Name: Proteomika oddolna i proteomika typu shotgun w celu zidentyfikowania kompleksowego proteomu ślimakowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Poznaj zaawansowane techniki proteomiki oddolnej i typu shotgun w analizie ślimaka u myszy. Metoda ta umożliwia identyfikację błonowych i rozpuszczalnych białek, wzbogacając dane o proteomie narządu słuchu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Dr. Kentowi Seeleyowi, dyrektorowi Centrum Odkrywania i Innowacji Leków (CDDI) Proteomics Core Facility na Uniwersytecie Południowej Florydy za korzystanie z tego obiektu. Prace te były wspierane przez grant NIH/NIDCD R01 DC004295 dla B.H.A.S.

Oświadczenie etyczne
Eksperymenty z użyciem tkanek myszy zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Południowej Florydy (Protokoły 3931R, 3482R) zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health.
1. Ekstrakcja białka
<ol>
	<li>Wyizolować nabłonek czuciowy ślimaka od 16 30-dniowych (P30) myszy CBA/J i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>W dniu eksperymentu przemyć tkankę 500 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wirować przez 3 minuty przy 1 000 x g i usunąć supernatant. Powtórz w sumie trzy prania.</li>
	<li>Sonikować tkankę przez 30 sekund na lodzie w 100 μl buforu do lizy zawierającego 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 120 mM NaCl, 50 mM NaF, 5 mM EDTA, 500 μg/ml AEBSF, 10 μg/ml leupeptyny, 100 μg/ml pepstatyny, 2 μg/ml aprotyniny i 0,5 μg/ml mikrocystyny za pomocą dysmembratora sonicznego (Model 100; Thermo Fisher). Schłodzić lizat na lodzie przez 1 minutę między każdą sonikacją. Sonikuj w sumie 3x.</li>
	<li>Odwirować ekstrakt w temperaturze 750 x g w temperaturze 4 °C przez 2 minuty i usunąć supernatant do nowej mikroprobówki. Wyekstrahować osad w 50 μl buforu do lizy, sonikując przez 30 sekund na lodzie. Odwirować ekstrakt w temperaturze 750 x g w temperaturze 4 °C przez 2 min. Połączyć oba lizaty i odwirować w temperaturze 28 600 x g w temperaturze 4 °C przez 60 minut. Usunąć supernatant do nowej mikroprobówki i dodać 20 μl buforu do lizy zawierającego 0,1% ASB-14 do osadu. Wirować przez 1 minutę i inkubować przez 60 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Podgrzewać próbkę w temperaturze 95 °C przez 5 minut, następnie schładzać w temperaturze 4 °C przez 60 minut. Następnie odwirowywać w temperaturze 16 000 x g w temperaturze 25 °C przez 10 minut. Zebrać supernatant i przenieść do nowej probówki.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę o sile 16 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i zachować supernatant do roztrawienia.</li>
</ol>
2. Podwójne trawienie białka tryptycznego całego lizatu za pomocą FASP
<ol>
	<li>Dodać 30 μl podwielokrotności (≤400 μg) ekstraktu z białka ślimaka, zawierającego 4% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 i 0,1 M ditiotreitolu (DTT) bezpośrednio do filtra wirowego 30K i wymieszać z 200 μl 8 M mocznika w Tris-HCl. Wirować przy 14 000 x g przez 15 min.</li>
	<li>Rozcieńczyć koncentrat 200 μl 8 M roztworu mocznika i odwirować przy 14 000 x g przez 15 minut.</li>
	<li>Dodać 10 μl 10x jodoacetamidu (IAA) w 8 M roztworze mocznika do koncentratu w filtrze i wirować przez 1 min. Inkubować filtr wirowy przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT) w ciemności, a następnie odwirować w 14 000 x g przez 10 min.</li>
	<li>Dodać 100 μl 8 M roztworu mocznika do koncentratu na jednostce filtrującej i odwirować przy 14 000 x g przez 15 minut. Powtórz ten krok 2x. Dodać 100 μl 50 mM roztworu wodorowęglanu amonu (ABC) do jednostki filtrującej i odwirować przy 14 000 x g przez 10 min. Powtórz ten krok 2x.</li>
	<li>Dodać 0,4 μg/μl trypsyny w stosunku enzymu do białka 1:100 (w/w) i inkubować przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po inkubacji dodać 40 μl 50 mM roztworu ABC do jednostki filtrującej i odwirować przy 14 000 x g przez 10 min. Powtórz ten krok 1x.</li>
	<li>Dodać 50 μl 0,5 M roztworu NaCl do filtra wirowego i odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut. Przenieść filtrat zawierający peptydy tryptyczne do świeżej mikroprobówki i zakwasić kwasem mrówkowym (FA) do 1,0%, aby zatrzymać trawienie.</li>
	<li>Umyj jednostkę filtrującą 40 μl 8 M mocznika, a następnie przemyj 2x 40 μl 18 MΩ wody.</li>
	<li>Umyć jednostkę filtrującą 3x 100 μl 50 mM roztworu ABC. Po ostatnim płukaniu dodać 0,4 μg/μl trypsyny w stosunku enzymu do białka 1:100 (w/w) i inkubować O/N w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Eluować peptydy tryptyczne z drugiego trawienia, dodając 40 μl 50 mM roztworu ABC do jednostki filtrującej i odwirować przy 14 000 x g przez 10 min. Powtórz ten krok 1x.</li>
	<li>Dodać 50 μl 0,5 M roztworu NaCl do jednostki filtrującej i odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut. Przenieść filtrat zawierający peptydy tryptyczne do świeżej mikroprobówki i zakwasić FA do 1,0%.</li>
	<li>Próbki można oznaczyć ilościowo za pomocą testu kolorymetrycznego na mikropłytkach przy użyciu BSA jako wzorca.</li>
</ol>
3. Endoproteinaza LysC i tryptyczne trawienie całego lizatu za pomocą FASP
<ol>
	<li>Dodać 30 μl podwielokrotności (≤400 μg) ekstraktu białka ślimaka zawierającego 4% SDS, 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 i 0,1 M DTT bezpośrednio do filtra wirowego 30K i wymieszać z 200 μl 8 M mocznika w Tris-HCl. Wirować przy 14 000 x g przez 15 min.</li>
	<li>Rozcieńczyć koncentrat 200 μl 8 M roztworu mocznika i odwirować przy 14 000 x g przez 15 minut.</li>
	<li>Dodać 10 μl 10x IAA w 8 M roztworze mocznika do koncentratu w filtrze i wirować przez 1 min. Inkubować filtr wirowy przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, a następnie odwirować przy 14 000 x g przez 10 min.</li>
	<li>Dodać 100 μl 8 M roztworu mocznika do koncentratu na jednostce filtrującej i odwirować przy 14 000 x g przez 15 min. Powtórzyć ten krok 2x. Dodać 100 μl 100 mM roztworu ABC do jednostki filtrującej i odwirować przy 14 000 x g przez 10 min. Powtórz ten krok 2x.</li>
	<li>Dodać 0,1 μg/μl endoproteinazy LysC w stosunku 1:50 (w/w) enzymu do białka i inkubować O/N w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Po inkubacji dodać 40 μl 100 mM roztworu ABC do jednostki filtrującej i odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut. Powtórz ten krok 1x.</li>
	<li>Dodać 50 μl 0,5 M roztworu NaCl do filtra wirowego i odwirować przy 14 000 x g przez 10 min. Przenieść filtrat zawierający peptydy LysC do świeżej mikroprobówki i zakwasić FA do 1,0%, aby zatrzymać trawienie.</li>
	<li>Umyj jednostkę filtrującą 40 μl 8 M mocznika, a następnie przemyj 2x 40 μl 18 MΩ wody.</li>
	<li>Umyć jednostkę filtrującą 3x 100 μl 50 mM roztworu ABC. Po ostatnim płukaniu dodać 0,4 μg/μl trypsyny w stosunku enzym do białka 1:100 i inkubować O/N w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Elute peptydy tryptyczne przez dodanie 40 μl 50 mM roztworu ABC do jednostki filtrującej i odwirować przy 14 000 x g przez 10 min. Powtórz ten krok 1x.</li>
	<li>Dodać 50 μl 0,5 M roztworu NaCl do jednostki filtrującej i odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut. Przenieść filtrat zawierający peptydy tryptyczne do świeżej mikroprobówki i zakwasić 1,0% FA.</li>
	<li>Próbkę można określić ilościowo za pomocą testu kolorymetrycznego na mikropłytce z BSA jako wzorcem.</li>
</ol>
4. Odsalanie peptydów za pomocą wirujących kolumn
<ol>
	<li>Aktywować kolumnę C18 MacroSpin, dodając 500 μl acetonitrylu (ACN) i odwirować przy 1 100 x g przez 1 minutę. Po odwirowaniu odrzucić przepływ.</li>
	<li>Zrównoważyć kolumnę z 500 μl 0,1% FA i odwirować przy 1,100 x g przez 1 min. Odrzucić przepływ i powtórzyć ten krok 1x.</li>
	<li>Dodać do 500 μl roztworu peptydowego do kolumny i odwirować przy 1 100 x g przez 1 min. Jeżeli objętość próbki jest większa niż 500 μl, należy powtórzyć ten krok.</li>
	<li>Przemyć kolumnę 500 μl 0,1% FA i odwirować przy 1,100 x g przez 1 minutę. Wyrzucić przepływ. Powtórz ten krok 1x.</li>
	<li>Dodać do kolumny 250 μl ACN w stosunku 90:10 do wody i odwirować przy 1 100 x g przez 1 min. Zebrać eluent zawierający odsolone peptydy i przenieść do świeżej mikroprobówki. Powtórz ten krok 1x.</li>
	<li>Wysuszyć odsoloną próbkę peptydu w wirówce próżniowej i nie dopuścić do całkowitego wyschnięcia próbki.</li>
</ol>
5. Chromatografia jonowymienna
<ol>
	<li>Wstrzyknąć 50-100 μg strawionej próbki białka do kolumny SCX (polisulfoetylo A) o wymiarach 200 x 2,1 mm i 5 μm, aby oddzielić peptydy.</li>
	<li>Stosować gradient 2-40% B przez 50 minut przy natężeniu przepływu 250 μl/min. Rozpuszczalnik A to 5 mM mrówczanu amonu, pH 3,0 w 25% acetonitrylu i 75% ddH2O. Rozpuszczalnik B to 500 mM mrówczanu amonu, pH 6,0 w 25% ACN i 75% ddH2O.</li>
	<li>Monitorować frakcje peptydowe przy 280 nm i zbierać frakcje w odstępach 2-minutowych za pomocą kolektora frakcji.</li>
	<li>Wysuszyć frakcje w koncentratorze próżniowym i ponownie zawiesić w 500 μl 50% acetonitrylu w ddH2O zawierającym 5% FA, aby pomóc w usuwaniu soli.</li>
	<li>Ponownie wysuszyć frakcje i przechowywać w temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do użycia do analizy nano LC-MS/MS.</li>
</ol>
6. Opady acetonu
Przed separacją GELFrEE supernatant białka ślimaka musi zostać odsolony. Wytrącanie acetonu może być stosowane do odsalania i zagęszczania białek.
<ol>
	<li>Dodać trzy objętości lodowatego acetonu do supernatantu ślimaka. Delikatnie przetrząsnąć i inkubować w temperaturze -20 °C O/N.</li>
	<li>Odwirować mieszaninę próbki o masie 15 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.</li>
	<li>Przemyć granulki białkowe 3x schłodzonym acetonem i odwirować w temperaturze 14 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wysuszyć granulat na powietrzu i rozpuścić w 112 μl wody o pojemności 18 MΩ.</li>
	<li>Określić stężenie białka za pomocą testu kolorymetrycznego na mikropłytce.</li>
</ol>
7. GELFrEE Frakcjonowanie nabłonka czuciowego ślimaka
<ol>
	<li>Dodać 30 μl 5x buforu próbki (0,25 M Tris-HCl pH 6,8, 10% (w/v) SDS, 50% glicerolu, 0,5% (w/v) błękitu bromofenolowego) do odsolonego białka zawieszonego w 112 μl 18 MΩ wody.</li>
	<li>Dodać 8 μl 1M DTT i podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 5 minut, aby zredukować wiązania dwusiarczkowe białek. Po podgrzaniu pozostawić do ochłodzenia do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Dodać 8 ml buforu roboczego do zbiornika anody, 150 μl buforu roboczego do komory pobierania próbek i 6 ml buforu roboczego do zbiornika katody.</li>
	<li>Usunąć za pomocą pipety bufor, który mógł przepłynąć do komory ładowania próbki.</li>
	<li>Załadować 150 μl (≤1 mg) mieszaniny białek ślimaka do komory ładowania próbki za pomocą 8% wkładu z octanem trisu o zakresie masowym 3,5-150 kDa.</li>
	<li>Opuść elektrody i zamknij pokrywę instrumentu, aby rozpocząć bieg.</li>
	<li>Przy pierwszej przerwie w działaniu przyrządu dodać 2 ml buforu roboczego do zbiornika katodowego i wznowić pracę.</li>
	<li>W każdym odstępie czasu na urządzeniu należy pobrać próbkę z komory pobierania próbek za pomocą pipety i dodać do świeżo oznakowanej mikroprobówki. Przemyć komorę zbiorczą 2x 150 μl bieżącego buforu i wyrzucić.</li>
	<li>Dodać 150 μl świeżo uruchomionego buforu do komory pobierania próbki i wznowić pracę. Frakcje białkowe należy zbierać w czasie 2,6 godziny w łącznej objętości 150 μl/frakcję.</li>
</ol>
8. Elektroforeza żelowa 1D frakcji GELFrEE
Elektroforeza żelowa 1D może być użyta do wizualizacji wyników frakcjonowania GELFrEE przed mineralizacją enzymatyczną i analizą MS. Frakcje białkowe GELFrEE można rozdzielić na 4-15% żelu Tris-HCl.
<ol>
	<li>Zmieszać 5 μl podwielokrotności każdej frakcji GELFrEE z 5 μl buforu rozcieńczającego próbkę (350 mM DTT w buforze próbki).</li>
	<li>Podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 3 minuty.</li>
	<li>Fajne próbki do RT.</li>
	<li>Załadować 10 μl każdej frakcji GELFrEE w poszczególne pasy żelu i załadować 5 μl wzorca masy cząsteczkowej w ostatnim niewykorzystanym pasie.</li>
	<li>Uruchom żel pod napięciem 125 V przez 1,5 godziny lub do momentu, gdy przód barwnika dotrze do dna żelu.</li>
	<li>Ostrożnie usuń żel i zaplamić za pomocą Silver Stain Plus, aby uwidocznić separację białek.</li>
</ol>
9. Trawienie białek frakcji GELFrEE za pomocą FASP
Zmodyfikowana procedura FASP jest używana do usuwania detergentów i trawienia frakcji GELFrEE.
<ol>
	<li>Dodać każdą pojedynczą frakcję bezpośrednio do jednostki filtrującej o temperaturze 30 K; wymieszać z 200 μl 8 M mocznika w Tris-HCl i odwirować przy 14 000 x g przez 25 minut.</li>
	<li>Rozcieńczyć koncentrat 200 μl roztworu mocznika i odwirować przy 14 000 x g przez 12 minut. Powtórzyć ten krok 1x.</li>
	<li>Dodać 10 μl 10x IAA w roztworze mocznika do koncentratu w każdej jednostce filtrującej, wirować przez 1 minutę i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu mocznika do koncentratu na jednostkach filtracyjnych i odwirować przy 14 000 x g przez 15 min. Powtórz ten krok 2x. Dodać 100 μl 100 mM roztworu ABC do jednostek filtrujących i odwirować przy 14 000 x g przez 10 min. Powtórz ten krok 2x.</li>
	<li>Dodać 0,1 μg/μl LysC, aby uzyskać stosunek enzymu do białka 1:50 (w/w) do jednostek filtrujących i inkubować O/N w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Po inkubacji dodać 40 μl 100 mM roztworu ABC do filtrów wirowych i odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut. Powtórz ten krok 1x.</li>
	<li>Dodać 50 μl 0,5 M roztworu NaCl do filtrów wirowych i odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut. Przenieść filtrat zawierający peptydy LysC z każdego filtra wirowego do świeżej mikroprobówki i zakwasić kwasem trifluorooctowym (TFA).</li>
	<li>Umyj filtry wirowe 40 μl 8 M mocznika, a następnie przemyj 2x 40 μl 18 MΩ wody.</li>
	<li>Umyj filtry wirowe 3x 100 μl 50 mM roztworu ABC. Po ostatnim płukaniu dodać 0,4 μg/μl trypsyny w stosunku enzym do białka 1:100 (w/w) i inkubować O/N w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Eluować peptydy tryptyczne z każdej jednostki filtracyjnej, dodając 40 μl 50 mM roztworu ABC i odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut. Powtórz ten krok 1x.</li>
	<li>Dodać 50 μl 0,5 M roztworu NaCl do jednostek filtrujących i odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut. Przenieść filtrat zawierający peptydy tryptyczne z każdej jednostki filtrującej do świeżej mikroprobówki i zakwasić TFA.</li>
	<li>Wysuszyć wszystkie składniki mineralne w koncentratorze próżniowym.</li>
</ol>
10. Przygotowanie próbki dla LC-MS/MS
<ol>
	<li>Rozpuścić wysuszony LysC i peptyd tryptyczny, trawić frakcje w 20 μl 0,1% FA i wirować.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 20 000 x g przez 10 minut i usunąć górne 95% próbki do nowej fiolki na próbkę.</li>
	<li>Wstrzyknąć 5 μl każdej frakcji peptydowej do pułapki na próbki o wymiarach 100 μm x 25 mm w celu usunięcia soli i zanieczyszczeń, a następnie przeprowadzić separację chromatograficzną w kolumnie C18 o wymiarach 75 μm × 10 cm.</li>
	<li>Stosować gradient 2-40% B przez 100 minut przy natężeniu przepływu 200 nl/min. Rozpuszczalnik A to 95% ddH2O, a 5% acetonitryl zawiera 0,1% FA. Rozpuszczalnik B to 80% ACN, a 20% ddH2O zawiera 0,1% FA.</li>
	<li>Zbierz dziesięć tandemowych widm masowych dla każdego skanu MS na spektrometrze mas o wysokiej rozdzielczości. W tym eksperymencie użyto spektrometru mas LTQ Orbitrap.</li>
</ol>
11. Identyfikacja białka
<ol>
	<li>Identyfikacja białek za pomocą mysiej bazy danych UniProt zawierającej zarówno sekwencje białek do przodu, jak i do tyłu oraz typowe zanieczyszczenia. Do przeszukiwania bazy danych białek wykorzystywane jest oprogramowanie MaxQuant z wyszukiwarką MASCOT.</li>
	<li>Parametry wyszukiwania, które można zastosować, obejmują: stałą modyfikację karbamidometylu cysteiny, zmienne modyfikacje utleniania metioniny, N-końcową acetylację białek, maksymalnie 2 pominięte rozszczepienia. Minimalna długość peptydu, którą należy wziąć pod uwagę przy identyfikacji, to 6 aminokwasów. Wprowadzić błąd stężenia masowego peptydu wynoszący ±8 ppm i tolerancję masy fragmentu wynoszącą 1,2 Da (błąd masy zależy od używanego spektrometru mas).</li>
	<li>W oprogramowaniu MaxQuant należy użyć 1% współczynnika fałszywych wykryć (FDR) do identyfikacji peptydów i białek. Identyfikacja białka jest podana za pomocą liczby dopasowanych peptydów, procentowego pokrycia sekwencji białka i sekwencji peptydów.</li>
</ol>

<ol><li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+-+Mass+spectrometry+and+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Review - Mass spectrometry and protein analysis.</a> Science. 312, 212-217 (2006).</li>
<li>Jamesdaniel, S., Hu, B., Kermany, M. H., Jiang, H., Ding, D., Coling, D., Salvi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+induced+changes+in+the+expression+of+p38%2FMAPK+signaling+proteins+in+the+sensory+epithelium+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Noise induced changes in the expression of p38/MAPK signaling proteins in the sensory epithelium of the inner ear.</a> J. Proteomics. 75, 410-424 (2011).</li>
<li>Thalmann, I., Hughes, I., Tong, B. D., Ornitz, D. M., Thalmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+analysis+of+proteins+in+inner+ear+tissues+and+fluids+with+emphasis+on+endolymphatic+sac%2C+otoconia%2C+and+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Microscale analysis of proteins in inner ear tissues and fluids with emphasis on endolymphatic sac, otoconia, and organ of Corti.</a> Electrophoresis. 27, 1598-1608 (2006).</li>
<li>Thalmann, I., Rosenthal, H. L., Moore, B. W., Thalmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+of+Corti-specific+polypeptides%3A+OCP-I+and+OCP-II%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Acoust.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Organ of Corti-specific polypeptides: OCP-I and OCP-II.</a> J. Acoust. Soc. Am. 67, (1980).</li>
<li>Kathiresan, T., Harvey, M., Sokolowski, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKathiresan%2C+T+%22The+use+of+two-dimensional+gels+to+identify+novel+protein-protein+interactions+in+the+cochlea.+In+Auditory+and+vestibular+research+%3A+methods+and+protocols%22">The use of two-dimensional gels to identify novel protein-protein interactions in the cochlea. In Auditory and vestibular research : methods and protocols</a>. , Humana ; Springer. New York, N.Y. (2009).</li>
<li>Zheng, Q. Y., Rozanas, C. R., Thalmann, I., Chance, M. R., Alagramam, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+ear+proteomics+of+mouse+models+for+deafness%2C+a+discovery+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Inner ear proteomics of mouse models for deafness, a discovery strategy.</a> Brain Res. 1091, 113-121 (2006).</li>
<li>Peng, H., Liu, M., Pecka, J., Beisel, K. W., Ding, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analysis+of+the+Organ+of+Corti+Using+Nanoscale+Liquid+Chromatography+Coupled+with+Tandem+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analysis of the Organ of Corti Using Nanoscale Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry.</a> Int. J. Mol. Sci. 13, 8171-8188 (2012).</li>
<li>Elkan-Miller, T., Ulitsky, I., Hertzano, R., Rudnicki, A., Dror, A. A., Lenz, D. R., Elkon, R., Irmler, M., Beckers, J., Shamir, R., Avraham, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Transcriptomics%2C+Proteomics%2C+and+MicroRNA+Analyses+Reveals+Novel+MicroRNA+Regulation+of+Targets+in+the+Mammalian+Inner+Ear%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Integration of Transcriptomics, Proteomics, and MicroRNA Analyses Reveals Novel MicroRNA Regulation of Targets in the Mammalian Inner Ear.</a> Plos One. 6, (2011).</li>
<li>Yang, Y., Dai, M., Wilson, T. M., Omelchenko, I., Klimek, J. E., Wilmarth, P. A., David, L. L., Nuttall, A. L., Gillespie, P. G., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B%2FK%2B-ATPase+%CE%B11Identified+as+an+Abundant+Protein+in+the+Blood-Labyrinth+Barrier+That+Plays+an+Essential+Role+in+the+Barrier+Integrity.+%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Na+/K+-ATPase α1Identified as an Abundant Protein in the Blood-Labyrinth Barrier That Plays an Essential Role in the Barrier Integrity. </a> Plos One. 6, (2011).</li>
<li>Shin, J. B., Streijger, F., Beynon, A., Peters, T., Gadzala, L., McMillen, D., Bystrom, C., Vander Zee, C. E., Wallimann, T., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+Bundles+Are+Specialized+for+ATP+Delivery+via+Creatine+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hair Bundles Are Specialized for ATP Delivery via Creatine Kinase.</a> Neuron. 53, 371-386 (2007).</li>
<li>Chen, Z. Y., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inner+ear+gene+expression+database%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">An inner ear gene expression database.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 3, 140-148 (2002).</li>
<li>Gabashvili, I. S., Sokolowski, B. H., Morton, C. C., Giersch, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channel+gene+expression+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Ion channel gene expression in the inner ear.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 305-328 (2007).</li>
<li>Horvatovich, P., Hoekman, B., Govorukhina, N., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry+in+analysing+complex+proteomics+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Multidimensional chromatography coupled to mass spectrometry in analysing complex proteomics samples.</a> J. Sep. Sci. 33, 1421-1437 (2010).</li>
<li>Ye, M. L., Jiang, X. G., Feng, S., Tian, R. J., Zou, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+chromatographic+techniques+and+methods+in+shotgun+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Advances in chromatographic techniques and methods in shotgun proteome analysis.</a> Trends Anal. Chem. 26, 80-84 (2007).</li>
<li>Wu, C. C., MacCoss, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+proteomics%3A+Tools+for+the+analysis+of+complex+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Shotgun proteomics: Tools for the analysis of complex biological systems.</a> Curr. Opin. Mol. Ther. 4, 242-250 (2002).</li>
<li>Bora, A., Anderson, C., Bachani, M., Nath, A., Cotter, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Two-Dimensional+Separation+of+Intact+Proteins+for+Bottom-Up+Tandem+Mass+Spectrometry+of+the+Human+CSF+Proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Robust Two-Dimensional Separation of Intact Proteins for Bottom-Up Tandem Mass Spectrometry of the Human CSF Proteome.</a> J. Proteome Res. 11, 3143-3149 (2012).</li>
<li>Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry%3A+Bottom-up+or+top-down%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry: Bottom-up or top-down.</a> Science. 314, 65-66 (2006).</li>
<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422, 198-207 (2003).</li>
<li>Reid, G. E., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+down%27+protein+characterization+via+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Top down' protein characterization via tandem mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 37, 663-675 (2002).</li>
<li>Han, X., Aslanian, A., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+for+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry for proteomics.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 483-490 (2008).</li>
<li>Thalmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+ear+proteomics%3A+A+fad+or+hear+to+stay%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Inner ear proteomics: A fad or hear to stay.</a> Brain Res. 1091, 103-112 (2006).</li>
<li>Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+significance+of+channels+and+transporters+expressed+in+the+inner+ear+and+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, (2007).</li>
<li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).</li>
<li>Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+ultrafiltration+units+for+proteomic+and+N-glycoproteomic+analysis+by+the+filter-aided+sample+preparation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method.</a> Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).</li>
<li>Darville, L. N., Sokolowski, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+Proteomic+Analysis+of+Mouse+Cochlear+Sensory+Epithelium+by+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry.</a> J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).</li>
<li>Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O'Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PRoteomics+IDEntifications+%28PRIDE%29+database+and+associated+tools%3A+status+in+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Kluczowymi krokami do maksymalizacji identyfikacji białek na podstawie nabłonka czuciowego ślimaka są: 1) zastosowanie wielu endoproteinaz do trawienia, 2) zastosowanie wielu technik separacji oraz 3) wykorzystanie spektrometru masowego o wysokiej rozdzielczości. Zastosowanie wielu enzymów zwiększa liczbę peptydów i poprawia pokrycie sekwencji białek, a tym samym poprawia liczbę zidentyfikowanych białek w tkance ślimaka. Trypsyna, najczęściej stosowana proteaza, zapewnia skuteczne i specyficzne rozszczepianie białek, gen...

Proteomika to badanie złożonych systemów biologicznych poprzez analizę ekspresji, funkcji, modyfikacji i interakcji białek1. Do analizy proteomu ucha wewnętrznego wykorzystano kilka metod, w tym mikromacierzprzeciwciał 2, dwuwymiarową elektroforezę żelową3-5 i DIGE6. Jednak tylko ograniczona liczba białek została zidentyfikowana i scharakteryzowana2,7-10, w porównaniu z ponad 10 000 genów i wyrażonych znaczników sekwencji (EST) zidentyfikowanych w uchu wewnętrznym11,12, SM jest najczęściej stosowaną i wszechstronną techniką w proteomice do charakteryzacji białek. Analiza złożonych próbek proteomicznych, takich jak ślimak, może być trudna. Jednak połączenie wielu technik separacji ze stwardnieniem rozsianym umożliwia identyfikację większej liczby peptydów i białek, ze względu na zwiększony zakres stężeń dynamicznych i pojemność szczytową13. Chromatografia wielowymiarowa redukuje wysoce złożone mieszaniny białek, umożliwiając zastosowanie różnych mechanizmów adsorpcji. Istnieją dwa powszechnie stosowane podejścia do analizy proteomu stwardnienia rozsianego: proteomika typu shotgun i proteomika oddolna. W proteomice typu shotgun mieszanina nienaruszonych białek jest trawiona enzymatycznie i rozdzielana za pomocą chromatografii wielowymiarowej z silną chromatografią kationowymienną (SCX), a następnie chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RPLC)14,15. Rozdzielone peptydy poddaje się tandemowemu przeszukiwaniu MS i baz danych15. Główną zaletą tej techniki jest to, że w jednej analizie można zidentyfikować tysiące białek, a technika ta jest lepiej dostosowana do białek błonowych.
W podejściu oddolnym, mieszanina białek jest rozdzielana, zwykle przez jedno- lub dwuwymiarową elektroforezę, a poszczególne pasma białkowe lub plamki są wycinane i trawione za pomocą enzymu takiego jak trypsyna, co zwykle prowadzi do powstania wielu peptydów. Jednak innym, nowszym podejściem elektroforetycznym, stosowanym w proteomice oddolnej, jest GELFrEE. Technika ta frakcjonuje próbki białek w fazie ciekłej i sprawia, że są one mniej złożone przed analizą. Technika ta jest powtarzalna, zapewnia wysoki odzysk białka i zmniejsza dystrybucję białek o dużej obfitości w złożonych próbkach białek16. Peptydy, powstałe z oddzielonych białek, są analizowane przez MS za pomocą odcisków palców masy peptydowej lub tandemu MS (MS/MS), w celu stworzenia znaczników sekwencji do przeszukiwania bazy danych17-19. Niektóre z głównych zalet stosowania podejścia oddolnego to możliwość uzyskania separacji w wysokiej rozdzielczości i kompleksowe pokrycie białkami. Proteomika oddolna jest najczęściej stosowaną techniką w proteomice20, stąd dostępnych jest kilka narzędzi bioinformatycznych. Ponadto białka można rozdzielić w złożonej mieszaninie przed trawieniem, dzięki czemu istnieje większa szansa na identyfikację.
Jednym z głównych wyzwań związanych z używaniem ucha wewnętrznego do analizy proteomicznej jest jego mały rozmiar, ograniczona dostępność i różnorodność typów komórek21. Ponadto kluczowymi białkami, które wyróżniają jego funkcjonalność, takimi jak kanały jonowe, transportery i receptory, są białka błonowe, które mogą być trudne do wyizolowania22. W związku z tym przygotowanie próbki wspomagane filtrem (FASP) jest korzystne w analizach proteomicznych tkanek, które są ograniczone do ekstrakcji białek i które wymagają detergentów do rozpuszczania błon23. Filtrowanie to pozwala na analizę MS białek błonowych i rozpuszczalnych oraz na zdolność do izolowania peptydów z zanieczyszczeń o niskiej masie cząsteczkowej23,24.
Obecny protokół opisuje powszechnie stosowane podejścia proteomiczne, które są łączone i modyfikowane w celu analizy białek rozpuszczalnych i błonowych oraz maksymalizacji liczby identyfikatorów białek z nabłonka czuciowego ślimaka. Opiszemy stosowanie proteomiki typu shotgun z wielotrawieniem FASP, chromatografią jonowymienną, MS o wysokiej rozdzielczości i analizą danych. Ponadto opiszemy proteomikę oddolną z GELFrEE, multi-digestionem FASP, stwardnieniem rozsianym o wysokiej rozdzielczości i analizą danych.

<table><tbody><tr><td>Wkład 8% z octanu tris&nbsp;</td><td>Protein Discovery</td><td>42103</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Honeywell</td><td>015-1L</td><td></td></tr><tr><td>AEBSF</td><td>Calbiochem</td><td>101500</td><td></td></tr><tr><td>Mrówczan amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC16861</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Calbiochem</td><td>616370</td><td></td></tr><tr><td>ASB-14&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>182750-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>BioRad</td><td>500-0112</td><td></td></tr><tr><td>C18 kolumna&nbsp;</td><td>Nowy cel</td><td>A25112</td><td>75 &mu; m x 10 cm&nbsp;</td></tr><tr><td>Test białka DC</td><td>BioRad</td><td>500-0116</td><td>Protokół testu mikropłytek</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Endoproteinaza Lys-C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3428</td><td></td></tr><tr><td>FASP Zestaw do trawienia białek</td><td>Protein Discovery</td><td>44250</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy&nbsp;</td><td>Fluka</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>System frakcjonowania GELFrEE</td><td>Odkrycie białka</td><td>42001</td><td>GELFrEE 8100</td></tr><tr><td>Leupeptyna</td><td>Calbiochem</td><td>108975</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna makrospinowa</td><td>Grupa Nest</td><td>SMM SS18V</td><td>Krzemionka C18</td></tr><tr><td>Mikrocystyna</td><td>Calbiochem</td><td>475815</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna polisulfoetylu A</td><td>Grupa Nest</td><td>202SE0503</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Rozszyfrowywanie soniczne&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>15-338-53</td><td>Model 100</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6567</td><td>Klasa proteomiczna</td></tr></tbody></table>

proteomika oddolna i proteomika typu shotgun w celu zidentyfikowania kompleksowego proteomu ślimakowego

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

Proteomika to powszechnie stosowane podejście, które może dostarczyć wglądu w złożone systemy biologiczne. Nabłonek czuciowy ślimaka zawiera receptory, które przekształcają energię mechaniczną dźwięku w energię elektrochemiczną przetwarzaną przez obwodowy i ośrodkowy układ nerwowy. Opracowano kilka technik proteomicznych do badania ucha wewnętrznego ślimaka, takich jak dwuwymiarowa elektroforeza żelowa różnicowa (2D-DIGE), mikromacierz przeciwciał i spektrometria mas (MS). MS jest najbardziej wszechstronnym i wszechstronnym narzędziem w proteomice, a w połączeniu z metodami separacji może zapewnić dogłębny proteom próbek biologicznych. Metody separacji w połączeniu ze stwardnieniem rozsianym mają zdolność wzbogacania próbek białek, wykrywania białek o niskiej masie cząsteczkowej i białek hydrofobowych oraz identyfikacji białek o niskiej liczebności poprzez zmniejszenie zakresu dynamiki proteomu. Do całego lizatu lub frakcjonowanego lizatu białkowego można zastosować różne strategie trawienia w celu zwiększenia pokrycia sekwencji peptydów i białek. Wykorzystanie różnych technik separacji, w tym silnej wymiany kationowej (SCX), odwróconej fazy (RP) i elektroforezy uwięzionej w żelu frakcji ciekłej (GELFrEE) może być stosowane w celu zmniejszenia złożoności próbki przed analizą MS w celu identyfikacji białka.

Aby uzyskać jak najbardziej kompleksowy proteom nabłonka sensorycznego ślimaka, niezbędna jest szybka dyssekcja tkanki przed ekstrakcją białek i przygotowaniem próbek. Można zastosować dwie techniki proteomiczne: proteomikę typu shotgun oraz proteomikę bottom-up. W celu przygotowania próbek do proteomiki typu shotgun zastosowano procedurę trawienia FASP, zgodnie z ilustracją na Rysunku 1. Metoda FASP umożliwia zagęszczanie białek, usuwanie detergentów oraz trawienie białek przy użyciu wielu enzymów. Zast...

Analiza proteomu nabłonka czuciowego ślimaka może być trudna ze względu na jego mały rozmiar oraz dlatego, że białka błonowe są trudne do wyizolowania i zidentyfikowania. Zarówno białka błonowe, jak i rozpuszczalne można zidentyfikować, łącząc wiele metod preparatywnych i technik separacji wraz ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości.

Proteomika oddolna i proteomika typu shotgun w celu zidentyfikowania kompleksowego proteomu ślimakowego

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest uzyskanie jak największej liczby identyfikacji białek z nabłonka sensorycznego ślimaka za pomocą różnych technik proteomicznych. W pierwszym etapie izoluje się ślimaka oraz nabłonek sensoryczny od dorosłych myszy, a w drugim etapie poddaje się je sonikacji w buforze do lizy w celu uzyskania białek. W celu zwiększenia pokrycia sekwencji peptydów i białek stosuje się różne strategie trawienia w odniesieniu do całego lizatu lub do frakcjonowanego lizatu białkowego.Następnie wykorzystuje się różne techniki rozdziału, w tym silną wymianę kationową oraz chromatografię odwrotnej fazy, aby zmniejszyć złożoność próbek przed analizą za pomocą spektrometrii mas. Wyniki wykazują identyfikację licznej grupy białek błonowych i rozpuszczalnych w nabłonku sensorycznym ślimaka myszy dzięki zastosowaniu wielu podejść proteomicznych oraz spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroarrays przeciwciał i dwuwymiarowa elektroforeza żelowa, jest możliwość identyfikacji dużej liczby białek zarówno rozpuszczalnych, jak i błonowych, co zwiększa zakres danych proteomu ślimaka.Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat biomarkerów związanych z zaburzeniami słuchu i łzawienia, może zostać ona zastosowana również do innych układów, np. do identyfikacji biomarkerów związanych z wiekiem oraz rakiem piersi lub płuc. Metodę tę można również wykorzystać do badania innych próbek biologicznych, takich jak krew. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zauważyliśmy ograniczony zakres dostępnych danych proteomicznych z wewnętrznego ucha ssaków, a w szczególności niewielką liczbę białek błonowych zidentyfikowanych przed rozpoczęciem tej procedury.Wyizolować nabłonek sensoryczny ślimaka od myszy w 30. dniu po urodzeniu. Po przemyciu tkanki buforem fosforanowym 1x, dodać do tkanki 100 µL buforu lizującego i sonikować mieszaninę przez 30 sekund w lodzie przy użyciu sonikatora. Chłodzić lizat w lodzie przez jedną minutę pomiędzy każdą sonikacją, a następnie sonikować próbkę łącznie trzy razy.Zawiesinę wirowano przy 16,000 ×g w temperaturze 4 °C przez pięć minut. Po zakończeniu wirowania należy zachować nadsącz do trawienia. Następnie 30 µL aalikwotę ekstraktu białkowego z ślimaka dodaje się bezpośrednio do filtra wirowego 30 K i miesza z 200 µL 8 M mocznika w wirówce Riss HCL.Wiruj mieszaninę z prędkością 14 000 ×g przez 15 minut. Po zakończeniu rozcieńcz koncentrat 200 µL roztworu mocznika o stężeniu 8 M i powtórz wirowanie w tych samych warunkach co poprzednio. Następnie do koncentratu w filtrze dodaj 10 µL acetamidu 10 XI oto oraz 90 µL roztworu mocznika o stężeniu 8 M i mieszaj w wstrząsarze wierzchołkowym przez jedną minutę.Po umieszczeniu filtra wirowego w statywie do mikrowirówki, należy inkubować go przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności po wirowaniu przy 14 000 ×g przez 10 minut w obecności 0,1 µg/µL endoproteazy Lys-C w stosunku enzymu do białka 1:50, a następnie inkubować mieszaninę przez noc w temperaturze 30 °C. Po zakończeniu należy dodać 40 µL 100 mM roztworu wodorowęglanu amonu do jednostki filtra i wirować mieszaninę przy 14 000 ×g przez 10 minut. Po powtórzeniu poprzedniego kroku jednostkę filtra należy przemyć 40 µL 8 M mocznika. Następnie jednostkę filtra należy przemyć dwukrotnie 40 µL wody Milli-Q.Po trzykrotnym przemyciu jednostki filtrującej 100 µL 50 mM roztworu wodorowęglanu amonu, dodać trypsynę o stężeniu 0,4 µg/µL w stosunku enzymu do białka 1:100 i inkubować mieszaninę przez noc w temperaturze 37 °C. Po inkubacji eluować peptydy tryptyczne, dodając do jednostki filtrującej 40 µL 50 mM roztworu wodorowęglanu amonu, a następnie wirować mieszaninę z prędkością 14 000 ×g przez 10 minut. Następnie powtórzyć ten krok jeszcze raz.Na tym etapie należy wprowadzić od 50 do 100 µg próbki strawionego białka na kolumnę do silnej wymiany kationowej o wymiarach 200 × 2,1 mm i wielkości cząstek 5 µm. Aby rozdzielić peptydy, monitoruj frakcje peptydowe przy 280 nm i zbieraj je w odstępach dwuminutowych. Po wykorzystaniu kolektora frakcji, wysusz je w koncentratorze próżniowym. Po zakończeniu procesu, przechowuj wysuszone frakcje w temperaturze -80 °C do momentu ich wykorzystania w chromatografii cieczowej.Analiza tandemową spektrometrią mas. W innym podejściu do rozdzielenia mieszaniny białek zastosowano frakcjonowanie bezżelowe. Po odsoleniu nadsączu białek ślimakowych poprzez wytrącanie acetonem, do odsolonych białek uprzednio zawieszonych w 112 µL wody Milli Q należy dodać 30 µL pięciokrotnego buforu do próbek.Następnie dodaj 8 µL 1 M DTT i podgrzewaj mieszaninę w temperaturze 95 °C przez pięć minut w celu redukcji mostków dwusiarczkowych białek. Po podgrzaniu pozwól mieszaninie ostygnąć. Do zbiornika anodowego dodaj 8 mL buforu do elektroforezy, do komory zbierania próbek 150 µL buforu do elektroforezy, a do zbiornika katodowego 6 mL buforu do elektroforezy.Następnie nanieś 150 µL mieszaniny białek ślimaka do komory ładowania próbek, używając kartridża z 8% octanem trisu o zakresie mas od 3,5 do 150 kDa. Po uruchomieniu procesu zbieraj próbkę z komory zbierania w każdym zaprogramowanym interwale zatrzymania instrumentu za pomocą pipety i przenoś ją do nowo oznakowanej mikroprobówki. Następnie przemyj komorę zbierania dwukrotnie 150 µL buforu do elektroforezy i odrzuć zawartość.Po przeprowadzeniu jednowymiarowej elektroforezy żelowej frakcji wolnych od żelu, każdą z poszczególnych frakcji należy przenieść bezpośrednio do jednostki filtrującej 30 K. Następnie każdą frakcję miesza się z 200 µL 8 M mocznika w buforze Tris-HCl. Po wirowaniu z prędkością 14 000 ×g przez 25 minut, do koncentratu w każdej jednostce filtrującej dodaje się 10 µL 10 XI octanu acetamidu w roztworze mocznika i miesza na wortexie przez jedną minutę.Po umieszczeniu filtrów wirowych w statywie do mikrowirówki inkubować próbki przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie do jednostek filtracyjnych dodać 0,1 µg/µL LY C, aby uzyskać stosunek enzymu do białka od 1:50; po inkubacji przez noc w temperaturze 30 °C dodać do filtrów wirowych 40 µL 100 mM roztworu wodorowęglanu amonu i wirować próbki z prędkością 14 000 ×g przez 10 minut. Po jednorazowym powtórzeniu poprzedniego kroku przemyć filtry wirowe trzy razy 100 µL 50 mM roztworem wodorowęglanu amonu, a po ostatnim przemyciu dodać 0,4 µg/µL trypsyny w stosunku enzymu do białka 1:100. Po inkubacji próbek przez noc w temperaturze 37 °C eluować peptydy trypsynowe z każdej jednostki filtracyjnej, dodając 40 µL 50 mM roztworu wodorowęglanu amonu, a następnie wirować próbki z prędkością 14 000 ×g przez 10 minut.Po jednokrotnym powtórzeniu tego kroku, należy poddać próbki analizie za pomocą cieczowej chromatografii sprzężonej z tandemową spektrometrią mas. Zastosowano dwie procedury podwójnego trawienia. Pierwszą było trawienie triptychyną, a następnie drugie trawienie trypsyną; otrzymane frakcje połączono, rozdzielono na kolumnie silnie zasadowej wymiany kationowej na 18 frakcji i poddano analizie za pomocą nanocieczowej chromatografii sprzężonej z tandemową spektrometrią mas.Łącznie zidentyfikowano 1 485 białek przy 1% FDR podczas pojedynczego przebiegu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas. Stosując to podejście eksperymentalne, spośród zidentyfikowanych białek odpowiednio 324 i 258 białek zaklasyfikowano do mitochondrium i błony plazmatycznej.Drugą procedurę podwójnego trawienia stanowiło trawienie lys C, a następnie trawienie trypsyną. Każdy hydrolizat był oddzielnie nakładany i rozdzielany na kolumnie silnie jonowymiennej kationowej na 18 frakcji, a następnie analizowany za pomocą nano cieczowej chromatografii sprzężonej z tandemową spektrometrią mas. Wyniki trawienia lys C i trypsyną pozwoliły na zidentyfikowanie łącznie 3 503 białek przy 1% FDR.Dodatkowo, odpowiednio 605 i 617 białek zaklasyfikowano do mitochondrium oraz błony plazmatycznej. Podejście to pozwoliło uzyskać największą liczbę identyfikatorów białek związanych z błoną. Analiza duplikatów dla LY C i trypsyny.Frakcje wykazały, że ponad 65% zidentyfikowanych białek było wspólnych dla obu eksperymentów. Jednak w analizie powtórzonej zidentyfikowano również nowe białka. Dodatkowe peptydy i białka zostały zidentyfikowane w wyniku niewielkich zmian w chromatografii, co doprowadziło do fragmentacji innych peptydów.Przygotowano żel barwiony srebrem w celu wizualizacji wyników frakcjonowania bezżelowego, zgodnie z ilustracją. Żel wykazał rozdział białek według rosnącej masy cząsteczkowej dla każdej kolejnej frakcji. W związku z tym 12 ciekłych frakcji uzyskanych bez użycia żelu poddano trawieniu z wykorzystaniem dwóch różnych wieloaspektowych podejść do trawienia, a następnie przeanalizowano za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas.Pierwsze podejście do trawienia przeprowadzono z wykorzystaniem podwójnego trawienia trypsyną, co doprowadziło do identyfikacji 2 165 białek przy 1% FDR podczas pojedynczego przebiegu tandemowej spektrometrii mas z chromatografią cieczową. W tym eksperymencie odpowiednio 516 i 399 białek sklasyfikowano jako białka mitochondrium oraz błony plazmatycznej. Drugie podejście do trawienia przeprowadzono z wykorzystaniem endoproteinazy Ly C, a następnie trawienia trypsyną i pojedynczego przebiegu chromatografii cieczowej.Analiza tandemową spektrometrią mas zidentyfikowała 2 211 białek przy FDR na poziomie 1%. Podejście to wykazało podobną liczbę białek związanych z błoną co w przypadku zastosowania metody z trypsyną; dane proteomiczne z spektrometrii mas zostały zdeponowane w Proteome Exchange Consortium pod identyfikatorem zbioru danych PXD 0 0 0 2 3 1. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby unikać zanieczyszczeń na każdym etapie oraz utrzymywać tkankę w lodzie podczas ekstrakcji białek, aby zapobiec ich degradacji.

bottom-up-shotgun-proteomics-to-identify-comprehensive-cochlear

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Proteomika od dołu do góry i Shotgun w celu zidentyfikowania pełnego proteomu ślimakowego

Pierwotne rzęski wpływają na różne szlaki sygnałowe. Ślimak ssaków jest idealny do badania sygnalizacji biegunowości komórek płaskich (PCP). Dysfunkcja rzęsek wpływa na rozrost ślimaka, wzór komórkowy i orientację komórek rzęsatych, odczyty PCP. Naszym celem jest analiza sygnalizacji PCP w ślimaku myszy za pomocą analizy fenotypowej, immunohistochemii i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Ocena fenotypów polaryzacji komórek płaskich w ślimaku myszy z mutacją ciliopatii

Identyfikacja molekuł i szlaków kontrolujących plastyczność synaptyczną i pamięć jest nadal głównym wyzwaniem w neurobiologii. W tym miejscu opisano przepływ pracy dotyczący względnej kwantyfikacji białek synaptycznych rzekomo zaangażowanych w molekularną reorganizację synaps podczas uczenia się i konsolidacji pamięci w paradygmacie uczenia się słuchowego.

Ilościowe profilowanie proteomu synaptycznego w wysokiej rozdzielczości regionów mózgu myszy po uczeniu się dyskryminacji słuchowej

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia profilowania polisomów na izolowanym perfundowanym sercu myszy. Opisano metody perfuzji serca, profilowania polisomów i analizy frakcji polisomów w odniesieniu do mRNA, miRNA i proteomu polisomowego.

Dynamiczna analiza proteomiczna i miRNA polisomów z izolowanego serca myszy po perfuzji Langendorffa

Szczegółowy protokół jest opisany do separacji, identyfikacji i charakterystyki proteoform w próbkach białek za pomocą elektroforezy strefy kapilarnej-elektrorozpylania jonizacji-tandemowej spektrometrii mas (CZE-ESI-MS/MS). Protokół może być wykorzystany do charakterystyki proteoform w prostych próbkach białkowych w wysokiej rozdzielczości oraz do identyfikacji proteoform na dużą skalę w złożonych próbkach proteomów.

Proteomika na dużą skalę z wykorzystaniem tandemowej spektrometrii mas z elektroforezą strefy kapilarnej

Ten manuskrypt opisuje eksperymentalny protokół oceny cech morfologicznych i statusu funkcjonalnego synaps wstęgowych u normalnych myszy. Prezentowany model nadaje się również do modeli z ograniczeniami synaptopatii ślimakowej wywołanych hałasem i związanych z wiekiem. Omówiono również korelacyjne wyniki poprzednich badań na myszach.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna synaps wstęgowych w określonych obszarach częstości ślimaka myszy

Opisany protokół zapewnia zoptymalizowaną ilościową analizę proteomiczną próbek tkanek przy użyciu dwóch podejść: ilościowego opartego na znacznikach i bez etykiety. Podejścia oparte na znacznikach mają tę zaletę, że zapewniają dokładniejszą ocenę ilościową białek, podczas gdy podejście bez znaczników jest bardziej opłacalne i służy do analizy setek próbek kohorty.

Kompleksowy przepływ pracy proteomiki próbek tkanek opartej na spektrometrii mas

Szczegółowy protokół i trzy skrypty Pythona są dostępne do obsługi zrobotyzowanego systemu obsługi płynów o otwartym kodzie źródłowym do wykonywania półautomatycznego przygotowania próbek białek do eksperymentów spektrometrii mas, obejmujących etapy usuwania detergentów, trawienia białek i odsalania peptydów.

Zautomatyzowane przetwarzanie próbek proteomicznych typu shotgun przez robota laboratoryjnego typu open source

Tutaj opisujemy opartą na spektrometrii mas proteomiczną charakterystykę linii komórkowych ze znanymi losami tkanek u zarodka kręgowca Xenopus laevis.

Proteomika spektrometrii mas sterowana linią komórkową w rozwijającym się zarodku (żaby)

Zidentyfikowaliśmy łożysko jako główny organ krwiotwórczy podczas rozwoju. Stwierdziliśmy, że macierzyste komórki krwiotwórcze (HSCs) są zarówno generowane, jak i powielane w łożysku w unikalnych niszach mikrośrodowiskowych. W niniejszej pracy opisujemy techniki eksperymentalne niezbędne do izolacji i wizualizacji HSCs w łożysku myszy.

Izolacja i analiza hematopoetycznych komórek macierzystych z łożyska

Poznaj zaawansowane techniki proteomiki oddolnej i typu shotgun w analizie ślimaka u myszy. Metoda ta umożliwia identyfikację błonowych i rozpuszczalnych białek, wzbogacając dane o proteomie narządu słuchu.

Proteomika oddolna i proteomika typu shotgun w celu zidentyfikowania kompleksowego proteomu ślimakowego

Przeglądaj więcej filmów