Proteomika oddolna i proteomika typu shotgun w celu zidentyfikowania kompleksowego proteomu ślimakowego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest uzyskanie jak największej liczby identyfikacji białek z nabłonka sensorycznego ślimaka za pomocą różnych technik proteomicznych. W pierwszym etapie izoluje się ślimaka oraz nabłonek sensoryczny od dorosłych myszy, a w drugim etapie poddaje się je sonikacji w buforze do lizy w celu uzyskania białek. W celu zwiększenia pokrycia sekwencji peptydów i białek stosuje się różne strategie trawienia w odniesieniu do całego lizatu lub do frakcjonowanego lizatu białkowego.

Następnie wykorzystuje się różne techniki rozdziału, w tym silną wymianę kationową oraz chromatografię odwrotnej fazy, aby zmniejszyć złożoność próbek przed analizą za pomocą spektrometrii mas. Wyniki wykazują identyfikację licznej grupy białek błonowych i rozpuszczalnych w nabłonku sensorycznym ślimaka myszy dzięki zastosowaniu wielu podejść proteomicznych oraz spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroarrays przeciwciał i dwuwymiarowa elektroforeza żelowa, jest możliwość identyfikacji dużej liczby białek zarówno rozpuszczalnych, jak i błonowych, co zwiększa zakres danych proteomu ślimaka.

Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat biomarkerów związanych z zaburzeniami słuchu i łzawienia, może zostać ona zastosowana również do innych układów, np. do identyfikacji biomarkerów związanych z wiekiem oraz rakiem piersi lub płuc. Metodę tę można również wykorzystać do badania innych próbek biologicznych, takich jak krew. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zauważyliśmy ograniczony zakres dostępnych danych proteomicznych z wewnętrznego ucha ssaków, a w szczególności niewielką liczbę białek błonowych zidentyfikowanych przed rozpoczęciem tej procedury.

Wyizolować nabłonek sensoryczny ślimaka od myszy w 30. dniu po urodzeniu. Po przemyciu tkanki buforem fosforanowym 1x, dodać do tkanki 100 µL buforu lizującego i sonikować mieszaninę przez 30 sekund w lodzie przy użyciu sonikatora. Chłodzić lizat w lodzie przez jedną minutę pomiędzy każdą sonikacją, a następnie sonikować próbkę łącznie trzy razy.

Zawiesinę wirowano przy 16,000 ×g w temperaturze 4 °C przez pięć minut. Po zakończeniu wirowania należy zachować nadsącz do trawienia. Następnie 30 µL aalikwotę ekstraktu białkowego z ślimaka dodaje się bezpośrednio do filtra wirowego 30 K i miesza z 200 µL 8 M mocznika w wirówce Riss HCL.

Wiruj mieszaninę z prędkością 14 000 ×g przez 15 minut. Po zakończeniu rozcieńcz koncentrat 200 µL roztworu mocznika o stężeniu 8 M i powtórz wirowanie w tych samych warunkach co poprzednio. Następnie do koncentratu w filtrze dodaj 10 µL acetamidu 10 XI oto oraz 90 µL roztworu mocznika o stężeniu 8 M i mieszaj w wstrząsarze wierzchołkowym przez jedną minutę.

Po umieszczeniu filtra wirowego w statywie do mikrowirówki, należy inkubować go przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności po wirowaniu przy 14 000 ×g przez 10 minut w obecności 0,1 µg/µL endoproteazy Lys-C w stosunku enzymu do białka 1:50, a następnie inkubować mieszaninę przez noc w temperaturze 30 °C. Po zakończeniu należy dodać 40 µL 100 mM roztworu wodorowęglanu amonu do jednostki filtra i wirować mieszaninę przy 14 000 ×g przez 10 minut. Po powtórzeniu poprzedniego kroku jednostkę filtra należy przemyć 40 µL 8 M mocznika. Następnie jednostkę filtra należy przemyć dwukrotnie 40 µL wody Milli-Q.

Po trzykrotnym przemyciu jednostki filtrującej 100 µL 50 mM roztworu wodorowęglanu amonu, dodać trypsynę o stężeniu 0,4 µg/µL w stosunku enzymu do białka 1:100 i inkubować mieszaninę przez noc w temperaturze 37 °C. Po inkubacji eluować peptydy tryptyczne, dodając do jednostki filtrującej 40 µL 50 mM roztworu wodorowęglanu amonu, a następnie wirować mieszaninę z prędkością 14 000 ×g przez 10 minut. Następnie powtórzyć ten krok jeszcze raz.

Na tym etapie należy wprowadzić od 50 do 100 µg próbki strawionego białka na kolumnę do silnej wymiany kationowej o wymiarach 200 × 2,1 mm i wielkości cząstek 5 µm. Aby rozdzielić peptydy, monitoruj frakcje peptydowe przy 280 nm i zbieraj je w odstępach dwuminutowych. Po wykorzystaniu kolektora frakcji, wysusz je w koncentratorze próżniowym. Po zakończeniu procesu, przechowuj wysuszone frakcje w temperaturze -80 °C do momentu ich wykorzystania w chromatografii cieczowej.

Analiza tandemową spektrometrią mas. W innym podejściu do rozdzielenia mieszaniny białek zastosowano frakcjonowanie bezżelowe. Po odsoleniu nadsączu białek ślimakowych poprzez wytrącanie acetonem, do odsolonych białek uprzednio zawieszonych w 112 µL wody Milli Q należy dodać 30 µL pięciokrotnego buforu do próbek.

Następnie dodaj 8 µL 1 M DTT i podgrzewaj mieszaninę w temperaturze 95 °C przez pięć minut w celu redukcji mostków dwusiarczkowych białek. Po podgrzaniu pozwól mieszaninie ostygnąć. Do zbiornika anodowego dodaj 8 mL buforu do elektroforezy, do komory zbierania próbek 150 µL buforu do elektroforezy, a do zbiornika katodowego 6 mL buforu do elektroforezy.

Następnie nanieś 150 µL mieszaniny białek ślimaka do komory ładowania próbek, używając kartridża z 8% octanem trisu o zakresie mas od 3,5 do 150 kDa. Po uruchomieniu procesu zbieraj próbkę z komory zbierania w każdym zaprogramowanym interwale zatrzymania instrumentu za pomocą pipety i przenoś ją do nowo oznakowanej mikroprobówki. Następnie przemyj komorę zbierania dwukrotnie 150 µL buforu do elektroforezy i odrzuć zawartość.

Po przeprowadzeniu jednowymiarowej elektroforezy żelowej frakcji wolnych od żelu, każdą z poszczególnych frakcji należy przenieść bezpośrednio do jednostki filtrującej 30 K. Następnie każdą frakcję miesza się z 200 µL 8 M mocznika w buforze Tris-HCl. Po wirowaniu z prędkością 14 000 ×g przez 25 minut, do koncentratu w każdej jednostce filtrującej dodaje się 10 µL 10 XI octanu acetamidu w roztworze mocznika i miesza na wortexie przez jedną minutę.

Po umieszczeniu filtrów wirowych w statywie do mikrowirówki inkubować próbki przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie do jednostek filtracyjnych dodać 0,1 µg/µL LY C, aby uzyskać stosunek enzymu do białka od 1:50; po inkubacji przez noc w temperaturze 30 °C dodać do filtrów wirowych 40 µL 100 mM roztworu wodorowęglanu amonu i wirować próbki z prędkością 14 000 ×g przez 10 minut. Po jednorazowym powtórzeniu poprzedniego kroku przemyć filtry wirowe trzy razy 100 µL 50 mM roztworem wodorowęglanu amonu, a po ostatnim przemyciu dodać 0,4 µg/µL trypsyny w stosunku enzymu do białka 1:100. Po inkubacji próbek przez noc w temperaturze 37 °C eluować peptydy trypsynowe z każdej jednostki filtracyjnej, dodając 40 µL 50 mM roztworu wodorowęglanu amonu, a następnie wirować próbki z prędkością 14 000 ×g przez 10 minut.

Po jednokrotnym powtórzeniu tego kroku, należy poddać próbki analizie za pomocą cieczowej chromatografii sprzężonej z tandemową spektrometrią mas. Zastosowano dwie procedury podwójnego trawienia. Pierwszą było trawienie triptychyną, a następnie drugie trawienie trypsyną; otrzymane frakcje połączono, rozdzielono na kolumnie silnie zasadowej wymiany kationowej na 18 frakcji i poddano analizie za pomocą nanocieczowej chromatografii sprzężonej z tandemową spektrometrią mas.

Łącznie zidentyfikowano 1 485 białek przy 1% FDR podczas pojedynczego przebiegu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas. Stosując to podejście eksperymentalne, spośród zidentyfikowanych białek odpowiednio 324 i 258 białek zaklasyfikowano do mitochondrium i błony plazmatycznej.

Drugą procedurę podwójnego trawienia stanowiło trawienie lys C, a następnie trawienie trypsyną. Każdy hydrolizat był oddzielnie nakładany i rozdzielany na kolumnie silnie jonowymiennej kationowej na 18 frakcji, a następnie analizowany za pomocą nano cieczowej chromatografii sprzężonej z tandemową spektrometrią mas. Wyniki trawienia lys C i trypsyną pozwoliły na zidentyfikowanie łącznie 3 503 białek przy 1% FDR.

Dodatkowo, odpowiednio 605 i 617 białek zaklasyfikowano do mitochondrium oraz błony plazmatycznej. Podejście to pozwoliło uzyskać największą liczbę identyfikatorów białek związanych z błoną. Analiza duplikatów dla LY C i trypsyny.

Frakcje wykazały, że ponad 65% zidentyfikowanych białek było wspólnych dla obu eksperymentów. Jednak w analizie powtórzonej zidentyfikowano również nowe białka. Dodatkowe peptydy i białka zostały zidentyfikowane w wyniku niewielkich zmian w chromatografii, co doprowadziło do fragmentacji innych peptydów.

Przygotowano żel barwiony srebrem w celu wizualizacji wyników frakcjonowania bezżelowego, zgodnie z ilustracją. Żel wykazał rozdział białek według rosnącej masy cząsteczkowej dla każdej kolejnej frakcji. W związku z tym 12 ciekłych frakcji uzyskanych bez użycia żelu poddano trawieniu z wykorzystaniem dwóch różnych wieloaspektowych podejść do trawienia, a następnie przeanalizowano za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas.

Pierwsze podejście do trawienia przeprowadzono z wykorzystaniem podwójnego trawienia trypsyną, co doprowadziło do identyfikacji 2 165 białek przy 1% FDR podczas pojedynczego przebiegu tandemowej spektrometrii mas z chromatografią cieczową. W tym eksperymencie odpowiednio 516 i 399 białek sklasyfikowano jako białka mitochondrium oraz błony plazmatycznej. Drugie podejście do trawienia przeprowadzono z wykorzystaniem endoproteinazy Ly C, a następnie trawienia trypsyną i pojedynczego przebiegu chromatografii cieczowej.

Analiza tandemową spektrometrią mas zidentyfikowała 2 211 białek przy FDR na poziomie 1%. Podejście to wykazało podobną liczbę białek związanych z błoną co w przypadku zastosowania metody z trypsyną; dane proteomiczne z spektrometrii mas zostały zdeponowane w Proteome Exchange Consortium pod identyfikatorem zbioru danych PXD 0 0 0 2 3 1. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby unikać zanieczyszczeń na każdym etapie oraz utrzymywać tkankę w lodzie podczas ekstrakcji białek, aby zapobiec ich degradacji.