Nanowłókna i nanostruktury białkowe ECM zaprojektowane przy użyciu montażu inicjowanego powierzchniowo

Ogólnym celem tej procedury jest inżynieria wolnostojących nanowłókien, nanostruktur i matryc 2D z pojedynczych lub wielu białek macierzy zewnątrzkomórkowej przy użyciu montażu inicjowanego powierzchniowo. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie stempli z polidimetylu soanu lub PDMS poprzez wylanie prepolimeru PDMS na topograficznie wzorzystą formę wzorcową i pozostawienie go do utwardzenia. Drugim krokiem jest wycięcie utwardzonych stempli PDMS i pokrycie ich roztworem zawierającym pożądane białka macierzy zewnątrzkomórkowej.

Następnie stemple są myte, suszone i drukowane mikrokontaktowo na szkiełku nakrywkowym z poli N iso propylu i akryloamidu lub szkiełku nakrywkowym pokrytym PAM. Ostatnim krokiem jest nawodnienie szkiełka nakrywkowego ciepłą wodą dejonizowaną o temperaturze 40 stopni Celsjusza i pozostawienie go do stopniowego ostygnięcia redukcji roztworu. Temperatura poniżej około 32 stopni Celsjusza powoduje rozpuszczenie wrażliwej termicznie warstwy PAM rury i uwolnienie zmontowanych nanowłókien białkowych lub nanostruktur.

Ostatecznie, zmontowane nanowłókna i nanostruktury są wolnostojące w roztworze, co zostało potwierdzone przez kontrast fazowy i/lub mikroskopię fluorescencyjną, i mogą być wykorzystywane w dalszych zastosowaniach, takich jak rusztowania inżynierii tkankowej. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak separacja twarzy lub elektroprzędzenie, jest możliwość inżynierii nanowłókien białkowych ECM przy użyciu techniki, która naprawdę naśladuje sposób, w jaki komórki normalnie budują włókna ECM in vivo. Technika montażu inicjowanego powierzchniowo ma szereg unikalnych zalet, w tym możliwość kontrolowania składu białek, morfologii włókien i architektury rusztowania.

Co więcej, możemy zaprojektować nanowłókna białkowe ECM z białek macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak laminat włóknisty nin i kolagen typu czwartego, co okazało się trudne przy użyciu innych rodzajów metod. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkankowej, umożliwiając naukowcom opracowanie konstruktów o specyficznych i dobrze zdefiniowanych wskazówkach fizycznych i chemicznych, aby kierować różnymi zachowaniami komórek, takimi jak adhezja i różnicowanie. Jeśli dopiero zaczynasz przygodę z tą techniką, powinieneś pamiętać o ciągłym sprawdzaniu jakości swoich łodyg, a także wierności drukowanych wzorów mikrokontaktowych.

Jest to niezbędne do uzyskania prawidłowego montażu nanowłókien i nanostruktur ECM. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować polimer wstępny polidimetylosoanu lub PDMS, łącząc bazę elastomerową i utwardzacz w stosunku 10 do jednego wagowo, zwykle stosuje się 80 gramów zasady i osiem gramów utwardzacza, aby zapewnić wystarczającą ilość PDMS do pokrycia formy wzorcowej mieszanką warstw o grubości jednego centymetra i DGA PDMS za pomocą mieszalnika dośrodkowego ustawionego na następującą mieszaninę w 2000 obr./min przez dwie minuty, DGA przy 2000 obr./min przez dwie minuty. Wystarczająco biedny.

PDMS wstępnie polimeruje na formie głównej, aby utworzyć tutaj warstwę o grubości jednego centymetra, PDMS przez pieczenie w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Po utwardzeniu użyj skalpela, aby wyciąć obszar zawierający wzór, aby utworzyć stempel PDMS. Aby odróżnić stronę elementu od tylnej strony stempla PDMS.

Wytnij nacięcie w jednym z rogów na odwrocie stempla. Rozpocznij tę procedurę od oczyszczenia szkiełek nakrywkowych o średnicy 25 milimetrów, sonikacji szkiełek nakrywkowych w 95% etanolu przez godzinę, a następnie wysuszenia ich w piekarniku o temperaturze 65 stopni Celsjusza. Następnie przygotuj roztwór poli i izopropyloakrylamidu lub piam, rozpuść piam w jednym butanolu o stężeniu 10% Wyśrodkuj czystą szklaną szkiełko nakrywkowe na uchwycie próżniowym wirówki i odpipetuj 200 mikrolitrów roztworu rurki Pam na szklaną powierzchnię, aby całkowicie pokryć powierzchnię.

Obracaj szkiełko nakrywkowe z prędkością 6 000 obr./min przez jedną minutę. Oczyść znaczki PDMS za pomocą sonikacji w 50% etanolu przez 30 minut, a następnie wysusz pod strumieniem suszenia azotem, a wszystkie kolejne kroki należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zachować sterylność w zastosowaniach, w których macierz zewnątrzkomórkowa lub nanostruktury ECM będą używane z komórkami. Etap drukowania mikrokontaktowego jest najtrudniejszym aspektem tej procedury.

Ważne jest, aby przed użyciem sprawdzić stemple PDMS pod kątem widocznych wad. Nie należy również używać roztworu białkowego, który jest starszy niż dwa tygodnie Miejsce. Pokrywę pokrytą PIAM wsuwa się do zamkniętej szalki Petriego i sterylizuje za pomocą ekspozycji na promieniowanie UV.

Wystarczy 45 minut w świetle UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Pokryj powierzchnię wzoru każdego stempla PDMS 200 mikrolitrami roztworu białkowego. Stosuje się tutaj fibronektynę lub FN w stężeniu 50 mikrogramów na mililitr w sterylnej wodzie destylowanej.

Inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej, po godzinie umyć stemplowniki PDMS i wodę destylowaną w celu usunięcia nadmiaru białka i dokładnie wysuszyć pod strumieniem azotu. Ważne jest, aby całkowicie usunąć wodę, aby uniknąć przedwczesnego rozpuszczenia rury. Powłoka Pam na szkiełku nakrywkowym i niewłaściwe przenoszenie białka.

Wykonaj drukowanie mikrokontaktowe, umieszczając stronę charakterystyczną stempla PDMS w kontakcie z szkiełkiem nakrywkowym pokrytym PAM, jeśli jest to wymagane. Za pomocą kleszczy lekko postukaj w tylną część stempli, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza i zapewnić równomierny kontakt po pięciu minutach. Odklej stempel PDMS od szkiełka nakrywkowego.

Na tym etapie. W zależności od badania, dodatkowe białka ECM mogą być modelowane w celu stworzenia bardziej złożonych i wieloskładnikowych struktur. Po wydrukowaniu wzoru ECM umieść wzorzyste szkiełko nakrywkowe pokryte PAM na 35-milimetrowej szalce Petriego i sprawdź wierność wzoru za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym.

W zależności od wzoru, może być konieczna kamera CCD do rozwiązania funkcji wzoru. Mikroskopia fluorescencyjna może być również wykorzystana do sprawdzenia wzoru, pod warunkiem, że białka ECM są znakowane fluorescencyjnie. Po sprawdzeniu wierności wzoru dodaj trzy mililitry wody destylowanej o temperaturze 40 stopni Celsjusza do szalki Petriego i pozwól wodzie stopniowo schłodzić rozpuszczenie rury.

Warstwę PAM i uwalnianie wzorców białek ECM można monitorować za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Zazwyczaj, aby zapewnić uwolnienie nanostruktur białkowych ECM, woda jest schładzana do temperatury pokojowej znacznie poniżej dolnej krytycznej temperatury roztworu w rurze, pam, która wynosi 32 stopnie Celsjusza. Jeżeli aplikacja nie pozwala na stosowanie technik optycznych, uwalnianie można monitorować poprzez pomiar temperatury roztworu.

Nanowłókna i inne nanostruktury będą unosić się w wodzie po uwolnieniu warstwy PAM rury. W celu dalszych zastosowań należy manipulować nanotkaninami i innymi nanostrukturami, ale dokładne podejście będzie zależało od celu eksperymentalnego. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki, aby wykazać, że montaż inicjowany powierzchniowo lub SIA jest zdolny do inżynierii nanowłókien białkowych ECM z precyzyjną kontrolą wymiarów włókien.

Układ prostokątów fibronektyny o długości 50 mikrometrów i szerokości 20 mikrometrów utworzono na pokrytym piam szkiełku nakrywkowym dodanym do wody o temperaturze 40 stopni Celsjusza, a następnie schłodzonym poniżej dolnego roztworu krytycznego. Temperatura piam spowodowała rozpuszczenie piam i uwolnienie nanowłókien fibroiny po uwolnieniu. Włókna kurczyły się, ponieważ znajdowały się pod wpływem nieodłącznego naprężenia wstępnego.

Po nałożeniu wzoru na powierzchnię piam, analiza Alice wymiarów nanowłókien fibronektyny przed wydaniem wykazała, że były to monodyspersyjne o średniej długości 50,19 plus minus 0,49 mikrometra i średniej szerokości 19,98 plus minus 0,17 mikrometra. Po uwolnieniu nanowłókna znacznie się skurczyły, ale pozostały monodyspersyjne o średniej długości 14,15 plus minus 0,92 mikrometra i średniej szerokości 2,65 plus minus 0,32 mikrometra. Mikroskopia sił atomowych zapewniła perspektywę wyższej rozdzielczości zmian wymiarowych włókien związanych z procesem uwalniania SIA.

Warto zauważyć, że włókna przed uwolnieniem miały jednolitą grubość około pięciu nanometrów, podczas gdy włókna po uwolnieniu miały grubość rzędu kilkuset nanometrów, podczas gdy długość i szerokość zmniejszyły się. Korzystając z procesu SIA, możliwe jest zaprojektowanie różnych nanostruktur białkowych ECM o regulowanym rozmiarze, kształcie i składzie. Na przykład nanowłókna fibronektyny początkowo o szerokości 20 mikrometrów i długości jednego centymetra zostały wzorowane na rurze.

Szkiełko nakrywkowe pokryte PAM po schłodzeniu i rurze. Pam rozpuszczenie, nanowłókna zostały uwolnione, tworząc długie nici o zmniejszonej szerokości około trzech mikrometrów. Ponadto, ponieważ wzór jest definiowany przez topografię powierzchni stempla PDMS używanego do drukowania mikrokontaktowego, możliwe jest zaprojektowanie złożonych nanostruktur białkowych ECM jako dowodu słuszności koncepcji.

Powstały wieloramienne gwiazdy fibroinowe. Uwolnienie termiczne spowodowało skurczenie ramion, ale nie centralnego obszaru gwiazdy, w którym ramiona się połączyły. SIA współpracuje również z innymi białkami ECM, takimi jak laminat lub LN, a wiele białek ECM może być włączonych do tej samej struktury.

W tym przykładzie ortogonalne połączone ze sobą linie fibronektyny o szerokości 20 mikrometrów pokazane na czerwono i linie lamininy o szerokości 50 mikrometrów pokazane na zielono zintegrowane z nanotkaniną 2D zostały wzorzyste, a następnie uwolnione po uwolnieniu, oba typy nanowłókien skurczyły się, ale ogólne połączenie i kwadratowa struktura sieci zostały zachowane. Wyniki te pokazują, że SIA może być stosowany do inżynierii materiałów ECM o różnych składach i strukturach. Na koniec przedstawiono kilka przykładów nieudanego SIA nanowłókien ECM.

Jedną z przyczyn jest niewłaściwe uwalnianie niekompletnego wzoru z powodu słabego przenoszenia białka ECM na powierzchnię piam. Podczas drukowania mikrokontaktowego obecność otworów, nieregularnych krawędzi i innych defektów stworzy nanowłókna i nanostruktury, które są niekompletne i podatne na pękanie i fragmentację po uwolnieniu. Szybkie rozpuszczanie PAM w rurze może również powodować słabą wierność wzoru po zwolnieniu.

Na przykład przy użyciu wody o temperaturze 20 stopni Celsjusza, temperaturze już niższej od dolnego roztworu krytycznego. Temperatura piam spowoduje, że piam szybko pęcznieje i rozpuszcza się. Może to spowodować, że nanowłókna odskoczą i pękną, jak pokazano na 32. obrazie, i utworzą losowe, niezorganizowane konfiguracje, jak pokazano na 52-sekundowym obrazie.

Przed rozpoczęciem tej procedury należy ocenić stan PDMS pod kątem wad, a także upewnić się, że wszystkie powierzchnie są wolne od kurzu. W przeciwnym razie uniemożliwi to prawidłowy transfer białka i doprowadzi do złego montażu struktur A CM. Tak więc, zgodnie z tą procedurą, uwalniające się nanowłókna lub nanostruktury mogą być wykorzystywane do wielu rzeczy, takich jak analiza właściwości mechanicznych włókien białkowych lub wykorzystywane jako rusztowania dla inżynierii tkankowej.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak inżynierować nanowłókna i nanostruktury białek ECM o dostrojonym składzie, geometrii i architekturze. W szczególności zrozumiesz, jak mikrokontaktowo drukować wzory białek ECM na szkiełkach nakrywkowych pokrytych pytonem, a następnie termicznie wyzwalać rozpuszczenie powierzchni w celu złożenia struktur ECM.