Analiza inicjacji translacji w warunkach stresowych za pomocą profilowania polisomów

Ogólnym celem tej procedury jest zmierzenie wpływu warunków stresowych na translację, inicjację komórek i tkanek ssaków poprzez profilowanie polisomów. Osiąga się to poprzez najpierw leczenie komórek rakowych ssaków lekiem przeciwnowotworowym, a następnie przygotowanie ekstraktów komórkowych. Drugim krokiem jest zrobienie sacharozy, gradientów.

Następnie ekstrakty komórkowe są ładowane na sacharozę, gradienty i ultra odwirowywane w celu oddzielenia frakcji rybosomalnych. Ostatecznie przeprowadza się analizę western blot przy użyciu specyficznych przeciwciał w celu oceny związku badanych białek z polisomem. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącą metodą, taką jak znakowanie metaboliczne, jest to, że pozwala nam ocenić wpływ warunków stresu na etap inicjacji translacji.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie terapii stresu, takie jak to, czy i jak leki przeciwnowotworowe wpływają na inicjację translacji. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię raka, ponieważ pomaga ona odkryć nowe szlaki regulacyjne inicjacji translacji. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat regulacji inicjacji translacji w hodowlach komórkowych, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak izolowane tkanki, w tym mózg i nowotwory.

Aby przygotować automatyczny system frakcjonowania gradientu gęstości, najpierw umyj system rurek aparatu 0,1% SDS przez pięć minut. Następnie myj system rurek 70% etanolem przez pięć minut, a następnie roztworem RNA Zap przez pięć minut. I wreszcie, za pomocą DEPC, wody, osusz system rurek, pompując powietrze do systemu.

Następnie przygotuj 15% i 55% roztwory sacharozy, aby wygenerować liniowy gradient sacharozy od 15 do 55% za pomocą modelu ISCO 160 gradientu. Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, ważne jest, aby dokładnie kontrolować prędkość pompy perystaltycznej tris, aby uniknąć tworzenia pęcherzyków lub turbulencji w gradientach w czasie, gdy program do tworzenia gradientów jest uruchomiony, schłodzić ultrawirówkę do czterech stopni Celsjusza. Utrzymuj gradienty na poziomie czterech stopni Celsjusza do czasu użycia w tym eksperymencie wykorzystuje komórki raka szyjki macicy o niskim pasażu, wcześniej posiane, aby osiągnąć 80% konfluencji.

W dniu eksperymentu. Ważne jest, aby wykonać ekstrakcję ze świeżych komórek i uniknąć zanieczyszczenia RNA podczas tej procedury, 90 minut przed dodaniem leku przeciwnowotworowego należy zastąpić pożywkę komórek świeżą, kompletną pożywką. Aby stymulować translację, włóż komórki z powrotem do inkubatora.

Dodaj lek przeciwnowotworowy bezpośrednio do hodowli komórkowej jako dodatek kontrolny. DMSO inkubować przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla po czterech godzinach, umieścić płytki na lodzie i trzykrotnie umyć komórki zimnymi komórkami do zbioru PBS w jednym mililitrze buforu do lizy, aby uzyskać najlepsze wyniki. Użyj około 12 milionów komórek dla każdego warunku eksperymentalnego.

Przenieś komórki z zeskrobanych płytek do probówki einor i dobrze wymieszaj, przepuszczając je 15 razy przez strzykawkę. Pozwól lizatom komórkowym spoczywać na lodzie przez 15 minut. Następnie umieść kilka kropli lizatu komórkowego na szkiełku i oceń lizę komórkową za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego przy użyciu obiektywu 10x.

Po zweryfikowaniu lizy komórek należy sklarować lizat komórkowy przez odwirowanie w temperaturze 11 000 g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś rozpuszczalny lizat zawierający polirybosomy do nowej probówki i trzymaj ją na lodzie przed załadowaniem ekstraktów cytoplazmatycznych na gradienty sacharozy. Dokładnie zmierz stężenie obecnego RNA za pomocą spektrofotometru i powoli załaduj około 20 OD dwie 60 jednostek ekstraktu na gradient 15 do 55% sacharozy.

Upewnij się, że na powierzchni probówki jest od dwóch do trzech milimetrów wolnej przestrzeni, aby uniknąć przepełnienia probówki podczas wirowania. Załaduj rurki na wirnik. Umieść wirnik na ultrawirówce i odwiruj gradienty w temperaturze 230 000 G w czterech stopniach Celsjusza przez dwie godziny i 30 minut.

Po zakończeniu wirowania wyjmij probówki i ostrożnie umieść je na lodzie, nie naruszając gradientów. Aby rozpocząć frakcjonowanie ekstraktów cytoplazmatycznych, należy umieścić gradienty sacharozy w automatycznym systemie frakcjonowania gęstości i przystąpić do automatycznego frakcjonowania i zbierania frakcji zgodnie z opisem producenta. Zbierz każdą frakcję o wielkości 0,5 mililitra do pojedynczych probówek einor z ciągłym monitorowaniem absorbancji przy 250 nanometrach równolegle z operacją frakcjonowania gradientowego, profil polirybosomalny będzie edytowany na papierze wykresu na końcu każdego przebiegu.

Przenieś rurki końcowe z zebranymi frakcjami na lód. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj dwie objętości 100% zimnego etanolu do każdej zebranej frakcji i pozwól kompleksom białkowym RNA wytrącić się w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez noc. W celu ekstrakcji białek odwirować każdy osad białka RNA w temperaturze 11 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza po umyciu 70% etanolem na sucho i ponownie zawiesić osad.

Bufor próbki strony SDS Przed przystąpieniem do analizy western blot w celu ekstrakcji RNA Resus, zawiesić każdy osad białka RNA w buforze do lizy zawierającym 0,1% SDS, strawić składnik białkowy osadu za pomocą dwóch miligramów na mililitr proteinazy K przez 30 minut. W łaźni wodnej o temperaturze 55% Celsjusza dodaj jedną objętość chloroformu fenolowego, dwie objętości chloroformu i 0,1 objętości dwóch molowych octanów sodu o pH cztery. Odstaw na lód na 15 minut.

Wirować w temperaturze 10 000 GS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Zebrać powstałą fazę wodną z każdej próbki wytrącić RNA, dodając jedną objętość izopropanolu i 0,2 mikrograma na mikrolitr glikogenu i pozostawiając na noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnego dnia wiruj osad w temperaturze 10 000 G w czterech stopniach Celsjusza przez jedną godzinę.

Usunąć supernatant i przemyć osad RNA 70% zimnym etanolem, ponownie zawiesić osad RNA w małej objętości RNA. Darmowa woda. Oceń ilość i jakość RNA za pomocą spektrofotometru.

Pokazano tutaj reprezentatywne profile polisomów z ekstraktów cytoplazmatycznych. Przygotowany z komórek helo wyhodowanych w normalnych warunkach lub po leczeniu inhibitorem proteasomu przez cztery godziny i odwirować do liniowego gradientu sacharozy od 15 do 55% objętości do masy. Pozycje rybosomów 40 s, rybosomów 60 s, rybosomów 80 s, monosów i polisomów są wskazane w każdym profilu.

Frakcje od góry do dołu gradientu są pokazane od lewej do prawej, frakcje zostały zebrane i przeanalizowane za pomocą Western blot z przeciwciałami przeciwko dużemu rybosomalnemu białku L 28, a także białemu FMRP związane z polisomem, które służą jako kontrola integralności polisomów w normalnych warunkach wzrostu. Kompleksy inicjujące translację są przekształcane w polirybosomy, których wykrycie przez profilowanie polisomów świadczy o aktywnej inicjacji translacji, jak zaobserwowano tutaj. Leczenie inhibitorem proteasomu zmniejsza piki polisomów przy jednoczesnym wzroście monosów DS wskazującym na zahamowanie inicjacji translacji Podczas udziału w tej procedurze ważne jest, aby pracować w środowisku wolnym od nanosomów, aby ostrożnie obchodzić się z gradientami i kontrolować lizę komórek Zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak krew zachodnia i krew północna, można wykonać, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak asocjacja określonego białka lub M MNA z polisomem, na który wpływa leczenie przeciwnowotworowe Po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się translacją biologiczną do zbadania wpływu regulacji czynników inicjujących translację na choroby ludzkie, takie jak nowotwory i choroby neurodegeneracyjne.