Rozciąganie komórek z mikrowzorem na błonie PDMS

Ten manuskrypt przedstawia technikę wywierania lub uwalniania sił na przylegające komórki lub tkanki za pomocą jednokierunkowego rozciągania.

Ogólnym celem tej procedury jest rozciągnięcie komórek wzorcowych na elastycznej membranie z polidimetylosuboksanu lub PDMS. Osiąga się to poprzez użycie arkusza A-P-D-M-S, a następnie nałożenie mikrowzoru na PDMS. Arkusz PDMS z mikrowzorem jest następnie montowany na urządzeniu rozciągającym, a na górze umieszczana jest pula oporowa medium.

Następnie komórki są platerowane na powierzchni arkusza PDMS z mikrowzorem i pozostawiane do przyczepienia do wzoru przed przepłukaniem w celu usunięcia nieprzyłączonych komórek. Ostatnim krokiem jest zastosowanie wydłużenia do komórki zawierającej PDMS w celu rozciągnięcia komórek. Ostatecznie mikroskopia wideo służy do pokazania, że przyłożenie sił do włókien retrakcyjnych mitotycznych komórek ssaków podczas rozciągania komórek powoduje deformację komórki.

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomechaniki, takie jak: jaki jest wpływ sił zewnętrznych na procesy komórkowe, takie jak podział? Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy chcieliśmy przyłożyć siły do dzielącej się komórki, aby rozpocząć wycinanie kawałka PDMS o wymiarach około 35 na 20 milimetrów z gotowego arkusza. W tym przypadku używany jest dostępny na rynku cienki arkusz PDMS, ponieważ jest on bardziej powtarzalny i mniej podatny na pękanie w porównaniu z arkuszami wykonanymi na zamówienie. PDMS.

Usuń górną i dolną warstwę ochronną z tworzywa sztucznego i za pomocą pęsety umieść PDMS na plastikowej szalce Petriego. Następnie myj PDMS 70% etanolem przez pięć minut na rotatorze przy 30 oscylacjach na minutę. Po umyciu osusz powierzchnię, przepuszczając po niej powietrze.

Następnie oświetl PDMS głębokim światłem ultrafioletowym przez pięć minut w odległości około pięciu centymetrów od żarówek ultrafioletowych. W międzyczasie przygotuj roztwór E-D-C-N-H-S zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Roztwór należy przygotować tuż przed użyciem, ponieważ reaktywność roztworu zanika w ciągu kilku godzin.

Przenieść arkusze PDMS z szalki Petriego na pokrywę szalki Petriego, która nie została podświetlona. Dzięki temu otoczenie PDMS będzie bardzo hydrofobowe i ułatwi to pracę. Następny krok.

Odpipetować roztwór E-D-C-N-H-S nad PDMS i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji. Spłucz nadmiar E-D-C-N-H-S wodą.

Następnie dodać roztwór PEG szczepiony PLL i inkubować od trzech godzin do nocy w temperaturze pokojowej po inkubacji, spłukać nadmiar szczepionego kołka PLL z PDMS wodą. PDMS jest teraz pasywowany lub funkcjonalizowany za pomocą PEG szczepionego PLL i może być przechowywany przez kilka dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby nadać wzór miejscu PDMS, arkusz A-P-D-M-S na syntetycznej kwarcowej masce fotograficznej z mikrocechami do wzoru.

Umieść stronę PDMS z szczepionym PLL PEG przodem do chromowanej strony maski fotograficznej. Następnie oświetlaj przez siedem minut przez maskę fotograficzną w odległości około pięciu centymetrów od żarówek ultrafioletowych. Po oświetleniu.

Dodaj wodę do maski i PDMS, a następnie powoli oderwij PDMS od maski, zamontuj wcześniej pasywowany PDMS na urządzeniu rozciągającym. Przymocuj jedną stronę PDMS do stałej części noszy. Przymocuj drugą stronę do ruchomej części noszy, nie zaciskając zbyt mocno arkusza PDMS.

Jeśli PDMS jest zbyt mocno zaciśnięty, staje się krótszy, co może prowadzić do hamowania, ponieważ napięcie będzie większe dla tej samej długości rozciągania. Upewnij się, że są dobrze dokręcone, w przeciwnym razie arkusz PDMS ześlizgnie się, gdy tylko rozpocznie się rozciąganie lub później podczas eksperymentu. Następnie inkubuj PDMS z roztworem fibronektyny przez godzinę.

W temperaturze pokojowej możliwe jest użycie innych białek macierzy zewnątrzkomórkowej, ale nie zostały one przetestowane za pomocą tego protokołu. Na koniec przepłucz PDMS solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Następnie wytnij prostokąt PDMS w grubej płycie PDMS.

Następnie wytnij kolejny prostokąt w środku. Aby uzyskać pulę, która zachowa komórki i podłoże, dodaj smar silikonowy pod ten prostokątny wycięty PDMS i umieść go na wierzchu arkusza PDMS, aby utworzyć pulę retencyjną podłoża. Smar pozwoli na ślizganie się basenu po arkuszu PDMS podczas rozciągania w celu ukształtowania komórek.

Najpierw odłącz komórki od kolby hodowlanej przy 50% płynności CO. Gdy komórki znajdą się w zawiesinie, odpipetuj je kilka razy końcówką o pojemności 200 mikrolitrów, aby rozbić agregaty, co zapewni, że poszczególne komórki zwiążą się ze wzorem. Następnie dodaj jeden mililitr zawiesiny komórkowej do basenu.

Pozwól komórkom związać się ze wzorami przez 10 do 30 minut, w zależności od komórki. Wpisz w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki przyczepią się do wzorów, delikatnie przepłucz pływające komórki zrównoważonym podłożem, aby przepłukać komórki.

Usunąć pożywkę za pomocą pipety zasysającej, jednocześnie dodając pożywkę. Bardzo ważne jest, aby utrzymać wystarczający topnik, aby zmyć nieprzyłączone komórki, jednocześnie utrzymując komórki zanurzone w podłożu. Następnie dodaj szkiełko nakrywkowe na wierzchu basenu, aby uniknąć parowania i wycieku medium w przypadku pęknięcia PDMS i pozwól komórkom rozprzestrzenić się przez kilka godzin na wzorach.

Następnie umieść urządzenie na odwróconym mikroskopie i rozpocznij obrazowanie. Unikaj używania obiektywów zanurzeniowych w olejku, ponieważ nie będą one działać z powodu problemów z ostrością. Aby rozciągnąć komórki mikrowzoru, przekręć mikrometryczną, jednocześnie korygując położenie stolika w osiach x, y i z.

Pozycja stolika musi zostać skorygowana, aby przeciwdziałać poszerzeniu PDMS i utracie ostrości. Technika przedstawiona w tym protokole wideo pozwoliła na przyłożenie sił do włókien retrakcyjnych mitotycznych komórek ssaków poprzez rozciągnięcie substratu na początku metafazy. Niektóre z tych włókien retrakcyjnych zostały odciągnięte od ciała komórki, co spowodowało przyłożenie siły mechanicznej do kory komórek mitotycznych przed rozciągnięciem, komórka jest pokryta owalnym wzorem, aby to osiągnąć.

Wzór odbywa się za pomocą PDMS, który jest rozciągany podczas odcisku okrągłych wzorów przez maskę fotograficzną. Po rozciągnięciu podłoże jest rozciągane tak, że wzór staje się okręgiem. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób możesz umieścić komórki na wzorcach makr, a następnie zastosować siły rozciągające do podłoża.