ze wszystkich typów komórek w normalnych i patologicznych warunkach w przestrzeni moczowej, w tym podocyty kłębuszkowe i komórki wyściełające systemy drenażu moczu, które wydają się być wzbogacone o miRNA1-2. Wielu badaczy wykryło odrębne białka w egzosomach wyizolowanych z moczu osób zdrowych, a także osób z chorobami nerek i/lub chorobami systematycznymi3-5. Egzosomy można izolować różnymi metodami, takimi jak dwuetapowe ultrawirowanie różnicowe z sacharozą6-7 lub bez niej, połączenie filtra nanomembranowego z ultrawirowaniem8-9 lub wytrącanie10-11. Niedawno opracowaliśmy prostą, szybką, skalowalną i skuteczną metodę izolowania egzosomów moczu i wykrywania biomarkerów miRNA i białek11. Chociaż biomarkery można wykryć w wielu różnych płynach biologicznych, mocz jest najwygodniejszym wyborem dla pacjentów z chorobami nerek i dróg moczowych, ponieważ można go uzyskać w dużych ilościach w stosunkowo nieinwazyjny sposób.
Chociaż istnieje kilka metod izolowania egzosomów moczu6-11, najczęściej stosowaną procedurą jest ultrawirowanie różnicowe z 30% poduszką sacharozową. Chociaż metoda ta jest skuteczna, a jakość powstałych egzosomów wyizolowanych za pomocą tej procedury jest wysoka, sama technika wymaga wykwalifikowanego personelu i jest czasochłonna, wymagając kilku etapów ultrawirowania. Inne metody, takie jak filtracja i wytrącanie, zostały opracowane do izolacji egzosomów, w tym jedna, która wykorzystuje zastrzeżony odczynnik do wytrącania (tj. ExoQuick-TC: System Biosciences; Mountain View, Kalifornia). Chociaż wytrącanie przy użyciu tego odczynnika jest szybkie i stosunkowo łatwe, czystość wyizolowanych egzosomów jest niska w porównaniu z metodą ultrawirowania. Niedawno porównaliśmy sześć metod izolacji egzosomów moczu, w tym modyfikację metody wytrącania za pomocą ExoQuick-TC, którą opracowaliśmy w naszym laboratorium11. Odkryliśmy, że ta zmodyfikowana metoda wytrącania dawała większe ilości białka, miRNA i mRNA, a sama procedura była szybsza i łatwiejsza do wdrożenia niż ultrawirowanie. W tym miejscu opisujemy protokół eksperymentalny naszej zmodyfikowanej metody wytrącania w sposób krokowy i zawieramy omówienie zalet i wad tej techniki w porównaniu z innymi metodami izolacji egzosomów. Zmodyfikowana metoda wytrącania polega na początkowym wytrącaniu cząstek egzosomu, a następnie usuwaniu białka Tamm-Horsfall, które jest skorelowane z białkami egzosomalnymi i o którym wiadomo, że zmniejsza wydajność egzosomów z moczu. Odkryliśmy, że te modyfikacje zwiększyły wydajność i czystość preparatu egzosomalnego z moczu.

<table><tbody><tr><td>Corning 15 ml Probówka wirówkowa</td><td>Corning (Sigma Aldrich)</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Sorvall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DL-ditiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9779</td><td>stosowana w końcowym stężeniu 200 mg/ml</td></tr><tr><td>System Novex NuPAGE SDS-PAGE (4-12% Bis-Tris Gel 1,0 mm, 10 dołków</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>NP0321BOX Do analizy SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania e-blottingu ECL Advance</td> GE <td>Healthcare Life Sciences</td><td>RPN2135</td><td>Do wykrywania biomarkerów Western blot</td></tr><tr><td>Exoquick-TC Reagent</td><td>System Biosciences (SBI)</td><td>EXOTC50A-1</td><td>Do izolacji egzosomów</td></tr><tr><td>Kompletny zestaw Exosome CD9 ELISA Biosciences</td><td>(SBI)</td><td>EXOEL-CD9-A-1</td><td>Do oznaczania ilościowego egzosomów</td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA/Białko mini zestaw</td><td>Qiagen</td><td>80004</td><td>Do izolacji DNA, RNA, białek</td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia Rneasy MinElute</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spektrofotometr UV-Vis</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>do oznaczania ilościowego białek</td></tr><tr><td>ProteoSilver Sliver Stain Kit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PROTSIL1-1KT</td><td>Do barwienia żeli</td></tr> <tr><td>SDS-PAGESystem elektroforezy Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>Technologie życia Do</td><td></td><td>uruchamiania żeli SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Testy mikroRNA TaqMan</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Do testów RT-PCR</td></tr><tr><td>Oprogramowanie qBasePlus v1.5</td><td>Biogazelle NV</td><td></td><td>Do analizy danych z testu RT-PCR</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko ALIX</td><td>Millipore</td><td></td><td>Do wykrywania biomarkerów</td></tr> <tr><td>western blotMysie przeciwciało monoklonalne przeciwko TSG101</td><td>Abcam</td><td></td><td>Do wykrywania biomarkerów western blot</td></tr></tbody></table>

zmodyfikowana metoda wytrącania w celu wyizolowania egzosomów moczu

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

Identyfikacja biomarkerów, które pozwalają na wczesne wykrywanie chorób nerek w moczu i osoczu, jest przedmiotem aktywnego zainteresowania od kilku lat. Pęcherzyki egzosomów moczowych o wielkości 40-100 nm są uwalniane do moczu w normalnych warunkach przez komórki ze wszystkich segmentów nefronu i mogą zawierać białka, mRNA i mikroRNA reprezentatywne dla ich typu komórki. W warunkach dysfunkcji lub uszkodzenia nerek egzosomy mogą zawierać zmienione proporcje tych składników, które mogą służyć jako biomarkery choroby. Obecnie dostępnych jest kilka metod izolacji egzosomów moczu, a wcześniej przeprowadziliśmy eksperymentalne porównanie każdego z tych podejść, w tym trzy oparte na ultrawirowaniu, jedno przy użyciu koncentratora ultrafiltracji nanomembranowej, jedno przy użyciu komercyjnego odczynnika do wytrącania i jedno wykorzystujące modyfikację techniki wytrącania za pomocą odczynnika ExoQuick, który opracowaliśmy w naszym laboratorium. Odkryliśmy, że zmodyfikowana metoda wytrącania dała najwyższą wydajność cząstek egzosomów, miRNA i mRNA, dzięki czemu podejście to jest odpowiednie do izolacji egzosomów w celu późniejszego profilowania RNA. Dochodzimy do wniosku, że zmodyfikowana metoda wytrącania egzosomów stanowi szybką, skalowalną i skuteczną alternatywę dla izolacji egzosomów z moczu. W tym raporcie opisujemy naszą zmodyfikowaną technikę wytrącania przy użyciu odczynnika ExoQuick do izolowania egzosomów z ludzkiego moczu.

Egzosomy moczowe przenoszą biomarkery białkowe, miRNA i mRNA wydzielane z komórek nabłonkowych nerek. Izolacja i detekcja tych egzosomów mogą stanowić przydatne narzędzie diagnostyczne we wczesnym wykrywaniu chorób nerek, takich jak nefropatia cukrzycowa. Istnieje kilka metod izolacji egzosomów z próbek moczu pobranych od ludzi. Wcześniej porównaliśmy sześć metod izolacji egzosomów z moczu i zbadaliśmy uzyskane poziomy białek, mRNA oraz miRNA11. Naszym celem w niniejszej pracy było szczegółowe opisanie zmodyfi...

Ten manuskrypt opisuje protokół izolowania egzosomów z ludzkiego moczu przy użyciu zmodyfikowanej techniki wytrącania.

Zmodyfikowana metoda wytrącania w celu wyizolowania egzosomów moczu

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprojektowanie zmodyfikowanej metody wytrącania egzosomów, która stanowi szybką, skalowalną i skuteczną alternatywę dla izolacji egzosomów z moczu. Osiąga się to najpierw poprzez usunięcie dużych martwych komórek oraz szczątków komórkowych z próbki moczu za pomocą wirowania, a następnie przeniesienie nadsączu zawierającego egzosomy z moczu do nowej probówki. W drugim kroku osad rozpuszcza się w roztworze izolacyjnym zawierającym DTT, aby usunąć białko TAM horse fall.Następnie, po dodatkowym wirowaniu, supernatant wolny od białek całkowitych (TP) inkubuje się z odczynnikiem exo quick TC przez noc w celu wytrącenia egzosomów następnego dnia. Próbki potraktowane odczynnikiem exo quick TC są wirowane po raz ostatni w celu uzyskania osadu egzosomów. Ostatecznie, w celu identyfikacji interesujących biomarkerów, na wyizolowanych egzosomach można przeprowadzić analizy końcowe, takie jak Western blot i qPCR w czasie rzeczywistym.Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak ultracentryfugacja, filtracja i precypitacja, jest to, że metoda ta nie wymaga etapów ultracentryfugacji, jest łatwa do przeprowadzenia i stosunkowo szybka, zapewniając jednocześnie wysoką wydajność względnie czystych egzosomów do późniejszej analizy molekularnej. Przed pobraniem moczu należy dodać 3,125 ml świeżo przygotowanego koktajlu inhibitorów proteaz do pustego, sterylnego pojemnika, a następnie zebrać do niego około 10 ml pierwszej frakcji moczu. Przenieś próbkę do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.Należy pamiętać, że do izolacji egzosomów można wykorzystać również 24-godzinną próbkę moczu, przechowującą się w temperaturze 4 °C. Wirować probówki przez 10 minut przy 17 000 g i 37 °C, aby usunąć lub oddzielić szczątki komórkowe od egzosomów z moczu. Następnie, uważając, aby nie zaburzyć osadu, przenieść nadsącz do nowej probówki i resuspender osad w 500 µL roztworu izolacyjnego.Inkubować osad z DTT o stężeniu końcowym 200 mg/mL w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Próbkę należy mieszać na wirówce typu vortex co dwie minuty. Po całkowitym rozpuszczeniu osadu dodać do próbki 500 µL roztworu izolacyjnego i natychmiast odwirować otrzymaną zawiesinę.Połącz nadpływ z wcześniej zebranym nadpływem i resuspenduj nowy osad w 50 µL roztworu do izolacji. W celu przeprowadzenia analizy SDS-PAGE i izolacji egzosomów, inkubuj najpierw 11 mL połączonego nadpływu z 3,3 mL odczynnika exo quick TC w temperaturze 4 °C przez co najmniej 12 godzin. Po inkubacji odwiruj próbkę, a następnie przenieś nadpływ do nowej probówki w celu analizy SDS-PAGE; osad zawierający egzosomy z moczu wykorzystuje się do ekstrakcji DNA/RNA lub białek albo przechowuje w temperaturze -80 °C.Użyj spektrofotometru NanoDrop, aby określić stężenia DNA i RNA każdej ekstrakcji, mierząc absorbancję przy 260 i 280 nanometrach przy użyciu dwóch mikrolitrów próbki. Zmodyfikowana reprodukcja analizy SDS-PAGE oraz detekcji biomarkerów za pomocą analizy western blot jest przedstawiona w ścieżkach z nieprzetworzonym moczem, gdzie w pierwszej próbce osadu moczowego zaobserwowano prążki białkowe odpowiadające 90 do 100 kilodaltonów, co wskazuje odpowiednio na obecność i usunięcie białka TAM horse fall w końcowych ścieżkach nadsączu i osadu egzosomów. Prążek białka TAM horse fall nie został zaobserwowany, co wskazuje na usunięcie białka TAM horse fall w poprzednich etapach, co skutkowało zwiększoną wydajnością osadu egzosomów.W tym eksperymencie wykryto biomarkery Alex oraz TSG 1 0 1 nawet przy zastosowaniu niewielkich ilości próbek, co wskazuje na bardzo czysty osad egzosomów do analizy biomarkerów oraz brak obfitych białek rozpuszczalnych, w tym białka TAM horse fall po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się przewlekłą chorobą nerek do wykorzystania wyizolowanych z moczu egzosomów we wczesnym wykrywaniu i diagnozowaniu nefropatii cukrzycowej.

a-modified-precipitation-method-to-isolate-urinary-exosomes

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Zmodyfikowana metoda osadzania do izolacji egzosomów moczu

Egzosomy izolowane z plazmy mogą być używane jako nieinwazyjny i powtarzalny sposób wykrywania i śledzenia biomarkerów do wczesnego wykrywania i postępu choroby. Ten film opisuje protokół oddzielania egzosomów od próbek osocza pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc, które można wykorzystać do ekstrakcji DNA i białek.

Izolacja egzosomów: technika oddzielania egzosomów od osocza pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc

Ten film opisuje technikę ultrawirowania opartą na gęstości do izolowania egzosomów z kondycjonowanych pożywek pobranych z ludzkich embrionalnych hodowli komórek nerkowych przy użyciu 25% (w/w) poduszki sacharozowej przygotowanej w tlenku deuteru. Wyizolowane egzosomy mogą być wykorzystywane do dalszych zastosowań.

Izolacja egzosomów: technika ultrawirowania oparta na gęstości wykorzystująca poduszkę sacharozy do oddzielania egzosomów od kondycjonowanych pożywek hodowanych komórek

W tym artykule przedstawiono metodę izolacji egzosomów z krwi pełnej i dalszej analizy za pomocą śledzenia nanocząstek za pomocą półautomatycznego instrumentu. Prezentowana technologia zapewnia niezwykle czułą metodę wizualizacji i analizy cząstek w ciekłej zawiesinie.

Innowacyjna metoda kwantyfikacji egzosomów i pomiaru wielkości

Płyn żółciowy jest cennym źródłem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów, które zawierają potencjalnie ważne biomarkery. Protokół ten stanowi solidną metodę izolowania egzosomów z ludzkiej żółci w celu dalszych analiz, w tym profilowania miRNA.

Izolacja i profilowanie egzosomów zawierających mikroRNA z ludzkiej żółci

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania egzosomów zarówno z osocza, jak i surowicy z redukcją kooczyszczania nieegzosomalnych białek krwi. Zoptymalizowany protokół obejmuje ultrafiltrację, leczenie proteazą i chromatografię wykluczania wielkości. Ulepszone oczyszczanie egzosomów przynosi korzyści w dalszych analizach, w tym dokładniejszej kwantyfikacji pęcherzyków i charakterystyce proteomicznej.

Trawienie białek, ultrafiltracja i chromatografia wykluczania wielkości w celu optymalizacji izolacji egzosomów z ludzkiego osocza krwi i surowicy

Tutaj opisujemy dwa protokoły izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, wirowanie ultrafiltracji i ultrawirowanie z wirowaniem gradientu gęstości, aby wyizolować pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z próbek płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego myszy. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z mysiego płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego za pomocą obu metod są określane ilościowo i charakteryzowane.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z mysiego płynu płucnego z oskrzelowo-pęcherzykowego przy użyciu techniki wirowania ultrafiltracji

Tutaj prezentujemy protokół przejściowej poprawy funkcji serca u myszy z dystrofią mięśniową Duchenne'a poprzez przeszczepienie egzosomów pochodzących z normalnych miogennych komórek progenitorowych.

Oczyszczanie i przeszczepianie miogennych egzosomów pochodzących z komórek progenitorowych w celu poprawy funkcji serca u myszy z dystroficznym zapłonem mięśniowym Duchenne'a

Ten protokół ilustruje 1) izolację i hodowlę pierwotnych fibroblastów z mięśnia brzuchatego łydki dorosłej myszy, a także 2) oczyszczanie i charakterystykę egzosomów za pomocą różnicowej metody ultrawirowania w połączeniu z gradientami gęstości sacharozy, a następnie analizami western blot.

Izolacja i charakterystyka egzosomów z fibroblastów mięśni szkieletowych

Obecny protokół zawiera szczegółowe opisy skutecznego izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych moczu za pomocą funkcjonalizowanych kulek magnetycznych. Ponadto obejmuje kolejne analizy, w tym western blotting, proteomikę i fosfoproteomikę.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z biofluidów na podstawie powinowactwa chemicznego do analizy proteomicznej i fosfoproteomicznej

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są niezwykle obiecujące dla zastosowań biomedycznych, ale obecne metody izolacji są czasochłonne i niepraktyczne do użytku klinicznego. W niniejszej pracy prezentujemy urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia bezpośrednią izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z dużych objętości płynów biologicznych w sposób ciągły przy minimalnych krokach.

Jednoetapowa izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek o dużej objętości za pomocą rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego A4F

Poznaj zmodyfikowaną metodę wytrącania egzosomów z moczu, która oferuje szybkie, skalowalne i skuteczne izolowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Ta technika umożliwia analizę biomarkerów metodami Western blot i qPCR.

Zmodyfikowana metoda wytrącania w celu wyizolowania egzosomów moczu

Przeglądaj więcej filmów