Zmniejszone stężenie itrakonazolu i czas jego trwania są skuteczne w leczeniu zakażenia Batrachochytrium dendrobatidis u

Ogólnym celem niniejszej procedury jest leczenie płazów zainfekowanych grzybem *Batrachochytrium dendrobatidis* (BD) za pomocą chemioterapii przeciwgrzybiczej z zastosowaniem triazolu. Cel ten osiąga się poprzez uprawę kultur BD i inokulację zwierząt patogenem grzybiczym. Drugim krokiem jest przebadanie zwierząt za pomocą ekstrakcji DNA i qPCR z wymazów ze skóry w celu potwierdzenia infekcji BD.

Następnie zainfekowane zwierzęta poddaje się leczeniu poprzez kąpiele w 0,0025% roztworze ekonazolu przez pięć minut dziennie przez sześć dni. Ostatnim krokiem jest monitorowanie stanu infekcji u leczonych zwierząt poprzez przeprowadzenie analizy QPCR wymazów ze skóry przez minimum cztery tygodnie po zakończeniu leczenia w celu potwierdzenia skuteczności terapii. Procedura ta wykazuje, że zmniejszone stężenie i krótszy czas leczenia przeciwgrzybiczym itrakonazolem są efektywne w leczeniu zwierząt zainfekowanych bd. Główną zaletą stosowania tego schematu leczenia w porównaniu z zalecaną dawką, którą jest 0,01% roztwór itrakonazolu przez 11 dni, jest fakt, że zmniejszone stężenie wynoszące jedną czwartą dawki zalecanej oraz skrócenie czasu leczenia do sześciu dni pozostają skuteczne w zwalczaniu infekcji BD, a jednocześnie minimalizują negatywne skutki uboczne związane ze stosowaniem zalecanej dawki terapeutycznej.

Po inkubacji BD w bulionie z Tritonem, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, oraz sprawdzeniu ruchliwości zarodników Zo, zalej każdą płytkę pięcioma mililitrami odstanej wody kranowej i odczekaj 10 minut, aby zarodniki ZO wniknęły do podłoża. Następnie przelej zawiesinę zarodników Zo do przenośnego pojemnika. Oszacuj stężenie zarodników ZO za pomocą hemocytometru i rozcieńcz mieszaninę odstaną wodą kranową do stężenia 1×10⁶ na 3 ml w celu inokulacji zwierzęcia, takiego jak przedstawiona tutaj Latoria vei Alpina.

Przyłóż zwierzę nad pojemnikiem o pojemności 50 ml i wlej 3 ml mieszaniny inokulum na jego brzuch. Następnie umieść zwierzę w pojemniku wraz ze spłyniętym inokulum. Zamknij pojemnik pokrywką i pozostaw zwierzę w nim na 24 godziny, aby zapewnić infekcję.

Aby zapobiec kontaminacji patogenem BD, należy zdjąć stare rękawiczki i odłożyć je do autoklawowania przed utylizacją. Po założeniu nowej pary rękawiczek można przystąpić do inokulacji kolejnego zwierzęcia.

Po 24 godzinach od inokulacji należy przenieść zwierzęta z powrotem do ich indywidualnych, zdezynfekowanych terrariów na dwa tygodnie. Należy pamiętać o dezynfekcji wszystkich płynnych odpadów przed utylizacją poprzez doprowadzenie roztworu do stężenia 10% wybielacza po upływie dwóch tygodni. W celu potwierdzenia udanej infekcji BD należy pobrać wymazy od zwierząt za pomocą sterylnego patyczka bawełnianego.

Delikatnie obracaj wymaz podczas i pomiędzy pociągnięciami. Wymaż pięć razy brzuch z każdej strony, każde udo oraz każdą z czterech kończyn, co daje łącznie 45 pociągnięć. Przechowuj wymazy w mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml w temperaturze -20 °C.

Wyizoluj genomowy DNA z wymazów, korzystając z dostępnego komercyjnie zestawu do izolacji DNA, a następnie przeprowadź qPCR zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przygotuj trzy kąpiele terapeutyczne, po jednej dla każdej z trzech dawek itrakonazolu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie umieść poszczególne płazy w zdezynfekowanych.

Pojemniki w formie puszek o pojemności 50 mililitrów zawierające 35 mililitrów roztworu do zabiegu. Pamiętając o zmianie rękawiczek pomiędzy zwierzętami, należy sporadycznie i delikatnie obracać pojemnikiem, aby upewnić się, że zwierzęta są całkowicie pokryte roztworem przez pięć minut. Po pięciu minutach należy przenieść zwierzęta z powrotem do zdezynfekowanego obszaru.

Powtarzać pięciominutową terapię codziennie przez kolejne pięć dni. Ponownie przetestować zwierzęta w kierunku zakażenia BD tydzień po zakończeniu leczenia, a następnie raz w tygodniu przez cztery tygodnie, aby upewnić się, że zakażenie ustąpiło. Należy pamiętać, że nawet po zakończeniu leczenia zwierzęta muszą być traktowane tak, jakby nadal stanowiły ryzyko kontaminacji.

Zwierzęta muszą być utrzymywane w oddzielnej strefie przez co najmniej miesiąc po zakażeniu. Jeśli leczenie okaże się nieskuteczne, należy je powtórzyć. Różne gatunki i różne stadia rozwojowe reagują odmiennie na zakażenie oraz schematy leczenia, dlatego przed szerokim wdrożeniem metoda leczenia musi zostać poddana próbom.

Ponieważ BD stanowi zagrożenie biologiczne, należy cotygodniowo dezynfekować poszczególne terraria, kąpielowo myjąc terrarium oraz pojemniki do zabiegów w 10% roztworze wybielacza. Moczyć przez co najmniej 30 sekund, wypłukać wybielacz dwukrotnie wodą i pozostawić pojemniki do wyschnięcia na 24 godziny przed ponownym użyciem w celu przeżycia żab. Przedstawiono tutaj przebieg po 11 dniach leczenia BD lub po sześciu dniach leczenia BD.

Czarne strzałki wskazują ostatni dzień leczenia. Linie ciągłe oznaczają przeżywalność grup kontrolnych. Czarne linie ciągłe dotyczą zwierząt, które były dodatnie pod kątem BD, ale nie otrzymały leczenia BD.

Pełne szare linie reprezentują zwierzęta, które były ujemne w kierunku BD i nie otrzymały leczenia BD. Linie przerywane przedstawiają przeżywalność grup leczonych wskazanym stężeniem ekonazolu. Wszystkie zwierzęta traktowane 0,0025% w nebulizatorze przez sześć dni były ujemne w kierunku BD cztery tygodnie po zakończeniu leczenia, w związku z czym terapię tę uznano za skuteczną.

Dodatkowo, przy tym dawkowaniu ekonazolu nie odnotowano istotnych różnic w śmiertelności w porównaniu z grupami kontrolnymi z dodatkiem BD. Należy zauważyć, że zastosowanie ekonazolu w stężeniu 0,01% i 0,005% przez 11 dni doprowadziło do istotnego wzrostu śmiertelności w porównaniu z kontrolami pozytywnymi BD. Należy pamiętać, że patogen grzybowy BD stanowi zagrożenie biologiczne, co wymaga zachowania środków ostrożności, takich jak noszenie i regularna zmiana rękawic, autoklawowanie wszystkich odpadów stałych oraz dezynfekcja.

Wszystkie odpady ciekłe muszą zostać zutylizowane zgodnie z procedurą podczas wykonywania niniejszego protokołu.