Name: Izolacja podwójnie ujemnych limfocytów T αβ z nerki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Poznaj metodę izolacji podwójnie ujemnych limfocytów T αβ z nerki myszy. Technika ta umożliwia badanie funkcji immunologicznych komórek w nerkach i zrozumienie mechanizmów odpowiedzi immunologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez NIH PBS (R21 AI095484). Dziękujemy NHI za tetramer CD1d.

1. Przygotowanie instrumentów, pożywek hodowlanych i odczynników
<ol>
	<li>Instrumenty: Przygotuj odczynniki w sterylnych warunkach i używaj pod kapturem z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Przygotuj 1 l pożywki do hodowli tkankowych RPMI, dodaj 5% płodowej surowicy bydlęcej, 2,1 g wodorowęglanu, 10 ml glutaminianu 100x, 10 mg HEPES, 1 mg pirogronianu sodu i 10 ml 100x penicyliny/streptomycyny. 
	Uwaga: zalecana pożywka do hodowli tkankowych, RPMI, jest wymienna z DMEM.</li>
	<li>Przygotować 5% roztwór kolagenazy "D" (5 ml kolagenazy "D" na 9 ml pożywki do hodowli tkankowych).</li>
	<li>Przygotuj roztwór Percollu w trzech różnych stężeniach: 100%, 80% i 40%. Następujące stężenia oblicza się dla 1 próbki. Roztwory należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Roztwór Percollu: dodać 9 ml nierozcieńczonego Percollu (z roztworu podstawowego); dodać 1 ml PBS 10x.</li>
		<li>Roztwór Percollu: dodać 8 ml Percoll 100%; dodać 2 ml PBS 1x.</li>
		<li>Roztwór Percollu: dodać 4 ml Percoll 80%; dodać 4 ml PBS 1x.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 1 l buforu do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS), dodać 5 ml 10% BSA (0,1% BSA), 1 ml 10% azydku sodu (0,1%), 2 ml środka EDTA, uzupełnić do 1 000 ml 1x PBS.</li>
</ol>
2. Przygotowanie trawienia nerek
<ol>
	<li>Po uzyskaniu niezbędnej zgody instytucjonalnej, należy złożyć myszy w stan ośmiercenia i wykrwawić je standardowymi metodami oraz zgodnie z obowiązującymi przepisami i wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
	<ol>
		<li>Znieczulić mysz pentobarbitalem (0,07 mg/kg).</li>
		<li>Przejdź do wykrwawienia.</li>
		<li>Umieść mysz w pozycji leżącej na stole operacyjnym.</li>
		<li>Spryskaj okolice brzucha 70% etanolem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 10 ml roztworu kolagenazy D na szalkę Petriego.</li>
	<li>Usuń i odkapsułkuj obie nerki od każdej myszy.
	<ol>
		<li>Otwórz jamę brzuszną, wykonując nacięcie w linii środkowej przez skórę brzucha i otrzewną od mostka do łona.</li>
		<li>Odsłoń lewą nerkę, przesuwając jelito na bok.</li>
		<li>Ostrożnie oddzielić lewą kapsułkę za pomocą kleszczyków. 
		Uwaga: Kapsułka ma postać przezroczystej warstwy otaczającej nerkę i częściowo pokrytej tkanką tłuszczową okołonerkową.</li>
		<li>Usuń lewą nerkę, przecinając naczynia szypułkowe za pomocą nożyczek chirurgicznych.</li>
		<li>Powtórz tę samą procedurę dla prawej nerki. 
		Uwaga: Prawa nerka jest bardziej czaszkowa i bliżej linii środkowej (szypułki są krótsze).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść nerkę na szalce Petriego.</li>
	<li>Pociąć tkankę nerkową na małe kawałki (o średnicy 1-2 mm) za pomocą zwykłego metalowego ostrza kształtującego i umieścić kawałki w roztworze kolagenazy na 30-45 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C (ryc. 1).</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek jednojądrzastych nerki (KMNC) z trawienia nerek
<ol>
	<li>Otrzymać zawiesinę komórkową trawienia nerkowego poprzez mechaniczne rozbicie tkanki za pomocą sitka (70 μm) i ponownie zawiesić w 25 ml pożywki do hodowli tkankowych i wymieszać.</li>
	<li>Wirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia zawiesiny komórek.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad w 4 ml 40% roztworu Percoll i delikatnie nałożyć na 4 ml 80% roztworu Percollu za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia, bardzo powoli i ostrożnie. Spowoduje to powstanie dwóch faz wyraźnie oddzielonych półprzezroczystą warstwą. Na górze będzie żółta warstwa odpowiadająca lipidom.</li>
	<li>Wirować przy 1 500 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej z wirówką w trybie wyłączenia.</li>
	<li>Usunąć przez aspirację żółtą i grubą warstwę wierzchnią (około 1-2 ml).</li>
	<li>Za pomocą pipety transferowej zebrać tylko niewielką białawą, półprzezroczystą warstwę z powierzchni styku dwóch faz. Bardzo ostrożnie przenieść tę zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml pożywki do hodowli tkankowych, a następnie dodać 13 ml pożywki, aby uzyskać całkowitą objętość 15 ml.</li>
	<li>Wirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić próbki w 1 ml pożywki.</li>
	<li>Policz liczbę KMNC za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego na hemocytometrze i wyraź wyniki jako liczby KMNC na ml na nerkę.</li>
	<li>Umyj raz jak wyżej.</li>
</ol>
4. Izolacja komórek krwiotwórczych (CD45+) z KMNC (Krok I)
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić komórki do 107 w 90 μl działającego buforu.</li>
	<li>Dodać 10 μl mikrogranulek CD45 i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 1 ml działającego buforu, aby zatrzymać reakcję. Wirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w 500 μl bieżącego buforu.</li>
	<li>Przygotuj kolumnę magnetyczną, umieszczając ją na magnesie i przepłucz 3 ml bieżącego buforu.</li>
	<li>Przepuść zawiesinę komórek przez kolumnę magnetyczną i zbierz nieoznakowane komórki, które przechodzą przez kolumnę.</li>
	<li>Przemyć komórki trzykrotnie 3 ml bieżącego buforu. Następnie zbierz ścieki.</li>
	<li>Wyjąć kolumnę z separatora i odpipetować 5 ml bieżącego buforu na kolumny i natychmiast wypłukać oznakowaną frakcję. Ta frakcja zawiera komórki CD45+. Policz komórki.</li>
	<li>Aby obliczyć bezwzględną liczbę różnych podzbiorów limfocytów T w nerkach, pomnóż całkowitą liczbę KMNC przez procent komórek dodatnich określony za pomocą cytometrii przepływowej (ryc. 2).</li>
</ol>
5. Izolacja limfocytów T DN od preparacji CD45+ przez selekcję negatywną (Krok II)
<ol>
	<li>Dodać 2,5 μl (0,5 mg/ml, 1,25 μg) każdego z następujących biotynylowanych przeciwciał: anty-CD4, anty-CD8, receptora anty-Fc (CD16/32), anty-MHC klasy II (I-A b), tetrameru anty-CD1d PBS-57 na każde 107 komórek krwiotwórczych.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 30 minut w chłodni.</li>
	<li>Dodaj 1 ml mikrogranulek anty-biotyny.</li>
	<li>Inkubować przez 30 minut w chłodnym pomieszczeniu.</li>
	<li>Umieść rurkę w magnesie i przystąp do wyczerpania.</li>
	<li>Policz żywe komórki, aby określić całkowitą liczbę komórek T DN we frakcji ujemnej za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Sprawdź czystość limfocytów T DN za pomocą cytometrii przepływowej, postępując zgodnie z tą strategią bramkowania: pierwsza bramka CD45 +, druga bramka TCRαβ +. Wyklucz komórki CD1d+. Wykreśl CD4 + w porównaniu z CD8 +, aby zidentyfikować limfocyty T DN (Rysunek 3).</li>
	<li>Pomnóż całkowitą liczbę przez procent określony w czystości. 
	Uwaga: Użycie tego protokołu powoduje populację ponad 90% czystych limfocytów T DN.</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+previously+unknown+antigen-specific+regulatory+T+cell+and+its+mechanism+of+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression.</a> Nat Med. 6, 782-789 (2000).</li>
<li>Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+regulatory+function+of+lymphoproliferative+double+negative+T+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo.</a> J Exp Med. 196, 261-267 (2002).</li>
<li>Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+in+vivo+trogocytosis+as+a+mechanism+of+double+negative+regulatory+T+cell-mediated+antigen-specific+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression.</a> J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).</li>
<li>Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-lymphocyte+infusion+induces+transplantation+tolerance+by+activating+systemic+and+graft-infiltrating+double-negative+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells.</a> Blood. 100, 3408-3414 (2002).</li>
<li>Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+in+vitro-generated+DN+T+regulatory+cells+induces+permanent+cardiac+allograft+survival+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice.</a> Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).</li>
<li>Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+graft-versus-host+disease+by+double-negative+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells.</a> J Immunol. 171, 134-141 (2003).</li>
<li>Mohamood, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gld+mutation+of+Fas+ligand+increases+the+frequency+and+up-regulates+cell+survival+genes+in+CD25%2BCD4%2B+TR+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells.</a> Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).</li>
<li>Ascon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+mouse+kidneys+contain+activated+and+CD3%2BCD4-+CD8-+double-negative+T+lymphocytes+with+a+distinct+TCR+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire.</a> J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).</li>
<li>Hamad, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B220%2B+double-negative+T+cells+suppress+polyclonal+T+cell+activation+by+a+Fas-independent+mechanism+that+involves+inhibition+of+IL-2+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production.</a> J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).</li>
<li>Rabb, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+role+of+T+lymphocytes+in+renal+ischemia-reperfusion+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Renal%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice.</a> Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).</li>
<li>Burne, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+CD4%28%2B%29+T+cell+as+a+major+pathogenic+factor+in+ischemic+acute+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure.</a> J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).</li>
<li>Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+T+cell+depletion+in+murine+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury.</a> Transplantation. 74, 759-763 (2002).</li>
<li>Crispin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+double+negative+T+cells+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+produce+IL-17+and+infiltrate+the+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys.</a> J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).</li>
<li>Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+analyses+on+T-cell+subsets+in+lymph+nodes+of+MRL%2FMp-lpr%2Flpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Appl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).</li>
<li>Dowdell, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+FAS+mutations+are+common+in+patients+with+genetically+undefined+autoimmune+lymphoproliferative+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome.</a> Blood. 115, 5164-5169 (2010).</li>
<li>Juvet, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FcRgamma+promotes+T+cell+apoptosis+in+Fas-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice.</a> J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).</li>
<li>Thomson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FcR+gamma+presence+in+TCR+complex+of+double-negative+T+cells+is+critical+for+their+regulatory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function.</a> J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rośnie zainteresowanie limfocytami T DN, ponieważ są one zaangażowane w różne stany patologiczne, takie jak zaburzenia autoimmunologiczne, rak, tolerancja przeszczepów i pierwotne choroby nerek, w tym ostre uszkodzenie nerek (AKI), kłębuszkowe zapalenie nerek 8,13. Dlatego istnieje potrzeba lepszego zrozumienia i scharakteryzowania funkcji patofizjologicznych limfocytów T DN. Jednak obecnie brakuje zrozumienia funkcji tych komórek w porównaniu z limfocytami T CD4 i CD8. Głównym powodem je...

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/51192/isolation-of-double-negative-t-cells-from-the-kidney">Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney</a>.
There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:
Samatha Bandapelle
instead of:
Samantha Bandapelle

A correction was made to: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney.

Erratum: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Obwodowe αβTCR+CD3+CD4-CD8-podwójnie ujemne (DN) limfocyty T dzielą się na różne podzbiory, które mają różne fenotypy i funkcje1-4. Limfocyty T DN są słabo poznane, ale coraz częściej biorą udział w patofizjologicznych odpowiedziach immunologicznych w różnych modelach choroby4-6.
DN Limfocyty T to unikalny typ komórek odpornościowych, który jest coraz częściej zaangażowany w regulację różnych odpowiedzi immunologicznych i autoimmunologicznych oraz modulację tolerancji allotransplantu. 4-6,9 Rzadko występują we krwi obwodowej i wtórnych narządach limfatycznych (śledziona i węzły chłonne). Są jednak głównymi mieszkańcami prawidłowego nabłonka nerek i jelit10-12. Bardzo niewiele wiadomo na temat ich funkcji7 w nerkach w stanie stacjonarnym i w stanach patologicznych, takich jak ostre uszkodzenie nerek (AKI) związane z przeszczepem nerki.
Ze względu na skomplikowane role różnych komórek odpornościowych w regulacji odpowiedzi immunologicznych, w tym alloodpowiedzi, zdefiniowanie roli każdego gracza jest kluczowe dla zrozumienia aloodpowiedzi i projektowania nowych terapii. Biorąc pod uwagę znaczną liczbę limfocytów T DN obecnych w nerkach w warunkach fizjologicznych i różnych warunkach chorobowych, limfocyty T DN prawdopodobnie będą odgrywać kluczową rolę w regulacji odpowiedzi immunologicznej i autoimmunologicznej u myszy i ludzi oraz alloodpowiedzi u biorców przeszczepów. Gromadzące, choć wciąż rozproszone dowody wskazują na to, że limfocyty DN T pełnią zarówno funkcje patogenne, jak i immunosupresyjne, ale nie wiadomo, dlaczego i w jaki sposób wykazują one określoną szkodliwą lub supresyjną funkcję oraz jak wpływa na nie środowisko.
Ze względu na ich niską liczebność w nerkach, konieczne są ulepszone metody izolacji.
Obecnie nie ma standardowego protokołu izolacji limfocytów T DN z tkanek nielimfatycznych. Nasz protokół opisuje nowatorską metodę izolacji limfocytów T DN z nerki; Jednak metoda ta może być również stosowana w przypadku różnych tkanek nielimfatycznych.

<table><tbody><tr><td>Okap z przepływem laminarnym&nbsp;</td><td>Baker Company, Inc</td><td></td><td>Lub równoważny sprzęt&nbsp;</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Lub równoważne wyposażenie&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>63514-11</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator sterowany atmosferą</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>&nbsp;( 37 &stopnie; C z 5% CO2)</td></tr><tr><td>Analityczny cytometr przepływowy</td><td>LSR II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Media Tech</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>Corning Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>0,1% azydek sodu (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy buforowany solą fizjologiczną (PBS)</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Mediatech</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>bufor EDTA&nbsp;</td><td>Kolumny Sigma-Aldrich</td><td>E1161</td><td></td></tr><tr><td>LS&nbsp;</td><td>Mikrogranulki MiltenyiBiotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD45+</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>6.78E-51</td><td></td></tr><tr><td>Mikrogranulki biotyny&nbsp;</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD45 (klon: 30-F11)&nbsp; PerCP&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD45 (klon: 30-F11)&nbsp; APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>anty-TCR Pacific Blue&nbsp; (ab-chain, klon: H57-597)</td><td>Invitrogen</td><td>HM3628</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD4 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0043</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD8 FITC</td><td>eBioscience</td><td>8011-0087</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD4 biotynylowany (GK1.5)</td><td>BD</td><td>553728</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD8 biotynylowany&nbsp; (Klon 53-6.7)</td><td>BD</td><td>553029</td><td></td></tr><tr><td>anty-MHC klasy II (I-A b) biotynylowany</td><td>BD</td><td>553609</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Running Buffer - Bufor separacyjny MACS&nbsp;</td><td>MIlteny I Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J myszy</td><td>Jackson Labs</td><td>000664</td><td>Nerki - Węzły chłonne</td></tr><tr><td>szalka Petriego&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>356517</td><td></td></tr><tr><td>70 & #956; Filtr M&nbsp;</td><td>Tłok Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Lub równoważny sprzęt&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki GeneMate 50 ml</td><td>Bioexpress</td><td>C-3394-3</td><td>Lub równoważne wyposażenie&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówki GeneMate 15 ml</td><td>Bioexpress</td><td>C-3394-1</td><td>Lub równoważne wyposażenie&nbsp;</td></tr><tr><td>CD1d &#945;-galcer tetramer</td><td>NHI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja podwójnie ujemnych limfocytów t αβ z nerki

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Obecnie nie ma standardowego protokołu izolacji limfocytów T DN z tkanek nielimfatycznych, pomimo ich coraz częściej zgłaszanego udziału w różnych odpowiedziach immunologicznych. Limfocyty T DN są unikalnym typem komórek odpornościowych, który bierze udział w regulacji odpowiedzi immunologicznej i autoimmunologicznej oraz tolerancji na allotransplantacje1-6. Limfocyty T DN są jednak rzadkie we krwi obwodowej i wtórnych narządach limfatycznych (śledziona i węzły chłonne), ale są głównymi mieszkańcami normalnej nerki. Bardzo niewiele wiadomo na temat ich funkcji patofizjologicznej7 ze względu na ich niedostatek na peryferiach. Niedawno opisaliśmy kompleksową analizę fenotypową i funkcjonalną tej populacji w nerkach8 w stanie stacjonarnym i podczas uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego. Analiza funkcji limfocytów T DN zostanie znacznie ulepszona dzięki opracowaniu protokołu ich izolacji od nerki.
Tutaj opisujemy nowatorski protokół, który pozwala na izolację wysoce czystych limfocytów T ab CD4+ CD8+ i limfocytów T DN z mysiej nerki. Krótko mówiąc, trawimy tkankę nerkową za pomocą kolagenazy i izolujemy jednojądrzaste komórki nerkowe (KMNC) za pomocą gradientu gęstości. Następnie następują dwa etapy w celu wzbogacenia hematopoetycznych limfocytów T z 3% do 70% z KMNC. Pierwszy etap polega na pozytywnej selekcji komórek krwiotwórczych za pomocą zestawu do izolacji CD45+. W drugim etapie limfocyty T DN są izolowane ujemnie przez usunięcie niepożądanych komórek przy użyciu przeciwciał monoklonalnych CD4, CD8 i MHC klasy II oraz tetrameru CD1d α-galcer. Ta strategia prowadzi do populacji ponad 90% czystych limfocytów T DN. W celu potwierdzenia czystości stosuje się barwienie powierzchni wyżej wymienionymi przeciwciałami, a następnie analizę FAC.

Nerka myszy szczepu dzikiego C57BL/6 (B6) zawiera około 1,5-2,1 x 106 komórek jednojądrowych na jedną nerkę. Nie więcej niż około 10% stanowią komórki hematopoetyczne CD45+. W celu przygotowania jednojądrowych komórek nerki (KMNC), nerki tnie się na małe kawałki, jak pokazano na Rysunku 1, a następnie poddaje trawieniu z użyciem 5% kolagenazy.
Następnie wykonano wirowanie w gradiencie gęstości w celu zebrania warstwy KMNC (Rysunek 2, panel lewy)</...

Komórki DNabT są rzadkie wśród obwodowych limfocytów T, jednak są obfite w niektórych tkankach nielimfatycznych. Trudność w wyizolowaniu limfocytów DN T z tkanki nielimfatycznej utrudnia ich analizę funkcjonalną pomimo rosnącego rozpoznanego znaczenia patofizjologicznego. Opisujemy nowy protokół izolacji wysoce oczyszczonych limfocytów T DN z mysiej nerki.

Izolacja podwójnie ujemnych limfocytów T αβ z nerki

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opisanie sposobu izolacji czystych i podwójnie negatywnych limfocytów T z nerki myszy. Jest to osiągane poprzez wstępne trawienie nerki w roztworze kolagenazy. Następnie komórki mononuklearne są rozdzielane za pomocą gradientu gęstości, a komórki hematopoetyczne CD 45 pozytywne są zbierane metodą selekcji pozytywnej.W rezultacie limfocyty T podwójnie negatywne mogą zostać następnie wyizolowane poprzez selekcję negatywną. W 1998 roku nasz zespół odkrył, że komórki odpornościowe, w szczególności limfocyty T, wbrew ówczesnym dogmatom, pośredniczyły w ostrym uszkodzeniu nerek. W nerkach i sercu znajdowało się zbyt mało tych komórek, aby móc je badać, dlatego opracowaliśmy technikę pozwalającą na ich lepszą analizę.Z zaskoczeniem odkryliśmy populację komórek T podwójnie ujemnych, pozbawionych CD4 lub CD8, które występowały w dużym zagęszczeniu zarówno w prawidłowej nerce, jak i podczas uszkodzenia. Szczegółowa i udoskonalona technika pozwalająca na lepsze badanie tych komórek oraz analizę mechanizmów ich działania zostanie opisana w nadchodzącym filmie. Badamy komórki T podwójnie ujemne od 2001 roku, a niedawno nawiązaliśmy współpracę z laboratorium dr. Roba, aby zmodyfikować regionalną metodę izolacji tych komórek w celu uzyskania czystej populacji, którą można wykorzystać do badania różnych biologicznych reakcji odpornościowych.Choć metoda ta pozwala na analizę komórek odpornościowych w nerkach, może być ona zastosowana również do innych układów, takich jak tkanki nielimfatyczne. Przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego należy do szalki Petriego przeznaczonej do zbierania tkanek dodać 10 milliliters kolagenazy D. Następnie obszar brzuszny uśpionej myszy należy spryskać 70%ethanol.Następnie wykonaj nacięcie w linii pośrodkowej przez skórę brzucha i otrzewną od mostka do łonka, a następnie odsuń jelita bocznie, aby odsłonić lewą nerkę. Zidentyfikuj lewą torebkę, która przejawia się jako przezroczysta warstwa otaczająca nerkę, częściowo pokryta tkanką tłuszczową okołonerkową, i ostrożnie oddziel ją od nerki za pomocą pęsety. Następnie przetnij naczynia szypuły nożyczkami chirurgicznymi, aby usunąć tkankę, a nerkę umieść w szalce Petriego.Następnie po usunięciu prawej nerki, za pomocą zwykłego metalowego ostrza formującego, należy pociąć tkankę nerki na małe kawałki o wielkości od 1 do 2 mm. Kawałki należy trawić w roztworze kolagenazy przez 30 do 45 minut w temperaturze 37 °C, a następnie, aby wyizolować mononuklearne komórki nerki, mechanicznie rozbić zawiesinę nerki, przeciskając ją przez sitko o oczkach 70 µm. Zawiesinę komórkową należy ponownie zawiesić w 25 ml pożywki do hodowli tkankowych.Następnie, po delikatnym wstrząsaniu, odwiruj komórki i resuspenduj osad w czterech mililitrach 40% roztworu Percoll. Następnie za pomocą plastikowej pipety transferowej delikatnie nanieś roztwór komórek w Percollu na cztery mililitry 80% roztworu Percoll, aby utworzyć dwie fazy wyraźnie oddzielone półprzezroczystą warstwą. Wirowanie przeprowadzaj przez 30 minut przy 1500 Gs w temperaturze pokojowej z wyłączonym hamowaniem, a następnie pobierz około jeden do dwóch mililitrów grubej, żółtej, górnej warstwy zawierającej lipidy.Za pomocą nowej pipety transferowej pobierz lekko białawą, półprzezroczystą warstwę z granicy faz do probówki stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml pożywki do hodowli tkankowych. Następnie dodaj 13 ml pożywki, aby uzyskać objętość całkowitą 15 ml. Po przemyciu i policzeniu komórek, rozcieńcz je do stężenia 1 × 10⁷ w 90 µL buforu do elektroforezy.Następnie inkubuj komórki w 10 µL mikrokulek anty-CD45 w temperaturze 4 °C. Po 15 minutach dodaj 1 ml buforu do płukania, aby zatrzymać reakcję. Następnie odwiruj komórki i zawieś je ponownie.Resuspend osad w 500 µL świeżego buforu do elucji. Następnie umieść kolumnę w magnesie do separacji kulek i przemyj kolumnę trzema mililitrami buforu do elucji. Następnie przepuść zawiesinę komórkową przez kolumnę magnetyczną, zbierając nieoznaczone komórki, które przejdą przez kolumnę.Przemyj probówkę zawierającą komórki trzykrotnie, używając po 3 ml buforu płuczącego, zbierając każdorazowo odciek, a następnie zdejmij kolumnę z magnesu. Napełnij kolumnę 5 ml buforu płuczącego i natychmiast wypłucz oznaczoną frakcję zawierającą komórki CD 45 dodatnie. Następnie, po przeliczeniu komórek, inkubuj je z 2,5 µL każdego z tych biotynylowanych przeciwciał na każdą 1 × 10⁷ komórek krwiotwórczych w temperaturze 4 °C.Po 30 minutach inkubuj komórki przez kolejną pół godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza w 1 mL mikrokulek antybiotynowych. Umieść nową kolumnę w magnesie, a następnie załaduj komórki na kolumnę w sposób przedstawiony przed chwilą, tym razem zbierając frakcję negatywną. Na koniec policz żywe komórki, aby określić całkowitą liczbę podwójnie negatywnych limfocytów T we frakcji negatywnej, i pomnóż tę liczbę przez procent czystości określony w analizie cytometrycznej.Podczas gdy nerki myszy szczepu C57BL/6 zawierają około 1,5 do 2,1 × 10⁶ monocyto-limfocytów na nerkę, mniej niż 10% stanowią hematopoetyczne komórki CD45-dodatnie. Po wirowaniu w gradiencie gęstości w celu zebrania warstwy monocyto-limfocytów nerkowych, komórki CD45-dodatnie mogą zostać dodatkowo oczyszczone do poziomu około 80 do 95% za pomocą separacji magnetycznej kulek CD45-dodatnich. Wśród wzbogaconych hematopoetycznych komórek CD45-dodatnich około 30 do 60% stanowią limfocyty T podwójnie ujemne.Selekcja negatywna komórek CD 45-dodatnich w celu usunięcia komórek CD 4-dodatnich, CD 8-dodatnich, MHC klasy II-dodatnich oraz tetramer-dodatnich pozwala na uzyskanie wysokiej czystości (90 do 95%) podwójnie negatywnych limfocytów T. Stosując ten protokół, można uzyskać do 0,5 × 10⁶ magnetycznie znakowanych hematopoetycznych komórek CD 45-dodatnich na mysz. Procedura ta pozwoli na lepsze zrozumienie funkcji biologicznych i mechanizmów działania podwójnie negatywnych limfocytów T w różnych tkankach.

isolation-of-double-negative-t-cells-from-the-kidney

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja podwójnie ujemnych komórek T αβ z nerki

Izolacja limfocytów przy użyciu zestawu Miltenyi MACs jest niezawodną metodą oczyszczania komórek z homogenatów całych tkanek limfatycznych. Komórki oczyszczone za pomocą systemu Miltenyi charakteryzują się zazwyczaj czystością ≥ 96%. W niniejszym materiale przedstawiamy kroki niezbędne do izolacji komórek T CD4+, wykorzystując jeden z wielu zestawów oferowanych przez firmę Miltenyi.

Izolacja limfocytów T CD4+ z węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem oczyszczania metodą Miltenyi MACS

Film wyjaśnia sposób oczyszczania limfocytów B poprzez celowanie immunomagnetyczne i separację od zawiesiny komórek jednojądrzastych krwi obwodowej. Metoda ta polega na znakowaniu niepożądanych typów komórek specyficznymi przeciwciałami lub ligandami (połączonymi z cząstkami magnetycznymi) skierowanymi przeciwko określonym białkom powierzchniowym komórki, które mają zostać usunięte z heterogenicznej zawiesiny komórkowej przez separację magnetyczną.

Negatywna selekcja immunomagnetyczna: metoda oczyszczania limfocytów B z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

Ten film demonstruje protokół izolacji opartej na znakowaniu magnetycznym populacji limfocytów T CD4+Vδ1+γδ o niskim stężeniu z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Wykorzystując kombinację przeciwciał anty-Vδ1 sprzężonych z FITC, magnetycznych mikrokulek anty-FITC i superparamagnetycznych kulek pokrytych przeciwciałem anty-CD4, limfocyty T CD4 + Vδ1 + można z powodzeniem oczyścić z populacji PBMC.

Selektywna izolacja limfocytów T CD4 + Vδ1 + γδ z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

Tutaj zapewniamy zoptymalizowany protokół izolacji i klonowania rzadkiej jednostki limfocytów T obwodowych komórek T Vδ1+CD4+, która jest, jak wykazaliśmy ostatnio, pozatymicznym progenitorem limfocytów T αβ. Technika ta pozwala na ilościowe wyizolowanie, sklonowanie i efektywną ekspansję tych komórek w hodowli ex vivo.

Izolacja i hodowla ex vivo limfocytów T Vδ1+CD4+γδ, pozatymicznego progenitora komórek αβT

Techniki, które są niezawodne i skuteczne w izolacji komórek odpornościowych nerek, są potrzebne do dalszych zastosowań. Wymaga to znakowania powierzchniowego przeciwciałami niewielkiej liczby komórek odpornościowych nerek. W niniejszym artykule opisujemy zwięzłą metodę izolacji komórek odpornościowych nerek, która pozornie osiąga ten cel.

Niezawodna i wysokowydajna izolacja komórek odpornościowych nerek

Tutaj prezentujemy protokół indukcji tolerancji w transplantacji i oceniamy in vitro i in vivo zdolność tłumienia różnych podzbiorów komórek od biorcy oraz status immunologiczny biorcy wobec dawcy lub egzogennych antygenów.

Ocena in vitro i in vivo aktywności supresyjnej komórek T, B i mieloidalnych oraz odpowiedzi humoralnych u biorców przeszczepów

Tutaj prezentujemy nowatorską metodę izolacji i hodowli komórek zrębu okołonaczyniowego nerek (kPSC) opartą na perfuzji całego narządu za pomocą enzymów trawiennych i wzbogacaniu komórek NG2. Dzięki tej metodzie możliwe jest uzyskanie wystarczającej liczby komórek do terapii komórkowej.

Nowatorska metoda izolacji klasy klinicznej okołonaczyniowych komórek zrębowych ludzkich nerek

Przedstawiamy prosty protokół izolacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z krwi pełnej uzyskanej od pacjentów, u których zdiagnozowano zespół Sézary'ego, a następnie selekcję limfocytów T CD4+, ich stymulację octanem forbolu12-mirystynian13 i jonoforem A23187 oraz przygotowanie RNA do profilowania transkryptomicznego.

Izolowanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i limfocytów T CD4+ od pacjentów z zespołem Sézary'ego w celu profilowania transkryptomicznego

Po infekcji wirusowej, nerka zawiera stosunkowo dużą liczbę limfocytów T CD8+ i daje możliwość badania nieśluzówkowych komórekT RM. W tym miejscu opisujemy protokół izolacji limfocytów nerkowych myszy do analizy cytometrii przepływowej.

Izolacja mysich limfocytów T CD8 + rezydujących w nerkach do analizy cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych nerek myszy, który poprawia reprezentację typów komórek rdzeniastych nerek i pozwala uniknąć artefaktów ekspresji genów spowodowanych dysocjacją enzymatyczną tkanki.

Izolacja jąder z nerki dorosłej myszy w celu sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Protokół ten opisuje procedurę przeżycia dla bezpiecznej i dobrze tolerowanej obustronnej limfadenektomii nerki u myszy.

Grzybicza limfadenektomia nerek u myszy

Poznaj metodę izolacji podwójnie ujemnych limfocytów T αβ z nerki myszy. Technika ta umożliwia badanie funkcji immunologicznych komórek w nerkach i zrozumienie mechanizmów odpowiedzi immunologicznej.

Izolacja podwójnie ujemnych limfocytów T αβ z nerki

Przeglądaj więcej filmów