Warunkowanie strachu śladowego u myszy

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena uczenia się i pamięci zależnej od hipokampa u myszy z wykorzystaniem warunkowania w sferze śledzącej (trace sphere conditioning). Osiąga się to najpierw poprzez wytrenowanie zwierzęcia w kojarzeniu sygnału dźwiękowego z bodźcem awersyjnym. Następnego dnia zwierzę jest umieszczane w nowym kontekście, a następnie rejestruje się zachowanie zamierania (freezing) w reakcji na dźwięk.

Trzeciego dnia zwierzę zostaje zwrócone do pierwotnego kontekstu i rejestrowane jest zachowanie zamierania. Wyniki wykazują, że myszy trenowane z parowaniem tonu z wstrząsem wykazują częstsze zachowania zamierania niż te, które nie otrzymały wstrząsu. Metoda ta może być wykorzystana do uzyskania wglądu w uczenie się i pamięć zależną od hipokampa u myszy i jest szczególnie użyteczna w badaniach nad zwierzętami transgenicznymi oraz knockout.

Poniższą procedurę przeprowadza się w komorze warunkowania lękowego umieszczonej wewnątrz większej komory wygłuszającej. Przy zamkniętych drzwiach komory należy ustawić oświetlenie tak, aby osiągnąć pożądany poziom iluminacji; jeśli światła zostały rozmieszczone prawidłowo, wskaźnik poziomu oświetlenia powinien być wyłączony. Należy użyć miernika poziomu dźwięku, aby potwierdzić stały poziom szumu tła w każdej komorze.

Następnie należy skalibrować sygnał dźwiękowy używany podczas szkolenia. Do kalibracji poziomu wstrząsu należy użyć zewnętrznego urządzenia kalibracyjnego. Umieść jeden przewód na pręcie, a drugi trzy lub cztery pręty dalej.

Użyj generatora wstrząsów, aby podać impuls i przeprowadź kalibrację, aż do osiągnięcia odpowiedniego poziomu. Powtórz ten krok dla każdej komory warunkowania lękowego. Po przygotowaniu aparatury przenieś osobniki do pomieszczenia przechowalniczego, oddzielonego od pomieszczenia testowego, aby zminimalizować nadmierny stres związany z manipulacją zwierzętami.

Przed przeprowadzeniem badania należy oznakować ogony myszy co najmniej 30 minut przed testem lub w dniu poprzedzającym. Po przygotowaniu do rozpoczęcia procedury, przenieś badaną mysz do czystej, oznakowanej klatki w celu transportu do komory warunkowania lękowego. Umieść mysz w komorze, zamknij drzwiczki i uruchom program komputerowy.

Pierwszego dnia treningu myszy mogą przez trzy minuty eksplorować komorę. Następnie oprogramowanie emituje sygnał dźwiękowy przez 22 s, po którym następuje 22-sekundowy interwał śledzenia kończący się łagodnym wstrząsem stóp. Należy obserwować badany obiekt, aby potwierdzić, że otrzymał on bodziec awersyjny.

Pięć prób warunkowania oddzielają 202-sekundowe odstępy między próbami. Po zakończeniu prób należy pozwolić zwierzęciu pozostać w komorze testowej przez jedną minutę przed wyjęciem, a następnie umieścić je z powrotem w klatce transportowej i przenieść do pomieszczenia z klatkami. Jeśli w klatce domowej znajdują się kolejne myszy do indywidualnego przetestowania, należy przetrzymywać mysz do czasu, aż wszystkie zwierzęta przejdą testy.

Oczyść komorę testową 30% izopropanolem w ramach przygotowania do badania kolejnego zwierzęcia. Powtarzaj te kroki, aż wszystkie myszy zostaną przeszkolone. Przenieś wszystkie myszy z powrotem do pomieszczenia kolonii.

Po przetestowaniu ostatniej myszy z kohorty, następnego dnia przeprowadzane są badania pamięci śladowej lęku. Tego dnia należy zastąpić ściółkę w klatkach transferowych pociętym papierem, aby zmienić ich kontekst.

Zmieniono również kontekst komory. Aby zmienić teksturę i wygląd podłoża, należy umieścić arkusz pianki pod przezroczystą akrylową wkładką na dnie. Wewnątrz obszaru testowego należy umieścić akrylową przegrodę.

Zmień zapach, umieszczając ekstrakt z wanilii w korytku na serwatkę pod podłogą. W tym dniu, pomiędzy każdą myszą, czyść komorę 70% etanolem zamiast 30% izopropanolu. Po przygotowaniu umieść mysz w komorze testowej i uruchom program.

Sesja rozpoczyna się od dwuminutowego okresu bazowego, po którym następują trzy prezentacje sygnałów dźwiękowych. Pomiędzy każdą prezentacją sygnału występuje 222-sekundowy odstęp między próbami. Po zakończeniu sesji myszy należy zwrócić do ich klatek domowych i kontynuować procedurę, aż wszystkie zwierzęta zostaną przebadane w ramach przygotowania do testów w dniu następnym.

Przywróć ten sam kontekst, który był stosowany pierwszego dnia. Oczyść komorę 30% izopropanolem. Kondycjonowanie kontekstowe przeprowadza się trzeciego dnia.

Używając tych samych klatek transportowych co pierwszego dnia, należy odebrać mysz testową z pomieszczenia utrzymaniowego. Umieść mysz w komorze testowej, a następnie uruchom program do badania pamięci kontekstowej. Uruchom program rejestrujący zachowania zamarcia (freezing) przez osiem minut.

Po tym czasie należy zwrócić myszy do ich klatki domowej i kontynuować testowanie zgodnie z wcześniejszym opisem; reprezentatywne wyniki wykazują wzrost zachowań zamierania u zwierząt poddanych parowaniu sygnału dźwiękowego z wstrząsem w miarę trwania sesji treningowej. W nowym kontekście myszy, które otrzymały awersyjny bodziec w postaci wstrząsu, wykazywały częstsze zamieranie w porównaniu z myszami, które nie otrzymały wstrząsu podczas bazowego śledzenia sygnału dźwiękowego oraz w odstępach między próbami. Po powrocie do pierwotnego kontekstu zwierzęta poddane awersyjnemu bodźcowi w postaci wstrząsu wykazywały konsekwentnie wyższy poziom zachowań zamierania w ciągu ośmiominutowego okresu.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykorzystania warunkowania lękowego z odstępem czasowym (trace fear conditioning) w celu zrozumienia procesów uczenia się i pamięci zależnych od hipokampa u myszy.