Name: Analiza inicjacji translacji w warunkach stresowych za pomocą profilowania polisomów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Poznaj metodę profilowania polisomów do analizy inicjacji translacji w komórkach ssaków pod wpływem stresu. Technika ta pozwala ocenić aktywność rybosomów bez konieczności metabolicznego znakowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

P. A. jest stypendystą "Pierre Durand" na Wydziale Lekarskim Uniwersytetu Laval. Prace te były wspierane przez Kanadyjską Radę ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (MOP-CG095386) dla R. M. Frakcjonator polisomów został zakupiony w ramach grantu Kanadyjskiej Fundacji na rzecz Innowacji (MOP-GF091050) dla R. M. R. M posiada nową nagrodę wynagrodzenia badacza CIHR.
Jesteśmy wdzięczni doktorom E. Khandjian, I. Gallouzi, S. Di-Marco i A. Cammasowi za pomocne rady.

Protokół jest zgodny z wytycznymi zatwierdzonymi przez Komisję Oceny Etycznej Laval.
1. Przygotowanie kultur komórkowych i manipulacja mózgiem
<ol>
	<li>Komórki ssaków i Drosophila
	<ol>
		<li>Hoduj komórki raka szyjki macicy HeLa i komórki embrionalne Schneider Drosophila zgodnie z zaleceniami American Type Culture Collection. Pracuj z komórkami przy niskim przejściu.</li>
		<li>Płytki komórkowej w celu osiągnięcia 80% zbieżności w dniu eksperymentu. Aby uzyskać najlepsze wyniki, użyj ∼12 x 106 komórek dla każdego warunku eksperymentalnego. Przed przygotowaniem ekstraktów do analizy polisomów należy stymulować translację, dodając świeżą, kompletną pożywkę przez co najmniej 90 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja mózgu: Odizoluj mózgi myszy w wieku od 9 do 16 dni po urodzeniu. Eutanazja polega na wdychaniu CO2 po znieczuleniu i zwichnięciu szyjki macicy. Po uśmierceniu należy odizolować cały mózg i umieścić go w temperaturze -80 °C lub bezpośrednio przenieść do zimnego PBS 1X w celu natychmiastowego użycia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie systemu frakcjonowania w gradimencie gęstości
<ol>
	<li>Myć system rurek z 0,1% SDS przez 5 minut.</li>
	<li>Umyj system rurek 70% etanolem przez 5 minut, a następnie roztworem RNaseZAP przez 5 minut przed umyciem go wodą DEPC.</li>
	<li>Pompować powietrze w celu wysuszenia systemu przewodów urządzenia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie gradientów sacharozy
<ol>
	<li>Przygotować 15% i 55% roztwory sacharozy w 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 1,25 mM MgCl2, 150 mM NaCl i 1 mM DTT.</li>
	<li>Wygeneruj liniowy gradient sacharozy 15-55% za pomocą formera gradientu Isco Model 160, zgodnie z opisem w instrukcjach producenta. Jednak ważne jest, aby dobrze kontrolować prędkość pompy perystaltycznej TRIS, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków lub turbulencji w gradientach. Utrzymuj gradienty w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
	<li>W czasie, gdy uruchomiony jest program do tworzenia gradientu, schłodzić ultrawirówkę do temperatury 4 °C.</li>
</ol>
4. Przygotowanie ekstraktów z komórek i mózgu myszy
<ol>
	<li>Przygotowanie ekstraktów komórkowych
	<ol>
		<li>Umieść płytkę (płytki) na lodzie i umyj komórki 3x zimnym PBS 1X.</li>
		<li>Zebrać komórki (∼12 x 106) w 1 ml buforu do lizy (20 mM Tris-HCl o pH 7,4, 1,25 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1% Nonidet P40, 5 U/ml inhibitora RNazy, uzupełnionego kompletnymi tabletkami koktajlowymi z inhibitorami proteazy bez EDTA), przenieś je do probówki Eppendorfa i dobrze wymieszaj, przepuszczając je 15 razy przez strzykawkę insulinową 1 ml U100 28 G 1/2. Pozostaw lizat komórkowy na lodzie na 15 minut.</li>
		<li>Umieść kilka kropli lizatu komórkowego na szkiełku, aby ocenić lizę komórkową, obserwując pod mikroskopem kontrastu fazowego przy użyciu obiektywu 10X. Tylko jądra komórkowe powinny być widoczne i żadne błony komórkowe nie powinny być widoczne świadczące o lizie komórek. Jako kontrolę obserwuj niezlizane komórki.</li>
		<li>Klarować lizat komórkowy przez odwirowanie w stężeniu 11 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C i utrzymywać rozpuszczalny lizat zawierający polirybosomy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie ekstraktów z mózgu myszy
	<ol>
		<li>Homogenizować cały izolowany mózg (∼500 mg) przez 10 uderzeń w lodowatym homogenizatorze z 2 ml buforu do lizy i klarować homogenat przez odwirowanie w temperaturze 11 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Załadować otrzymany supernatant na poduszkę z 50% sacharozy i kontynuować sedymentację przez 2 godziny przy 200 000 x g za pomocą wirnika ultrawirówki TH-641 w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zawiesić półprzezroczysty osad zawierający polirybosomy w 1 ml buforu do lizy i dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół. Pozostaw zawieszenie na lodzie przez 30 minut przed załadowaniem na pochyłości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Ładowanie ekstraktów na gradienty sacharozy i ultrawirowanie
<ol>
	<li>Zmierzyć stężenie RNA obecnego w ekstrakcie cytoplazmatycznym za pomocą spektrofotometru. Ostrożnie i powoli załaduj ∼20 OD260 jednostek ekstraktu na gradient sacharozy od 15% do 55%. Upewnij się, że na powierzchni probówki jest 2-3 mm wolnej przestrzeni, aby uniknąć przelania probówek podczas wirowania.</li>
	<li>Odwirować gradienty za pomocą ultrawirówki przez 2 godziny 30 minut przy 230 000 x g przy użyciu wirnika ultrawirówki TH-641 w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu wirowania wyjmij probówki i ostrożnie umieść je na lodzie, aby nie naruszyć gradientów.</li>
</ol>
6. Frakcjonowanie ekstraktów cytoplazmatycznych do profilowania polisomów
<ol>
	<li>Umieścić gradienty sacharozy w automatycznym systemie frakcjonowania gęstości i przystąpić do automatycznego frakcjonowania i zbierania frakcji (po 0,5 ml każdy), zgodnie z opisem producenta.</li>
	<li>Zebrać każdą frakcję (∼500 μl) do pojedynczych probówek Eppendorfa z ciągłym monitorowaniem absorbancji przy 254 nm. Równolegle z operacją frakcjonowania gradientowego, profil polirybosomalny będzie edytowany na papierze wykresu. Alternatywnie można użyć jednostki akwizycji danych dołączonej do rejestratora wykresów, aby uzyskać elektroniczną akwizycję profilu polisomowego.</li>
	<li>Na koniec każdego cyklu przenieś zebrane Eppendorfy na suchy lód. W tym czasie zebrane frakcje należy przechowywać w temperaturze -80 °C lub bezpośrednio wytrącić kompleksy białko-RNA w następujący sposób.</li>
</ol>
7. Ekstrakcja i analiza białek
<ol>
	<li>Do każdej zebranej frakcji gradientu sacharozy dodać 2 objętości 100% zimnego etanolu i pozostawić kompleksy RNA-białko na wytrącenie się w temperaturze -20 °C przez noc.</li>
	<li>Odwirować każdy osad białka RNA w temperaturze 11 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, a następnie przemyć 70% etanolem. Wysuszyć i ponownie zawiesić osad w buforze próbki SDS-PAGE przed przystąpieniem do Western blot przy użyciu specyficznych przeciwciał (patrz rysunek 2).</li>
</ol>
8. Ekstrakcja i analiza RNA
<ol>
	<li>Wytrącić kompleksy RNA-białko, jak w punkcie 7.1. Ponownie zawiesić każdy osad białka RNA w buforze do lizy zawierającym 0,1% SDS. Trawić składnik białkowy osadu za pomocą 2 mg/ml proteinazy K przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C.</li>
	<li>Ekstrahować składniki RNA osadu przez dodanie 1 objętości "fenolu: chloroformu", 2 objętości chloroformu i 0,1 objętości 2 M NaOAc pH 4 i odwirowanie przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 min. Wytrącić RNA z otrzymanej fazy wodnej każdej próbki przez noc w temperaturze -20 °C, dodając 1 objętość izopropanolu i 0,2 μg/μl glikogenu. Wirować osad przez 1 godzinę w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C. Przemyć osad RNA 70% zimnym etanolem.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad RNA w małej objętości wody wolnej od RNAzy. Oceń ilość i jakość RNA za pomocą spektrofotometru.</li>
</ol>

<ol><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Fournier, M. -J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell International. 10 (12), (2010).</li>
<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+of+messenger+RNA+by+Fragile+X+Mental+Retardation+protein+into+cytoplasmic+granules+induces+translation+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression.</a> Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).</li>
<li>Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Boilard, N., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragile+X+Mental+Retardation+protein+determinants+required+for+its+association+with+polyribosomal+mRNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Fragile X Mental Retardation protein determinants required for its association with polyribosomal mRNPs.</a> Human Molecular Genetics. 12 (23), 3087-3096 (2003).</li>
<li>Farny, N. G., Kedersha, N. L., Silver, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Metazoan+stress+granule+assembly+is+mediated+by+P-eIF2alpha-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">a Metazoan stress granule assembly is mediated by P-eIF2alpha-dependent and -independent mechanisms.</a> RNA. 15 (10), New York, N.Y. 1814-1821 (2009).</li>
<li>Gareau, C., Houssin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+fragile+x+mental+retardation+protein+recruitment+and+dynamics+in+Drosophila+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Characterization of fragile x mental retardation protein recruitment and dynamics in Drosophila stress granules.</a> PLoS ONE. 8 (2), (2013).</li>
<li>Brackett, D. M., Qing, F., Amieux, P. S., Sellers, D. L., Horner, P. J., Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMR1+transcript+isoforms%3A+association+with+polyribosomes%3B+regional+and+developmental+expression+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">FMR1 transcript isoforms: association with polyribosomes; regional and developmental expression in mouse brain.</a> PLoS ONE. 8 (3), (2013).</li>
<li>Khandjian, E. W., Huot, M. -E., Tremblay, S., Davidovic, L., Mazroui, R., Bardoni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+evidence+for+the+association+of+fragile+X+mental+retardation+protein+with+brain+polyribosomal+ribonucleoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biochemical evidence for the association of fragile X mental retardation protein with brain polyribosomal ribonucleoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13357-13362 (2004).</li>
<li>Erikson, A., Winblad, B., Wallace, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+gene+expression+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neuropsychopharmacol+Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Translational control of gene expression in the human brain.</a> Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 (3-4), 469-479 (1989).</li>
<li>Stephens, S. B., Nicchitta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+In+vitro+and+tissue+culture+methods+for+analysis+of+translation+initiation+on+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">V In vitro and tissue culture methods for analysis of translation initiation on the endoplasmic reticulum.</a> Methods in Enzymology. 431, 47-60 (2007).</li>
<li>Koritzinsky, M., Wouters, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+regulation+of+messenger+RNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and regulation of messenger RNA translation.</a> Methods in Enzymology. 435, 247-273 (2007).</li>
<li>Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes.</a> Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).</li>
<li>Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+slowdown+mediates+translational+arrest+during+cellular+division%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).</li>
<li>Thomas, J. D., Johannes, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mRNAs+that+continue+to+associate+with+polysomes+during+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Identification of mRNAs that continue to associate with polysomes during hypoxia.</a> RNA. 13, 1116-1131 (2007).</li>
<li>Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., Lü, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+gene+translation+profiles+reveal+tumor+type+and+cancer-specific+components%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components.</a> Cancer Research. 68 (10), 3819-3826 (2008).</li>
<li>Fournier, M. -J., Coudert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+mTORC1-eIF4E+Pathway+alters+Stress+Granules+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the mTORC1-eIF4E Pathway alters Stress Granules Formation.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (11), 2285-2301 (2013).</li>
<li>Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+for+the+survival+motoneuron+protein+as+a+translational+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator.</a> Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).</li>
<li>Béchade, C., Rostaing, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+distribution+of+survival+motor+neuron+%28SMN%29+protein%3A+possible+involvement+in+nucleocytoplasmic+and+dendritic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport.</a> The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).</li>
<li>Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., Côté, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDRD3%2C+a+novel+Tudor+domain-containing+protein%2C+localizes+to+cytoplasmic+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules.</a> Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).</li>
<li>Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+let-7a+miRNA+blocks+protein+production+on+actively+translating+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).</li>
<li>Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+analyse+the+specific+impact+of+rapamycin+on+mRNA-ribosome+association%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Genomics%22%5BJournal%5D)">An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association.</a> BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).</li>
<li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), New York, N.Y. 414-421 (2007).</li>
<li>Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unifying+model+for+mTORC1-mediated+regulation+of+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation.</a> Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
<li>Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+footprints+on+a+transcriptome+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal footprints on a transcriptome landscape.</a> Genome Biology. 10 (4), (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Analiza profilu polisomów na gradientach sacharozy pozwala na pomiar inicjacji translacji poprzez analizę gęstości polisomów wyizolowanych z komórek lub tkanek9,11-14. Technika ta jest najlepszym (jeśli nie jedynym) podejściem do pomiaru inicjacji translacji in vivo. Służy do monitorowania stanu translacji rosnących komórek podczas cyklu komórkowego15 oraz do oceny wpływu różnych rodzajów stresu, w tym infekcji wirusowych, niedotlenienia13,16, promieniowania17 i leków ...

Komórki eukariotyczne nieustannie napotykają szereg szkodliwych warunków fizjologicznego i środowiskowego, które wymagają szybkiej adaptacyjnej odpowiedzi komórkowej. Reakcja komórki na stres obejmuje precyzyjną równowagę między czynnikami działającymi przeciwko przeżyciu i pro-przeżyciu. Zakłócenie tej równowagi może mieć nieodwracalne konsekwencje, prowadząc do rozwoju patologii człowieka, takich jak nowotwory i choroby neurodegeneracyjne. W pierwszym etapie reakcji na stres komórki aktywują szlaki sprzyjające przetrwaniu, które obejmują skoordynowaną kontrolę zmian w ekspresji genów na poziomie translacji mRNA.
translacja mRNA u eukariontów to złożony proces komórkowy, który obejmuje skoordynowane interakcje między czynnikami inicjacji translacji (eIF), specyficznymi białkami wiążącymi RNA (RBD) i cząsteczkami RNA1. Translacja mRNA jest podzielona na trzy odrębne fazy: inicjację, wydłużenie i zakończenie. Chociaż wszystkie trzy fazy podlegają mechanizmom regulacyjnym, mechanizmy kontroli translacyjnej koncentrują się głównie na fazie inicjacji translacji, która w związku z tym stanowi etap ograniczający szybkość syntezy białek2.
Inicjacja translacji to wysoce uporządkowany proces, który rozpoczyna się od utworzenia trójskładnikowego kompleksu eIF2a.GTP.Met-tRNAiMet, a następnie jego wiązania z podjednostką rybosomu 40S, co prowadzi do powstania kompleksu pre-inicjacyjnego. Kolejnym krokiem jest rekrutacja kompleksu preinicjacyjnego do mRNA, co wiąże się z aktywnością czynników inicjujących translację, takich jak eIF4F i eIF3. Utworzony w ten sposób kompleks preinicjacyjny 48S ulega specyficznym zmianom konformacyjnym, które umożliwiają tej maszynerii rozpoczęcie skanowania nieulegającego translacji regionu 5' mRNA, dopóki nie rozpozna kodonu inicjacyjnego AUG. Większość czynników inicjujących translację jest następnie uwalniana, a podjednostki 60S są rekrutowane w celu utworzenia kompleksu rybosomu 80S zdolnego do translacji, w którym to momencie rozpoczyna się synteza białek (ryc. 1). Więcej niż jeden monosom 80S może translować ten sam mRNA na raz, wytwarzając tak zwane polisomy (lub polirybosomy). Gęstość polisomów na mRNA odzwierciedla szybkość inicjacji, elongacji i terminacji, a zatem jest miarą translatowalności określonego transkryptu. Jednak profil polisomowy jest używany głównie do oceny zmian w translacji mRNA na etapie inicjacji. Tutaj użyliśmy inhibitora proteasomu jako inhibitora inicjacji translacji. Leczenie komórek nowotworowych tym lekiem indukuje reakcję stresową charakteryzującą się aktywacją kinazy stresowej o nazwie HRI, która fosforyluje czynnik inicjacji translacji eIF2a3. Fosforylacja eIF2a jest jednym z głównych zdarzeń prowadzących do zahamowania inicjacji translacji w komórkach ssaków4.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Komórki</td></tr><tr><td>raka szyjki macicy HeLa</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego (Manassas, VA; ATCC)</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Schneider Drosophila komórki embrionalne</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego (Manassas, VA; ATCC)</td><td>CRL-1963</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Pożywka hodowlana i suplementy</td></tr><tr><td>Schneidera' s Drosophila Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SO146-500ml</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Technologie życia</td><td>11995-073</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Naukowiec</td><td>Naukowiec SH30396-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Technologie życiowe</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Roztwory sacharozy</td></tr><tr><td>D-sacharoza</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP220-212</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49767</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Fisher Scientist</td><td>B3925</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Bufor do lizy</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Tekniscience</td><td>3624-05</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cyfrowa Umowa</td><td>Telekomunikacyjna Sigma-Aldrich</td><td>D 9779</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nonidet P40 (Igepal CA-630 )</td><td>MJS Biolynx</td><td>19628</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Tekniscience</td><td>4095-02</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy (Rekombinowany inhibitor rybonukleazy RnaseOUT)</td><td>Life technologies</td><td>10777-019</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Antyproteazy (kompletne, mini, wolne od EDTA)Roche</td><td></td> <td>11,836,170,001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Ekstrakcja RNA</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Life technologie</td><td>AM2542</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fenol:chloroform</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP1754I-400</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>Chloroform Fisher Scientist</td><td>C298-500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Technologie Glycogen</td><td>Life</td><td>10814-010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Acros organics</td><td>327270010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Przeciwciała</td></tr><tr><td>przeciwciała anty-FMRP</td><td>Fournier et al., Cancer Cell International, 2010</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

analiza inicjacji translacji w warunkach stresowych za pomocą profilowania polisomów

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precyzyjna kontrola translacji mRNA jest fundamentalna dla homeostazy komórek eukariotycznych, szczególnie w odpowiedzi na stres fizjologiczny i patologiczny. Zmiany w tym programie mogą prowadzić do wzrostu uszkodzonych komórek, co jest cechą charakterystyczną rozwoju raka, lub do przedwczesnej śmierci komórek, jak to ma miejsce w chorobach neurodegeneracyjnych. Wiele z tego, co wiemy na temat molekularnych podstaw kontroli translacyjnej, uzyskano z analizy polisomów przy użyciu systemu frakcjonowania w gradiencie gęstości. Technika ta opiera się na ultrawirowaniu ekstraktów cytoplazmatycznych na liniowym gradiencie sacharozy. Po zakończeniu wirowania system umożliwia frakcjonowanie i kwantyfikację odwirowanych stref odpowiadających różnym populacjom rybosomów translujących, co pozwala uzyskać profil polisomowy. Zmiany w profilu polisomów wskazują na zmiany lub defekty w inicjacji translacji, które występują w odpowiedzi na różne rodzaje stresu. Technika ta pozwala również ocenić rolę określonych białek w inicjacji translacji oraz zmierzyć aktywność translacyjną określonych mRNA. Tutaj opisujemy nasz protokół wykonywania profili polisomów w celu oceny inicjacji translacji komórek i tkanek eukariotycznych w normalnych lub stresujących warunkach wzrostu.

Jak wspomniano wcześniej, profil polizomowy umożliwia analizę zmian w inicjacji translacji w warunkach stresu. Rycina 1 przedstawia uproszczony schemat inicjacji translacji, która, jak opisano wcześniej, jest procesem wieloetapowym obejmującym uporządkowany montaż kompleksów inicjacji translacji. W normalnych warunkach wzrostu kompleksy inicjacji translacji są przekształcane w polirybosomy, których wykrycie w profilu polizomowym świadczy o aktywnej inicjacji translacji (Rycina 2; Untreat...

Tutaj opisujemy metodę analizy zmian w inicjacji translacji mRNA komórek eukariotycznych w odpowiedzi na warunki stresu. Metoda ta opiera się na rozdzielaniu prędkości na gradientach sacharozy rybosomów translujących z rybosomów nietranslujących.

Analiza inicjacji translacji w warunkach stresowych za pomocą profilowania polisomów

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar wpływu warunków stresowych na translację i inicjację w komórkach i tkankach ssaków za pomocą profilowania polisomów. Jest to osiągane poprzez uprzednie potraktowanie komórek nowotworowych ssaków lekiem przeciwnowotworowym, a następnie przygotowanie ekstraktów komórkowych. Drugim krokiem jest sporządzenie gradientów sacharozy.Następnie ekstrakty komórkowe nanosi się na gradienty sacharozy i poddaje ultrawirowaniu w celu oddzielenia frakcji rybosomalnych. Ostatecznie przeprowadza się analizę western blot z użyciem specyficznych przeciwciał, aby ocenić powiązanie badanych białek z polisomami. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak znakowanie metaboliczne, jest to, że pozwala ona ocenić wpływ warunków stresowych na etap inicjacji translacji.Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie terapii stresu, takie jak to, czy i w jaki sposób leki przeciwnowotworowe wpływają na inicjację translacji. Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię nowotworów, ponieważ pomaga ona w ujawnianiu nowych szlaków regulacyjnych inicjacji translacji. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat regulacji inicjacji translacji w hodowlach komórkowych, można ją również zastosować w innych systemach, takich jak izolowane tkanki, w tym mózg i guzy.Aby przygotować zautomatyzowany system frakcjonowania w gradiencie gęstości, najpierw przemyj układ przewodów aparatury 0,1% SDS przez pięć minut. Następnie przemyj układ przewodów 70% etanolem przez pięć minut, a potem roztworem RNA Zap przez pięć minut. Na koniec przemyj układ wodą z DEPC i osusz go, wpompowując do systemu powietrze.Następnie przygotuj 15% i 55% roztwory sacharozy i wytwórz liniowy gradient sacharozy od 15 do 55% przy użyciu urządzenia do tworzenia gradientów ISCO model one 60. Zgodnie z instrukcjami producenta, ważne jest precyzyjne kontrolowanie prędkości perystaltycznej pompy tris, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza lub turbulencji w gradientach podczas działania programu generatora gradientu. Ochłodź ultrawirówkę do 4°C. Przechowuj gradienty w temperaturze 4°C do momentu użycia. W eksperymencie wykorzystano komórki HeLa raka szyjki macicy o niskim pasażu, wcześniej wysiane do osiągnięcia 80% konfluencji.W dniu eksperymentu. Ważne jest, aby przeprowadzić ekstrakcje ze świeżych komórek oraz uniknąć kontaminacji RNA podczas tej procedury; na 90 minut przed dodaniem leku przeciwnowotworowego należy wymienić medium komórkowe na świeże, kompletne medium. Aby stymulować translację, należy ponownie umieścić komórki w inkubatorze.Dodaj lek przeciwnowotworowy bezpośrednio do hodowli komórkowej jako kontrolę dodatnią. Inkubuj w DMSO przez cztery godziny w temperaturze 37°C i 5% CO2. Po czterech godzinach umieść płytki na lodzie i przemyj komórki trzykrotnie zimnym PBS. Zbierz komórki w 1 mL buforu do lizy, aby uzyskać najlepsze wyniki. Do każdego warunku eksperymentalnego wykorzystaj około 12 milionów komórek.Przenieś komórki z zeskrobanych płytek do probówki typu Eppendorf i wymieszaj dokładnie, przepuszczając je 15 razy przez strzykawkę. Pozostaw lizaty komórkowe w lodzie na 15 minut. Następnie nanieś kilka kropel lizatu komórkowego na szkiełko i oceń stopień lizy komórek za pomocą mikroskopii fazokontrastowej z użyciem obiektywu 10 x.Po potwierdzeniu lizy komórek, oczyść lizat komórkowy poprzez wirowanie przy 11 000 Gs przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś rozpuszczalny lizat zawierający polirybosomy do nowej probówki i przechowuj go w lodzie przed nałożeniem ekstraktów cytoplazmatycznych na gradienty sacharozy. Zmierz stężenie obecnego RNA za pomocą spektrofotometru, a następnie ostrożnie i powoli nałóż około 20 OD dwóch 60 jednostek ekstraktu na gradient sacharozy 15 do 55%.Należy upewnić się, że na powierzchni probówki pozostało od dwóch do trzech milimetrów wolnej przestrzeni, aby zapobiec przelaniu zawartości podczas wirowania. Umieść probówki w wirniku. Umieść wirnik w ultrawirowarce i wiruj gradienty z przyspieszeniem 230 000 Gs w temperaturze czterech stopni Celsius za dwa godziny i 30 minut.Po zakończeniu wirowania ostrożnie wyjmij probówki i umieść je w lodzie, uważając, aby nie zakłócić gradientów. Aby rozpocząć frakcjonowanie ekstraktów cytoplazmatycznych, umieść gradienty sacharozowe w zautomatyzowanym systemie frakcjonowania gęstościowego i przeprowadź automatyczne frakcjonowanie oraz zbieranie frakcji zgodnie z instrukcjami producenta. Zbieraj każdą frakcję o objętości 0,5 ml do oddzielnych probówek typu einor, prowadząc równolegle do operacji frakcjonowania gradientu ciągły monitoring absorbancji przy 250 nm; profil polirybosomalny będzie rejestrowany na papierze milimetrowym po zakończeniu każdego cyklu.Przenieś probówki z zebranymi frakcjami na lód. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj dwie objętości 100% zimnego etanolu do każdej zebranej frakcji i pozostaw kompleksy RNA-białko do wytrącenia w temperaturze -20 °C przez noc. W celu ekstrakcji białek, każdą próbkę osadu RNA-białko odwiruj przy 11 000 Gs przez 20 minut w temperaturze 4 °C, a następnie po przemyciu 70% etanolem wysusz osad na powietrzu i resuspenduj go.Bufor do próbek w żelu SDS-PAGE Przed przystąpieniem do analizy western blot w celu ekstrakcji RNA Resus, zawiesić każdy osad białkowo-RNA w buforze lizującym zawierającym 0,1% SDS, a następnie trawić komponent białkowy osadu proteinazą K w stężeniu 2 mg/mL przez 30 minut. W łaźni wodnej o temperaturze 55 °C dodać jedną objętość fenolo-chloroformu, dwie objętości chloroformu oraz 0,1 objętości 2 M octanu sodu o pH 4. Pozostawić na lodzie na 15 minut.Wiruj przy 10 000 g w temperaturze 4°C przez 20 minut. Zbierz powstałą fazę wodną każdej próbki i wytrąć RNA, dodając jedną objętość izopropanolu oraz 0,2 µg/µL glikogenu, a następnie pozostaw w temperaturze -20°C przez noc. Następnego dnia odwiruj osad przy 10 000 g w temperaturze 4°C przez jedną godzinę.Usunąć nadsącz i przemyć osad RNA 70% zimnym etanolem, a następnie zawiesić osad RNA w niewielkiej objętości wolnej wody do RNA. Ocenić ilość i jakość RNA za pomocą spektrofotometru.Przedstawiono tutaj reprezentatywne profile polisomów z ekstraktów cytoplazmatycznych. Przygotowano je z komórek HeLa hodowanych w warunkach normalnych lub po czterogodzinnym traktowaniu inhibitorem proteasomów, a następnie poddano wirowaniu w liniowym gradiencie sacharozy o stężeniu od 15 do 55% masy w objętości. Pozycje rybosomów 40 S, rybosomów 60 S, monosomów 80 S oraz polisomów są zaznaczone na każdym profilu.Frakcje od góry do dołu gradientu przedstawiono od lewej do prawej; frakcje zostały zebrane i przeanalizowane metodą Western blot z użyciem przeciwciał przeciwko dużemu białku rybosomalnemu L 28, a także przeciwko białku FMRP powiązanemu z polisomami, które służą jako kontrole integralności polisomów w normalnych warunkach wzrostu. Kompleksy inicjacji translacji są przekształcane w polirybosomy, których wykrycie za pomocą profilowania polisomów świadczy o aktywnej inicjacji translacji, co zaobserwowano w tym przypadku. Leczenie inhibitorem proteasomu zmniejsza piki polisomów przy jednoczesnym wzroście monosomów, co wskazuje na inhibicję inicjacji translacji. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pracować w środowisku wolnym od RNaz, ostrożnie obchodzić się z gradientami oraz kontrolować lizę komórek po zakończeniu tej procedury.W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, czy asocjacja specyficznego białka lub mRNA z polisomami jest wpływana przez leczenie przeciwnowotworowe, można przeprowadzić inne metody, takie jak western blot i northern blot. Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie translacji do zbadania wpływu regulacji czynników inicjacji translacji w chorobach ludzkich, takich jak nowotwory i choroby neurodegeneracyjne.

analysis-translation-initiation-during-stress-conditions-polysome

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza inicjacji translacji w warunkach stresu poprzez profilowanie polisomów

Niniejszy artykuł opisuje protokół ekstrakcji rybosomów translacyjnych z komórek eukariotycznych. Po ekstrakcji rybosomy są rozdzielane na monosomy i polirybosomy za pomocą frakcjonowania w gradiencie sacharozy, co pozwala na analizę różnych populacji rybosomalnych. W związku z tym metoda ta stanowi złoty standard w badaniu regulacji translacji.

Analiza profilu polirybosomów eukariotycznych

Rybosomy odgrywają kluczową rolę w syntezie białek. Frakcjonowanie polirybosomów (polisomów) za pomocą wirowania w gradiencie gęstości sacharozy umożliwia bezpośrednie określenie wydajności translacji poszczególnych mRNA w skali całego genomu. Ponadto metoda ta może być stosowana do analizy biochemicznej czynników związanych z rybosomami i polisomami, takich jak białka opiekuńcze i cząsteczki sygnałowe.

Frakcjonowanie polisomów i analiza translatomiów ssaków w skali całego genomu

Zdolność komórek do adaptacji do stresu jest kluczowa dla ich przetrwania. Regulacja translacji mRNA jest jedną z takich strategii adaptacyjnych, zapewniającą szybką regulację proteomu. W tym miejscu zapewniamy ustandaryzowany protokół profilowania polisomów w celu identyfikacji określonych mRNA, które ulegają selektywnej translacji w warunkach stresu.

Ocena selektywnej translacji mRNA w komórkach ssaków za pomocą profilowania polisomów

Ten protokół opisuje prostą metodę ekstrakcji i frakcjonowania transkryptów z tkanek roślinnych na podstawie liczby związanych rybosomów. Pozwala na globalne oszacowanie aktywności translacyjnej i określenie statusu translacyjnego określonych mRNA.

Łatwa metoda profilowania polisomów roślin

Regulacja translacyjna odgrywa ważną rolę w kontroli obfitości białek. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową metodę ilościowej analizy translacji w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae.

Kwantyfikacja translacji w całym genomie u pączkujących drożdży za pomocą profilowania rybosomów

Toeprinting ma na celu zmierzenie zdolności transkrybowanego RNA in vitro do tworzenia kompleksów inicjujących translację z rybosomami w różnych warunkach. Protokół ten opisuje metodę odciskania palca RNA ssaków i może być stosowany do badania translacji zarówno zależnej od czapeczki, jak i sterowanej przez IRES.

Analiza odcisków palców u nóg tworzenia kompleksu inicjacji translacji na mRNA ssaków

Ogólnym celem techniki profilowania polisomów jest analiza aktywności translacyjnej poszczególnych mRNA lub transkryptomu mRNA podczas syntezy białek. Metoda ta jest ważna dla badań nad regulacją syntezy białek, aktywacją i represją translacji w zdrowiu i wielu chorobach człowieka.

Profilowanie polisomów w Leishmania, komórkach ludzkich i jądrach myszy

Rozwój mózgu ssaków wymaga właściwej kontroli ekspresji genów na poziomie translacji. W tym miejscu opisujemy system profilowania polisomów z łatwą do złożenia platformą do tworzenia gradientu sacharozy i frakcjonowania w celu oceny stanu translacji mRNA w rozwijającym się mózgu.

Analiza translacji w rozwijającym się mózgu myszy przy użyciu profilowania polisomów

Prezentujemy technikę szybkiej stabilizacji kompleksów translacyjnych (biosyntezy białek) za pomocą sieciowania formaldehydem w żywych komórkach drożdży i ssaków. Podejście to umożliwia analizę przejściowych produktów pośrednich i dynamicznych interakcji RNA-białko. Usieciowane kompleksy mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak metody profilowania oparte na głębokim sekwencjonowaniu, mikroskopia i spektrometria mas.

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

Ten protokół opisuje, jak wygenerować profil polisomowy bez użycia automatycznych kreatorów gradientów lub systemów frakcjonowania gradientów.

Profilowanie polisomów bez kreatorów gradientów i systemów frakcjonowania

Przedstawiony tutaj protokół obejmuje profilowanie polisomalne w celu wyizolowania translatomów, mRNA związanych z rybosomami, do niepolisomalnych i polisomalnych RNA z Arabidopsis poprzez wirowanie w gradicynacji gęstości sacharozy. Metoda ta demonstruje wydajność translacji Arabidopsis poddanego stresowi cieplnemu.

Test wydajności translacji przy użyciu profili polisomowych pod wpływem stresu cieplnego

Poznaj metodę profilowania polisomów do analizy inicjacji translacji w komórkach ssaków pod wpływem stresu. Technika ta pozwala ocenić aktywność rybosomów bez konieczności metabolicznego znakowania.

Analiza inicjacji translacji w warunkach stresowych za pomocą profilowania polisomów

Przeglądaj więcej filmów