Name: Zmniejszone stężenie itrakonazolu i czas jego trwania są skuteczne w leczeniu zakażenia Batrachochytrium dendrobatidis u (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-14T18:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną metodę leczenia zakażenia Batrachochytrium dendrobatidis u płazów za pomocą itrakonazolu w obniżonym stężeniu. Skrócony czas kuracji skutecznie eliminuje grzyba przy minimalizacji działań niepożądanych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chciałbym podziękować C.L. Richards-Zawacki za pomoc w konceptualizacji projektu eksperymentalnego i pomoc w materiałach, A. Pessier za pomoc w ustaleniu schematu leczenia i analiz sekcji zwłok, M.W.H. Chatfield, M.J. Robak, K. Tasker i D. Lenger za pomoc w laboratorium i wsparcie oraz M. McFadden i P. Harlow z Taronga Zoo za wykorzystanie ich przestrzeni podczas kręcenia. Projekt został częściowo sfinansowany przez Departament Dzikiej Przyrody i Rybołówstwa Luizjany w ramach grantu Komisji Edukacji Ekologicznej Luizjany przyznanego L.A. Brannelly i Life Technologies.

Zatwierdzenie etyki: To badanie i jego metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Tulane (protokół nr 0407).
1. Testy na infekcję Bd
<ol>
	<li>Wymaz na Bd
	<ol>
		<li>Wymaz ze zwierząt sterylnym wacikiem pięć razy na brzuchu, pięć razy na każdym udzie, z każdej strony i każdej kończyny, co daje w sumie 45 pociągnięć. Wymaz jest nieinwazyjną metodą pobierania próbek na obecność Bd na skórze.</li>
		<li>Delikatnie obracaj wacik podczas i między pociągnięciami, aby upewnić się, że na waciku zebrała się jak największa ilość DNA.</li>
		<li>Waciki należy przechowywać w mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja DNA i test qPCR
	<ol>
		<li>Wyodrębnić genomowe DNA z wymazów za pomocą dostępnego w handlu zestawu do izolacji DNA, zgodnie z instrukcją dla tkanki zwierzęcej.</li>
		<li>Przeanalizuj wyekstrahowane DNA za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) zgodnie z Boyle i wsp. 17, z następującymi modyfikacjami:</li>
		<li>Rozcieńczyć próbki do ekstrakcji DNA w stosunku 1:10 podwójnie dejonizowaną wodą.</li>
		<li>Dodać 0,7 μl albuminy surowicy bydlęcej (BSA), aby zapobiec zahamowaniu PCR.</li>
		<li>Uwzględnij wewnętrzną kontrolę pozytywną w każdej próbce, aby upewnić się, że hamowanie PCR nie wpływa na wyniki.</li>
		<li>Przeprowadzić próbki z kontrolą dodatnią i ujemną oraz szeregiem wzorców rozcieńczenia, aby oszacować obciążenie zoosporami (infekcją).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Inokulacja
<ol>
	<li>Kultura Bd
	<ol>
		<li>Przygotować bulion tryptonowy, dodając 10 g tryptonu do 1 litra wody z odwróconej osmozy lub wody dejonizowanej, sterylizować w autoklawie (121 °C przez 40 min) i pozostawić do ostygnięcia. Po schłodzeniu do temperatury 23 °C dodać 1 ml penicyliny-streptomycyny.</li>
		<li>Hoduj szczep Bd (JEL411 od J. Longcore, wyizolowany z Guabal, Panama z lemura Phyllomedusa) w bulionie tryptonowym przez siedem dni w temperaturze 23 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś kulturę bulionu na płytki tryptonowe i agarowe.
	<ol>
		<li>Aby przygotować płytki, dodaj 10 g tryptonu i 10 g agaru do 1 l odwróconej osmozy lub wody dejonizowanej i autoklawu (121 °C przez 40 min).</li>
		<li>Gdy autoklawizowana mieszanina ostygnie na tyle, aby można ją było dotknąć, ale zanim zastygnie, wlej do szalek Petriego, pełnych w 1/4-1/3, w okapie z przepływem laminarnym.</li>
		<li>Gdy agar całkowicie zastygnie i ostygnie, dodaj 0,5 ml bulionu Bd do każdej płytki i równomiernie rozprowadź na płytce. Pozostawić do wyschnięcia.</li>
		<li>Po zaszczepieniu płytek zoosporami Bd, uszczelnij płytki Parafilmem.</li>
		<li>Pozostawić płytki do inkubacji w temperaturze 23 °C przez pięć do siedmiu dni. Sprawdź ruch zoospor, aby zapewnić żywotność przed inokulacją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Płytki zalewowe do roztworu do inokulacji zoospor
	<ol>
		<li>Po pięciu do siedmiu dniach inkubacji i wzrostu Bd, zalej każdą płytkę 5 ml dojrzałej wody z kranu i pozwól zoosporom dostać się do pożywki na 10 minut.</li>
		<li>Wlej zawiesinę zoospor do przenośnego pojemnika.</li>
		<li>Oszacuj stężenie zoospor za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Rozcieńczyć mieszaninę do stężenia 1 x 10,6 na 3 ml starzoną wodą z kranu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szczepienie zwierząt
	<ol>
		<li>W oddzielnych pojemnikach o pojemności 50 ml zaszczepić każde zwierzę, wylewając 3 ml mieszaniny inokulum na jego brzuszek. Pozwolić, aby dodatkowy inokulum spłynął na dno pojemnika do zaszczepiania.</li>
		<li>Każde zwierzę pozostanie w pojemniku do szczepienia przez 24 godziny, aby zapewnić zakażenie.</li>
		<li>Po 24 godzinach od zaszczepienia zwierzęta należy zwrócić do indywidualnie zdezynfekowanych terrariów.</li>
		<li>Pozwól, aby infekcja rozwijała się przez dwa tygodnie. Potwierdź zakażenie za pomocą wymazu i wyników qPCR i rozpocznij leczenie.</li>
		<li>W przypadku kontroli ujemnych Bd, należy zalać płytki agarowe wolne od Bd 5 ml dojrzałej wody z kranu i pozorować zaszczepić zwierzęta tymi samymi metodami, co powyżej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Schemat leczenia
<ol>
	<li>Przygotuj kąpiel zabiegową
	<ol>
		<li>Dodać 2,50 ml wodnego itrakonazolu (1% roztwór doustny Straranox) do 1 l roztworu Ringera dla (0,0025% itrakonazolu - najniższe skuteczne stężenie stosowane w zabiegu).
		<ol>
			<li>Przepis na roztwór Ringera: 1 l odwróconej osmozy lub wody dejonizowanej, 6,6 g chlorku sodu, 0,15 g chlorku potasu, 0,15 g chlorku wapnia i 0,2 g wodorowęglanu sodu. Roztwór w autoklawie (121 °C przez 40 min) i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej.</li>
			<li>Aby uzyskać stężenie 0,01% itrakonazolu, dodaj 10,00 ml wodnego roztworu itrakonazolu (1% roztwór doustny Straranox) do 1 l roztworu Ringera dla</li>
			<li>Aby uzyskać stężenie 0,005% itrakonazolu, dodaj 5,00 ml wodnego roztworu itrakonazolu (1% roztwór doustny Straranox) do 1 l roztworu Ringera dla.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku kontroli Bd-dodatnich i Bd-ujemnych należy kąpać zwierzęta w roztworze Ringera dla bez itrakonazolu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>leczenie
	<ol>
		<li>Umieścić poszczególne w zdezynfekowanych pojemnikach o pojemności 50 ml z 35 ml roztworu leczniczego.</li>
		<li>Upewnij się, że zwierzęta są całkowicie przykryte przez pięć minut, delikatnie obracając pojemnik.</li>
		<li>Wróć zwierzęta do zdezynfekowanych terrariów. Powtarzaj przez sześć dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zadbaj o powodzenie leczenia
	<ol>
		<li>Zwierzęta doświadczalne w kierunku zakażenia Bd w dniu rozpoczęcia leczenia.</li>
		<li>Zwierzęta przeprowadza się testy na obecność zakażenia Bd tydzień po zakończeniu leczenia i raz w tygodniu przez cztery tygodnie, aby upewnić się, że infekcja ustąpiła.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Bd jako zagrożenie biologiczne
<ol>
	<li>Dezynfekuj poszczególne terraria co tydzień.
	<ol>
		<li>Wykąp terraria i pojemniki zabiegowe w kąpieli z 10% roztworem wybielacza.</li>
		<li>Wypłucz każdy wybielony pojemnik dwukrotnie pod bieżącą wodą.</li>
		<li>Pozostaw pojemniki do wyschnięcia na 24 godziny przed ponownym użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podczas pracy ze zwierzętami należy nosić czyste rękawice nitrylowe, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu patogenem Bd. Zmieniaj rękawiczki między obchodzeniem się z każdym zwierzęciem.</li>
	<li>Zdezynfekuj wszystkie odpady płynne przed usunięciem, doprowadzając roztwór do 10% wybielacza.</li>
	<li>Przed usunięciem należy sterylizować w autoklawie wszystkie odpady stałe, które są potencjalnie narażone na Bd.</li>
</ol>

<ol><li>Stuart, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Status+and+trends+of+amphibian+declines+and+extinctions+worldwide%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide.</a> Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).</li>
<li>Skerratt, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spread+of+chytridiomycosis+has+caused+the+rapid+global+decline+and+extinction+of+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22EcoHealth%22%5BJournal%5D)">Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs.</a> EcoHealth. 4, 125-134 (2007).</li>
<li>Wake, D. B., Vredenburg, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colloquium+paper%3A+are+we+in+the+midst+of+the+sixth+mass+extinction%3F+A+view+from+the+world+of+amphibians%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Colloquium paper: are we in the midst of the sixth mass extinction? A view from the world of amphibians.</a> PNAS. 105, 11466-11473 (2008).</li>
<li>Voyles, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrolyte+depletion+and+osmotic+imbalance+in+amphibians+with+chytridiomycosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Aquat.+Org%22%5BJournal%5D)">Electrolyte depletion and osmotic imbalance in amphibians with chytridiomycosis.</a> Dis. Aquat. Org. 77 (2), 113-118 (2007).</li>
<li>Ramsey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphibian+immune+defenses+against+Batrachochytrium+dendrobatidis%3A+A+war+between+host+and+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Amphibian immune defenses against Batrachochytrium dendrobatidis: A war between host and pathogen.</a> , (2011).</li>
<li>McMahon, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chytrid+fungus+Batrachochytrium+dendrobatidis+has+nonamphibian+hosts+and+releases+chemicals+that+cause+pathology+in+the+absence+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis has nonamphibian hosts and releases chemicals that cause pathology in the absence of infection.</a> PNAS. 110 (1), 210-215 (2013).</li>
<li>Berger, L., Speare, R., Pessier, A., Voyles, J., Skerratt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+chytridiomycosis+requires+urgent+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Aquat.+Org%22%5BJournal%5D)">Treatment of chytridiomycosis requires urgent clinical trials.</a> Dis. Aquat. Org. 92, 165-174 (2010).</li>
<li>Chatfield, M. W. H., Richards-Zawacki, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+temperature+as+a+treatment+for+Batrachochytrium+dendrobatidis+infection+in+captive+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Aquat.+Org%22%5BJournal%5D)">Elevated temperature as a treatment for Batrachochytrium dendrobatidis infection in captive frogs.</a> Dis. Aquat. Org. 94 (3), 235-238 (2011).</li>
<li>Karbowski, M., et al. Free radical-induced megamitochondria formation and apoptosis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKarbowski%2C+M+%22Free+Rad.+Biol.+Med%22">Free Rad. Biol. Med</a>. 26 (98), 396-409 (1999).</li>
<li>Bishop, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+the+amphibian+chytrid+fungus+Batrachochytrium+dendrobatidis+by+Archey%27s+frog+Leiopelma+archeyi%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Aquat.+Org%22%5BJournal%5D)">Elimination of the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis by Archey's frog Leiopelma archeyi.</a> Dis. Aquat. Org. 84 (1), 9-15 (2009).</li>
<li>Pessier, A. P., Mendelson, J. A Manual For Control of Infectious Diseases in Amphibian Survival Assurance Colonies and Reintroduction Programs. , IUCN/SSC Conservation Breeding Specialist Group. Apple Valley, MN. (2009).</li>
<li>Page, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloramphenicol+1.+Hazards+of+use+and+the+current+regulatory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Aus.+Vet.+J%22%5BJournal%5D)">Chloramphenicol 1. Hazards of use and the current regulatory environment.</a> Aus. Vet. J. 68 (1), 1-2 (1991).</li>
<li>Yoon, H. -J., Seo, M. H., Kim, J. -K. Pharmaceutical formulations for itraconazole. , (2005).</li>
<li>Garner, T. W. J., Garcia, G., Carroll, B., Fisher, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+itraconazole+to+clean+Batrachochytrium+dendrobatidis+infection%2C+and+subsequent+depigmentation+of+Alytes+muletensis+tadpoles%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Aquat.+Org%22%5BJournal%5D)">Using itraconazole to clean Batrachochytrium dendrobatidis infection, and subsequent depigmentation of Alytes muletensis tadpoles.</a> Dis. Aquat. Org. 83, 257-260 (2009).</li>
<li>Brannelly, L. A., Richards-Zawacki, C. L., Pessier, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+trials+with+itraconazole+as+a+treatment+for+chytrid+fungal+infections+in+amphibians%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Aquat.+Org%22%5BJournal%5D)">Clinical trials with itraconazole as a treatment for chytrid fungal infections in amphibians.</a> Dis. Aquat. Org. 101 (2), 95-104 (2012).</li>
<li>Jones, M. E. B., Paddock, D., Bender, L., Allen, J. L., Schrenzel, M. S., Pessier, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+chytridiomycosis+with+reduced-dose+itraconazole%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Aquat.+Org%22%5BJournal%5D)">Treatment of chytridiomycosis with reduced-dose itraconazole.</a> Dis. Aquat. Org. 99 (3), 243-249 (2012).</li>
<li>Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantitative+detection+of+chytridiomycosis+%28Batrachochytrium+dendrobatidis%29+in+amphibian+samples+using+real-time+Taqman+PCR+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Aquat.+Org%22%5BJournal%5D)">Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay.</a> Dis. Aquat. Org. 60 (2), 141-148 (2004).</li>
<li>Martel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+safe+antifungal+treatment+protocol+to+eliminate+Batrachochytrium+dendrobatidis+from+amphibians%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Developing a safe antifungal treatment protocol to eliminate Batrachochytrium dendrobatidis from amphibians.</a> Med. Mycol. 49 (2), 143-149 (2011).</li>
<li>Bowerman, J., Rombough, C., Weinstock, S. R., Padgett-Flohr, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terbinafine+hydrochloride+in+ethanol+effectively+clears+Batrachochytrium+dendrobatidis+in+amphibians%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Herpetol.+Med.+Surg%22%5BJournal%5D)">Terbinafine hydrochloride in ethanol effectively clears Batrachochytrium dendrobatidis in amphibians.</a> J. Herpetol. Med. Surg. 20 (1), 24-29 (2010).</li>
<li>Young, S., Speare, R., Berger, L., Skerratt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloramphenicol+with+fluid+and+electrolyte+therapy+cures+terminally+ill+green+tree+frogs+%28Litoria+caerulea%29+with+chytridiomycosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Zoo+Wildlife+Med%22%5BJournal%5D)">Chloramphenicol with fluid and electrolyte therapy cures terminally ill green tree frogs (Litoria caerulea) with chytridiomycosis.</a> J. Zoo Wildlife Med. 43 (2), 330-337 (2012).</li>
</ol>

Autor deklaruje brak sprzecznych interesów finansowych.

Korzystając z tego protokołu, udało nam się bezpiecznie i skutecznie zmniejszyć dawkę leczniczą i czas leczenia itrakonazolem Bd u. Najniższa dawka i czas leczenia (0,0025% przez sześć dni) okazały się skuteczne w leczeniu subklinicznie zakażonego I. nebulifer. Skuteczność zarówno mniejszej dawki, jak i czasu leczenia wskazują na potrzebę przeprowadzenia badań klinicznych w leczeniu zakażenia Bd , ponieważ obecnie nie ma bezpiecznych i skutecznych metod leczenia, które można by stosować dla wsz...

doświadczają obecnie największego spadku różnorodności biologicznej spośród wszystkich taksonów kręgowców1. Chytridiomykoza, choroba skóry wywoływana przez patogen grzybiczy Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), jest jedną z głównych przyczyn tych dramatycznych spadków2. Bd jest najgorszym w historii patogenem powodującym utratę różnorodności biologicznej: infekuje ponad 600 gatunków i spowodował spadek liczebności ponad 300 gatunków, z czego aż 200 gatunków stało się krytycznie zagrożonych lub wymarłych2,3. Grzyb chytrid nie jest specyficzny dla żywiciela i nie jest jasne, jakie cechy gospodarza pozwalają na postęp infekcji Bd, powodując ciężką chorobę. Chytridiomykoza powoduje śmierć poprzez zakłócenie kanałów jonowych w skórze, co prowadzi do utraty elektrolitów i niewydolności serca4. Ponadto supernatant Bd (nie zawierający zoospor Bd) powoduje odpowiedź immunologiczną u kijanek5, co prowadzi naukowców do przekonania, że Bd wytwarza toksyczny produkt uboczny6.
Ponieważ wiele gatunków gwałtownie spada, kolonie w niewoli i programy hodowlane są ważnymi środkami ochronnymi i mogą być jedynym kołem ratunkowym dla niektórych gatunków. Zakładanie i utrzymywanie kolonii wolnych od chorób jest wyzwaniem dla ośrodków zarządzania. Obecne metody chemoterapeutyczne stosowane w leczeniu zakażeń Bd, choć skuteczne, mogą być szkodliwe dla leczonych zwierząt, a żadna pojedyncza metoda leczenia nie była skuteczna we wszystkich gatunkach i klasach wiekowych7.
Przeprowadzono niewiele badań klinicznych dotyczących leczenia zakażenia Bd 7. Trzy najczęściej stosowane metody leczenia to terapia cieplna, chloramfenikol i itrakonazol. Terapia cieplna jest opcją leczenia niechemioterapeutycznego, która wydaje się mieć niewiele skutków ubocznych, może być stosowana na wielu etapach życia i jest ogólnie skuteczna. W badaniu klinicznym Chatfield i Richards-Zawacki8 odkryli, że 96% leczonych zwierząt usunęło infekcje po 10 dniach trzymania w temperaturze 30 °C. Chociaż badanie to nie zakończyło się w 100% sukcesem, stanowi punkt odniesienia dla innych do oceny terapii cieplnej dla ich własnego gatunku. Terapia cieplna, choć skuteczna dla wielu gatunków, jest niepraktyczna dla wielu gatunków alpejskich, które nie mogą pozostać w wysokich temperaturach przez dłuższy czas. Chloramfenikol, środek przeciwbakteryjny, jest z powodzeniem stosowany w leczeniu Bd u wielu gatunków i hamuje rozwój grzybów in vitro. Jako środek przeciwbakteryjny, chloramfenikol nie atakuje grzyba specjalnie, ale wiadomo, że powoduje apoptozę w komórkach eukariotycznych9. Spekulowano, że terapia chloramfenikolem powoduje apoptozę w skórze, zabijając wewnątrzkomórkowe sporangia, chociaż dokładny mechanizm działania nie jest znany. Chociaż nie przeprowadzono żadnego badania klinicznego, a zatem nie oceniono dawki i czasu leczenia, obecne protokoły leczenia zazwyczaj wymagają zanurzenia na dwa do czterech tygodni10,11, co czyni to leczenie niepraktycznym dla lądowych. Chloramfenikol został również ograniczony w niektórych krajach do użytku weterynaryjnego, ponieważ narażenie ludzi wiąże się z rzadką postacią niedokrwistości aplastycznej12.
Itrakonazol, azolowy środek przeciwgrzybiczy, jest najczęściej stosowany w leczeniu infekcji Bd u w niewoli. Najczęściej stosowanym protokołem jest kąpanie zwierząt w 0,01% roztworze itrakonazolu przez pięć minut dziennie przez 11 kolejnych dni. Protokół ten został opracowany na podstawie standardów stosowanych do podawania ssaków i chociaż jest skuteczny w przypadku, nie jest oparty na badaniach klinicznych na11,13. Protokół ten może powodować negatywne skutki uboczne u niektórych gatunków, zwłaszcza u rodzaju Rana oraz u kijanek i niedawnych metamorfów11. Leczenie kijanek było skuteczne przy użyciu znacznie niższego stężenia (0,0005%) itrakonazolu, ale wiązało się z depigmentacją14. To samo stężenie zostało przetestowane na niedawnych metamorfach i okazało się, że nie jest skuteczne w leczeniu infekcji15. Ponieważ istnieje ryzyko wystąpienia negatywnych skutków ubocznych związanych z leczeniem itrakonazolem, niektórzy lekarze stosowali połowę zwykłego stężenia (0,005%) przez 11 kolejnych dni i stwierdzili, że jest to skuteczne w leczeniu infekcji Bd 16.
Niniejsze badanie jest podsumowaniem klinicznego badania klinicznego z użyciem itrakonazolu w leczeniu infekcji Bd 15. Protokół opisuje próbę znalezienia najniższej dawki i czasu leczenia, które są zarówno bezpieczne, jak i skuteczne w leczeniu itrakonazolu u zwierząt zakażonych Bd. Zwierzęta użyte w tym badaniu to niedawne metamorfy ropuch przybrzeżnych, mgławicy Incilius.

<table><tbody><tr><td>0,1% wodny itrakonazol, Sporonox</td><td>Janssen Pharmaceutica Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S640-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP510-100</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne waciki bawełniane</td><td>Sprzęt medyczny i drutowy</td><td>MW113</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Mikroprobówki</td><td>Sarstedt</td><td>73.703.217</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNEasy Zestaw do krwi i tkanek</td><td>Qiagen</td><td>69581</td><td></td></tr><tr><td>7500 Real-time PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351104</td><td></td></tr><tr><td>VIC IPC</td><td>Applied Biosystems</td><td>4308323</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM2618</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Invitrogen</td><td>30391023</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Invitrogen</td><td>Q10029</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430589</td><td></td></tr></tbody></table>

zmniejszone stężenie itrakonazolu i czas jego trwania są skuteczne w leczeniu zakażenia batrachochytrium dendrobatidis u

Reduced Itraconazole Concentration and Durations Are Successful in Treating Batrachochytrium dendrobatidis Infection in Amphibians

doświadczają największego spadku liczebności spośród wszystkich klas kręgowców, a główną przyczyną tych spadków jest patogen grzybiczy, Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), który powoduje chorobę chytridiomycosis. Kolonie zabezpieczające w niewoli są ważne na całym świecie dla zagrożonych gatunków i mogą być jedyną deską ratunku dla tych, które są krytycznie zagrożone wyginięciem. Utrzymanie kolonii wolnych od chorób jest priorytetem dla osób zarządzających zwierzętami w niewoli, jednak nie zidentyfikowano bezpiecznych i skutecznych metod leczenia dla wszystkich gatunków i na różnych etapach życia. Najczęściej stosowaną chemioterapeutyką jest itrakonazol, chociaż powszechnie stosowana dawka może być szkodliwa dla niektórych osób i gatunków. Przeprowadziliśmy badanie kliniczne w celu oceny, czy można znaleźć mniejszą i bezpieczniejszą, ale skuteczną dawkę itrakonazolu w leczeniu zakażeń Bd. Odkryliśmy, że zmniejszając stężenie leczenia z 0,01-0,0025% i skracając czas trwania leczenia z 11-6 dni 5-minutowych kąpieli, żaby można wyleczyć z infekcji Bd przy mniejszej liczbie skutków ubocznych i mniejszej śmiertelności związanej z leczeniem.

Leczenie itrakonazolem uznano za skuteczne, jeśli wszystkie zwierzęta były Bd-ujemne cztery tygodnie po zakończeniu terapii. Przed rozpoczęciem leczenia, dwa tygodnie po inokulacji, wszystkie zwierzęta inokulowane Bd były zainfekowane, przy średnim obciążeniu zoosporami wynoszącym 1,121.7 (±17.34), natomiast cztery tygodnie po zakończeniu leczenia zwierzęta z grupy kontrolnej Bd-dodatniej miały średnie obciążenie zoosporami na poziomie 16,765.12 (±14643.08).
Leczenie...

Zakażenie Batrachochytrium dendrobatidis u można wyeliminować za pomocą zmniejszonego stężenia (0,0025%) i krótszego czasu trwania (pięciominutowe kąpiele przez sześć dni) itrakonazolu niż jest to zwykle stosowane. Mniejszą śmiertelność i mniej negatywnych skutków ubocznych zaobserwowano przy użyciu tego zmodyfikowanego protokołu leczenia.

Zmniejszone stężenie itrakonazolu i czas jego trwania są skuteczne w leczeniu zakażenia Batrachochytrium dendrobatidis u

Amphibians are experiencing the greatest decline of any vertebrate class and a leading cause of these declines is a fungal pathogen, Batrachochytrium ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest leczenie płazów zainfekowanych grzybem *Batrachochytrium dendrobatidis* (BD) za pomocą chemioterapii przeciwgrzybiczej z zastosowaniem triazolu. Cel ten osiąga się poprzez uprawę kultur BD i inokulację zwierząt patogenem grzybiczym. Drugim krokiem jest przebadanie zwierząt za pomocą ekstrakcji DNA i qPCR z wymazów ze skóry w celu potwierdzenia infekcji BD.Następnie zainfekowane zwierzęta poddaje się leczeniu poprzez kąpiele w 0,0025% roztworze ekonazolu przez pięć minut dziennie przez sześć dni. Ostatnim krokiem jest monitorowanie stanu infekcji u leczonych zwierząt poprzez przeprowadzenie analizy QPCR wymazów ze skóry przez minimum cztery tygodnie po zakończeniu leczenia w celu potwierdzenia skuteczności terapii. Procedura ta wykazuje, że zmniejszone stężenie i krótszy czas leczenia przeciwgrzybiczym itrakonazolem są efektywne w leczeniu zwierząt zainfekowanych bd. Główną zaletą stosowania tego schematu leczenia w porównaniu z zalecaną dawką, którą jest 0,01% roztwór itrakonazolu przez 11 dni, jest fakt, że zmniejszone stężenie wynoszące jedną czwartą dawki zalecanej oraz skrócenie czasu leczenia do sześciu dni pozostają skuteczne w zwalczaniu infekcji BD, a jednocześnie minimalizują negatywne skutki uboczne związane ze stosowaniem zalecanej dawki terapeutycznej.Po inkubacji BD w bulionie z Tritonem, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, oraz sprawdzeniu ruchliwości zarodników Zo, zalej każdą płytkę pięcioma mililitrami odstanej wody kranowej i odczekaj 10 minut, aby zarodniki ZO wniknęły do podłoża. Następnie przelej zawiesinę zarodników Zo do przenośnego pojemnika. Oszacuj stężenie zarodników ZO za pomocą hemocytometru i rozcieńcz mieszaninę odstaną wodą kranową do stężenia 1×10⁶ na 3 ml w celu inokulacji zwierzęcia, takiego jak przedstawiona tutaj Latoria vei Alpina.Przyłóż zwierzę nad pojemnikiem o pojemności 50 ml i wlej 3 ml mieszaniny inokulum na jego brzuch. Następnie umieść zwierzę w pojemniku wraz ze spłyniętym inokulum. Zamknij pojemnik pokrywką i pozostaw zwierzę w nim na 24 godziny, aby zapewnić infekcję.Aby zapobiec kontaminacji patogenem BD, należy zdjąć stare rękawiczki i odłożyć je do autoklawowania przed utylizacją. Po założeniu nowej pary rękawiczek można przystąpić do inokulacji kolejnego zwierzęcia.Po 24 godzinach od inokulacji należy przenieść zwierzęta z powrotem do ich indywidualnych, zdezynfekowanych terrariów na dwa tygodnie. Należy pamiętać o dezynfekcji wszystkich płynnych odpadów przed utylizacją poprzez doprowadzenie roztworu do stężenia 10% wybielacza po upływie dwóch tygodni. W celu potwierdzenia udanej infekcji BD należy pobrać wymazy od zwierząt za pomocą sterylnego patyczka bawełnianego.Delikatnie obracaj wymaz podczas i pomiędzy pociągnięciami. Wymaż pięć razy brzuch z każdej strony, każde udo oraz każdą z czterech kończyn, co daje łącznie 45 pociągnięć. Przechowuj wymazy w mikroprobówkach o pojemności 1,5 ml w temperaturze -20 °C.Wyizoluj genomowy DNA z wymazów, korzystając z dostępnego komercyjnie zestawu do izolacji DNA, a następnie przeprowadź qPCR zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przygotuj trzy kąpiele terapeutyczne, po jednej dla każdej z trzech dawek itrakonazolu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie umieść poszczególne płazy w zdezynfekowanych.Pojemniki w formie puszek o pojemności 50 mililitrów zawierające 35 mililitrów roztworu do zabiegu. Pamiętając o zmianie rękawiczek pomiędzy zwierzętami, należy sporadycznie i delikatnie obracać pojemnikiem, aby upewnić się, że zwierzęta są całkowicie pokryte roztworem przez pięć minut. Po pięciu minutach należy przenieść zwierzęta z powrotem do zdezynfekowanego obszaru.Powtarzać pięciominutową terapię codziennie przez kolejne pięć dni. Ponownie przetestować zwierzęta w kierunku zakażenia BD tydzień po zakończeniu leczenia, a następnie raz w tygodniu przez cztery tygodnie, aby upewnić się, że zakażenie ustąpiło. Należy pamiętać, że nawet po zakończeniu leczenia zwierzęta muszą być traktowane tak, jakby nadal stanowiły ryzyko kontaminacji.Zwierzęta muszą być utrzymywane w oddzielnej strefie przez co najmniej miesiąc po zakażeniu. Jeśli leczenie okaże się nieskuteczne, należy je powtórzyć. Różne gatunki i różne stadia rozwojowe reagują odmiennie na zakażenie oraz schematy leczenia, dlatego przed szerokim wdrożeniem metoda leczenia musi zostać poddana próbom.Ponieważ BD stanowi zagrożenie biologiczne, należy cotygodniowo dezynfekować poszczególne terraria, kąpielowo myjąc terrarium oraz pojemniki do zabiegów w 10% roztworze wybielacza. Moczyć przez co najmniej 30 sekund, wypłukać wybielacz dwukrotnie wodą i pozostawić pojemniki do wyschnięcia na 24 godziny przed ponownym użyciem w celu przeżycia żab. Przedstawiono tutaj przebieg po 11 dniach leczenia BD lub po sześciu dniach leczenia BD.Czarne strzałki wskazują ostatni dzień leczenia. Linie ciągłe oznaczają przeżywalność grup kontrolnych. Czarne linie ciągłe dotyczą zwierząt, które były dodatnie pod kątem BD, ale nie otrzymały leczenia BD.Pełne szare linie reprezentują zwierzęta, które były ujemne w kierunku BD i nie otrzymały leczenia BD. Linie przerywane przedstawiają przeżywalność grup leczonych wskazanym stężeniem ekonazolu. Wszystkie zwierzęta traktowane 0,0025% w nebulizatorze przez sześć dni były ujemne w kierunku BD cztery tygodnie po zakończeniu leczenia, w związku z czym terapię tę uznano za skuteczną.Dodatkowo, przy tym dawkowaniu ekonazolu nie odnotowano istotnych różnic w śmiertelności w porównaniu z grupami kontrolnymi z dodatkiem BD. Należy zauważyć, że zastosowanie ekonazolu w stężeniu 0,01% i 0,005% przez 11 dni doprowadziło do istotnego wzrostu śmiertelności w porównaniu z kontrolami pozytywnymi BD. Należy pamiętać, że patogen grzybowy BD stanowi zagrożenie biologiczne, co wymaga zachowania środków ostrożności, takich jak noszenie i regularna zmiana rękawic, autoklawowanie wszystkich odpadów stałych oraz dezynfekcja.Wszystkie odpady ciekłe muszą zostać zutylizowane zgodnie z procedurą podczas wykonywania niniejszego protokołu.

reduced-itraconazole-concentration-durations-are-successful-treating

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zmniejszone stężenie i czas stosowania itrakonazolu są skuteczne w leczeniu infekcji Batrachochytrium dendrobatidis u płazów

To badanie obejmuje metody mające na celu ujawnienie wpływu na modelowego gospodarza ryb po zmianie składu społeczności mikrobiomu skóry i jelit przez antybiotyk.

Badanie fenotypów gospodarza w Gambusia affinis po leczeniu antybiotykami

Pokazano systemiczne i zlokalizowane modele infekcji wirusa grypy A u ludzi. Korzystając z modelu infekcji ogólnoustrojowej, danio pręgowany może być używany do badań przesiewowych leków przeciwwirusowych. Korzystając z modelu infekcji zlokalizowanej, danio pręgowany może być wykorzystany do scharakteryzowania odpowiedzi komórek odpornościowych gospodarza.

Wykorzystanie modeli wirusa grypy pręgowanej u ludzi do badań przesiewowych leków przeciwwirusowych i scharakteryzowania odpowiedzi komórek odpornościowych gospodarza

Ten protokół opisuje użycie wymazów z miski olejowej i analizy osadu w systemach danio pręgowanego, co prowadzi do zwiększenia wykrywalności w porównaniu do samego użycia wartowników do wykrywania patogenów, takich jak Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. i Pseudocapillaria tomentosa. Zaproponowano również system monitorowania jaj P. tomentosa w kwarantannie.

Badania przesiewowe środowiskowe Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. i Pseudocapillaria tomentosa w systemach danio pręgowanego

W tej pracy opisujemy ostry, przewlekły i wielopokoleniowy test biologiczny, aby zbadać wpływ pojedynczych i połączonych stresorów na turkusową karpię Nothobranchius furzeri. Protokół ten ma na celu badanie cech historii życia (śmiertelność, wzrost, płodność, waga) i krytycznego maksimum termicznego.

Protokół badania ostrej i przewlekłej ekotoksyczności turkusowej Killifish Nothobranchius furzeri

Określamy ilościowo śmierć komórek naskórka u żab z chytridiomykozą, używając dwóch metod. Po pierwsze, używamy końcowego znakowania końca nacięcia dUTP za pośrednictwem transferazy końcowej (TUNEL) in situ, aby określić różnice między klinicznie zakażonymi i niezakażonymi zwierzętami. Po drugie, przeprowadzamy analizę szeregów czasowych apoptozy nad infekcją za pomocą analizy białka kaspazy 3/7.

Wykorzystanie końcowego znakowania końca dUTP Nick za pośrednictwem transferazy końcowej (TUNEL) i testów kaspazy 3/7 do pomiaru śmierci komórek naskórka u żab z chytridiomykozą

Badania biologii dostarczają cennych informacji na temat procesów reprodukcyjnych, fizjologicznych, embriologicznych i rozwojowych, które napędzają organizmy wielu grup taksonomicznych. W tym miejscu przedstawiamy obszerny przewodnik po różnych metodologiach, które można wykorzystać do badania kontroli i monitorowania jajników u.

Techniki rozrodu do monitorowania i kontroli jajników u

Zarodki danio pręgowanego są używane do oceny toksyczności związków chemicznych. Rozwijają się zewnętrznie i są wrażliwe na chemikalia, co pozwala na wykrycie subtelnych zmian fenotypowych. Eksperyment wymaga jedynie niewielkiej ilości związku, który jest bezpośrednio dodawany do płytki zawierającej zarodki, dzięki czemu system testowy jest wydajny i opłacalny.

Szybka ocena toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego

Protokół oparty na 96-dołkowej płytce mikromiareczkowej przy użyciu testu redukcji 2,3-bis(2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo)-5-karboksyanilid-2H-tetrazolium (XTT) jest opisany tutaj, w celu zbadania wpływu przeciwciał na biofilmy utworzone przez C. tropicalis. Ten protokół in vitro może być wykorzystany do sprawdzenia wpływu potencjalnych nowych związków przeciwgrzybiczych na aktywność metaboliczną komórek gatunku Candida w biofilmach.

Rozpuszczalny test redukcyjny na bazie tetrazoliu do oceny wpływu przeciwciał na biofilmy Candida tropicalis

To jest metoda pobierania próbek i izolowania bakterii hodowlanych z mikrobioty skórnej europejskich salamander pletodontycznych (rodzaj Speleomantes). W tym miejscu przedstawiamy protokół pobierania próbek skóry salamandry za pomocą wymazów i przetwarzania ich przy użyciu metod hodowlanych. Opisujemy pobieranie próbek, izolację i założenie hodowli aksenicznej z charakterystyką szczepu bakteryjnego.

Izolacja i identyfikacja szczepów bakteryjnych ze skóry lądowych

Projektowanie białek polega na budowie sekwencji aminokwasów i włączaniu określonych motywów w celu stworzenia funkcjonalnych wariantów. Takie podejście ma kluczowe znaczenie dla opracowania peptydów przeciwdrobnoustrojowych (AMP) do zwalczania patogenów opornych na antybiotyki. W artykule przedstawiono procedurę budowy białek z wykorzystaniem różnych narzędzi bioinformatycznych.

Zastosowanie I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, serwera HADDOCK i lorii HEX do projektowania białek De Novo i In Silico

Protokół ten stanowi zoptymalizowany, szczegółowy przewodnik po wykorzystaniu planarialnej Schmidtea mediterranea jako modelu do badania interakcji gospodarz-patogen podczas infekcji grzybiczej. Metoda opiera się na wcześniejszej procedurze infekowania planarii ludzkim patogenem grzybowym Candida albicans, dostarczając szczegółowych wskazówek mających na celu zwiększenie powtarzalności i spójności eksperymentów.

Zoptymalizowany protokół dla zakażenia Candida albicans w Schmidtea mediterranea do badania patogenezy grzybów i obrony gospodarza

Poznaj zmodyfikowaną metodę leczenia zakażenia Batrachochytrium dendrobatidis u płazów za pomocą itrakonazolu w obniżonym stężeniu. Skrócony czas kuracji skutecznie eliminuje grzyba przy minimalizacji działań niepożądanych.

Zmniejszone stężenie itrakonazolu i czas jego trwania są skuteczne w leczeniu zakażenia Batrachochytrium dendrobatidis u

Przeglądaj więcej filmów