Name: Rozwarstwienie mięśnia poprzecznego brzucha w celu analizy całego połączenia nerwowo-mięśniowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Poznaj metodę preparowania mięśnia poprzecznego brzucha u myszy z wykorzystaniem immunofluorescencji do wizualizacji złączy nerwowo-mięśniowych. Technika ta umożliwia badanie patologii nerwowo-mięśniowej w modelach zwierzęcych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Canadian Institutes of Health Research (numer grantu MOP 38040) dla R.K., Muscular Dystrophy Association (USA) dla R.K., Families of SMA dla R.K. i L.M.M., The SMA Trust dla T.H.G. oraz The Muscular Dystrophy Campaign dla T.H.G.. L.M.M jest stypendystką Stypendium Podoktorskiego Kanadyjskiego Towarzystwa Stwardnienia Rozsianego, a R.K. jest stypendystką Uniwersyteckiej Katedry Badań nad Zdrowiem na Uniwersytecie w Ottawie.

Wszystkie procedury powinny być wykonywane zgodnie ze standardami opieki nad zwierzętami określonymi przez instytucję.
1. Fragment mięśni brzucha u myszy
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem uzupełnij 4% paraformaldehydu (PFA). Ostrzeżenie: PFA należy zawsze przechowywać w dygestorium i nosić odpowiedni sprzęt ochronny.</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji zatwierdzoną metodą. nuta: Mysz pokazana na filmie została poddana eutanazji w wyniku przedawkowania CO2 i zwichnięcia szyjki macicy. Ta mysz to 4-tygodniowa mysz typu dzikiego na hybrydowym tle CD1 / C57Bl6. Ta mysz została wyhodowana w obiektach dla zwierząt na Uniwersytecie w Ottawie z myszy, które zostały pierwotnie zakupione.</li>
	<li>Wykonaj wstępne nacięcie przez skórę na poziomie biodra i przetnij skórę dookoła myszy.</li>
	<li>Zdejmij skórę, ciągnąc do góry, aż osiągniesz poziom kończyny przedniej.</li>
	<li>Przetnij mięśnie brzucha na poziomie biodra i kontynuuj nacięcie, aż dotrzesz do kręgosłupa.</li>
	<li>W tym momencie zacznij ciąć w górę przez mięśnie i żebra, aż dotrzesz do kończyny górnej.</li>
	<li>Tnij prosto w poprzek, aż dotrzesz do kręgosłupa po drugiej stronie.</li>
	<li>Ciąć w dół, aż dojdziesz do punktu, w którym zacząłeś.</li>
	<li>Zwolnij membranę od spodu (uważając, aby nie uszkodzić mięśnia TVA) i umieść ją w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w naczyniu preparacyjnym pokrytym SYLGARD z kołkami preparacyjnymi o średnicy 0,2 mm.</li>
	<li>Przypnij klatkę piersiową i związane z nią mięśnie w naczyniu, powierzchowną stroną do góry, upewniając się, że mięsień jest w pełni rozciągnięty.</li>
	<li>Odlej 1x PBS i zastąp 4% PFA.</li>
	<li>Przykryj i pozostaw na bujanej platformie w temperaturze pokojowej na 15 min.</li>
	<li>Prać 3x w 1x PBS w temperaturze pokojowej przez 10 min.</li>
</ol>
* W tym momencie stałe mięśnie można zostawić w lodówce na noc przed kolejnym rozbiorem.
2. Izolacja mięśnia TVA
<ol>
	<li>Aby przystąpić do izolacji mięśnia TVA, pod mikroskopem preparacyjnym, zacznij od przecięcia zewnętrznego mięśnia skośnego na poziomie kilku ostatnich żeber (patrz rysunek 1, aby zapoznać się z przewodnikiem z adnotacjami).</li>
	<li>Cięć prosto w dół obok linea alba (uważając, aby nie przeciąć TVA poniżej), aż dotrzesz do początku wewnętrznego mięśnia skośnego.</li>
	<li>Następnie przetnij w poprzek, aby uwolnić leżący nad nim mięsień prosty brzucha i zewnętrzne mięśnie skośne z górnej części TVA poniżej.</li>
	<li>Usuń naczynie krwionośne i wszelki leżący nad nim tłuszcz z mięśnia TVA.</li>
	<li>Uwolnij mięsień z leżącego nad nim ostatniego żebra.</li>
	<li>Przeciąć wokół brzegów mięśnia i przenieść na 24-dołkową płytkę zawierającą PBS.</li>
</ol>
3. Znakowanie immunofluorescencyjne i mikroskopia mięśnia TVA
Dla wszystkich kolejnych kroków, usuń płyn za pomocą pipety z cienką końcówką i pozostaw płytkę na kołyszącej się platformie. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie kolejne kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej.
<ol>
	<li>Inkubować w PBS zawierającym 1:1,000 fluorescencyjnie znakowanej bungarotoksyny przez 30 minut, aby oznaczyć NMJ. Można to zrobić w ciemnym pomieszczeniu lub pod folią.</li>
	<li>Przepuszczalność mięśni poprzez dodanie 300 μl na studzienkę 2% Triton X-100 w PBS i pozostawienie na platformie do kołysania na 30 minut.</li>
	<li>Inkubować w odczynniku blokującym (4% BSA, 1% Triton w PBS) przez 30 min.</li>
	<li>Inkubować w odczynniku blokującym zawierającym przeciwciała pierwszorzędowe (neurofilament 1:100; białko pęcherzyków synaptycznych 2, 1:250) w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Umyć 3x w 1x PBS.</li>
	<li>Inkubować w PBS zawierającym 1:250 przeciwciała drugorzędowe przez 2-4 godziny.</li>
	<li>Umyć 3x w 1x PBS.</li>
	<li>Zamontuj mięśnie na szkiełkach podstawowych za pomocą wystarczającej ilości fluorescencyjnych mediów montażowych i szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Szkiełka najlepiej oglądać przy użyciu dwupasmowego filtra przepustowego w standardowym mikroskopie epifluorescencyjnym.</li>
	<li>NMJ najlepiej obrazować za pomocą projekcji serii Z na mikroskopie konfokalnym wyposażonym w obiektyw o powiększeniu co najmniej 40X.</li>
</ol>

<ol><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu. Rev. Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li>
<li>Dupuis, L., Loeffler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+junction+destruction+during+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+insights+from+transgenic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis: insights from transgenic models.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 341-346 (2009).</li>
<li>Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+neuromuscular+synaptic+vulnerability+in+motor+neurone+disease%3A+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol.+Appl.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36, 133-156 (2010).</li>
<li>Murray, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 949-962 (2008).</li>
<li>Kariya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+SMN+protein+impairs+maturation+of+the+neuromuscular+junctions+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Reduced SMN protein impairs maturation of the neuromuscular junctions in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2552-2569 (2008).</li>
<li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+TDP-43+causes+age-dependent+progressive+motor+neuron+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Loss of TDP-43 causes age-dependent progressive motor neuron degeneration.</a> Brain. 136, 1371-1382 (2013).</li>
<li>Martinez-Hernandez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+defects+in+type+I+spinal+muscular+atrophy+in+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Synaptic defects in type I spinal muscular atrophy in human development.</a> J. Pathol. 229, 49-61 (2013).</li>
<li>Fischer, L. R., Li, Y., Asress, S. A., Jones, D. P., Glass, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+SOD1+leads+to+oxidative+stress+in+peripheral+nerve+and+causes+a+progressive+distal+motor+axonopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Absence of SOD1 leads to oxidative stress in peripheral nerve and causes a progressive distal motor axonopathy.</a> Exp. Neurol. 233, 163-171 (2012).</li>
<li>Cifuentes-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofilament+accumulation+at+the+motor+endplate+and+lack+of+axonal+sprouting+in+a+spinal+muscular+atrophy+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model.</a> Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).</li>
<li>Fischer, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis+is+a+distal+axonopathy%3A+evidence+in+mice+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol.%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man.</a> Exp. Neurol.. 185, 232-240 (2004).</li>
<li>Diers, A., Kaczinski, M., Grohmann, K., Hubner, C., Stoltenburg-Didinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+of+peripheral+nerve%2C+motor+end-plate+and+skeletal+muscle+in+patients+suffering+from+spinal+muscular+atrophy+with+respiratory+distress+type+1+%28SMARD1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure of peripheral nerve, motor end-plate and skeletal muscle in patients suffering from spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1).</a> Acta Neuropathol. 110, 289-297 (2005).</li>
<li>Ang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+axonal+sprouting+and+neuromuscular+junction+loss+in+an+animal+model+of+Charcot-Marie-Tooth+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Motor axonal sprouting and neuromuscular junction loss in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 281-293 (2010).</li>
<li>Simon, C. M., Jablonka, S., Ruiz, R., Tabares, L., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor-induced+sprouting+preserves+motor+function+in+a+mouse+model+of+mild+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor-induced sprouting preserves motor function in a mouse model of mild spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 973-986 (2010).</li>
<li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul.+Disord%22%5BJournal%5D)">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul. Disord. 20, 740-743 (2010).</li>
<li>Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+photo-bleaching+to+delineate+single+Schwann+cells+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction.</a> J. Vis. Exp. (4460), (2013).</li>
<li>Murray, L. M., Thomson, D., Conklin, A., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+translation+elongation+factor+%28eEF1A2%29+expression+in+vivo+differentiates+between+Wallerian+degeneration+and+dying-back+neuronal+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Loss of translation elongation factor (eEF1A2) expression in vivo differentiates between Wallerian degeneration and dying-back neuronal pathology.</a> J. Anat. 213, 633-645 (2008).</li>
<li>Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+smn+threshold+in+mice+dictates+onset+of+an+intermediate+spinal+muscular+atrophy+phenotype+associated+with+a+distinct+neuromuscular+junction+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul.+Disord%22%5BJournal%5D)">A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology.</a> Neuromuscul. Disord. 22, 263-276 (2012).</li>
<li>Comley, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ApoE+isoform-specific+regulation+of+regeneration+in+the+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">ApoE isoform-specific regulation of regeneration in the peripheral nervous system.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2406-2421 (2011).</li>
<li>Wright, M., Kim, A., Son, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+administration+of+muscarinic+antagonists+and+triple-immunostaining+of+the+levator+auris+longus+muscle+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li>
<li>Ling, K. K., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+neuromuscular+denervation+of+clinically+relevant+muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 21, 185-195 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym filmie szczegółowo opisaliśmy protokół rozwarstwienia mięśnia TVA od myszy i znakowania immunofluorescencyjnego NMJ w mięśniu w całości. Przedstawiamy również dane pokazujące, że mięsień ten może być wykorzystany do analizy patologii połączeń nerwowo-mięśniowych w mysim modelu SMA.
Sukces w tej technice zależy od wielu czynników. Poniżej przedstawiono niektóre z najczęstszych problemów. Po pierwsze: słabe barwienie immunohistochemiczne. Przyczyn takiego stanu rzeczy może być wiele, a jedną z najczęstszych jest stosowanie innych odczynników niż te wymienione w tym protokole. Wysokiej jakości mikroskopia elektronowa klasy PFA jest bardzo ważna dla zapewnienia dobrego barwienia, podobnie jak wybór przeciwciał wymienionych w tym protokole. Ponadto u starszych zwierząt (tj. > 3 miesięcy) uzyskanie dobrej jakości barwienia może być trudniejsze. Dzieje się tak ze względu na zwiększoną grubość powięzi otaczającej mięsień i wzrost akumulacji tłuszczu między skośnym zewnętrznym a poprzecznym brzucha. Ważne jest, aby usunąć tłuszcz przed przystąpieniem do immunofluorescencji. Może być również konieczne usunięcie części powięzi pokrywającej mięsień, który może ulec pogrubieniu. Czasami trudno jest usunąć powięź i tłuszcz z mięśnia bez poniesienia pewnego uszkodzenia włókna mięśniowego i zakłócenia wzorca unerwienia. Jeśli jednak ta technika zostanie wykonana ostrożnie, dobrej jakości barwienie można uzyskać od myszy w wieku co najmniej 1 roku. U młodszych myszy (tj. w wieku poniżej 3 miesięcy) nie powinno być konieczne wykonywanie żadnego drażnienia lub rozdzielania włókien mięśniowych. Po drugie: trudności w znalezieniu NMJ po sekcji i barwieniu. Dzieje się tak często dlatego, że rozwarstwienie nie rozciąga się poniżej ostatniego żebra. Większość NMJ znajduje się tuż pod ostatnim żebrem i dlatego należy zadbać o to, aby ta część mięśnia została uwzględniona w rozwarstwieniu. Po trzecie: przyleganie mięśnia EO do mięśnia TVA. Jest to często skarga, gdy osoby próbują rozszerzyć rozwarstwienie poniżej poziomu mięśnia skośnego wewnętrznego (IO). Obszar mięśnia TVA, w którym występuje również IO, jest trudniejszy do analizy, ponieważ może być trudno odróżnić, który mięsień jest który. Z tego powodu rutynowo po prostu preparujemy najbardziej górną część mięśnia TVA. Na tym poziomie nie ma przylegania między mięśniami EO i TVA, dlatego nie powinno to stanowić istotnego problemu.
Jedną z istotnych przeszkód w korzystaniu z mięśnia TVA, w porównaniu z mięśniami wyrostka robaczkowego, jest dostępność zarówno do manipulacji chirurgicznych, jak i wstrzykiwania substancji. Tego typu eksperymenty mogą być kluczowe dla zbadania fizjologii NMJ w danym mięśniu. Chociaż TVA jest z pewnością trudniej dostępny niż częściej używane mięśnie, takie jak piszczel przedni lub brzuchaty łydki, wcześniejsze prace wykazały, że możliwe jest odnerwowanie TVA poprzez chirurgiczne uszkodzenie nerwów międzyżebrowych. Od niedawna wykorzystujemy również ten mięsień do miejscowego podawania substancji w znieczuleniu ogólnym (dane niepublikowane). Chociaż eksperymenty te mogą stanowić umiarkowane wyzwanie techniczne, niniejsza praca pokazuje, że są one wykonalne, a tym samym rozszerzają przydatność tego mięśnia do analizy NMJ zarówno w przypadku manipulacji patologicznej, jak i fizjologicznej.
Mięsień TVA jest jednym z wielu cienkich, płaskich mięśni rozmieszczonych w całym ciele, które można wykorzystać do całościowej analizy wzorców unerwienia. Inne mięśnie obejmują grupę mięśni czaszki unerwionych przez neurony ruchowe pochodzące z jądra twarzowego pnia mózgu, obejmującą dźwigacz długi grzbietu, małżowinę uszną górną i przywodziciela auris długiego, których rozwarstwienie zostało opisane wcześniej14,19. Co więcej, mięśnie otaczające mięsień TVA, w tym EO, IO i mięsień prosty brzucha, mogą być również znakowane i wykorzystywane do analizy NMJ. Aby uzyskać kompleksową analizę patologii NMJ w modelu mysim, ważne jest, aby wziąć pod uwagę liczbę mięśni rozmieszczonych w całym ciele i nie ograniczać analizy do jednego mięśnia. Jest to zilustrowane w mysich modelach chorób neuronu ruchowego, w których występuje znaczna niejednorodność poziomów patologii NMJ między różnymi mięśniami20. Taka zmienność międzymięśniowa jest niezwykle cennym narzędziem podczas badania mechanizmu podatności neuronów ruchowych i dlatego ograniczenie analizy do pojedynczego mięśnia mogłoby znacznie zmniejszyć potencjał badań.

Połączenia nerwowo-mięśniowe (NMJ) to połączenie synaptyczne między dolnym neuronem ruchowym a włóknem mięśni szkieletowych. Są one tradycyjnie uważane za synapsę trójdzielną, składającą się z neuronu (zakończenie presynaptyczne), włókna mięśniowego (zakończenie postsynaptyczne) i końcowej komórki Schwanna1. NMJ wydają się być wczesnymi i znaczącymi celami w patologii w wielu chorobach neuronu ruchowego i modelach mysich2,3. Typowe objawy obejmują odnerwienie, w którym ruchowa płytka końcowa staje się pozbawiona unerwienia presynaptycznego, obrzęk zakończenia presynaptycznego i zmniejszenie złożoności morfologii NMJ4-11. Można również zauważyć reakcje kompensacyjne, które obejmują kiełkowanie końcowe i węzłowe, w którym procesy aksonalne rozciągają się od pozostałych zakończeń synaptycznych lub międzywęźli do reinerwowanych odnerwionych płytek końcowych12,13. Ze względu na ścisłą korelację między aktywnością synaptyczną a morfologią NMJ, z analizy morfologii NMJ można uzyskać wiele informacji na temat stanu funkcjonalnego neuronów ruchowych. Ponieważ utrata NMJ często stanowi jeden z pierwszych aspektów patologii nerwowo-mięśniowej4,10, kwantyfikacja na poziomie unerwienia może dostarczyć ważnych informacji na temat postępu patologii i potencjalnego efektu interwencji terapeutycznej. Ponadto, ponieważ utrata NMJ stanowi znaczący krok w patologicznej progresji, opracowanie leków, które mogą stabilizować połączenia i zachęcać do regeneracji, może przynieść znaczące korzyści.
Podczas analizy morfologii NMJ, wybór mięśni ma ogromne znaczenie. Niektóre z podstawowych zagadnień mogą obejmować typ włókien mięśniowych, pozycję ciała i analizę porównawczą z warunkami ludzkimi. Ponadto, gdy wymagane są manipulacje, takie jak wstrzyknięcie substancji lub urazowe uszkodzenie nerwów, należy również rozważyć dostępność eksperymentalną. Ogólnie rzecz biorąc, lepiej jest analizować zakres mięśni rozmieszczonych w całym ciele, odzwierciedlających szereg podtypów jednostek motorycznych. Często jednak na wybór mięśni wpływa łatwość sekcji. W związku z tym analiza NMJ jest często wykonywana wyłącznie na dużych mięśniach wyrostka robaczkowego, takich jak mięśnie brzuchate łydki. Aby uzyskać dobre barwienie NMJ w takich mięśniach, często wymagane jest cięcie lub mechaniczne rozerwanie włókien mięśniowych. W rezultacie wzorzec unerwienia może zostać zakłócony, a kompleksowa i wysokiej jakości analiza wzorców unerwienia, kiełkowania i odnerwienia jest często zagrożona. Alternatywnym podejściem jest użycie cienkich, płaskich mięśni, które nie wymagają sekcji i mogą być barwione i montowane w stanie nienaruszonym, co pozwala na kompleksowy przegląd całego unerwienia mięśnia. Istnieje szereg mięśni, które można wykorzystać do takiej analizy, w tym grupa mięśni czaszki (obejmująca dźwigacz auris długi, małżowinę uszną górną i przywodziciela auris longus)14, mięśnie klatki piersiowej (np. Triangularis sterni)15 oraz mięśnie brzucha (np. mięśnie poprzeczne brzucha (TVA)). Główną przeszkodą w używaniu takich mięśni jest wiedza techniczna wymagana do ich rozwarstwienia bez uszkodzenia.
W tym filmie przedstawiamy protokół do analizy i przeprowadzenia immunofluorescencyjnego znakowania mięśnia TVA od myszy, aby umożliwić kompleksową analizę wzorca unerwienia i morfologii NMJ. Mięsień TVA jest głównie mięśniem wolnokurczliwym, zawierającym najgłębszą warstwę mięśni brzucha i jest unerwiony przez dolne nerwy międzyżebrowe. Wcześniejsze prace wykazały, że jest on konsekwentnie wysoce podatny na patologię w wielu mysich modelach dziecięcej choroby neuronu ruchowego, rdzeniowego zaniku mięśni (SMA) oraz w innych mysich modelach wczesnego zwyrodnienia neuronów ruchowych4,16. Dlatego sugerujemy, że TVA jest użytecznym mięśniem do podejmowania analizy NMJ w neuropatiach obwodowych.

<table><tbody><tr><td>Wodny roztwór paraformaldehydu (16%) Mikroskopia</td> <td>elektronowa Sciences</td><td>15700</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Kątowe nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki - ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning</td><td>zależny od lokalnego dostawcy</td><td>Użyj tego, aby zrobić naczynie rozwarstwiające do przypinania mięśni</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Sprzężony</td><td>Invitrogen</td><td>B-13422</td><td></td></tr><tr><td>Albumina z surowicy bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Neurofilament Przeciwciało pierwotne (2H3), Supernatant</td><td>Rozwojowy Studia: Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SV2 Przeciwciało pierwotne (SV2), Badania rozwojowe supernatantu</td><td>Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-166-003</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże do montażu fluorescencyjnego</td><td>Szkiełka Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>(Superfrost Plus; Biały)</td> <td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>CD1/C57Bl6 mysz</td><td>Jackson Labs</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rozwarstwienie mięśnia poprzecznego brzucha w celu analizy całego połączenia nerwowo-mięśniowego

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analiza morfologii połączeń nerwowo-mięśniowych może dostarczyć ważnych informacji na temat stanu fizjologicznego danego neuronu ruchowego. Analiza cienkich, płaskich mięśni może dać znaczną przewagę nad tradycyjnie stosowanymi grubszymi mięśniami, takimi jak te z kończyny tylnej (np. mięsień łydki). Cienkie mięśnie pozwalają na kompleksowy przegląd całego wzorca unerwienia danego mięśnia, co z kolei pozwala na identyfikację selektywnie wrażliwych pul neuronów ruchowych. Mięśnie te umożliwiają również analizę takich parametrów, jak wielkość jednostki motorycznej, rozgałęzienie aksonów i kiełkowanie końcowe/węzłowe. Częstą przeszkodą w używaniu takich mięśni jest zdobycie wiedzy technicznej w celu ich sekcji. W tym filmie szczegółowo opisujemy protokół preparowania mięśnia poprzecznego brzucha (TVA) od młodych myszy i wykonywania immunofluorescencji w celu wizualizacji aksonów i połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ). Pokazujemy, że ta technika daje pełny przegląd wzorca unerwienia mięśnia TVA i może być wykorzystana do zbadania patologii NMJ w mysim modelu dziecięcej choroby neuronu ruchowego, rdzeniowego zaniku mięśni.

Powyższy protokół opisuje izolację i barwienie mięśnia TVA w celu analizy NMJ. Pozwala to na analizę wzorców unerwienia mięśni w preparatach całych oraz wysokorozdzielczą analizę morfologii NMJ (Rysunek 2). Technikę tę można z sukcesem zastosować do ujawnienia patologii NMJ w modelach mysich chorób neuronów ruchowych, takich jak SMA4,17 (Rysunek 3). W mysich modelach SMA występuje znaczna zmienność patologii w obrębie różnych mięśni, jednak mięsień TVA jest konsekwentnie silnie dotknięty zmianami. Świadczą o tym denerwacja płyt końcowych motorycznych, akumulacja neurofilamentów w terminalu presynaptycznym oraz kiełkowanie terminali (Rysunek 3). Przedstawione tutaj wyniki wykazują zatem, że opisana powyżej technika może być skuteczną metodą zapewniającą kompleksowy przegląd unerwienia oraz analizę patologii NMJ w modelach mysich.
<img alt="Schemat anatomiczny ryby, z wyróżnieniem sekcji płetwy wraz z analizą geometryczną do badań strukturalnych." fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przegląd muskulatury brzusznej myszy. (A) Obraz przedstawia klatkę piersiową z przytwierdzoną muskulaturą brzuszną, która została usunięta z niedawno uśpionej myszy i rozpięta w naczyniu sekcyjnym stroną powierzchowną do góry (A). (B) Sekcja na obrazie A została opisana w celu zaznaczenia przybliżonych granic mięśni brzucha. Po lewej stronie sekcji widoczne są powierzchowne mięśnie brzucha, w tym mięsień skośny zewnętrzny (obrysowany na niebiesko) oraz rectus abdominis (mięsień prosty brzucha, obrysowany na czerwono). Po prawej stronie sekcji mięśnie powierzchowne zostały usunięte, co umożliwiło wizualizację mięśnia transversus abdominis (mięśnia poprzecznego brzucha, obrysowanego na zielono) oraz mięśnia skośnego wewnętrznego (obrysowanego na żółto). Celem niniejszego protokołu jest przeprowadzenie sekcji górnej części mięśnia TVA, przedstawionej tutaj jako zielony pełny trójkąt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz</a>.
<img alt="Schemat obrazowania neuronów z barwieniem NF/SV2/BTX; mikroskopia ukazująca strukturę i połączenia neuronów." fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Przegląd całego preparatu złącza nerwowo-mięśniowego w mięśniu TVA. Obrazy przedstawiające przykładowe złącza NMJ z mięśnia TVA wizualizowane za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego na neurofilamenty (NF; zielony), białko pęcherzyków synaptycznych 2 (SV2; zielony) oraz bungarotoksynę (BTX; czerwony). Obrazy stanowią montaż mikrografii fluorescencyjnych ukazujących cały mięsień (A) lub obrazy konfokalne przedstawiające grupy (B) lub pojedyncze (C) złącza NMJ. Pasek skali = 800 µm (A), 70 µm (B), 25 µm (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna neuronów ruchowych w modelu mysim SMA; znakowanie NF/SV2/BTX, kontrola vs mutant." fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 3. Patologia złącza nerwowo-mięśniowego w mięśniu TVA w modelu mysim SMA.Mikrografie konfokalne przedstawiające złącza nerwowo-mięśniowe (NMJ) z mięśnia TVA, wizualizowane za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego na neurofilament (NF; zielony), białko pęcherzyków synaptycznych 2 (SV2; zielony) i bungarotoksynę (BTX; czerwony) u myszy kontrolnych (Smn2B/+) lub w modelu mysim SMA (Smn2B/-). Zauważalnie, podczas gdy u myszy kontrolnych obserwuje się prawidłową morfologię NMJ, w mięśniach TVA myszy Smn2B/- widoczne są dowody pełnej denerwacji (biała grot strzałki), częściowej denerwacji (fioletowa grot strzałki), kiełkowania terminalnego (niebieska grot strzałki) i obrzęku presynaptycznego (żółta grot strzałki). Płyty końcowe postsynaptyczne są również mniej złożone, co odzwierciedla pozornie mniej dojrzały fenotyp. Pasek skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.

W tym filmie demonstrujemy protokół do preparacji mięśnia poprzecznego brzucha myszy i używamy immunofluorescencji i mikroskopii do wizualizacji połączeń nerwowo-mięśniowych.

Rozwarstwienie mięśnia poprzecznego brzucha w celu analizy całego połączenia nerwowo-mięśniowego

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Poprzeczny mięsień ADOS to cienki, płaski mięsień tworzący najgłębszą warstwę muskulatury brzucha. Jest on przytwierdzony do linii środkowej za pomocą linii alpha oraz do głębokiej powierzchni klatki piersiowej. W tym filmie dokonamy preparacji górnej części tego mięśnia i wykorzystamy immunofluorescencję do wizualizacji wzorców innowacji oraz struktury złącza nerwowo-mięśniowego.Do tej sekcji będą potrzebne narzędzia wymienione osobno w załączonym protokole. Po uśpieniu myszy odpowiednią metodą spryskaj ją 70% etanolem, aby zminimalizować rozprzestrzenianie się sierści. Połóż mysz na plecach i wykonaj nacięcie skóry na wysokości biodra.Należy uważać, aby nie przeciąć mięśni brzucha. Kontynuuj to nacięcie dookoła myszy. Po wykonaniu nacięcia odsunie skórę w górę, w stronę głowy myszy.Ponownie, uważając, aby nie przerwać mięśni brzucha, przetnij mięśnie brzuszne i kontynuuj nacięcie, aż dotrzesz do kolumny kręgosłupa. W tym miejscu wykonaj cięcie w górę przez żebra, aż znajdziesz się powyżej mostka, dbając o uwolnienie przepony z klatki piersiowej.Powtórz ten proces po drugiej stronie myszy. W tym momencie przetnij żebra oraz mostek i przenieś żebra wraz z przytwierdzonymi mięśniami do naczynia sekcyjnego powleczonego agarosem. Rozepnij mięsień, używając szpilek do sekcji owadów.Utrwal tkankę w 4% PFA i pozostaw na platformie kołyszącej przez 15 minut. Oto przykład tego, jak powinna wyglądać przypięta mięsień. Po lewej stronie obrazu widoczne są mięśnie powierzchowne, w tym mięsień skośny zewnętrzny zaznaczony na niebiesko oraz mięsień prosty brzucha zaznaczony na czerwono.Warstwa ta została odchylona po prawej stronie obrazu, aby odsłonić mięsień skośny wewnętrzny zaznaczony na żółto oraz mięsień poprzeczny brzucha zaznaczony na zielono. Naszym celem jest wypreparowanie górnej części mięśnia poprzecznego brzucha. W miejscu wskazanym przez pełny zielony trójkąt pod mikroskopem operacyjnym należy przeciąć mięsień skośny zewnętrzny w punkcie, w którym pokrywa on żebra, a następnie rozciąć mięsień skośny zewnętrzny powyżej mięśnia poprzecznego brzucha. Należy przecinać aż do momentu ujrzenia początku mięśnia skośnego wewnętrznego, widocznego tutaj jako styczne włókna mięśniowe po lewej stronie obrazu.Usuń naczynie krwionośne, delikatnie odklejając je od powierzchni mięśnia. Następnie, używając rozdzielania tępego, oddziel mięsień poprzeczny brzucha od nadległego żebra. Przetnij tkanki wokół krawędzi mięśnia, upewniając się, że obejmujesz część znajdującą się pod żebrem.Usuń żebro i przenieś mięsień na płytkę 24-dołkową w celu przeprowadzenia immunofluorescencji. Wszystkie procedury immunofluorescencyjne wykonuj w płytce 24-dołkowej. Użyj pipety z cienką końcówką i postępuj zgodnie z protokołem opisanym w niniejszym manuskrypcie.Należy upewnić się, że zastosowano odczynniki szczegółowo opisane w niniejszym protokole. Po barwieniu immunofluorescencyjnym zamocować mięśnie na szkiełkach przedmiotowych przy użyciu fluorescencyjnego medium montażowego; za pomocą pęsety delikatnie rozprostować mięsień, upewniając się, że jest on płaski przed nałożeniem szkiełka nakrywki. Podczas montażu należy mocno docisnąć mięsień, aby go spłaszczyć. Jak pokazano na tym obrazie, protokół ten może być wykorzystany do barwienia całego preparatu mięśnia brzusznego poprzecznego w celu wizualizacji złącza nerwowo-mięśniowego i wzorców innowacji.Na tym obrazie aksony i zakończenia synaptyczne są przedstawione w kolorze zielonym, znakowane przeciwciałami przeciwko SB two i neurofilamentowi, natomiast płyty motoryczne są pokazane w kolorze czerwonym, znakowane alfa-bungarotoksyną. Seria obrazów Z z mikroskopii konfokalnej może zostać teraz wykorzystana do uzyskania obrazów morfologii złącza neuromuskularnego o wysokiej rozdzielczości. Niniejszy protokół można zastosować do badania patologii złącza neuromuskularnego w modelach mysich.Na przykład te obrazy przedstawiają patologię złącza nerwowo-mięśniowego w modelu mysim zaniku mięśni rdzeniowych. Należy zauważyć, że strzałki białe lub fioletowe wskazują odpowiednio na dowody pełnej lub częściowej denerwacji, strzałki niebieskie na kiełkowanie terminalne, a strzałki żółte na obrzęk presynaptyczny. Taka analiza może dostarczyć istotnych informacji na temat procesów patologicznych w chorobach neuronów ruchowych.

dissection-transversus-abdominis-muscle-for-whole-mount-neuromuscular

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Sekcja mięśnia Transversus Abdominis w celu analizy całopostaciowych złączy nerwowo-mięśniowych

Zastosowanie elektrofizjologii w badaniach dostępnych synaps umożliwia ilościowe pomiary aktywności synaptycznej, co jest przydatne w analizie mutantów synaptycznych. Niniejszy artykuł opisuje metodę dysekcji służącą do odsłonięcia złączy neuromięśniowych (NMJ) u Caenorhabditis elegans (C. elegans) i krótko omawia możliwe zastosowania tak przygotowanego preparatu.

Disekcja i rejestracja z połączenia nerwowo-mięśniowego C. elegans

Złącze neuromięśniowe (NMJ) Drosophila melanogaster stanowi istotny system modelowy do badania prawidłowej funkcji synaptycznej, jak i zaburzeń tej funkcji występujących w niektórych chorobach neurologicznych. Przedstawiamy protokół sekcji układu ruchowego larw Drosophila oraz immunobarwienia białek strefy aktywnej w obrębie NMJ.

Disekcja i obrazowanie stref aktywnych w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila

Wizualizacja pojedynczych komórek w gęsto upakowanych tkankach, takich jak terminalne komórki Schwanna (SCs) w złączach nerwowo-mięśniowych (NMJs), jest trudna. „Sekwencyjne fotoblaknięcie” pozwala na wyodrębnienie pojedynczych terminalnych SCs, na przykład w eksplantacie mięśnia triangularis sterni — wygodnej preparacji nerwowo-mięśniowej, w której sekwencyjne blaknięcie można połączyć z obrazowaniem poklatkowym i post-hoc immunobarwieniem.

Sekwencyjne fotoblaknięcie w celu wyznaczenia pojedynczych komórek Schwanna w złączu neuromięśniowym

Ten film demonstruje protokół oceny integralności strukturalnej połączeń nerwowo-mięśniowych w grzbietowych mięśniach podłużnych Drosophila. Procedura polega na barwieniu neuronów i mięśni dwoma odrębnymi przeciwciałami i porównaniu wzorców fluorescencji między muchami zmutowanymi i dzikimi. Zmniejszenie barwienia neuronów u zmutowanych much wskazuje na neurodegenerację, podczas gdy struktura mięśni pozostaje nienaruszona.

Ocena integralności strukturalnej połączeń nerwowo-mięśniowych mięśni grzbietowych podłużnych u Drosophila

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest zmienione w różnych stanach, które czasami mogą prowadzić do niewydolności synaptycznej. W niniejszym raporcie opisano metody oparte na mikroskopie fluorescencyjnym do ilościowego określania takich zmian strukturalnych.

Połączenie nerwowo-mięśniowe: pomiar wielkości synaps, fragmentacji i zmian gęstości białek synaptycznych za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej

Skuteczność domięśniowego wychwytu i wstecznego transportu cząsteczek do odpowiednich neuronów ruchowych zależy od lokalizacji miejsc wstrzyknięć w stosunku do płytek końcowych silnika (MEP). W tym miejscu opisujemy, jak zlokalizować MEP na mięśniach szkieletowych, aby zoptymalizować wsteczny transport znaczników do neuronów ruchowych.

Iniekcje domięśniowe wzdłuż płytek końcowych silnika: minimalnie inwazyjne podejście do przenoszenia znaczników bezpośrednio do neuronów ruchowych

Ocena funkcjonalna połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) może dostarczyć istotnych informacji na temat komunikacji między mięśniem a nerwem. W tym miejscu opisujemy protokół kompleksowej oceny zarówno NMJ, jak i funkcjonalności mięśni przy użyciu dwóch różnych preparatów mięśniowo-nerwowych, tj. płaszczkowato-kulszowego i przeponowo-przeponowego.

Pomiar funkcjonalności połączenia nerwowo-mięśniowego

Tutaj proponujemy metodę efektywnego pozyskiwania pojedynczych włókien mięśniowych we wczesnych stadiach rozwoju pourodzeniowego z homozygotycznego zmutowanego modelu myszy Lamin Δ8-11, bardzo ciężkiego modelu dystrofii mięśniowej Emery'ego-Dreifussa (EDMD).

Izolacja i hodowla pojedynczych włókien mięśniowych z mysiego modelu dystrofii mięśniowej Embergla-Dreifussa we wczesnym rozwoju poporodowym

Zdolność do dokładnego wykrywania komponentów połączenia nerwowo-mięśniowego jest kluczowa w ocenie zmian w jego architekturze spowodowanych procesami patologicznymi lub rozwojowymi. Poniżej przedstawiamy pełny opis prostej metody uzyskiwania wysokiej jakości obrazów całych połączeń nerwowo-mięśniowych, które można wykorzystać do wykonywania pomiarów ilościowych.

Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości

Protokół pokazuje metodę badania korelacji przestrzennej między zakończeniami presynaptycznymi, receptorami postsynaptycznymi i okołosynaptycznymi komórkami Schwanna w mięśniu brzuchatym łydki szczura przy użyciu immunohistochemii fluorescencyjnej z różnymi biomarkerami, a mianowicie: neurofilamentem 200, pęcherzykowym transporterem acetylocholiny, alfa-bungarotoksyną i S100.

Wizualizacja cech morfologicznych połączenia nerwowo-mięśniowego w mięśniu brzuchatym łydki przyśrodkowym szczura

Ten raport przedstawia nową procedurę przygotowania próbki do wizualizacji połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila. Metoda ta jest bardziej skuteczna w zapobieganiu zwijaniu się próbek w porównaniu z metodą tradycyjną i jest szczególnie przydatna w analizie ultrastrukturalnej połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila.

Optymalizacja procesu przygotowania próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila

Poznaj metodę preparowania mięśnia poprzecznego brzucha u myszy z wykorzystaniem immunofluorescencji do wizualizacji złączy nerwowo-mięśniowych. Technika ta umożliwia badanie patologii nerwowo-mięśniowej w modelach zwierzęcych.

Rozwarstwienie mięśnia poprzecznego brzucha w celu analizy całego połączenia nerwowo-mięśniowego

Przeglądaj więcej filmów