Name: Ocena rozwoju mysich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych w łatach Peyera z wykorzystaniem adoptywnego transferu przodków hematopoetycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-17T16:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Poznaj metodę oceny rozwoju plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych w łatach Peyera myszy przy użyciu adoptywnego transferu przodków hematopoetycznych. Technika ta umożliwia badanie potencjału rozwojowego komórek CDP in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy doktorom Alexowi Gelbardowi i Willemowi Overwijkowi za porady dotyczące hydrodynamicznego transferu genów. Praca ta była wspierana przez granty z NIH (AI098099, SSW), MD Anderson Center for Cancer Epigenetics, MD Anderson Center for Inflammation and Cancer (SSW) oraz R.E. Bob Smith Education Fund (HSL).

Instytucjonalna zgoda musi być uzyskana z góry dla wszystkich eksperymentalnych manipulacji z udziałem myszy. Obejmują one wykorzystanie myszy C57BL6 do izolacji komórek progenitorowych szpiku kostnego, myszy Ifnar - / - jako biorców do adoptywnego transferu hematopoetycznych komórek progenitorowych oraz zastosowanie HGT do nadekspresji cytokin in vivo. Odpowiednie warunki mieszkaniowe i opieka nad zwierzętami muszą być również zapewnione przez badacza lub instytucję. Ponadto może być wymagane zatwierdzenie instytucjonalne dla plazmidów stosowanych w hydrodynamicznym transferze genów (tj. zatwierdzenie rekombinacji DNA). Opisane tutaj badania zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w UT MD Anderson Cancer Center.
1. Hydrodynamiczny transfer genów (HGT)
Ten krok powinien być wykonany 2 dni przed transferem adopcji CDP w celu wywołania krążącego Flt3L do ekspansji DC in vivo5. Przygotuj co najmniej 5 myszy/grupę biorców.
<ol>
	<li>Aby osiągnąć skuteczne HGT, naczynia krwionośne biorcy myszy Ifnar-/- (CD45.2 +) należy rozszerzyć poprzez wystawienie myszy na działanie lampy grzewczej przez 5-10 minut.</li>
	<li>Umieść mysz w urządzeniu krępującym i zdezynfekuj jej ogon 70% etanolem.</li>
	<li>Wstrzyknąć 5 μg plazmidu kodującego Flt3L w 2 ml sterylnego PBS do żyły ogonowej za pomocą igły 27 G. W przypadku kohorty kontrolnej wstrzyknąć 5 μg pustego wektora (pORF) przez żyłę ogonową, jak wskazano.</li>
	<li>Monitoruj myszy przez 15-30 minut, aby upewnić się, że nie ma szkodliwych skutków wstrzyknięcia żyły ogonowej. Zwróć myszy do obiektu mieszkalnego na 2 dni.</li>
</ol>
2. Izolacja hematopoetycznych przodków od szpiku kostnego myszy
Ten krok powinien być wykonany 2 dni po HGT. Użyj kongenicznych myszy CD45.1+ jako źródła komórek progenitorowych szpiku kostnego do adopcyjnego transferu do biorców Ifnar-/- (CD45.2+). W tym protokole szczepy kongeniczne są wymagane do rozróżnienia DC pochodzących od dawcy i biorcy, a także do uniknięcia wyczerpania o podłożu immunologicznym z powodu niedopasowania MHC. Około 10-20 myszy będzie potrzebnych do dostarczenia wystarczającej liczby hematopoetycznych komórek progenitorowych (10,5 komórek / mysz biorca) do eksperymentów transferowych.
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji 10 kongennych myszy CD45.1+ przez uduszenie CO2 i zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Umieść każdą tuszę na tacy sekcyjnej i wysterylizuj brzuch i nogi 70% etanolem.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w środkowej części brzucha i przetnij skórę od brzucha do każdej nogi, przecinając skórę na całej długości nogi.</li>
	<li>Delikatnie usuń skórę z każdej nogi, a następnie odetnij i usuń nogi z tuszy w stawie biodrowym za pomocą ostrych nożyczek.</li>
	<li>Ostrożnie usuń mięśnie z kości udowej i piszczelowej każdej nogi za pomocą ostrego ostrza.</li>
	<li>Usunąć oba końce kości udowej i piszczelowej ostrym skalpelem i umieścić kości w naczyniu hodowlanym zawierającym pełne RPMI (RMPI z 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą, 1% penicyliną/streptomycyną, 1 mM pirogronianu sodu i 50 μM β-merkaptoetanolu).</li>
	<li>Przygotować strzykawkę zawierającą 1 ml pełnego RPMI, podłączoną do igły o sile 27 G.</li>
	<li>Wprowadzić igłę 27 G do jednego końca kości udowej lub piszczelowej. Wypłucz szpik kostny z kości udowej lub piszczelowej, delikatnie wstrzykując cały RPMI do kości. Upewnij się, że komórki szpiku kostnego są usuwane z kości; Można to osiągnąć, wizualnie wykrywając wyrzucone nośniki, które wydają się mętne.</li>
	<li>Powtórz płukanie każdej kości udowej i piszczelowej 3x, aby dokładnie usunąć komórki szpiku kostnego.</li>
	<li>Przygotuj zawiesinę jednokomórkową, delikatnie pipetując komórki w górę i w dół 3-5 razy w naczyniu hodowlanym.</li>
	<li>Usuń zanieczyszczenia, przepuszczając komórki szpiku kostnego przez sitko komórkowe 40 μM, umieszczając wysiękowe komórki w nowym naczyniu hodowlanym. Wszelkie grudki komórek, które pojawiają się na sitku, należy delikatnie docisnąć końcówką sterylnego tłoka strzykawki.</li>
	<li>Lizować czerwone krwinki (RBC) obecne w całkowitej zawiesinie komórek szpiku kostnego za pomocą komercyjnego buforu do lizy RBC zgodnie z instrukcjami producenta. Użyć 2 ml buforu do lizy RBC/4-6 x 107 komórek (zwykle komórek z jednej myszy) i czasu inkubacji 5 minut w temperaturze suchej.</li>
	<li>Przepłukać komórki szpiku kostnego przez granulowanie komórek przez odwirowanie przez 4 minuty przy 500 x g, delikatnie zasysając pożywkę hodowlaną, ponownie zawieszając w 10 ml buforu FACS (1x PBS + 2 mM EDTA + 1% FBS), granulując komórki przez odwirowanie i delikatnie zasysając bufor do przemywania .</li>
	<li>Powtórz pranie, jak opisano w kroku 2.13, w sumie 2 prania.</li>
</ol>
3. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) w celu izolacji CDP
Ten krok wymaga dostępu do separatora komórek MidiMACS i kolumn LD MACS do wstępnej procedury selekcji negatywnej, a także maszyny FACS z co najmniej 3 laserami do oczyszczania wielokolorowego podzbioru progenitorów po barwieniu fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami.
<ol>
	<li>Po drugim płukaniu w kroku 2.14 policz komórki szpiku kostnego. Osadzać komórki przez odwirowanie, jak opisano w kroku 2.13, a następnie ponownie zawiesić w buforze FACS, aby uzyskać końcowe stężenie 4 x 107 komórek na 30 μl buforu FACS.</li>
	<li>Aby przygotować komórki do FACS, komórki ujemne są najpierw wzbogacane techniką selekcji negatywnej, która usuwa komórki dodatnie pod względem linii z mieszaniny szpiku kostnego za pomocą chromatografii kolumnowej z kulkami magnetycznymi. W przypadku procedury selekcji negatywnej dodać 1 μg każdego z następujących komercyjnych szczurzych przeciwciał anty-mysich (Abs), które rozpoznają markery linii krwiotwórczej: CD3, CD19, CD11c, CD11b i Ter-119 Abs. Abs należy dodać w objętości 2 μl/Ab do 30 μl zawiesiny komórek w buforze FACS.</li>
	<li>Inkubować zawiesinę komórkową w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Po inkubacji przemyć komórki dwukrotnie 10 ml buforu FACS, jak opisano w kroku 2.13.</li>
	<li>Zawiesić komórki, aby uzyskać końcowe stężenie 4 x 10 7 komórek/40 μl buforu FACS. Dodać 20 μl kozich mikrokulek magnetycznych IgG przeciw szczurom na każde 40 μl zawiesiny komórkowej. Delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Przemyć komórki 10 ml buforu FACS, jak opisano w kroku 2.13.</li>
	<li>Zawiesić do 108 komórek szpiku kostnego w 500 μl buforu FACS.</li>
	<li>Załaduj kolumnę MACS LD do separatora komórek MidiMACS zgodnie z instrukcjami producenta i wstępnie przepłucz kolumnę 2 ml buforem FACS.</li>
	<li>Nanieść zawiesinę komórek szpiku kostnego na kolumnę, ładując do 5 x 108 komórek w 2,5 ml buforu FACS. Upewnij się, że probówka zbiorcza (15 ml probówka stożkowa) jest umieszczona pod kolumną. Przemyć kolumnę 3x 2 ml buforu/płukania FACS i zebrać komórki, które przechodzą przez kolumnę, które zostaną wzbogacone o komórki ujemne pod względem linii. Policz komórki w materiale eluowanym (przemywanym) z kolumny.</li>
	<li>Aby przeprowadzić pozytywną selekcję podzbiorów progenitorów hematopoetycznych za pomocą FACS, wybarwić komórki następującymi fluorescencyjnie sprzężonymi Abs: IL-7R (Pacific Blue), Flt3 (PE), Sca-1 (PE. Cy7), CD115 (APC), c-kit (APC. Cy7) Abs, plus mieszanina markerów linii Abs skierowanych przeciwko CD3, CD19, CD11c, CD11b, F4/80 i Ter119 (wszystkie oznaczone PerCP Cy5.5). Użyj 0,5-1 μl każdego Ab w całkowitej objętości 100 μl. Inkubować zawiesinę komórkową w temperaturze 4 °C przez 20-30 min.</li>
	<li>Przemyć komórki, jak wskazano w kroku 2.13 i ponownie zawiesić w buforze FACS w stężeniu 2-3 x 10 7 komórek/ml. Przefiltrować komórki przez rurkę z filtrem siatkowym o średnicy 35 μM, aby usunąć grudki komórek. Ten ostatni krok jest kluczowy, aby uniknąć zatkania maszyny FACS.</li>
	<li>Umieścić zawiesinę komórek w probówce FACS na stoliku FACS i posortować CDP (lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) na podstawie wskazanego profilu znacznika. Zbierz oczyszczone komórki w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml pełnego RPMI.</li>
	<li>Zapisz bezwzględną liczbę posortowanych komórek na końcu przebiegu FACS. Osadzać komórki przez wirowanie, jak wskazano w kroku 2.13, a następnie ponownie zawiesić w sterylnym PBS do eksperymentów z transferem adoptywnym.</li>
</ol>
4. Przeniesienie adopcyjne CDP
Ten krok jest zazwyczaj wykonywany w pomieszczeniu dla zwierząt, w którym trzymane są myszy odbiorcy. W zależności od lokalizacji maszyny FACS, może to obejmować transport oczyszczonych populacji komórek progenitorowych do obiektu dla zwierząt przed przeniesieniem adopcyjnym. Zawiesiny komórek progenitorowych powinny być utrzymywane w sterylnej formie i transportowane na lodzie.
<ol>
	<li>Przygotować zawiesiny komórek do wstrzykiwań, rozcieńczając 105 oczyszczonych CDP w całkowitej objętości 100 μl sterylnego PBS. Umieścić zawiesinę komórek w strzykawce przymocowanej do igły o sile 27 G.</li>
	<li>Myszy biorcy Ifnar-/- (CD45.2+) należy wystawić na działanie lampy grzewczej przez 5-10 minut, aby uzyskać skuteczne wstrzyknięcie przez żyłę ogonową.</li>
	<li>Umieść mysz w urządzeniu krępującym i zdezynfekuj jej ogon 70% etanolem.</li>
	<li>Wstrzyknąć 105 CDP oczyszczonych przez FACS w 100 μl PBS do żyły ogonowej za pomocą igły 27 G.</li>
	<li>Monitoruj myszy przez 15-30 minut, aby upewnić się, że nie ma szkodliwych skutków wstrzyknięcia żyły ogonowej. Zwróć myszy do ośrodka mieszkalnego.</li>
</ol>
5. Izolacja PP i pomiar ilości pDC
<ol>
	<li>Po 7-10 dniach od przeniesienia adopcyjnego należy poddać myszy biorcy eutanazji. Delikatnie otwórz mysz przez preparację i odsłoń jelito.</li>
	<li>Usuń całe jelito i umieść je na ręcznikach papierowych nasączonych PBS. Zbierz wszystkie widoczne PP wzdłuż ściany jelita cienkiego za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek. Myszy C57BL6 i Ifnar-/- zazwyczaj mają 5-10 PP / mysz, które różnią się od izolowanych pęcherzyków limfatycznych znajdujących się wzdłuż jelita cienkiego18. Należy pamiętać, że PP są często strukturalnie różne nawet w obrębie jednej myszy, więc ostrożnie upewnij się, że wszystkie PP są zidentyfikowane i przeanalizowane.</li>
	<li>Umieść PP na szalce Petriego zawierającej PBS i użyj kleszczy do usunięcia kału. Powtórz tę procedurę dwukrotnie, aby wyczyścić PP.</li>
	<li>Trawić PPs z 1 mg/ml kolagenazy dożylnej w 10 ml 1x zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS) w kolbie o pojemności 50 ml, energicznie mieszając przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umieścić strawiony PP w górnej komorze sitka do komórek o wielkości 40 μm i przepchnąć komórki przez sitko za pomocą sterylnego tłoka strzykawki. Zebrać zawiesinę komórek PP w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odcedzone komórki PP osad odcedzić przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić w 6 ml 37% roztworu Percollu (37% Percoll w pożywce RPMI). Delikatnie umieść 6 ml 70% roztworu Percollu (70% Percoll w pożywce RPMI) pod zawiesiną komórek, aby utworzyć gradient krokowy Percoll</li>.
	<li>Wirować komórki przez 20 minut przy 800 x g z odłamaniem wirówki. Komórki jednojądrzaste będą migrować do granicy faz 37/70%. Po odwirowaniu należy zebrać populację komórek jednojądrzastych przez staranne pipetowanie w obszarze granic faz. Zebrane komórki osadu należy odwirować i przemyć dwukrotnie w 50 ml pełnej ilości RPMI/przepłukanie. Duża objętość jest używana, aby zapewnić całkowite usunięcie Percollu.</li>
	<li>Wybarwić zebrane komórki PP następującymi przeciwciałami, aby wykryć mysie pDC, które pochodzą od adoptywnie przeniesionych komórek progenitorowych (CD45.1 +) lub myszy biorców (CD45.2 +): CD45.1 (APC. Cy7), CD45.2 (PE. Cy7), CD11c (Pacific Blue), CD11b (PerCP Cy5.5), B220 (APC), Siglec-H (PE) i PDCA-1 (FITC) Abs. Wykonaj analizę cytometrii przepływowej komórek PP, jak wskazano w krokach 3.9 i 3.10. Zidentyfikuj pDC na podstawie ich fenotypu CD11c+, CD11b-B220+ Siglec-H+ PDCA-1+. Bezwzględne liczby pDC można określić za pomocą następującego równania: % pDC x całkowita liczba komórek PP = PP pDCs.</li>
</ol>

<ol><li>Cella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+monocytes+migrate+to+inflamed+lymph+nodes+and+produce+large+amounts+of+type+I+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon.</a> Nat. Med. 5 (8), 919-923 Forthcoming.</li>
<li>Siegal, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+the+principal+type+1+interferon-producing+cells+in+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The nature of the principal type 1 interferon-producing cells in human blood.</a> Science. 284 (5421), 1835-1837 Forthcoming.</li>
<li>Asselin-Paturel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+type+I+IFN-producing+cells+are+immature+APCs+with+plasmacytoid+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology.</a> Nat. Immunol. 2 (12), 1144-1150 Forthcoming.</li>
<li>Contractor, N., Louten, J., Kim, L., Biron, C. A., Kelsall, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Peyer%27s+patch+plasmacytoid+dendritic+cells+%28pDCs%29+produce+low+levels+of+type+I+interferons%3A+possible+role+for+IL-10%2C+TGFbeta%2C+and+prostaglandin+E2+in+conditioning+a+unique+mucosal+pDC+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Peyer's patch plasmacytoid dendritic cells (pDCs) produce low levels of type I interferons: possible role for IL-10, TGFbeta, and prostaglandin E2 in conditioning a unique mucosal pDC phenotype.</a> J. Immunol. 179 (5), 2690-2694 (2007).</li>
<li>Li, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-intrinsic+role+for+IFN-alpha-STAT1+signals+in+regulating+murine+Peyer+patch+plasmacytoid+dendritic+cells+and+conditioning+an+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cell-intrinsic role for IFN-alpha-STAT1 signals in regulating murine Peyer patch plasmacytoid dendritic cells and conditioning an inflammatory response.</a> Blood. 118 (14), 3879-3889 (2011).</li>
<li>D'Amico, A., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+progenitors+of+mouse+dendritic+cells+and+plasmacytoid+predendritic+cells+are+within+the+bone+marrow+hemopoietic+precursors+expressing+Flt3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3.</a> J. Exp. Med. 198 (2), 293-303 Forthcoming.</li>
<li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311 (5757), 83-87 Forthcoming.</li>
<li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+dendritic+cell+development+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of dendritic cell development and homeostasis.</a> Science. 324 (5925), 392-397 (2009).</li>
<li>Naik, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+subtypes+from+single+precursor+cells+derived+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo.</a> 8 (11), 1217-1226 Forthcoming.</li>
<li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clonogenic+common+Flt3%2BM-CSFR%2B+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nat. Immunol. 8 (11), 1207-1216 (2007).</li>
<li>Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+differentiation%3A+myeloid+and+lymphoid+pathways+to+murine+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells.</a> Blood. 121 (1), 11-19 Forthcoming.</li>
<li>Hirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBPbeta+is+required+for+%27emergency%27+granulopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">C/EBPbeta is required for 'emergency' granulopoiesis.</a> Nat. Immunol. 7 (7), 732-739 (2006).</li>
<li>Overwijk, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+antitumor+effects+of+IL-23+as+a+cancer+vaccine+adjuvant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunological and antitumor effects of IL-23 as a cancer vaccine adjuvant.</a> J. Immunol. 176 (9), 5213-5222 (2006).</li>
<li>Cervantes-Barragan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells+control+T-cell+response+to+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (8), 3012-3017 (2012).</li>
<li>Goubier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells+mediate+oral+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells mediate oral tolerance.</a> Immunity. 29 (3), 464-475 (2008).</li>
<li>Lande, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+activate+plasmacytoid+dendritic+cells+by+releasing+self-DNA-peptide+complexes+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus.</a> Sci. Transl. Med. 3 (73), Forthcoming.</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells+induce+NK+cell-dependent%2C+tumor+antigen-specific+T+cell+cross-priming+and+tumor+regression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice.</a> J. Clin. Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).</li>
<li>Fagarasan, S., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+IgA+synthesis%3A+regulation+of+front-line+body+defences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences.</a> Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 63-72 (2003).</li>
<li>Cisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+E2-2+is+an+essential+and+specific+regulator+of+plasmacytoid+dendritic+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development.</a> Cell. 135 (1), 37-48 (2008).</li>
<li>Blasius, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cell+antigen+2+is+a+specific+marker+of+type+I+IFN-producing+cells+in+the+naive+mouse%2C+but+a+promiscuous+cell+surface+antigen+following+IFN+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cell antigen 2 is a specific marker of type I IFN-producing cells in the naive mouse, but a promiscuous cell surface antigen following IFN stimulation.</a> J. Immunol. 177 (5), 3260-3265 (2006).</li>
<li>Symons, A., Budelsky, A. L., Towne, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+Th17+cells+in+the+gut+pathogenic+or+protective%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Are Th17 cells in the gut pathogenic or protective.</a> Mucosal. Immunol. 5 (1), 4-6 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Opisana w niniejszym dokumencie technika transferu adoptywnego oceniała wkład CDP w populację PP pDC u myszy biorców, które mają niedobór PP pDC (np. myszy Ifnar-/- ). W przyszłych eksperymentach ważna będzie ocena potencjału innych podzbiorów progenitorowych w generowaniu PP pDC, w szczególności czy PP pDC pochodzą od Flt3+ CLP. Pytanie to jest istotne, ponieważ pozostaje niejasne, dlaczego PP pDC są wyjątkowo wrażliwe na sygnały IFNAR-STAT1 dla narosłu PP5 i czy PP pDC...

Tutaj demonstrujemy protokół do oceny, czy powszechne komórki progenitorowe komórek dendrytycznych (CDP) są zdolne do powstania populacji plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) w plamie Peyera (PP). Ogólnym celem zastosowania tej metody była ocena regulacji rozwojowej pDC w plastrze Peyera (PP pDCs). Powodem, dla którego jest to ważne, jest to, że PP pDC różnią się od pDC znajdujących się w innych tkankach, w tym w szpiku kostnym, krwi i śledzionie, a zatem nie jest jasne, czy PP pDC i inne populacje pDC są powiązane rozwojowo i/lub funkcjonalnie. W szczególności pDC są powszechnie znane z tego, że są głównymi producentami interferonu typu I (IFN) w układzie krwiotwórczym, reagując na stymulację receptorów Toll-podobnych 7 i 9 (TLR7/9) poprzez szybkie wydzielanie IFN1-3. Jednak PP pDC mają niedobór w wytwarzaniu IFN typu I w odpowiedzi na stymulację agonistą TLR4,5. Co więcej, PP pDC różnią się również od pDC znajdujących się w szpiku kostnym i śledzionie tym, że wymagają sygnałów z receptora interferonu typu I (IFN) (IFNAR1) lub cząsteczki sygnałowej IFN STAT1 do ich rozwoju i / lub akumulacji5. Dane te sugerują możliwość, że różne mechanizmy regulacyjne kontrolują PP pDC w porównaniu z pDC w innych narządach (np. szpiku kostnym, śledzionie)5.
Przesłanka, która doprowadziła do opracowania tej metody, opierała się na najnowszych osiągnięciach w zrozumieniu biologii komórek dendrytycznych (DC). Większość, jeśli nie wszystkie, podzbiory DC pochodzą od hematopoetycznych komórek progenitorowych, które wyrażają receptor kinazy tyrozynowej 3 podobny do FMS (Flt3)6-10; jednak rozwój DC nie ogranicza się do klasycznych szlaków szpikowych i limfoidalnych. Na przykład wspólne komórki progenitorowe szpiku Flt3+ (CMPs, lin- IL-7R- Sca-1- c-kit+ CD34+ FcγRlo/-) powodują powstawanie CDP (lin- c-kitlo CD115+ Flt3+), które dalej różnicują się w pDC i konwencjonalne DC (cDCs)9,10. Natomiast wspólne komórki progenitorowe limfoidalne Flt3 + (CLPs, lin- IL-7R + Sca-1lo c-kitlo) rozwijają się głównie w pDC11. W związku z tym wcześniejsze badania wskazują, że pDC powstają z co najmniej 2 odrębnych populacji progenitorów układu krwiotwórczego pod regulacją Flt3L, chociaż typowa analiza została ograniczona do podzbiorów pDC szpiku kostnego, śledziony i / lub krwi. W związku z tym populacje progenitorowe, które generują PP pDC, wymagały zbadania. Zrozumienie pochodzenia PP pDC rzuci światło na to, czy dzielą one wspólne ścieżki rozwojowe z innymi populacjami pDC, czy też wykorzystują odrębne mechanizmy podczas ich generowania w PP.
Unikalną zaletą opisanego tutaj podejścia jest wykorzystanie myszy, które wykazują poważny niedobór PP pDCs, jako biorców do adoptywnego transferu krwiotwórczych komórek progenitorowych. Myszy z delecją genetyczną w genie kodującym IFNAR1 (myszy Ifnar-/-) lub STAT1 (Stat1-/-) wykazały uderzające zubożenie w PP pDCs5. W związku z tym szczepy te zapewniają środowisko, w którym PP pDC są redukowane, co pozwala na przeprowadzenie adoptywnych badań transferowych przy braku silnych reżimów ablacji komórek, takich jak śmiertelne napromieniowanie. Dodatkowym atutem przedstawionej metody jest zastosowanie hydrodynamicznego transferu genów (HGT) w celu stymulacji podwyższonych ilości krążącego Flt3L. Zapewnia to opłacalne podejście do indukcji Flt3L in vivo, w porównaniu z wstrzykiwaniem rekombinowanego białka. W licznych badaniach, w tym w naszym laboratorium, wykorzystano HGT do indukowania ilości cytokin w różnych warunkach eksperymentalnych5,12,13.
Podział pracy i precyzyjne funkcje immunologiczne dla DC są przedmiotem dużego zainteresowania immunologii. W szczególności pDC są ważnymi mediatorami tolerancji doustnej i ogólnoustrojowej odpowiedzi przeciwwirusowej, ale wydaje się również, że przyczyniają się do rozwoju i utrzymywania się autoimmunizacji i raka14-17. Opisany w niniejszym dokumencie protokół pozwoli na pełniejsze zbadanie mechanizmów rozwojowych regulujących PP pDC. Ponadto podejście to może pozwolić na badania oceniające funkcję PP pDC i może zostać rozszerzone o zrozumienie regulacji i funkcji innych populacji immunologicznych w obrębie PP.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J</td><td>JAX</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>B6. SJL</td><td>JAX</td><td>2014</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówki stożkowe</td><td>BD Biosciences</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówki stożkowe</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne pęsety</td><td></td><td></td><td></td>chirurgiczne</tr><tr><td>Sterylne nożyczki</td><td></td><td></td><td></td>do małych par</tr><tr><td>Sterylne nożyczki dla dużych par</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m sitko komórkowe</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>35 &mu; m rurki z nasadką do siatek komórkowych</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Bufor lizujący RBC</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> FACS <td>PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filtr sterylizowany</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17089102</td><td></td></tr><tr><td>10x HBSS</td><td>Sigma</td><td>H4641</td><td></td></tr><tr><td>Collagenaza IV</td><td>Worthington</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>Kozie mikrokulki IgG przeciw szczurom</td><td>Milteyni Biotec</td><td>130-048-501</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna LD</td><td>Milteyni Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-D3</td><td>BD Biosciences</td><td>555273</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-CD19</td><td>BD Biosciences</td><td>553783</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-CD11b</td><td>BD Biosciences</td><td>553308</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty-CD11c</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>553799</tr><tr><td>Szczur anty-Ter119</td><td>BD Biosciences</td><td>553671</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD3 (PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-0031</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD19 (PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-0193</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD11b (PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-0112</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD11c (PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-0114</td><td></td></tr><tr><td>Anty-F4/80 ( PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-4801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ter119 (PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-5921</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SCA-1 (PE. Cy7)</td><td>eBiosciences</td><td>25-5981</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD115 (APC)</td><td>eBiosciences</td><td>17-1152</td><td></td></tr><tr><td>Anti-c-kit (APC. Cy7)&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>47-1171</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IL-7R (Pacific Blue)</td><td>eBiosciences</td><td>48-1271</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLT3 (PE)</td><td>eBiosciences</td><td>12-1351</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45.1 (APC. Cy7)</td><td>BD Biosciences</td><td>560579</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD45.2 (PE. Cy7)</td><td>Biolegend</td><td>109830</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11c (Pacific Blue)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0114</td><td></td></tr><tr><td>Anti-B220 (APC)</td><td>eBiosciences</td><td>25-0452</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Siglec-H (PE)</td><td>eBiosciences</td><td>12-0333</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PDCA-1 (FITC)</td><td>eBiosciences</td><td>Nov-72</td><td></td></tr><tr><td>Sorter komórek</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>np. BD Fortessa Lampa</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>grzewcza</td></tr><tr><td>Ogranicznik</td><td></td><td></td><td></td>myszy</tr><tr><td>1 ml Strzykawki</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>27&frac12; Igły G (sterylne)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305109</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena rozwoju mysich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych w łatach peyera z wykorzystaniem adoptywnego transferu przodków hematopoetycznych

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę analizy zdolności oczyszczonych hematopoetycznych komórek progenitorowych do generowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) w jelitowym plastrze Peyera (PP). Wspólne komórki progenitorowe komórek dendrytycznych (CDP, lin- c-kitlo CD115 + Flt3 +) oczyszczono ze szpiku kostnego myszy C57BL6 za pomocą FACS i przeniesiono do myszy biorców, które nie mają znaczącej populacji pDC w PP; w tym przypadku myszy Ifnar-/- zostały użyte jako odbiorcy transferu. U niektórych myszy nadekspresja ligandu czynnika wzrostu komórek dendrytycznych Flt3 (Flt3L) została wymuszona przed adoptywnym transferem CDP, przy użyciu hydrodynamicznego transferu genów (HGT) plazmidu kodującego Flt3L. Nadekspresja Flt3L rozszerza populacje DC pochodzące z przeniesionych (lub endogennych) komórek progenitorowych układu krwiotwórczego. Po 7-10 dniach od przeniesienia progenitora pDC, które powstają z adoptywnie przeniesionych komórek progenitorowych, odróżniono od komórek biorczych na podstawie ekspresji markera CD45, przy czym pDC z przeniesionych CDP to CD45.1 +, a biorcy to CD45.2 +. Zdolność przenoszonych CDP do przyczyniania się do populacji pDC w PP i reagowania na Flt3L oceniano za pomocą cytometrii przepływowej zawiesin pojedynczych komórek PP od myszy biorców. Metoda ta może być stosowana do badania, czy inne populacje progenitorowe są zdolne do wytwarzania PP pDC. Ponadto podejście to można wykorzystać do zbadania roli czynników, które według przewidywań wpływają na rozwój pDC w PP, poprzez przenoszenie podzbiorów progenitorowych z odpowiednim knockdownem, nokautem lub nadekspresją domniemanego czynnika rozwojowego i/lub poprzez manipulowanie krążącymi cytokinami za pośrednictwem HGT. Metoda ta może również umożliwić analizę, w jaki sposób PP pDC wpływają na częstość lub funkcję innych podgrup immunologicznych w PP. Unikalną cechą tej metody jest wykorzystanie myszy Ifnar-/-, które wykazują poważnie zubożone PP pDC w porównaniu ze zwierzętami typu dzikiego, co pozwala na odtworzenie PP pDC przy braku zakłócających skutków śmiertelnego napromieniowania.

Nasze wyniki przedstawiają strategię bramkowania dla izolacji CDP z komórek szpiku kostnego myszy (Rysunek 1), zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokołach 2 i 3. CDP stanowią około 0,1% wszystkich komórek szpiku kostnego, a z jednej myszy można wyizolować w przybliżeniu 4-6 x 104 CDP. Po transferze adoptywnym CDP różnicują się w pDC i cDC10.
<img alt="Sortowanie progenitorów DC; wykres cytometrii p...

Ten protokół opisuje eksperymentalne procedury oceny różnicowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych w plastrze Peyera od typowych komórek progenitorowych komórek dendrytycznych, przy użyciu technik obejmujących izolację komórek za pośrednictwem FACS, hydrodynamiczny transfer genów i analizę przepływu podzbiorów immunologicznych w plastrze Peyera.

Ocena rozwoju mysich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych w łatach Peyera z wykorzystaniem adoptywnego transferu przodków hematopoetycznych

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Ogólnym celem poniższej procedury jest zbadanie zdolności oczyszczonych progenitorów krwiotwórczych do różnicowania się w plazmacytoidalne komórki dendrytyczne w kępkach Peyera w jelitach po transferze adopcyjnym. Osiąga się to poprzez przeprowadzenie hydrodynamicznego transferu genu plazmidu kodującego czynnik wzrostu komórek dendrytycznych FLT3 ligand do myszy z upośledzeniem funkcji plazmacytoidalnych komórek dendrytycznych w kępkach Peyera.W drugim kroku wspólne komórki progenitorowe dendrytyczne są izolowane z szpiku kostnego typu dzikiego za pomocą separacji koralikami magnetycznymi i sortowania przepływowego. W ostatnim kroku komórki progenitorowe są przenoszone adoptywnie poprzez wstrzyknięcie dożylne do myszy z upośledzoną populacją plazmacytoidalnych komórek dendrytycznych w płacie pyres, które zostały poddane hydrodynamicznemu transferowi genów. Ostatecznie populacja plazmacytoidalnych komórek dendrytycznych w płacie pyres pochodząca z donorskich hematopoetycznych komórek progenitorowych może zostać oceniona za pomocą cytometrii przepływowej.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny immunologii, takie jak pochodzenie rozwojowe plazmacytoidalnych k

assessing-development-murine-plasmacytoid-dendritic-cells-peyer-s

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ocena rozwoju murynowych komórek dendrytycznych typu plazmacytoidalnego w gąbczastych płatkach Peyer'a za pomocą przeszczepu komórek progenitorowych krwiotwórczych

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę różnicowania myeloidnych komórek dendrytycznych z szpiku kostnego myszy. Zaprezentowano izolację kości piszczelowej i udowej myszy oraz przetwarzanie szpiku kostnego. Pokazano zdjęcia obrazujące morfologię komórek przed i po różnicowaniu, a także schematy przedstawiające fenotyp komórek oraz produkcję IL-12 po dojrzewaniu z użyciem CpG.

Hodowla mieloidalnych komórek dendrytycznych z prekursorów szpiku kostnego

Prezentacja antygenu w wtórnych narządach limfatycznych przez komórki dendrytyczne jest kluczowa dla inicjacji adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej pośredniczonej przez limfocyty T. W niniejszej pracy demonstrujemy hodowlę mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego, ich aktywację oraz znakowanie do obrazowania dwufotonowego.

Generowanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego do zastosowań w obrazowaniu dwufotonowym

Ten film demonstruje test in vitro do generowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) z popularnych limfoidalnych komórek progenitorowych (CLP). Po jednoczesnej hodowli oczyszczonych CLP z napromieniowanymi γ komórkami zasilającymi w obecności liganda kinazy tyrozynowej-3 (FL) podobnego do Fms, CLP różnicują się w nieprzylegające pDC, których obecność potwierdza się za pomocą cytometrii przepływowej.

Wytwarzanie in vitro plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze wspólnych progenitorów limfoidalnych

Rośnie zainteresowanie zrozumieniem funkcji immunologicznych określonych subpopulacji komórek w łatach Peyera (PP), głównych miejscach indukcyjnych tkanek limfatycznych związanych z jelitami.  W tym miejscu przedstawiamy równoległe protokoły przygotowania preparatów pojedynczych komórek PP do analizy cytometrii przepływowej i kriosekcji PP do barwienia immunologicznego.

Izolowanie i barwienie immunologiczne limfocytów i komórek dendrytycznych z mysich plastrów Peyera

W tym badaniu prezentujemy system hodowli in vitro, który może efektywnie generować pDC poprzez kokulturę pospolitych komórek progenitorowych limfoidalnych z komórkami zasilającymi AC-6 w obecności ligandu Flt3.

In vitro Generowanie mysich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze wspólnych progenitorów limfoidalnych przy użyciu systemu AC-6 Feeder

Odrębne podzbiory komórek dendrytycznych istnieją jako rzadkie populacje w narządach limfoidalnych, dlatego są trudne do wyizolowania w wystarczającej liczbie i czystości do eksperymentów immunologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę o wysokiej skuteczności i wysokiej wydajności do izolacji wszystkich obecnie znanych głównych podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony myszy.

Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

Zgłaszamy protokół wykorzystujący sortowanie komórek aktywowane fluorescencją do izolowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) o wysokiej czystości ze szpiku kostnego myszy podatnych na toczeń do badań funkcjonalnych pDC.

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu oczyszczenia plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki tolerogennych komórek dendrytycznych (TolDCs) oraz oceny ich immunoterapeutycznej użyteczności.

Rozwój i charakterystyka funkcjonalna mysich tolerogennych komórek dendrytycznych

Tutaj prezentujemy protokół izolacji komórek dendrytycznych z mysich śledzion, poprzez magnetyczne sortowanie komórek, a następnie transfer adoptywny do naiwnych myszy. Model komórek dendrytycznych aktywowanych solą został wybrany, aby wyjaśnić krok po kroku procedury adoptywnej cytometrii transferowej i przepływowej.

Izolacja i transfer adoptywny komórek dendrytycznych prezentujących antygen traktowany wysoką solą

Tutaj udostępniamy protokół do badania potencjalnych czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w rozwój komórek dendrytycznych (DC) za pomocą lentiwirusowej transdukcji shRNA w celu uzyskania stabilnych linii komórkowych knockdown do różnicowania DC in vitro.

Badanie rozwoju komórek dendrytycznych przez knockdown genów za pośrednictwem krótkiej spinki do włosów za pośrednictwem RNA w linii komórek hematopoetycznych i progenitorowych in vitro

Poznaj metodę oceny rozwoju plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych w łatach Peyera myszy przy użyciu adoptywnego transferu przodków hematopoetycznych. Technika ta umożliwia badanie potencjału rozwojowego komórek CDP in vivo.

Ocena rozwoju mysich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych w łatach Peyera z wykorzystaniem adoptywnego transferu przodków hematopoetycznych (Wideo) | JoVE Journal

Ocena rozwoju mysich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych w łatach Peyera z wykorzystaniem adoptywnego transferu przodków hematopoetycznych

Przeglądaj więcej filmów