Rozciąganie komórek z mikrowzorem na błonie PDMS

Ogólnym celem tej procedury jest rozciągnięcie komórek w układzie wzorcowym na elastycznej membranie z polidimetylosiloksanu (PDMS). Jest to osiągane poprzez przygotowanie arkusza PDMS, a następnie naniesienie na niego mikrowzorca. Arkusz PDMS z naniesionym mikrowzorcem jest następnie montowany w urządzeniu do rozciągania, a na jego wierzchu umieszcza się zbiornik zatrzymujący medium.

Następnie komórki wysiewa się na powierzchnię mikrowzorcowanej płytki z PDMS i pozostawia do przytwierdzenia się do wzoru przed przepłukaniem w celu usunięcia nieprzytwierdzonych komórek. Ostatnim krokiem jest przyłożenie wydłużenia do płytki z PDMS zawierającej komórki, aby je rozciągnąć. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię wideo, aby wykazać, że przyłożenie sił do włókien retrakcyjnych mitotycznych komórek ssaków podczas rozciągania komórek prowadzi do deformacji komórki.

Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biomechaniki, takie jak: jaki jest wpływ sił zewnętrznych na procesy komórkowe, na przykład podział komórki? Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy chcieliśmy przyłożyć siły do dzielącej się komórki; należy zacząć od wycięcia kawałka PDMS o wymiarach około 35 by 20 mm z gotowej arkusza. W tym przypadku zastosowano komercyjnie dostępny cienki arkusz PDMS, ponieważ jest on bardziej powtarzalny i rzadziej pęka w porównaniu do PDMS przygotowywanego samodzielnie.

Usuń górną i dolną ochronną warstwę plastiku, a następnie za pomocą pęsety umieść PDMS w plastikowej szalce Petriego. Następnie przemyj PDMS 70% etanolem przez pięć minut na rotatorze przy 30 oscylacjach na minutę. Po przemyciu osusz powierzchnię, kierując na nią strumień powietrza.

Następnie naświetlaj PDMS głębokim światłem ultrafioletowym przez pięć minut w odległości około pięciu centymetrów od żarówek ultrafioletowych. W międzyczasie przygotuj roztwór E-D-C-N-H-S zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Roztwór musi zostać przygotowany bezpośrednio przed użyciem, ponieważ jego reaktywność spada w ciągu kilku godzin.

Przenieś arkusze PDMS z dania Petri na jego pokrywkę, która nie była naświetlana. Zapewni to wysoką hydrofobowość obszarów wokół PDMS i ułatwi kolejny krok.

Nanieś pipetą roztwór E-D-C-N-H-S na PDMS i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji wypłucz nadmiar E-D-C-N-H-S wodą.

Następnie należy dodać roztwór PEG szczepionego PLL i inkubować od trzech godzin do całej nocy w temperaturze pokojowej; po inkubacji nadmiar PEG szczepionego PLL należy wypłukać z PDMS wodą. PDMS jest teraz pasywowany lub funkcjonalizowany PEG szczepionym PLL i może być przechowywany przez kilka dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby stworzyć wzór na PDMS, należy umieścić arkusz PDMS na fotomase z syntetycznego kwarcu zawierającej mikrostruktury do wzorowania.

Umieść stronę PDMS z przeszczepionym PEG-PLL przylegającą do chromowanej strony fotomaski. Następnie naświetlaj przez siedem minut przez fotomaskę w odległości około pięciu centymetrów od żarówek ultrafioletowych. Po naświetlaniu.

Nanieść wodę na maskę i PDMS, a następnie powoli oddzielić PDMS od maski. Zamocować wcześniej pasywowany PDMS na urządzeniu do rozciągania. Przymocować jedną stronę PDMS do nieruchomej części rozciągacza. Przymocować drugą stronę do części ruchomej rozciągacza, uważając, aby nie zacisnąć zbyt dużego fragmentu arkusza PDMS.

Jeśli PDMS zostanie zbyt mocno zaciśnięty, ulegnie skróceniu, co może doprowadzić do pęknięcia, ponieważ przy tej samej odległości rozciągnięcia naprężenie będzie większe. Należy upewnić się, że śruby są dobrze dokręcone, w przeciwnym razie arkusz PDMS wyślizgnie się w momencie rozpoczęcia rozciągania lub w późniejszym etapie eksperymentu. Następnie należy inkubować PDMS w roztworze fibronektyny przez jedną godzinę.

W temperaturze pokojowej możliwe jest zastosowanie innych białek macierzy pozakomórkowej, jednak nie zostały one przetestowane w ramach niniejszego protokołu. W ostatnim kroku opłucz PDMS roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Następnie wytnij prostokąt z PDMS w grubej płycie PDMS.

Następnie wytnij wewnątrz kolejny prostokąt. Aby utworzyć zbiorniczek, który utrzyma komórki i pożywkę, nałóż smar silikonowy pod ten wycięty prostokąt z PDMS i umieść go na arkuszu PDMS, tworząc zbiorniczek na pożywkę. Smar umożliwi przesuwanie się zbiorniczka po arkuszu PDMS podczas rozciągania w celu wzorowania komórek.

Najpierw odseparuj komórki z kolby hodowlanej przy 50% konfluencji. Gdy komórki znajdą się w zawiesinie, pipetuj je kilkakrotnie końcówką 200 µL, aby rozbić agregaty, co zapewni przyleganie pojedynczych komórek do wzoru. Następnie dodaj 1 mL zawiesiny komórkowej do zbiornika.

Pozostawić komórki do związania z wzorami na 10 do 30 minut, w zależności od typu komórek, w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Po przytwierdzeniu się komórek do wzorów, delikatnie wypłukać niezwiązane komórki za pomocą zrównoważonego medium.

Odssać pożywkę za pomocą pipety aspiracyjnej, jednocześnie dodając nową pożywkę. Kluczowe jest utrzymanie odpowiedniego przepływu, aby wypłukać nieprzylegające komórki, zapewniając jednocześnie ich całkowite zanurzenie w pożywce. Następnie na powierzchni cieczy położyć szkiełko nakrywkowe, aby zapobiec parowaniu i wyciekowi pożywki w przypadku pęknięcia PDMS, i pozostawić komórki na kilka godzin, aby rozprzestrzeniły się na wzorach.

Następnie umieść urządzenie pod mikroskopem odwróconym i rozpocznij obrazowanie. Unikaj stosowania obiektywów imersyjnych olejowych, ponieważ nie będą one działać ze względu na problemy z ogniskowaniem. Aby rozciągnąć komórki w mikrowzorcu, obracaj śrubą mikrometryczną, korygując jednocześnie położenie stolika w osiach x, y i Z.

Pozycję stolika należy skorygować, aby przeciwdziałać rozszerzaniu się PDMS i utracie ostrości. Technika przedstawiona w tym protokole wideo umożliwiła przyłożenie sił do włókien retrakcyjnych mitotycznych komórek ssaków poprzez rozciąganie podłoża na początku metafazy. Niektóre z tych włókien retrakcyjnych zostały odciągnięte od ciała komórki, co skutkowało przyłożeniem siły mechanicznej do kory komórek mitotycznych; aby to osiągnąć, komórkę wysiewa się na wzór owalny przed rozciąganiem.

Wytrawianie wzorów odbywa się przy rozciągniętym PDMS podczas odciskania okrągłych wzorów przez maskę fotolitograficzną. Po rozciągnięciu podłoże jest naprężone w taki sposób, aby wzór stał się kołem. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wysiewać komórki na makrowzory, a następnie przykładać siły rozciągające do podłoża.