Proteomika oddolna i proteomika typu shotgun w celu zidentyfikowania kompleksowego proteomu ślimakowego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest osiągnięcie jak największej liczby identyfikacji białek z nabłonka czuciowego ślimaka przy użyciu różnych technik proteomicznych. Osiąga się to poprzez wyizolowanie ślimaka, nabłonka czuciowego od dorosłych myszy i sonikat w buforze do lizy w celu uzyskania białka jako drugiego etapu. Do całego lizatu lub frakcjonowanego lizatu białkowego stosuje się różne strategie trawienia w celu zwiększenia pokrycia sekwencji peptydów i białek.

Następnie stosuje się różne techniki separacji, w tym silną wymianę kationową i chromatografię z odwróconymi fazami w celu zmniejszenia złożoności próbki przed analizą specyfikacji masy. Wyniki wskazują na identyfikację dużej liczby błonowych i rozpuszczalnych białek nabłonka czuciowego ślimaka myszy przy użyciu wielu podejść proteomicznych i spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak mikromacierz przeciwciał i dwuwymiarowa elektroforeza żelowa, jest to, że identyfikowana jest duża liczba białek zarówno rozpuszczalnych, jak i błonowych, co zwiększa dane dotyczące proteomu ślimaka.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w biomarkery związane z upośledzeniem słuchu i łzawienia, może być również stosowana do innych systemów, takich jak identyfikacja biomarkerów związanych z wiekiem i rakiem piersi lub płuc. Metoda ta może być również stosowana do badania innych próbek biologicznych, takich jak krew. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zaobserwowaliśmy ograniczony zestaw danych proteomicznych dostępnych w uchu wewnętrznym ssaków, a w szczególności ograniczoną liczbę białek błonowych, które zostały zidentyfikowane przed rozpoczęciem tej procedury.

Wyizoluj nabłonek czuciowy ślimaka od 30 myszy w dniu poporodowym. Po umyciu tkanki jednym buforem fosforanowym dodać 100 mikrolitrów buforu do lizy do tkanki i sonikować mieszaninę przez 30 sekund na lodzie za pomocą rozczłonkowywania dźwiękowego. Schłodzić lizat na lodzie przez jedną minutę pomiędzy każdą sonikacją, a następnie poddać próbkę sonikacji w sumie trzy razy.

Centra stapiała zawiesinę w temperaturze 16 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Po zakończeniu zachować sklarowany osad do strawienia. Następnie dodać 30 mikrolitrów podwielokrotności ekstraktu białka ślimaka bezpośrednio do filtra wirowego 30 K i wymieszać z 200 mikrolitrami ośmiomolowego mocznika w wirówce Riss HCL.

Mieszanina w ilości 14 000 razy G przez 15 minut. Po zakończeniu rozcieńczyć koncentrat 200 mikrolitrami ośmiomolowego roztworu mocznika i powtórzyć wirowanie w tych samych warunkach, co poprzednio. Następnie dodaj 10 mikrolitrów 10 XI oto acetamidu i 90 mikrolitrów ośmiomolowego roztworu mocznika do koncentratu w filtrze i wiruj przez jedną minutę.

Po umieszczeniu filtra wirowego w stojaku do mikrowirówek, inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, po odwirowaniu w temperaturze 14 000 razy G przez 10 minut w ilości 0,1 mikrograma na mikrolitr proteazy endo ly C w stosunku enzymu do białka jeden do 50 i inkubować mieszaninę przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Po zakończeniu dodaj 40 mikrolitrów 100-milimolowego roztworu wodorowęglanu amonu do jednostki filtrującej i odwiruj mieszaninę przy 14 000 razy G przez 10 minut Po powtórzeniu poprzedniego kroku umyj jednostkę filtrującą 40 mikrolitrami ośmiomolowego mocznika. Następnie umyj jednostkę filtrującą dwa razy 40 mikrolitrami wody mili Q.

Po trzykrotnym umyciu jednostki filtrującej 100 mikrolitrami 50-milimolowego roztworu wodorowęglanu amonu dodać 0,4 mikrograma na mikrolitr trypsyny w stosunku enzymu do białka jeden do 100 i inkubować mieszaninę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji wymyć tryptytyczne peptydy, dodając 40 mikrolitrów 50-milimolowego roztworu wodorowęglanu amonu do jednostki filtrującej i odwirować mieszaninę przy 14 000 razy G przez 10 minut. Następnie powtórz ten krok jeszcze raz.

W tym momencie wstrzyknij od 50 do 100 mikrogramów strawionej próbki białka do kolumny kationitowej o wymiarach 200 na 2,1 milimetra o mocy pięciu mikrometrów Aby oddzielić peptydy, monitoruj frakcje peptydowe na 280 nanometrach i zbieraj frakcje w dwuminutowych odstępach. Za pomocą kolektora frakcji wysuszyć frakcje w koncentratorze próżniowym. Po zakończeniu przechowuj wysuszone frakcje w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do użycia w chromatografii cieczowej.

Analiza spektrometrii mas w tandemie. W innym podejściu zastosowano frakcjonowanie bez żelu do oddzielenia mieszaniny białek. Po odsoleniu supernatantu białka ślimaka przez wytrącanie acetonu, dodaj 30 mikrolitrów buforu pięciu x próbki do odsolonego białka uprzednio zawieszonego w 112 mikrolitrach wody Milli Q.

Następnie dodaj osiem mikrolitrów jednego molowego DTT i podgrzewaj mieszaninę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby zredukować wiązania dwusiarczkowe białek. Po podgrzaniu pozostaw mieszaninę do ostygnięcia. Dodać osiem mililitrów buforu roboczego do zbiornika anody, 150 mikrolitrów buforu roboczego do komory pobierania próbek i sześć mililitrów buforu roboczego do zbiornika katody.

Po tym załadowaniu należy wlać 150 mikrolitrów mieszaniny białek ślimaka do komory ładowania próbki, używając 8% wkładu z octanu tris o zakresie masowym od 3,5 do 150 kilodaltonów. Po rozpoczęciu pracy należy pobrać próbkę z komory pobierania próbek w każdym odstępie czasu na urządzeniu za pomocą pipety i dodać do świeżo oznakowanej mikroprobówki. Następnie umyj komorę zbiorczą dwa razy 150 mikrolitrami bieżącego buforu i wyrzuć.

Po elektroforezie żelowej 1D frakcji bezżelowych. Dodaj każdą pojedynczą frakcję bezpośrednio do jednostki filtrującej 30 K. Następnie wymieszać każdą frakcję z 200 mikrolitrami ośmiomolowego mocznika w tris HCL po odwirowaniu w temperaturze 14 000 razy G przez 25 minut, dodać 10 mikrolitrów 10 XI oto acetamidu w roztworze mocznika do koncentratu w każdej jednostce filtrującej i wirować przez jedną minutę.

Po umieszczeniu filtrów wirowych w stojaku do mikrowirówek, próbki należy inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie dodać 0,1 mikrograma na mikrolitr LY C dla stosunku enzymu do białka jeden do 50 do jednostek filtrujących po całonocnej inkubacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza, dodać 40 mikrolitrów 100-milimolowego roztworu wodorowęglanu amonu do filtrów wirowych i odwirować próbki w temperaturze 14 000 razy G przez 10 minut po jednokrotnym powtórzeniu poprzedniego kroku, Umyj filtry wirowe trzykrotnie 100 mikrolitrami 50-milimolowego roztworu wodorowęglanu amonu, po ostatnim praniu dodaj 0,4 mikrograma na mikrolitr trypsyny w stosunku enzymu do białka jeden do 100. Po inkubacji próbek przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza należy wymyć peptydy tryptykowe z każdej jednostki filtracyjnej, dodając 40 mikrolitrów 50-milimolowego roztworu wodorowęglanu amonu i odwirować próbki w temperaturze 14 000 razy G przez 10 minut.

Po powtórzeniu tego, krok jeden, przeanalizować próbki za pomocą tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej. Zastosowano dwie procedury podwójnego trawienia. Pierwszym było trawienie tryptykowe, a następnie drugie trawienie trypsyną, które zostały połączone frakcjonowane na silnej kolumnie kationowymiennej na 18 frakcji i analizowane za pomocą tandemowej spektrometrii mas chromatografii nanocieczowej.

W sumie 1 485 białek zidentyfikowano za pomocą 1% FDR podczas wykonywania jednoprzebiegowej spektrometrii mas z chromatografią cieczową w tandemie. Korzystając z tego eksperymentalnego podejścia. Spośród zidentyfikowanych białek 324 i 258 białek sklasyfikowano odpowiednio w mitochondrium i błonie plazmatycznej.

Druga procedura podwójnego trawienia polegała na trawieniu lizy C, a następnie trawieniu trypsyny. Każdy digest został indywidualnie załadowany i rozdzielony na kolumnie silnej kationowymienności na 18 frakcji, a następnie przeanalizowany za pomocą tandemowej spektrometrii mas chromatografii nanocieczowej. Wyniki trawienia LY C i trypsyny dały w sumie 3 503 białka z 1% FDR.

Dodatkowo białka 605 i 617 zostały sklasyfikowane odpowiednio w mitochondrium i błonie plazmatycznej. Podejście to pozwoliło uzyskać największą liczbę identyfikatorów białek związanych z błoną. Powtórna analiza LY C i trypsyny.

Frakcje wykazały, że ponad 65 zidentyfikowanych białek było wspólnych dla eksperymentów. Jednak w analizie powtórzeń znaleziono również nowo zidentyfikowane białka. Dodatkowe peptydy i białka zostały zidentyfikowane ze względu na niewielkie zmiany w chromatografii, co doprowadziło do powstania różnych peptydów do fragmentacji.

Przygotowano żel do barwienia srebrem w celu wizualizacji wyników frakcjonowania bez żelu, jak pokazano na ilustracji. W tym przypadku żel wykazał separację białek poprzez zwiększanie masy cząsteczkowej dla każdej kolejnej frakcji. W związku z tym 12 bezżelowych frakcji ciekłych wytrawiono przy użyciu dwóch różnych podejść do mineralizacji wieloaspektowej i przeanalizowano za pomocą tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej.

Pierwsze podejście do trawienia przeprowadzono przy użyciu podwójnego trawienia trypsyną, co doprowadziło do identyfikacji 2 165 białek z 1% FDR podczas wykonywania jednoprzebiegowej tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej. W tym eksperymencie 516 i 399 białek podzielono odpowiednio na mitochondrium i błonę plazmatyczną. Drugie podejście do trawienia przeprowadzono przy użyciu endoproteinazy ly C, a następnie trawienie trypsyną, jednoprzebiegową chromatografię cieczową.

Analiza spektrometrii mas w tandemie zidentyfikowała 2 211 białek z 1% FDR. Podejście to wykazało podobną liczbę białek związanych z błoną, jak w przypadku stosowania podejścia trypsyny trypsynowej, dane proteomiczne spektrometrii mas zostały zdeponowane w Konsorcjum Wymiany Proteomu z identyfikatorem zestawu danych PXD 0 0 0 2 3 1. Próbując tej procedury, należy pamiętać, aby unikać zanieczyszczenia na każdym kroku i utrzymywać tkankę na lodzie podczas wykonywania ekstrakcji białka, aby uniknąć degradacji białka.