Name: Nanowłókna i nanostruktury białkowe ECM zaprojektowane przy użyciu montażu inicjowanego powierzchniowo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 33 s
Description: Poznaj metodę inżynierii nanowłókien i nanostruktur z białek macierzy zewnątrzkomórkowej przy użyciu montażu inicjowanego powierzchniowo. Technika ta umożliwia tworzenie materiałów do zastosowań w inżynierii tkankowej i biotechnologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie finansowe zostało udzielone J.M.S. z NIH Biomechanics in Regenerative Medicine T32 Training Program (2T32EB003392), Q.J. z Dowd-ICES Fellowship oraz A.W.F. z NIH Director's New Innovator Award (1DP2HL117750).

1. Wytwarzanie formy wzorcowej za pomocą fotolitografii
<ol>
	<li>Nanowłókna, nanotkaniny i nanostruktury białkowe ECM, które mają zostać wytworzone, są najpierw projektowane przy użyciu oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD). Ten plik CAD jest następnie przesyłany do fotomaski. Rodzaj fotomaski będzie zależał od rozdzielczości funkcji; z maską fotomaskującą na bazie przezroczystości odpowiednią dla rozmiarów obiektów do ~10 μm. Mniejsze cechy <10 μm będą wymagały fotomaski chrom na szkle. Wszystkie przedstawione tutaj nanowłókna i nanostruktury zostały wytworzone przy użyciu przezroczystej fotomaski, a zatem miały grubość w skali nanometrów, ale nie wymiary boczne. 
	Uwaga: Ważne jest, aby rozróżnić, które obszary fotomaski będą ciemne (uniemożliwią przejście światła UV), a które będą przezroczyste (przepuszczają światło UV), ponieważ to, wraz z rodzajem fotorezystu (dodatni lub ujemny), będzie dyktować ostateczną topografię formy wzorcowej.</li>
	<li>Aby rozpocząć produkcję formy wzorcowej, należy odwodnić 4-calową płytkę silikonową, umieszczając ją na płycie grzejnej ustawionej na 150 °C na 15 minut.</li>
	<li>Wyśrodkuj wafel na uchwycie próżniowym wirówki. Wlej ujemny fotorezyst SU8-2015 na środek płytki i kontynuuj nalewanie w koncentrycznych okręgach, aż około dwie trzecie płytki zostanie pokryte. 
	Uwaga: Podczas nalewania butelkę SU8 należy trzymać blisko płytki, aby zminimalizować tworzenie się pęcherzyków.</li>
	<li>Zaprogramuj wirkowarkę w następujący sposób:
	<ul>
		<li>Cykl rozrzutu: 500 obr/min z przyspieszeniem 100 obr/min przez 10 sek.</li>
		<li>Cykl wirowania: 4 000 obr./min z przyspieszeniem 100 obr./min przez 30 sek.</li>
	</ul>
	Uwaga: Ta receptura przędzenia utworzy warstwę fotorezystu o grubości ~ 10 μm. Zmieniając prędkość wirowania lub formułę SU8, można regulować grubość.</li>
	<li>Wafelek upiecz na miękko, umieszczając go na płycie grzejnej ustawionej na 95 °C na 3 minuty.</li>
	<li>Wystaw wafel ze światłem UV przez fotomaskę, aby uzyskać całkowitą dawkę 140 mJ/cm2, 
	Uwaga: SU8 jest ujemnym fotorezystem, dlatego obszary, w których światło UV może przejść przez fotomaskę, pozostaną po wywołaniu i staną się wypukłymi elementami na głównej formie.</li>
	<li>Po ekspozycji upiecz wafel, umieszczając go na płycie grzejnej ustawionej na 95 °C na 4 minuty.</li>
	<li>Rozwiń wafel, umieszczając go w wywoływaczu SU8 na 3 minuty. Po 3 minutach opłucz wafel alkoholem izopropylowym. Jeśli podczas płukania wytworzy się biały film, wafel nie jest w pełni rozwinięty i należy go ponownie umieścić w wywoływaczu na kolejne 30 sekund. Ponownie spłucz alkoholem izopropylowym. Powtarzaj ten proces, aż podczas płukania alkoholem izopropylowym nie utworzy się biały film.</li>
	<li>Wysuszyć wafel w strumieniu azotu i umieścić na szalce Petriego o średnicy 150 mm w celu ochrony przed kurzem.</li>
</ol>
2. Tworzenie pieczęci PDMS
<ol>
	<li>Przygotuj prepolimer PDMS, łącząc bazę elastomerową i utwardzacz w stosunku 10:1 w/w. Zazwyczaj stosuje się 80 g bazy i 8 g utwardzacza, aby zapewnić wystarczającą ilość PDMS do pokrycia formy głównej warstwą o grubości 1 cm.</li>
	<li>Wymieszaj i odgazuj PDMS za pomocą mieszalnika dośrodkowego ustawionego na następującą wartość:
	<ul>
		<li>Mieszanie: 2 000 obr./min przez 2 minuty</li>
		<li>Degaz: 2 000 obr./min przez 2 min.</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Jeśli mieszalnik nie jest dostępny, należy mieszać PDMS ręcznie przez 10 minut za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Odgazować mieszaninę, umieszczając ją w eksykatorze próżniowym na 30 minut w celu usunięcia pęcherzyków.</li>
	<li>Wlej wystarczającą ilość prepolimeru PDMS na formę główną (wzorzysty wafel silikonowy), aby utworzyć warstwę o grubości 1 cm. Utwardź PDMS przez pieczenie w temperaturze 65 °C przez 4 godziny lub w temperaturze pokojowej przez 48 godzin.</li>
	<li>Po utwardzeniu obszary zawierające wzory można wyciąć, tworząc stemple PDMS. Aby odróżnić stronę elementu od tylnej strony stempla PDMS, wytnij wcięcie w jednym z rogów na odwrocie stempla.</li>
</ol>
3. Drukowanie mikrokontaktowe wzorców ECM
<ol>
	<li>Szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm należy czyścić metodą sonikacji w 95% etanolu przez 1 godzinę, a następnie wysuszyć w suszarce o temperaturze 65 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór PIPAAm, rozpuszczając PIPAAm w 1-butanolu o stężeniu 10% (w/v, zazwyczaj 1 g w 10 ml).</li>
	<li>Wyśrodkować szklane szkiełko nakrywkowe na uchwycie próżniowym urządzenia do powlekania i odpipetować 200 μl roztworu PIPAAm tak, aby pokryć całą powierzchnię szkła.</li>
	<li>Szkiełko nakrywkowe należy pokrywać z prędkością 6 000 obr./min przez 1 min.</li>
	<li>Oczyść znaczki PDMS przez sonikację w 50% etanolu przez 30 minut, a następnie wysusz pod strumieniem azotu. 
	Uwaga: Suszenie i kolejne etapy powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zachować sterylność w zastosowaniach, w których nanostruktury ECM będą używane z komórkami.</li>
	<li>Pokryj wzorzystą powierzchnię każdego stempla PDMS 200 μl roztworu białkowego, zwykle 50 μg/ml w sterylnej wodzie destylowanej dla FN. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. 
	Uwaga: Ta objętość powłoki jest przeznaczona dla stempla PDMS o średnicy1,5 cm2 i należy ją dostosować w zależności od rozmiaru stempla PDMS, użytego białka ECM i stężenia białka ECM w roztworze.</li>
	<li>Umyj stemple PDMS w wodzie destylowanej, aby usunąć nadmiar białka i dokładnie wysusz pod strumieniem azotu. 
	Uwaga: Woda pozostawiona na stemplu spowoduje przedwczesne rozpuszczenie powłoki PIPAAm na szkiełku nakrywkowym i uniemożliwi prawidłowe przenoszenie białka.</li>
	<li>W celu uzyskania sterylnego wytwarzania należy umieścić szkiełka nakrywkowe pokryte PIPAAm w zamkniętej szalce Petriego i sterylizować za pomocą ekspozycji na promieniowanie UV, wystarczy 45 minut w świetle UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Jeśli bezpłodność nie jest wymagana, ten krok można pominąć.</li>
	<li>Drukowanie mikrokontaktowe należy wykonać, umieszczając stronę charakterystyczną stempla PDMS w kontakcie ze szkiełkiem nakrywkowym pokrytym PIPAAm. W razie potrzeby za pomocą kleszczy lekko postukaj w tylną część stempli, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza i zapewnić równomierny kontakt.</li>
	<li>Po 5 minutach odklej stempel PDMS od szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Na tym etapie można modelować dodatkowe białka ECM, aby stworzyć bardziej złożone i wieloskładnikowe struktury. Zweryfikowano do 3 wydruków pod kątem pracy z tym procesem, a więcej może być wykonalnych.</li>
</ol>
4. Uwolnienie nanowłókien i nanostruktur ECM
<ol>
	<li>Umieść wzorzyste szkiełko nakrywkowe pokryte PIPAAm na szalce Petriego o średnicy 35 mm i sprawdź wierność wzoru za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. W zależności od wzoru, kamera CCD może być konieczna do rozpoznania cech wzoru. Mikroskopia fluorescencyjna może być również wykorzystana do sprawdzenia wzoru, pod warunkiem, że białka ECM są znakowane fluorescencyjnie.</li>
	<li>Dodać 3 ml wody destylowanej o temperaturze 40 °C do szalki Petriego i pozostawić wodę do stopniowego ostygnięcia.</li>
	<li>Rozpuszczanie warstwy PIPAAm i uwalnianie wzorców białek ECM można monitorować za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Jeżeli aplikacja nie pozwala na stosowanie technik optycznych, uwalnianie można monitorować poprzez pomiar temperatury roztworu. Zazwyczaj woda jest schładzana do temperatury pokojowej, znacznie poniżej LCST PIPAAm (32 °C), aby zapewnić uwolnienie nanostruktur białkowych ECM.</li>
	<li>Po uwolnieniu nanowłókna, nanotkaniny i inne nanostruktury unoszą się w wodzie. Aby wykorzystać je do dalszych zastosowań, należy nimi manipulować. Dokładne podejście będzie zależało od celu eksperymentu i może obejmować takie kroki, jak unieruchomienie na innej powierzchni, poruszanie się za pomocą systemu mikromanipulacyjnego lub zatopienie w hydrożelu.</li>
</ol>

<ol><li>Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+crosstalk+between+the+extracellular+matrix+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix and the cytoskeleton.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 793-805 (2001).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Teo, W. E., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+electrospinning+design+and+nanofibre+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">A review on electrospinning design and nanofibre assemblies.</a> Nanotechnology. 17, (2006).</li>
<li>Reneker, D. H., Chun, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometre+diameter+fibres+of+polymer%2C+produced+by+electrospinning%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanometre diameter fibres of polymer, produced by electrospinning.</a> Nanotechnology. 7, 216-21 (1996).</li>
<li>Ma, P. X., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+nano-scale+fibrous+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Synthetic nano-scale fibrous extracellular matrix.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 46, 60-72 (1999).</li>
<li>Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biodegradable+nanofiber+scaffold+by+electrospinning+and+its+potential+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).</li>
<li>Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibrous+structure%3A+a+novel+scaffold+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 60, 613-621 (2002).</li>
<li>Matthews, J. A., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Electrospinning of Collagen Nanofibers. Biomacromolecules. 3, 232-238 (2002).</li>
<li>Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Ramakrishna, S., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+and+mechanical+characterization+of+gelatin+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Electrospinning and mechanical characterization of gelatin nanofibers.</a> Polymer. 45, 5361-5368 (2004).</li>
<li>Wnek, G. E., Carr, M. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Electrospinning of Nanofiber Fibrinogen Structures. Nano Letters. 3, 213-216 (2002).</li>
<li>Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. A., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+chitosan-based+nanofibers+and+their+cellular+compatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility.</a> Biomaterials. 26, 6176-6184 (2005).</li>
<li>Jin, H. -J., Chen, J., Karageorgiou, V., Altman, G. H., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bone+marrow+stromal+cell+responses+on+electrospun+silk+fibroin+mats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Human bone marrow stromal cell responses on electrospun silk fibroin mats.</a> Biomaterials. 25, 1039-1047 (2004).</li>
<li>Wierzbicka-Patynowski, I., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+fibronectin+matrix+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of fibronectin matrix assembly.</a> Journal of Cell Science. 116, 3269-3276 (2003).</li>
<li>Mosher, D. F., Johnson, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+formation+of+disulfide-bonded+fibronectin+multimers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In vitro formation of disulfide-bonded fibronectin multimers.</a> Journal of Biological Chemistry. 258, 6595-6601 (1983).</li>
<li>Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+to+mechanically+tune+and+optically+probe+fibrillar+fibronectin+conformations+from+fully+relaxed+to+breakage%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage.</a> Matrix Biology. 27, 451-461 (2008).</li>
<li>Ulmer, J., Geiger, B., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-induced+fibronectin+fibrillogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Force-induced fibronectin fibrillogenesis in vitro.</a> Soft Matter. 4, 1998-2007 (2008).</li>
<li>Klotzsch, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+forms+the+most+extensible+biological+fibers+displaying+switchable+force-exposed+cryptic+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fibronectin forms the most extensible biological fibers displaying switchable force-exposed cryptic binding sites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. , (2009).</li>
<li>Feinberg, A. W., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-Initiated+Assembly+of+Protein+Nanofabrics%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Surface-Initiated Assembly of Protein Nanofabrics.</a> Nano Letters. 10, 2184-2191 (2010).</li>
<li>Deravi, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Contributions+of+Conformation+Extension+and+Domain+Unfolding+to+Properties+of+Fibronectin+Nanotextiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Differential Contributions of Conformation Extension and Domain Unfolding to Properties of Fibronectin Nanotextiles.</a> Nano Letters. 12, 5587-5592 (2012).</li>
<li>Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+Printing+of+Proteins+for+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology.</a> J Vis Exp. , 1065(2008).</li>
<li>Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+Involving+Multimodular+Proteins%3A+Converting+Force+into+Biochemical+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction Involving Multimodular Proteins: Converting Force into Biochemical Signals.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przedstawiona tutaj metoda SIA naśladuje składanie macierzy za pośrednictwem komórki i umożliwia inżynierię nanowłókien i nanostruktur białkowych ECM o regulowanym rozmiarze, organizacji i składzie. Chociaż nie jest identyczny z ECM generowanym przez komórkę, SIA tworzy ECM złożony z nanoskalowych włókien białkowych20 , które ulegają odwracalnemu składaniu/rozwijaniu podczas mechanicznego naprężania21 i mogą wiązać komórki20. Zapewnia to unikalną zdolność do budowania materiałów białkowyc...

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) w tkankach składa się z wielofunkcyjnych białek zaangażowanych w fizyczną i chemiczną regulację wielu procesów komórkowych, w tym adhezji, proliferacji, różnicowania i apoptozy1-3. ECM jest syntetyzowany, składany i organizowany przez komórki, a składowe włókienka białkowe mają unikalny skład, rozmiar włókien, geometrię i połączone ze sobą architektury, które różnią się w zależności od rodzaju tkanki i etapu rozwoju. Niedawne prace wykazały, że ECM może dostarczyć pouczających wskazówek, które pomogą komórkom w tworzeniu zmodyfikowanych tkanek4, co sugeruje, że rekapitulacja ECM pod względem składu i struktury może umożliwić rozwój materiałów biomimetycznych do zastosowań w inżynierii tkankowej i biotechnologii.
Opracowano wiele metod wytwarzania w celu stworzenia polimerowych rusztowań, które mogą naśladować aspekty ECM w tkankach. Na przykład zarówno elektroprzędzenie, jak i separacja faz wykazały zdolność do tworzenia porowatych matryc włókien o średnicach od dziesiątek mikrometrów do dziesiątek nanometrów5-7. Obie techniki wykazały również, że wysoce porowate matryce nanowłókien mogą wspomagać adhezję komórek i infiltrację do rusztowania8. Jednak podejścia te są ograniczone pod względem możliwych geometrii włókien, orientacji i architektur 3D, które można stworzyć. Elektroprzędzenie zazwyczaj wytwarza rusztowania z losowo zorientowanymi lub wysoce wyrównanymi włóknami, podczas gdy separacja faz wytwarza rusztowania z losowo zorientowanymi włóknami. Istnieją również ograniczenia dotyczące materiałów, przy czym naukowcy zazwyczaj używają syntetycznych polimerów, takich jak poli(ε-kaprolakton)8 i poli(kwas mlekowo-ko-glikolowy)9, które są następnie powlekane białkami ECM w celu promowania adhezji komórek. Stosowane są również naturalne biopolimery, w tym kolagen typuI 10, żelatyna11, fibrynogen12, chitozan13 i jedwab14, ale reprezentują tylko niewielki podzbiór białek znajdujących się w tkance natywnej. Większość tkanek zawiera większe środowisko białek i polisacharydów ECM, w tym fibronektyny (FN), lamininy (LN), kolagenu typu IV i kwasu hialuronowego, które są trudne lub niemożliwe do wytworzenia nanowłókien przy użyciu istniejących metod.
Aby sprostać temu wyzwaniu, skupiliśmy nasze wysiłki badawcze na naśladowaniu sposobu, w jaki komórki syntetyzują, składają i organizują fibryle białkowe ECM w swoim otoczeniu. Podczas gdy specyficzny proces fibrylogenezy różni się dla różnych białek ECM, zazwyczaj zmiana konformacyjna w cząsteczce białka ECM jest wywoływana przez interakcję enzymatyczną lub za pośrednictwem receptora, która odsłania tajemnicze miejsca samoorganizacji. Tutaj używamy FN jako systemu modelowego, aby lepiej zrozumieć proces fibrylogenezy. Krótko mówiąc, homodimery FN wiążą się z receptorami integryny na powierzchni komórki poprzez sekwencję aminokwasów RGD w 10. jednostce powtórzeń typu III. Po związaniu integryny oddalają się od siebie poprzez skurcz aktomiozyny i rozwijają dimery FN, odsłaniając tajemnicze miejsca samoorganizacji. Odsłonięcie tych miejsc wiązania FN-FN umożliwia dimerom FN składanie się w nierozpuszczalne fibryle bezpośrednio na powierzchni komórki15. Prace w systemach bezkomórkowych wykazały, że tajemnicze miejsca wiązania FN-FN mogą zostać ujawnione poprzez rozwijanie przy użyciu denaturantów16 lub napięcia powierzchniowego na granicy faz powietrze-ciecz-ciało stałe17-19. Jednak włókna FN utworzone tymi technikami są ograniczone do określonych rozmiarów i geometrii włókien i zwykle są związane z powierzchnią.
Tutaj opisujemy podejście określane jako montaż inicjowany powierzchniowo (SIA) 20, które pokonuje te ograniczenia poprzez wykorzystanie interakcji białko-powierzchnia do tworzenia wolnostojących, nierozpuszczalnych nanowłókien, nanotkanin (arkuszy 2D) i innych nanostruktur składających się z jednego lub wielu białek ECM (Rysunek 1). W tym procesie białka ECM są adsorbowane ze zwartej, globularnej konformacji w roztworze i częściowo denaturowane (rozkładane) na wzorzystym, hydrofobowym stemplu polidimetylosiloksanu (PDMS). Białka ECM są następnie przenoszone w tym stanie na reagującą termicznie powierzchnię poli(N-izopropyloakrylamidu) (PIPAAm) poprzez drukowanie mikrokontaktowe22. Po uwodnieniu wodą o temperaturze 40 °C PIPAAm pozostaje ciałem stałym, ale po schłodzeniu do 32 °C przechodzi przez niższą temperaturę krytyczną roztworu (LCST), gdzie staje się hydrofilowy, pęcznieje z wodą, a następnie rozpuszcza się, uwalniając zmontowane nanostruktury ECM z powierzchni. Metoda SIA zapewnia kontrolę nad wymiarami z precyzją w skali nanometrowej. Kontrolując kluczowe parametry, takie jak skład, geometria włókien i architektura, możliwe jest podsumowanie wielu właściwości ECM znalezionych in vivo i opracowanie zaawansowanych rusztowań do zastosowań w inżynierii tkankowej i biotechnologii.

<table><tbody><tr><td>Poli(N-izopropyloakrylaamid) / PIPAAm</td><td>Polysciences</td><td>21458-10</td><td>40 000 Mw</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Zestaw silikonowy (PDMS)</td> <td>Dow Corning</td><td></td><td>Mix 10 części bazy z 1 częścią utwardzacza.&nbsp;</td></tr><tr><td>Butanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>BD biosciences</td><td>354008</td><td>Człowiek, 1mg</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>BD biosciences</td><td>354239</td><td>Ultrapure, mysz, 1mg</td></tr><tr><td>negatywny Photoresist</td><td>Microchem</td><td>SU8-2015</td><td></td></tr><tr><td>SU8 Developer</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator Branson M3510</td><td>Branson Ultrasonic Corporation</td><td>CPN-952-318</td><td></td></tr><tr><td>Thinky ARE-250 Mikser</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spincoater</td><td>Specjalistyczne systemy powlekania</td><td>G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>Szklana pokrywa o średnicy 25 mm, nr 1,5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-86</td><td></td></tr></tbody></table>

nanowłókna i nanostruktury białkowe ecm zaprojektowane przy użyciu montażu inicjowanego powierzchniowo

ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) w tkankach jest syntetyzowana i składana przez komórki, tworząc trójwymiarową sieć białkową o ściśle regulowanej średnicy, składzie i organizacji włókien. Oprócz zapewnienia wsparcia strukturalnego, właściwości fizyczne i chemiczne ECM odgrywają ważną rolę w wielu procesach komórkowych, w tym adhezji, różnicowaniu i apoptozie. In vivo ECM jest składany przez odsłonięcie kryptycznych miejsc samoorganizacji (fibrylogenezy) w białkach. Proces ten różni się dla różnych białek, ale fibrylokeneza fibronektyny (FN) jest dobrze scharakteryzowana i służy jako system modelowy do składania ECM za pośrednictwem komórek. W szczególności komórki wykorzystują receptory integrynowe na błonie komórkowej do wiązania dimerów FN i sił kurczliwych generowanych przez aktomiozynę, aby rozwinąć się i odsłonić miejsca wiązania do złożenia w nierozpuszczalne włókna. Ten proces, w którym pośredniczy receptor, umożliwia komórkom składanie i organizowanie ECM od skali komórkowej do tkankowej. W tym miejscu przedstawiamy metodę określaną jako składanie inicjowane powierzchniowo (SIA), która podsumowuje składanie macierzy za pośrednictwem komórki za pomocą interakcji białko-powierzchnia w celu rozwinięcia białek ECM i złożenia ich w nierozpuszczalne włókna. Po pierwsze, białka ECM są adsorbowane na hydrofobowej powierzchni polidimetylosiloksanu (PDMS), gdzie częściowo denaturują (rozwijają się) i odsłaniają tajemnicze domeny wiążące. Niesfałdowane białka są następnie przenoszone w dobrze zdefiniowanych mikro- i nanowzorach poprzez drukowanie mikrokontaktowe na termicznie reagującą powierzchnię z poli(N-izopropyloakrylamidu) (PIPAAm). Termicznie wyzwalane rozpuszczanie PIPAAm prowadzi do końcowego montażu i uwolnienia nierozpuszczalnych nanowłókien i nanostruktur białkowych ECM o dobrze zdefiniowanej geometrii. Złożone architektury są możliwe dzięki zdefiniowanym przez inżynierię wzorcom na stemplach PDMS używanych do druku mikrokontaktowego. Oprócz FN, proces SIA może być stosowany z lamininą, fibrynogenem i kolagenami typu I i IV w celu stworzenia wieloskładnikowych nanostruktur ECM. W ten sposób SIA może być wykorzystany do inżynierii materiałów na bazie białek ECM z precyzyjną kontrolą składu białka, geometrii włókien i architektury rusztowania w celu odtworzenia struktury i składu ECM in vivo.

Metoda SIA umożliwia inżynierię nanowłókien białek ECM z precyzyjną kontrolą nad wymiarami włókien. Aby to zademonstrować, na szkiełku podstawowym pokrytym PIPAAm naniesiono wzory macierzy nanowłókien FN o wymiarach płaskich 50 x 20 μm (Ryc. 2A). Po zwolnieniu włókna uległy skurczeniu, ponieważ w momencie formowania na powierzchni PIPAAm znajdowały się pod wpływem wewnętrznego naprężenia wstępnego (Ryc. 2B). Analiza nanowłókien FN wykazała, że przed zwolnieniem były one monodyspersyjne, ...

Opisano metodę otrzymywania nanowłókien i złożonych nanostruktur z pojedynczych lub wielu białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Metoda ta wykorzystuje interakcje białko-powierzchnia do tworzenia wolnostojących materiałów na bazie białek o przestrajalnym składzie i architekturze do wykorzystania w różnych zastosowaniach inżynierii tkankowej i biotechnologii.

Nanowłókna i nanostruktury białkowe ECM zaprojektowane przy użyciu montażu inicjowanego powierzchniowo

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie wolnostojących nanowłókien, nanostruktur i matryc 2D z pojedynczych lub wielu białek macierzy zewnątrzkomórkowej przy użyciu montażu inicjowanego powierzchniowo. Osiąga się to najpierw poprzez przygotowanie stempli z polidimetylosiloksanu (PDMS) poprzez wylanie prepolimeru PDMS na matrycę wzorcową o określonej topografii i pozostawienie go do utwardzenia. Drugim krokiem jest wycięcie utwardzonych stempli PDMS i pokrycie ich roztworem zawierającym pożądane białka macierzy zewnątrzkomórkowej.Następnie stempla są płukane, suszone i naniesione metodą mikrokontaktowego druku na szklaną lamelkę pokrytą poli(N-izopropyloakrylamidem), czyli pNIPAM. Ostatnim krokiem jest nawodnienie lamelki ciepłą wodą dejonizowaną o temperaturze 40 °C i stopniowe schładzanie roztworu. Obniżenie temperatury poniżej około 32 °C wyzwala rozpuszczenie termowrażliwej warstwy pNIPAM i uwolnienie zmontowanych nanowłókien lub nanostruktur białkowych.Ostatecznie, zmontowane nanowłókna i nanostruktury są wolnostojące w roztworze, co potwierdzono za pomocą mikroskopii kontrastowej i/lub fluorescencyjnej, i mogą być wykorzystywane w dalszych zastosowaniach, takich ja

ecm-protein-nanofibers-nanostructures-engineered-using-surface

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Włókna i nanostruktury białkowe ECM projektowane za pomocą inicjowanej na powierzchni asemblerki

Opisano wydajne podejście do przygotowania nanowłókien udekorowanych grupami funkcyjnymi zdolnymi do specyficznych oddziaływań z białkami. Podejście to wymaga w pierwszej kolejności przygotowania polimeru funkcjonalizowanego odpowiednią grupą funkcyjną. Funkcjonalny polimer jest przekształcany w nanowłókna za pomocą elektroprzędzenia. Efektywność wiązania nanowłókien z białkiem jest badana za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Procedura wytwarzania biofunkcjonalnych nanowłókien

Ten artykuł opisuje tworzenie wysoce uporządkowanych struktur opartych na peptydach poprzez spontaniczny proces samoorganizacji. Metoda wykorzystuje dostępne na rynku peptydy i powszechnie stosowany sprzęt laboratoryjny. Technika ta może być stosowana do wielu różnych peptydów i może prowadzić do odkrycia nowych zespołów opartych na peptydach.

Tworzenie uporządkowanych struktur biomolekularnych przez samoorganizację krótkich peptydów

Nanoskalowane powierzchnie wysp morskich złożone z termoczułych kopolimerów blokowych zostały wytworzone metodą Langmuira-Schaefera do kontrolowania spontanicznej adhezji i odklejania komórek. Uwidoczniono zarówno przygotowanie powierzchni, jak i adhezję i odklejanie się komórek na powierzchni.

Przygotowanie termoczułych powierzchni nanostrukturalnych dla inżynierii tkankowej

Niniejsza praca opisuje metodę wytwarzania nanokryształów micelarnych, wyłaniającej się głównej klasy nanobiomateriałów. Ta metoda łączy w sobie elektronatryskiwanie od góry do dołu, samoorganizację od dołu do góry i kontrolę struktury na bazie rozpuszczalnika. Metoda wytwarzania jest w dużej mierze ciągła, może wytwarzać produkty wysokiej jakości i posiada niedrogie środki kontroli struktury.

Wytwarzanie sferycznych i ślimakowatych nanokryształów micelarnych poprzez połączenie elektrorozpylania, samoorganizacji i kontroli struktury na bazie rozpuszczalnika

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię przygotowania matrycy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) do wysokoprzepustowej manipulacji fizycznych i chemicznych sygnałów naśladujących mikrośrodowiska komórkowe in vivo oraz do identyfikacji optymalnego środowiska komórkowego dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) z profilowaniem pojedynczych komórek.

Wytwarzanie multipleksowanej sztucznej macierzy mikrośrodowiska komórkowego

Prezentowana jest prosta metoda wytwarzania nano-mikro wieloskalowych struktur dla funkcjonalnych powierzchni, poprzez agregację nanowłókien wytworzonych za pomocą anodowego filtra z tlenku glinu.

Wieloskalowe struktury agregowane za pomocą nadrukowanych nanowłókien dla powierzchni funkcjonalnych

Na styku rozpuszczalników organicznych i wodnych, dostosowane do potrzeb amfifilowe białka podobne do elastyny łączą się w złożone struktury supramolekularne, takie jak pęcherzyki, włókna i koacerwaty wywołane parametrami środowiskowymi. Opisane protokoły montażu pozwalają uzyskać kompartmenty oparte na błonach białkowych (PMBC) o przestrajalnych właściwościach, umożliwiające enkapsulację różnych ładunków.

Ukierunkowane składanie białek podobnych do elastyny w zdefiniowane struktury supramolekularne i enkapsulacja ładunku in vitro

Celem tego protokołu jest pokazanie montażu biomimetycznej nanomatrycy (NM) z nanorurkami o zasadzie Janusa (JBNT) i fibronektyną (FN). W przypadku jednoczesnej hodowli z ludzkimi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi (hMSC), NM wykazują doskonałą bioaktywność w zachęcaniu do adhezji hMSC.

Wytwarzanie biomimetycznej nano-matrycy z nanorurkami na bazie janusa i fibronektyną do adhezji komórek macierzystych

Ten protokół ma na celu ocenę biofunkcjonalnych, samoorganizujących się peptydów pod kątem adhezji komórek, morfologii organoidów i ekspresji genów poprzez barwienie immunologiczne. Wykorzystamy linię komórkową raka jelita grubego, aby zapewnić opłacalny sposób pozyskiwania organoidów do intensywnych testów.

Wytwarzanie i charakterystyka organoidów raka jelita grubego z linii komórkowej SW1222 w ultrakrótkiej, samoorganizującej się matrycy peptydowej

Wkładki do hodowli tkankowych z plastikowymi membranami są złotym standardem w laboratoriach hodowli komórkowych jako przepuszczalne nośniki do tworzenia warstw komórkowych i modeli tkanek barierowych. W niniejszym artykule przedstawiamy prostą metodę zastąpienia plastikowej membrany bardziej biologicznie istotną membraną wykonaną z rekombinowanego funkcjonalizowanego białka pajęczej nici.

Nanowłóknista błona podstawna naśladująca wykonana z rekombinowanej, funkcjonalizowanej nici pajęczej w niestandardowych wkładkach do hodowli tkankowych

Poniższy protokół przedstawia metodę wytłaczania opartą na ścinaniu do produkcji hydrożeli kolagenowych z nanoskalowymi wzorzystymi włókienkami, które mogą być stosowane w szerokim zakresie zastosowań inżynierii tkankowej.

Produkcja kolagenu o wzorzystym kształcie nanofibrylarnym dla inżynierii tkankowej

Poznaj metodę inżynierii nanowłókien i nanostruktur z białek macierzy zewnątrzkomórkowej przy użyciu montażu inicjowanego powierzchniowo. Technika ta umożliwia tworzenie materiałów do zastosowań w inżynierii tkankowej i biotechnologii.

Nanowłókna i nanostruktury białkowe ECM zaprojektowane przy użyciu montażu inicjowanego powierzchniowo

Przeglądaj więcej filmów