Ocena rozwoju mysich plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych w łatach Peyera z wykorzystaniem adoptywnego transferu przodków hematopoetycznych

Ogólnym celem poniższej procedury jest zbadanie zdolności oczyszczonych komórek progenitorowych układu krwiotwórczego do powstawania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych w plamach jelitowych po transferze adoptywnym. Osiąga się to poprzez wykonanie najpierw hydrodynamicznego transferu genów plazmidu, kodującego czynnik wzrostu komórek dendrytycznych. FLIT trzy ligandy do myszy z upośledzonymi komórkami dendrytycznymi plazmocytoidu PI w łatce.

W drugim etapie pospolite dendrytyczne komórki progenitorowe są izolowane ze szpiku kostnego typu dzikiego poprzez magnetyczną separację kulek i sortowanie przepływowe. W ostatnim etapie komórki progenitorowe są adoptywnie przenoszone przez wstrzyknięcie dożylne do myszy z upośledzonymi komórkami dendrytycznymi z plamami plazmocytoidalnymi, które były leczone hydrodynamicznym transferem genów. Ostatecznie populację komórek dendrytycznych plazmocytoidowych PI pochodzących z komórek progenitorowych krwi dawcy można ocenić za pomocą cytometrii przepływowej.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, takie jak pochodzenie rozwojowe komórek Cy Dendri plazmy, które lokalizują się w pirackich łatach. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w pochodzenie stosów, plami plazmocytoidalne komórki dendrytyczne. Można go również zastosować do zrozumienia, w jaki sposób plazmocytoidalne komórki dendrytyczne wpływają na populacje limfocytów w tych tkankach.

Dwa dni przed transferem adopcyjnym rozszerz naczynia krwionośne pięciu myszy biorców CD 45 2 z dodatnim nokautem receptora interferonu alfa pod lampą grzewczą przez pięć do 10 minut. Następnie dla każdej myszy umieść zwierzę w uwięzi i zdezynfekuj ogon 70% etanolem. Następnie za pomocą igły o rozmiarze 27 wstrzyknij pięć mikrogramów osocza i powlekaj trzy ligandy i dwa mililitry sterylnego PBS do żyły ogonowej każdego zwierzęcia.

W przypadku kohorty kontrolnej wstrzyknąć pięć mikrogramów pustego wektora. Po monitorowaniu myszy przez 15 do 30 minut, zwróć je do ich pomieszczenia. W dniu eksperymentu umieść wypreparowaną kość udową i piszczelową od 10 kongenicznych czarnych myszy CD 45 1 dodatnich C 57 w naczyniu hodowlanym zawierającym kompletne pożywki.

Następnie włóż igłę o rozmiarze 27 do jednego końca każdej kości i użyj kompletnego podłoża, aby przepłukać szpik kostny do naczynia trzy razy na kość. Upewnij się, że komórki szpiku kostnego są usuwane, potwierdzając, że wydalane podłoże wydaje się mętne. Sporządzić zawiesinę jednokomórkową, delikatnie pipetując pożywkę w górę i w dół trzy do pięciu razy w naczyniu hodowlanym.

Następnie usuń zanieczyszczenia, przepuszczając komórki szpiku kostnego przez sitko do komórek o średnicy 40 mikrometrów i rozbij wszelkie grudki komórek, delikatnie przykładając koniec sterylnego tłoka strzykawki. Na sitku odwiruj komórki, usuń supernatanty i czerwone krwinki w dwóch mililitrach buforu do lizy na cztery do sześciu razy 10 do siódmych komórek przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 10 mililitrów buforu faksowego do komórek szpiku kostnego i wiruj przez cztery minuty w temperaturze 500 razy G w temperaturze pokojowej.

Po delikatnym zassaniu sup natin, umyj granulat w 10 mililitrach bufora faksowego. Następnie wybarwić komórki markerem linii krwiotwórczej rozpoznającym przeciwciała po barwieniu przeciwciałami i myciu. Inkubuj komórki za pomocą kozich mikrokulek magnetycznych przeciw szczurom.

Podczas inkubacji mikrogranulek załaduj maksymalną kolumnę LD do separatora komórek MIDI max i wstępnie przepłucz kolumnę dwoma mililitrami bufora faksu. Następnie umieść stożkową rurkę o pojemności 15 mililitrów pod kolumną i załaduj do pięciu razy od 10 do ósmych komórek w 2,5 mililitra bufora faksu do kolumny. Umyj kolumnę trzykrotnie dwoma mililitrami buforu faksu na mycie, zbierając ujemne komórki pochodzenia przechodzą przez kolumnę do 15-mililitrowej probówki.

Policz komórki, które wymknęły się spod kontroli. Następnie, po wybarwieniu komórek odpowiednimi fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami, należy przenieść próbkę do rurki faksowej w celu posortowania wspólnych dendrytycznych komórek progenitorowych na podstawie pożądanego profilu markera. Zbierz oczyszczone komórki faksu do 15-mililitrowej probówki zawierającej pięć mililitrów kompletnego nośnika, a następnie na końcu uruchomienia faksu zapisz bezwzględną liczbę posortowanych komórek.

Po odwirowaniu komórki rozcieńczają się raz po 10 do jednej piątej oczyszczonych zwykłych dendrytycznych komórek progenitycznych na 100 mikrolitrów całkowitej objętości sterylnego PBS na mysz i odsysają zawiesiny komórek do jednej strzykawki wyposażonej w igły o rozmiarze 27. Następnie wstrzyknąć CD 45 1 dodatnie komórki progenitorowe do żyły ogonowej każdej myszy z nokautem receptora interferonu alfa CD 45 2 dodatniego, jak właśnie wykazano siedem do 10 dni po transferze adoptywnym. Usuń jelita od zwykłych myszy z wstrzykniętymi komórkami dendrytycznymi, umieszczając tkanki na ręcznikach papierowych nasączonych PBS.

Następnie użyj cienkich kleszczy i nożyczek, aby zebrać wszystkie widoczne plamy stosów wzdłuż ściany jelita cienkiego. Zauważ, że łaty stosów są często strukturalnie odrębne nawet w obrębie jednej myszy, więc upewnij się, że wszystkie łaty P'S są zidentyfikowane i przeanalizowane. Umyj wyizolowane plastry P'S trzy razy na szalce Petriego zawierającej PBS za pomocą kleszczy w celu usunięcia kału.

Następnie trawić plastry P'S z jednym miligramem na mililitr, kolagenazę cztery w 10 mililitrach HBSS w kolbie o pojemności 50 mililitrów, energicznie mieszając w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po godzinie wlej strawione plastry PIs do sitka komórkowego o średnicy 40 mikrometrów i użyj sterylnego tłoka strzykawki, aby wepchnąć komórki do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Po odwirowaniu przefiltrowanej zawiesiny komórek, ponownie zawieś osad w sześciu mililitrach 37% roztworu na wywołanie i przenieś go do 15-mililitrowej probówki.

Następnie delikatnie umieść pod spodem sześć mililitrów roztworu 70% na połączenie, aby utworzyć gradient kroku dla każdego połączenia. Teraz rozdziel komórki na 20 minut w temperaturze 800 razy G w temperaturze pokojowej z odłamaniem. Następnie zbierz populację komórek jednojądrzastych na granicy faz.

Po granulowaniu zebranych komórek umyj je dwukrotnie w 50 mililitrach kompletnego podłoża. Następnie wybarwić je odpowiednimi przeciwciałami, aby wykryć CD 45 1 dodatni plaster PYS. Plazmocytoidalne komórki dendrytyczne, które wywodzą się z adoptywnie przenoszonych komórek progenitorowych CD 41 dodatnich.

Analizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Plazmocytoidalne komórki dendrytyczne można zidentyfikować na podstawie ich fenotypu CD 11 C dodatniego clec H, PDCA, jednego dodatniego B dwóch 20 dodatnich CD 11 B ujemnego. Na koniec określ bezwzględną liczbę plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych za pomocą tego równania.

Te wykresy kropkowe wskazują na strategię bramkowania dla izolacji pospolitych przodków dendrytycznych. W przypadku komórek szpiku kostnego myszy, jak właśnie wykazano, wspólne dendrytyczne komórki progenitorowe stanowią około 0,1% wszystkich komórek szpiku kostnego i około cztery do sześciu razy 10 do czwartego. Spośród tych komórek można wyizolować od jednej myszy w celu identyfikacji plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych PI za pomocą cytometrii przepływowej.

Stosuje się początkową strategię bramkowania z rozproszeniem do przodu i z boku, a następnie bramkowania dla komórek CD 11 C dodatnich clec H. Myszy z nokautem receptora interferonu alfa wykazują znaczne zmniejszenie plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych z plamą pys w porównaniu z myszami typu dzikiego. Wspólne dendrytyczne komórki progenitorowe również różnicują się w konwencjonalne komórki dendrytyczne.

W przeciwieństwie do plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych, CD 11 C, c, dodatni, clec H, ujemne, konwencjonalne komórki dendrytyczne obserwuje się w podobnych ilościach zarówno u myszy typu dzikiego, jak i nokautowego. W związku z tym myszy z nokautem receptora interferonu alfa dają możliwość zbadania rekonstytucji plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych z plastrem PS bez skutków śmiertelnego napromieniowania. Adoptywny transfer pospolitych prekursorów dendrytycznych typu dzikiego do myszy z nokautem receptora interferonu alfa, jak właśnie wykazano, stymuluje wzrost liczby komórek dendrytycznych plazmocytoidalnych PI.

Co więcej, wstępne traktowanie hydrodynamicznym transferem genów trójligandu FL dodatkowo zwiększa ekspansję plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych w łatach PIs, co oznacza, że przeniesione wspólne przodki dendrytyczne i prawdopodobnie endogenne FL trzy dodatnie komórki progenitorowe reagują na ligand FL three poprzez indukcję plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych z plamą pyrusową. Oba warunki stymulują również CD 11 C dodatni clec H ujemny konwencjonalny wytwarzanie komórek dendrytycznych zgodnie z pochodzeniem rozwojowym konwencjonalnych komórek dendrytycznych. Plazmocytoidalne komórki dendrytyczne z plastrem PYS wyrażają tradycyjne plazmocytoidalne markery komórek dendrytycznych, w tym clec H, PDCA jeden i B dwa 20 i LAC CD 11 B.In dodatkowo, analiza plastrów PYS od myszy z nokautem receptora interferonu alfa, które otrzymują zarówno hydrodynamiczny transfer genów FL three ligand, jak i przenoszone wspólne progenitory dendrytyczne, pokazuje, że około 70% plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych pochodzi od dawcy CD 45 1 dodatnich wspólnych przodków dendrytycznych.

Łącznie dane te pokazują, że adoptywny transfer pospolitych dendrytycznych komórek progenitorowych indukuje PI łatają populację plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych w odpowiedzi na sygnały za pośrednictwem ligandu FL three in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i identyfikować komórki plazmocytoidu D z plamą pars.