Zmodyfikowana metoda wytrącania w celu wyizolowania egzosomów moczu
16 stycznia 2015
Ten manuskrypt opisuje protokół izolowania egzosomów z ludzkiego moczu przy użyciu zmodyfikowanej techniki wytrącania.
Ogólnym celem tej procedury jest zaprojektowanie zmodyfikowanej metody wytrącania egzosomów, która oferuje szybką, skalowalną i skuteczną alternatywę dla izolacji egzosomów z moczu. Osiąga się to poprzez usunięcie dużych martwych komórek i resztek komórkowych z próbki moczu przez odwirowanie, a następnie naczynie zawierające egzosomy moczu jest przenoszone do świeżej probówki. W drugim etapie osad rozpuszcza się w roztworze izolacyjnym zawierającym naziemną rejestrację cyfrową w celu usunięcia białka TAM końskiego upadku.
Następnie, po dalszym odwirowaniu, supernatant wolny od TP inkubuje się z odczynnikiem egzoszybkim TC przez noc, aby następnego dnia wytrącić egzosomy. Próbki poddane działaniu odczynnika Exo Quick TC są odwirowywane po raz ostatni w celu uzyskania osadu egzosomu. Ostatecznie na egzosomach można przeprowadzić dalsze procesy, takie jak Western blot i QPCR w czasie rzeczywistym, w celu zidentyfikowania interesujących biomarkerów.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ultra centryfikacja, filtracja i wytrącanie, jest to, że metoda ramienia nie wymaga żadnych kroków certyfikacji ultra, jest łatwa do wykonania stosunkowo szybka, a jednocześnie zapewnia wysoką, stosunkowo czystą wydajność egzosomu do późniejszej analizy molekularnej przed pobraniem moczu. Przy 3,125 mililitra świeżo przygotowanego koktajlu inhibitorów proteazy do pustego sterylnego pojemnika, a następnie zebrać około 10 mililitrów pierwszego pustego moczu w pojemniku. Przenieś próbkę do 15-mililitrowych stożkowych probówek.
Należy pamiętać, że pobraną w ciągu 24 godzin próbkę moczu można również wykorzystać do izolacji egzosomu poprzez przechowywanie w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Obracaj probówki przez 10 minut w temperaturze 17 000 GS i 37 stopniach Celsjusza, aby usunąć lub oddzielić resztki komórkowe od egzosomów moczu. Następnie, uważając, aby nie naruszyć osadu, przenieś supernatant do świeżej probówki i ponownie zawieś osad w 500 mikrolitrach roztworu izolacyjnego.
Inkubować osad z naziemną telewizją cyfrową w końcowym stężeniu 200 miligramów na mililitr w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Wirowanie próbki co dwie minuty. Następnie, gdy osad całkowicie się rozpuści, dodaj 500 mikrolitrów roztworu izolacyjnego do próbki i natychmiast odwiruj powstałą zawiesinę.
Połączyć supernatant z poprzednio zebranym supernatantem i ponownie zawiesić nowy osad w 50 mikrolitrach roztworu izolacyjnego. W celu analizy strony SDS w celu wyizolowania egzosomów, najpierw inkubuj 11 mililitrów połączonego supernatantu z 3,3 mililitra odczynnika exo quick TC w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 12 godzin. Po inkubacji odwirować próbkę, a następnie przenieść supernatant do świeżej probówki w celu analizy strony SDS, a osad zawierający egzosomy moczu jest używany do ekstrakcji D-N-A-R-N-A lub białka lub przechowywany w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Użyj spektrofotometru NanoDrop, aby określić stężenia DNA i RNA w każdej ekstrakcji, mierząc chłonność przy 260 i 280 nanometrach z dwoma mikrolitrami próbki. Zmodyfikowaną reprodukcję analizy strony SDS i detekcji biomarkerów za pomocą zachodniej analizy krwi pokazano na torach z nieprzetworzonym moczem i zaobserwowano pierwsze zakazy białka w moczu odpowiadające 90 do 100 kilodaltonów, co wskazuje na obecność i usunięcie białka upadku konia TAM odpowiednio w końcowych pasmach supernatantu i egzosomu. Nie zaobserwowano pasma białkowego TAM upadku konia, co wskazuje na usunięcie białka TAM upadku konia we wcześniejszych etapach i skutkuje zwiększoną wydajnością osadów egzosomów.
W tym eksperymencie biomarkery Alex i TSG 1 0 1 wykryto nawet wtedy, gdy użyto małych ilości próbki, co wskazuje na bardzo czystą osadę egzosomu do analizy biomarkerów i brak obfitych rozpuszczalnych białek, w tym białka upadku konia TAM po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się przewlekłą chorobą nerek do wykorzystania egzosomów izolowanych z moczu do wczesnego wykrywania i diagnozowania nefropatii cukrzycowej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy manuskrypt opisuje protokół izolacji egzosomów z ludzkiego moczu z wykorzystaniem zmodyfikowanej techniki precypitacji. Metoda ta ma na celu zapewnienie szybkiej, skalowalnej i skutecznej alternatywy dla izolacji egzosomów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Badania nad egzosomami
Wstęp
- Egzosomy to małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe biorące udział w komunikacji międzykomórkowej.
- Izolowanie egzosomów z moczu może dostarczyć informacji na temat różnych procesów biologicznych.
- Obecne metody mogą być czasochłonne i mniej wydajne.
- Zmodyfikowana technika precypitacji mogłaby zwiększyć odzysk egzosomów.
Cel badania
- Opracowanie szybkiej metody izolacji egzosomów z moczu.
- Poprawa skalowalności i skuteczności ekstrakcji egzosomów.
- Ułatwienie dalszych zastosowań, takich jak identyfikacja biomarkerów.
Zastosowane metody
- Wirowanie w celu usunięcia dużych komórek i zanieczyszczeń z próbek moczu.
- Rozpuszczanie osadu w roztworze izolacyjnym zawierającym DTT.
- Inkubowanie nadsączu z odczynnikiem exo quick TC przez noc.
- Końcowe wirowanie w celu uzyskania osadu egzosomów.
Główne wyniki
- Zmodyfikowana metoda pozwala na skuteczną izolację egzosomów z moczu.
- Egzosomy mogą być wykorzystywane w dalszych analizach, takich jak Western blot i qPCR.
- Efektywne usuwanie zanieczyszczeń zwiększa czystość izolowanych egzosomów.
- Protokół można skalować dla większych objętości próbek.
Wnioski
- Zmodyfikowana technika precypitacji jest skuteczną metodą izolacji egzosomów.
- Podejście to może usprawnić badania nad egzosomami w różnych studiach biologicznych.
- Przyszłe badania mogą zgłębić dodatkowe zastosowania izolowanych egzosomów.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolowanie egzosomów z moczu umożliwia nieinwazyjne odkrywanie biomarkerów chorób nerek, wspierając wczesną diagnostykę oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w opracowywaniu terapii nerkowych. Zmodyfikowana metoda wytrącania stanowi skalowalną, wysokowydajną alternatywę dla ultrawirowania, poprawiając powtarzalność i przepustowość w procesach walidacji celów terapeutycznych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji biomarkerów poprzez redukcję zanieczyszczeń i zwiększenie czystości egzosomów na potrzeby późniejszego profilowania molekularnego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez izolację egzosomów odzwierciedlających zawartość specyficzną dla danego typu komórek z segmentów nefronu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia szybką, skalowalną metodę izolacji egzosomów bez konieczności przeprowadzania ultrawirowania, co redukuje zmienność techniczną.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność wykrywania biomarkerów dzięki uzyskaniu wysokiej czystości osadów egzosomowych wzbogaconych w miRNA i mRNA do celów profilowania.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych próbek egzosomów do dalszych analiz, takich jak Western blot i qPCR, w celu wykrycia biomarkerów związanych z chorobą.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja izolacji egzosomów poprzez workflow oparty na precypitacji, kompatybilny z wysokoprzepustowym przetwarzaniem próbek.
- Gotowość do analizy: Uzyskiwanie spójnych wydajności egzosomów odpowiednich do ekstrakcji RNA i analizy białek, co wspiera powtarzalny screening biomarkerów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wspiera przejście od odkrywania biomarkerów w moczu do walidacji przedklinicznej poprzez dostarczanie ładunku egzosomów istotnego dla danej choroby.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia wykrycie zmian w zawartości egzosomów w warunkach dysfunkcji nerek, co pozwala na wyjaśnienie szlaków patofizjologicznych.
- Pewność prognostyczna: Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez powiązanie biomarkerów egzosomalnych z wczesnymi oznakami nefropatii cukrzycowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania – od testowania hipotez po identyfikację związków wiodących – umożliwiając nieinwazyjną izolację biomarkerów, co pozwala na wybór celu i zapewnia ciągłość badań przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez izolację egzosomów odzwierciedlających ładunek specyficzny dla komórek pochodzenia z układu moczowego.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki izolacji egzosomów, odpowiednie do opracowywania testów biomarkerów i przesiewania związków.
- Analityka: Umożliwia pomiar poziomów RNA i białek związanych z egzosomami za pomocą qPCR i Western blot w celu analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Łączy biomarkery egzosomów moczowych z przedklinicznymi modelami chorób nerek poprzez wykrywanie ładunku istotnego dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy skalowalną, standaryzowaną platformę izolacji, którą można zastosować w wielu typach próbek moczu i programach badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Usprawnia walidację celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej dzięki izolacji czystych egzosomów do profilowania biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i skalowalność poprzez eliminację etapów ultrawirowania i uproszczenie procesu pracy.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie lepszych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez zwiększenie pewności we wczesnym wykrywaniu biomarkerów chorób nerek.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na terapie nerkowe z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o rzetelne dane dotyczące biomarkerów egzosomalnych.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana jest wiedza z zakresu biologii egzosomów oraz technik molekularnych, takich jak ekstrakcja RNA i qPCR.
- Konieczny jest dostęp do wirówek, odczynnika ExoQuick TC oraz narzędzi spektrofotometrycznych do kwantyfikacji RNA/DNA.
- Wymagana jest standaryzacja między zespołami w celu zapewnienia spójnych czasów inkubacji, temperatur i sposobu obchodzenia się z odczynnikami.
- Należy uwzględnić kwestie adaptacji przy stosowaniu tej metody do różnych protokołów zbierania moczu lub warunków przechowywania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność inkubacji nocnej oraz ostrożnego postępowania, aby uniknąć utraty egzosomów podczas przenoszenia.
