Name: Rozciąganie komórek z mikrowzorem na błonie PDMS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Poznaj technikę rozciągania komórek na mikrowzorzystej błonie PDMS do badań biomechaniki komórek. Ta metoda pozwala obserwować deformację komórek ssaczych podczas mitozy przy użyciu mikroskopii wideo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To dzieło zostało założone przez Instytut Curie, Paryż, Francja. Nosze mechaniczne zostały zaprojektowane przez Damiena Cuveliera (Instytut Curie) i są produkowane przez firmę GREM (mecanique-grem.com). Wzór na PDMS został opracowany przez Ammara Azioune (Uniwersytet Bordeaux II).

1. Pasywacja PDMS
<ol>
	<li>Wytnij kawałek PDMS o wymiarach około 35 mm x 20 mm z gotowego arkusza (na przykład GelPak, zgodnie z tabelą materiałów).</li>
	<li>Usuń górną i dolną warstwę ochronną z tworzywa sztucznego (jeśli to konieczne) i użyj pęsety, aby umieścić PDMS na plastikowej (nie poddanej hodowli komórkowej) szalce Petriego.</li>
	<li>Myć PDMS 70% etanolem przez 5 minut na rotatorze przy 30 oscylacjach/min.</li>
	<li>Osusz powierzchnię, przepływając po niej powietrze.</li>
	<li>Oświetlać głębokim promieniowaniem UV (λ = 180 nm) przez 5 minut w odległości około 5 cm od żarówek UV (patrz karta materiałów w celu odniesienia do lampy; parametry będą się różnić dla różnych lamp).</li>
	<li>Przygotuj 200 μl roztworu EDC/NHS dla każdej cząstki PDMS (należy to przygotować tuż przed użyciem, ponieważ reaktywność roztworu zanika w ciągu godziny). Na 1 ml 0,05 M MES + 0,5 M buforu NaCl o pH 6,0 dodać 11,5 mg Sulfo-NHS i 19,2 mg EDC.</li>
	<li>Przenieść arkusze PDMS z szalki Petriego na pokrywę szalki Petriego, która nie została podświetlona. Zapewni to, że otoczenie PDMS będzie bardzo hydrofobowe i ułatwi kolejny krok.</li>
	<li>Dodać roztwór EDC/NHS i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Spłucz EDC/NHS wodą.</li>
	<li>Dodać roztwór PLL-g-PEG (0,5 mg/ml w HEPES 10 mM pH 8,6) i inkubować od 3 godzin do nocy w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Opłucz PLL-g-PEG wodą. Pasywowany PDMS (funkcjonalizowany za pomocą PLL-g-PEG) może być przechowywany przez kilka dni w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Wzorzec PDMS
<ol>
	<li>Weź arkusz PDMS i umieść go na syntetycznej kwarcowej fotomasce z mikroelementami do tworzenia wzorów (patrz rysunek 1). Umieść stronę PDMS z PLL-g-PEG skierowaną w stronę chromowanej strony fotomaski.</li>
	<li>Świecić przez 7 minut przez fotomaskę w odległości około 5 cm od żarówek UV.</li>
	<li>Dodaj wodę do maski + PDMS i powoli oderwij PDMS od maski.</li>
	<li>Inkubować z roztworem fibronektyny w stężeniu 50 mg/ml w buforze HEPES o pH 8,6 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Możliwe jest użycie innych białek ECM, ale nie zostały one przetestowane za pomocą tego protokołu.</li>
	<li>Spłucz PBS.</li>
</ol>
3. Montaż urządzenia
<ol>
	<li>Zamontuj wcześniej pasywowany PDMS na urządzeniu rozciągającym (patrz Dyskusja, aby zapoznać się z rozwiązywaniem problemów).
	<ol>
		<li>Przymocuj jedną stronę PDMS do stałej części noszy.</li>
		<li>Przymocuj drugą stronę do ruchomej części noszy, nie zaciskając zbyt mocno arkusza PDMS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytnij prostokąt PDMS (22 mm x 19 mm) w grubym dźgnięciu PDMS i wytnij kolejny prostokąt w środku, aby uzyskać pulę (lub ramkę), która zachowa komórki i nośniki (patrz Rysunek 2).</li>
	<li>Dodaj smar silikonowy pod tę pulę PDMS i umieść go na wierzchu arkusza PDMS, aby utworzyć pulę retencyjną medium. Smar pozwoli na ślizganie się basenu po arkuszu PDMS podczas rozciągania.</li>
</ol>
4. Wzorowanie komórek
<ol>
	<li>Odłączyć komórki od kolby hodowlanej o 50% konfluencji z Versenem.</li>
	<li>Policz komórki i ponownie je zawieś w stężeniu 200 000 komórek/ml.</li>
	<li>Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej do puli (dodatkowe informacje znajdują się w Dyskusji).</li>
	<li>Pozwól komórkom związać się ze wzorami przez 10-30 minut (w zależności od typu komórki, komórki RPE-1 zajmą 10 minut, a komórki HeLa 20 minut).</li>
	<li>Delikatnie przepłukać pływające komórki zrównoważonym podłożem (pożywka równoważąca w inkubatorze).</li>
	<li>Pozwól komórkom rozprzestrzeniać się przez kilka godzin na wzorach (RPE-1 będzie potrzebował co najmniej 2 godzin; Komórki HeLa będą potrzebować 3 godzin).</li>
	<li>Dodaj szkiełko nakrywkowe na wierzchu basenu, aby uniknąć parowania i wycieku medium w przypadku pęknięcia PDMS.</li>
	<li>Umieść urządzenie na odwróconym mikroskopie i rozpocznij obrazowanie. Unikaj używania obiektywów zanurzeniowych w olejku, ponieważ nie będą one działać z powodu problemów z ostrością.</li>
</ol>
5. Rozciąganie
<ol>
	<li>Przekręć mikrometryczną, jednocześnie korygując położenie stolika w osiach x, y i z (głównie x). Pozycja stolika musi zostać skorygowana, aby przeciwdziałać poszerzeniu PDMS i utracie ostrości. (Patrz akapit "Podczas rozciągania" w DYSKUSJI).</li>
</ol>

<ol><li>Vogel, V., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+force+and+geometry+sensing+regulate+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Local force and geometry sensing regulate cell functions.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 265-275 (2006).</li>
<li>Terenna, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+mechanisms+redirecting+cell+polarity+and+cell+shape+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical mechanisms redirecting cell polarity and cell shape in fission yeast.</a> Curr. Biol. 18 (22), 1748-1753 (2008).</li>
<li>Guillot, C., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+epithelial+tissue+homeostasis+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanics of epithelial tissue homeostasis and morphogenesis.</a> Science. 340 (6137), 1185-1189 (2013).</li>
<li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+morphogenesis+by+Fat%2FDachsous%2FFour-jointed+planar+cell+polarity+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway.</a> Science. 336 (6082), 724-727 (2012).</li>
<li>Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+cell+mechanics%2C+cell-cell+interactions%2C+and+proliferation+on+epithelial+packing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Curr. Biol. 17, 2095-2104 (2007).</li>
<li>Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+and+anisotropy+of+cortical+forces+orienting+Drosophila+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis.</a> Nat. Cell Biol. 10, 1401-1410 (2008).</li>
<li>Mitrossilis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-cell+response+to+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Real-time single-cell response to stiffness.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (38), 16518-16523 (2010).</li>
<li>Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchison, T., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+stimulation+and+constrained+cell+migration+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 12, 1783-1790 (2007).</li>
<li>Fink, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+forces+control+mitotic+spindle+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">External forces control mitotic spindle positioning.</a> Nat. Cell. Biol. 13 (7), 771-778 (2011).</li>
<li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).</li>
<li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+micropatterns%3A+A+direct+printing+protocol+using+deep+Uvs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep Uvs.</a> Methods Cell Biol. 97, 133-146 (2010).</li>
<li>Azioune, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+method+for+high-throughput+surface+patterning+of+deformable+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Robust method for high-throughput surface patterning of deformable substrates.</a> Langmuir. 27 (12), 7349-7352 (2011).</li>
<li>Carpi, N., Piel, M., Azioun, A., Cuvelier, D., Fink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+on+silicon+elastomer+%28PDMS%29+with+deep+UVs%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Exch%22%5BJournal%5D)">Micropatterning on silicon elastomer (PDMS) with deep UVs.</a> Protoc. Exch. , (2011).</li>
<li>Sinha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+respond+to+mechanical+stress+by+rapid+disassembly+of+caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cells respond to mechanical stress by rapid disassembly of caveolae.</a> Cell. 144 (3), 402-413 (2011).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Chociaż technika ta była wielokrotnie stosowana i jest dokładnie przetestowana, istnieje kilka krytycznych kroków, które mogą prowadzić do nieudanego eksperymentu.
O PDMS:
Do tej pracy wykorzystano GelPak, dostępny na rynku cienki arkusz PDMS. Alternatywnie arkusze PDMS mogą być odlewane bezpośrednio z PDMS mix. Zalecamy stosowanie GelPak, ponieważ jest on bardziej powtarzalny i mniej podatny na uszkodzenia w porównaniu z PDMS wykonanym na zamówienie.
<p class="jov...

Komórki tworzące tkankę w organizmach wyższych podlegają mechanicznym naprężeniom i siłom rozciągającym pochodzącym albo ze środowiska zewnętrznego, albo z otaczających komórek1,2. Komórki muszą przystosować się do tych sił i oprzeć się im, aby utrzymać integralność tkanek. Siły te są również ważne dla morfogenezy tkanek podczas rozwoju3,4. Przyłożenie sił mechanicznych do hodowanych komórek jest sposobem na naśladowanie tego, co może się wydarzyć w tkance, ale z ilościową i niezależną kontrolą kształtu komórki i deformacji komórki5,6. W tym celu można zastosować kilka technik. Można naciskać na komórki (całą komórkę lub jej część), na przykład za pomocą AFM lub pochodnych7,8 lub rozciągać podłoże, na którym rosną komórki.
Metoda opisana w tym artykule pokazuje, jak rozciągnąć płaskie podłoże pokryte komórkami. Technika ta została pierwotnie opracowana w celu oceny roli sił wywieranych na mitotyczne komórki ssaków9. Komórki mitotyczne pozostają połączone z podłożem poprzez włókna retrakcyjne, a rozciąganie błony wywierało siłę na te włókna, co z kolei powodowało rotację wrzeciona mitotowego. Interes w łączeniu mikrowzorów adhezyjnych i rozciąganiu polega na uzyskaniu niezależnej kontroli sił i kształtu poszczególnych komórek. Możliwe jest na przykład rozciągnięcie jajowatej komórki do idealnie izotropowego okrągłego kształtu, podczas gdy stosuje się rozciąganie jednoosiowe. Jeśli komórki nie są platerowane na mikrowzorach, rozciąganie jednoosiowe powoduje wydłużenie komórek, przy czym większość komórek ma długą oś wyrównaną z osią rozciągania. Trudno jest wtedy oddzielić efekt wyrównania długiej osi od efektu rozciągnięcia zastosowanego do komórek.
Urządzenie nadaje się do dowolnego obrazowania żywych komórek, w tym do długotrwałej mikroskopii fluorescencyjnej, a podczas eksperymentu można dodawać leki. Metoda mikromodelowania w głębokim promieniowaniu UV10 została szczegółowo opisana w Azioune i wsp.11 Wzorzec na PDMS został opisany w Azioune et al.12 Obecny protokół rozciągania jest wersją wideo Carpi i wsp.13

<table><tbody><tr><td>GelPak</td><td>GelPak</td><td>PF-60-X4</td><td>Dostępne są różne grubości/lepkość. Jedną z alternatyw może być przesyłanie PDMS&nbsp; siebie.</td></tr><tr><td>Smar silikonowy</td><td>GE Bayer Silikony</td><td>Baysilone-Paste</td><td>Ten jest biokompatybilny</td></tr><tr><td>Urządzenie do rozciągania</td><td>GREM m m&eacute; </td><td>canique Nosze 2011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EDC (chlorowodorek N-(3-dimetyloaminopropylo)-N&prime;-etylokarbodiimide)</td><td>Sigma</td><td>3450</td><td>Stabilny 6 miesięcy w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>NHS (SÓL SODOWA N-hydroksysulfosbursztymidu)</td><td>Sigma</td><td>56485</td><td>Chronić przed wilgocią</td></tr><tr><td>Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)</td><td>SurfaceSolutions (Zurych)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Syntetyczna kwarcowa fotomaska</td><td>Toppan</td><td></td><td>Weź standardową binarną fotomaskę z kwarcowej</td></tr><tr><td>fibronektyny z osocza bydlęcego</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

rozciąganie komórek z mikrowzorem na błonie pdms

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Siły mechaniczne wywierane na komórki i/lub tkanki odgrywają główną rolę w wielu procesach. Opracowaliśmy urządzenie do rozciągania komórek posianych na membranie PolyDiMethylSiloxane (PDMS), kompatybilne z obrazowaniem. Ta technika jest powtarzalna i wszechstronna. Membrana PDMS może być mikrowzorowana w celu ograniczenia komórek lub tkanek do określonej geometrii. Pierwszym krokiem jest wydrukowanie mikrowzorów na membranie PDMS techniką głębokiego UV. Membrana PDMS jest następnie montowana na napinaczach mechanicznych. Komora jest połączona z membraną biokompatybilnym smarem, aby umożliwić ślizganie się podczas rozciągania. Komórki są wysiewane i pozostawiane do rozprzestrzeniania się przez kilka godzin na mikrowzorach. Próbka może być wielokrotnie rozciągana i nierozciągana za pomocą mikrometrycznej. Wykonanie odcinka w pełnym zakresie zajmuje mniej niż minutę (około 30%). Przedstawiona tutaj technika nie obejmuje urządzenia z napędem, które jest niezbędne do szybkiego wykonywania powtarzających się cykli rozciągania i/lub rozciągania sterowanego komputerowo, ale można to wdrożyć. Rozciąganie komórek lub tkanek może być interesujące w przypadku pytań związanych z siłami komórkowymi, reakcją komórki na stres mechaniczny lub morfogenezą tkanek. Ta prezentacja wideo pokaże, jak uniknąć typowych problemów, które mogą pojawić się podczas wykonywania tego typu pozornie prostego eksperymentu.

Technika przedstawiona w niniejszym protokole wideo umożliwiła przyłożenie sił do włókien retrakcyjnych w dzielących się komórkach ssaków. W rzeczywistości podczas podziału komórkowego, na etapie mitozy, komórki ssaków kurczą się, przyjmując kształt sfery i pozostawiając cienkie kabelki aktynowe otoczone błoną, które są przytwierdzone do podłoża. Kabelki te (włókna retrakcyjne) stanowią zapis geometrii komórki sprzed wejścia w fazę podziału. Tworzenie mikrowzorów za pomocą głębokiego UV przez fotomaskę na cienkiej warstw...

Ten manuskrypt przedstawia technikę wywierania lub uwalniania sił na przylegające komórki lub tkanki za pomocą jednokierunkowego rozciągania.

Rozciąganie komórek z mikrowzorem na błonie PDMS

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Ogólnym celem tej procedury jest rozciągnięcie komórek w układzie wzorcowym na elastycznej membranie z polidimetylosiloksanu (PDMS). Jest to osiągane poprzez przygotowanie arkusza PDMS, a następnie naniesienie na niego mikrowzorca. Arkusz PDMS z naniesionym mikrowzorcem jest następnie montowany w urządzeniu do rozciągania, a na jego wierzchu umieszcza się zbiornik zatrzymujący medium.Następnie komórki wysiewa się na powierzchnię mikrowzorcowanej płytki z PDMS i pozostawia do przytwierdzenia się do wzoru przed przepłukaniem w celu usunięcia nieprzytwierdzonych komórek. Ostatnim krokiem jest przyłożenie wydłużenia do płytki z PDMS zawierającej komórki, aby je rozciągnąć. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię wideo, aby wykazać, że przyłożenie sił do włókien retrakcyjnych mitotycznych komórek ssaków podczas rozciągania komórek prowadzi do deformacji komórki.Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biomechaniki, takie jak: jaki jest wpływ sił zewnętrznych na procesy komórkowe, na przykład podział komórki? Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy chcieliśmy przyłożyć siły do dzielącej się komórki; należy zacząć od wycięcia kawałka PDMS o wymiarach około 35 by 20 mm z gotowej arkusza. W tym przypadku zastosowano komercyjnie dostępny cienki arkusz PDMS, ponieważ jest on bardziej powtarzalny i rzadziej pęka w porównaniu do PDMS przygotowywanego samodzielnie.Usuń górną i dolną ochronną warstwę plastiku, a następnie za pomocą pęsety umieść PDMS w plastikowej szalce Petriego. Następnie przemyj PDMS 70% etanolem przez pięć minut na rotatorze przy 30 oscylacjach na minutę. Po przemyciu osusz powierzchnię, kierując na nią strumień powietrza.Następnie naświetlaj PDMS głębokim światłem ultrafioletowym przez pięć minut w odległości około pięciu centymetrów od żarówek ultrafioletowych. W międzyczasie przygotuj roztwór E-D-C-N-H-S zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Roztwór musi zostać przygotowany bezpośrednio przed użyciem, ponieważ jego reaktywność spada w ciągu kilku godzin.Przenieś arkusze PDMS z dania Petri na jego pokrywkę, która nie była naświetlana. Zapewni to wysoką hydrofobowość obszarów wokół PDMS i ułatwi kolejny krok.Nanieś pipetą roztwór E-D-C-N-H-S na PDMS i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji wypłucz nadmiar E-D-C-N-H-S wodą.Następnie należy dodać roztwór PEG szczepionego PLL i inkubować od trzech godzin do całej nocy w temperaturze pokojowej; po inkubacji nadmiar PEG szczepionego PLL należy wypłukać z PDMS wodą. PDMS jest teraz pasywowany lub funkcjonalizowany PEG szczepionym PLL i może być przechowywany przez kilka dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby stworzyć wzór na PDMS, należy umieścić arkusz PDMS na fotomase z syntetycznego kwarcu zawierającej mikrostruktury do wzorowania.Umieść stronę PDMS z przeszczepionym PEG-PLL przylegającą do chromowanej strony fotomaski. Następnie naświetlaj przez siedem minut przez fotomaskę w odległości około pięciu centymetrów od żarówek ultrafioletowych. Po naświetlaniu.Nanieść wodę na maskę i PDMS, a następnie powoli oddzielić PDMS od maski. Zamocować wcześniej pasywowany PDMS na urządzeniu do rozciągania. Przymocować jedną stronę PDMS do nieruchomej części rozciągacza. Przymocować drugą stronę do części ruchomej rozciągacza, uważając, aby nie zacisnąć zbyt dużego fragmentu arkusza PDMS.Jeśli PDMS zostanie zbyt mocno zaciśnięty, ulegnie skróceniu, co może doprowadzić do pęknięcia, ponieważ przy tej samej odległości rozciągnięcia naprężenie będzie większe. Należy upewnić się, że śruby są dobrze dokręcone, w przeciwnym razie arkusz PDMS wyślizgnie się w momencie rozpoczęcia rozciągania lub w późniejszym etapie eksperymentu. Następnie należy inkubować PDMS w roztworze fibronektyny przez jedną godzinę.W temperaturze pokojowej możliwe jest zastosowanie innych białek macierzy pozakomórkowej, jednak nie zostały one przetestowane w ramach niniejszego protokołu. W ostatnim kroku opłucz PDMS roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Następnie wytnij prostokąt z PDMS w grubej płycie PDMS.Następnie wytnij wewnątrz kolejny prostokąt. Aby utworzyć zbiorniczek, który utrzyma komórki i pożywkę, nałóż smar silikonowy pod ten wycięty prostokąt z PDMS i umieść go na arkuszu PDMS, tworząc zbiorniczek na pożywkę. Smar umożliwi przesuwanie się zbiorniczka po arkuszu PDMS podczas rozciągania w celu wzorowania komórek.Najpierw odseparuj komórki z kolby hodowlanej przy 50% konfluencji. Gdy komórki znajdą się w zawiesinie, pipetuj je kilkakrotnie końcówką 200 µL, aby rozbić agregaty, co zapewni przyleganie pojedynczych komórek do wzoru. Następnie dodaj 1 mL zawiesiny komórkowej do zbiornika.Pozostawić komórki do związania z wzorami na 10 do 30 minut, w zależności od typu komórek, w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Po przytwierdzeniu się komórek do wzorów, delikatnie wypłukać niezwiązane komórki za pomocą zrównoważonego medium.Odssać pożywkę za pomocą pipety aspiracyjnej, jednocześnie dodając nową pożywkę. Kluczowe jest utrzymanie odpowiedniego przepływu, aby wypłukać nieprzylegające komórki, zapewniając jednocześnie ich całkowite zanurzenie w pożywce. Następnie na powierzchni cieczy położyć szkiełko nakrywkowe, aby zapobiec parowaniu i wyciekowi pożywki w przypadku pęknięcia PDMS, i pozostawić komórki na kilka godzin, aby rozprzestrzeniły się na wzorach.Następnie umieść urządzenie pod mikroskopem odwróconym i rozpocznij obrazowanie. Unikaj stosowania obiektywów imersyjnych olejowych, ponieważ nie będą one działać ze względu na problemy z ogniskowaniem. Aby rozciągnąć komórki w mikrowzorcu, obracaj śrubą mikrometryczną, korygując jednocześnie położenie stolika w osiach x, y i Z.Pozycję stolika należy skorygować, aby przeciwdziałać rozszerzaniu się PDMS i utracie ostrości. Technika przedstawiona w tym protokole wideo umożliwiła przyłożenie sił do włókien retrakcyjnych mitotycznych komórek ssaków poprzez rozciąganie podłoża na początku metafazy. Niektóre z tych włókien retrakcyjnych zostały odciągnięte od ciała komórki, co skutkowało przyłożeniem siły mechanicznej do kory komórek mitotycznych; aby to osiągnąć, komórkę wysiewa się na wzór owalny przed rozciąganiem.Wytrawianie wzorów odbywa się przy rozciągniętym PDMS podczas odciskania okrągłych wzorów przez maskę fotolitograficzną. Po rozciągnięciu podłoże jest naprężone w taki sposób, aby wzór stał się kołem. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wysiewać komórki na makrowzory, a następnie przykładać siły rozciągające do podłoża.

stretching-micropatterned-cells-on-a-pdms-membrane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Rozciąganie mikro wzorcowanych komórek na membranie PDMS

Prezentujemy w tym artykule nowatorską platformę rozciągającą, która może być wykorzystana do badania reakcji pojedynczych komórek na złożone anizotropowe dwuosiowe deformacje mechaniczne i ilościowego określania właściwości mechanicznych tkanek biologicznych.

Nowatorska platforma do rozciągania do zastosowań w mechanobiologii komórek i tkanek

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mają wrodzoną zdolność do różnicowania się i samoorganizacji w odrębne wzorce tkankowe; chociaż wymaga to prezentacji przestrzennych gradientów środowiskowych. Przedstawiamy mikrowzorce szablonowe jako prostą i solidną metodę generowania gradientów biochemicznych i mechanicznych w celu kontrolowania wzorców różnicowania hPSC.

Szablonowe mikrowzorce ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badania przestrzennej organizacji losów różnicowania

Przedstawiono protokół wytwarzania dużego obszaru nanowzorzystego podłoża z małych form o nanowzorze do badania nanotopograficznej modulacji zachowania komórek.

Ekspandowanie nanowzorzystych substratów przy użyciu techniki ściegu do nanotopograficznej modulacji zachowania komórek

Ten raport opisuje prostą, łatwą do wykonania technikę, wykorzystującą próżnię niskociśnieniową, do wypełniania kanałów mikroprzepływowych komórkami i substratami do badań biologicznych.

Wszechstronna metoda modelowania białek i komórek

Tutaj prezentujemy protokół, który opisuje wytwarzanie rozciągliwych, dwukanałowych, mikroprzepływowych urządzeń do hodowli komórek na poziomie narządów do rekapitulacji funkcjonalności na poziomie narządów in vitro.

Skalowalna produkcja rozciągliwych, dwukanałowych, mikroprzepływowych układów narządowych

Tutaj prezentujemy protokół do mikrowzorcowania komórek w rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą adhezji programowanej przez DNA. Protokół ten wykorzystuje laboratoryjną platformę fotolitograficzną do tworzenia wzorów oligonukleotydów DNA na szkiełku szkiełkowym, a następnie znakuje błony komórkowe dostępnymi na rynku komplementarnymi oligonukleotydami. Hybrydyzacja oligonukleotydów powoduje zaprogramowaną adhezję komórek.

Proste, niedrogie i modułowe modelowanie komórek za pomocą DNA

Opisujemy ulepszenia standardowej metody pomiaru sił trakcyjnych komórek, opartej na drukowaniu mikrokontaktowym z pojedynczym krokiem subtraktywnego tworzenia wzorów układów punktowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej na miękkich hydrożelach. Metoda ta pozwala na prostsze i bardziej spójne wytwarzanie wzorów wyspowych, niezbędnych do kontrolowania kształtu klastrów komórek.

Generowanie wzorców dla mikroskopii trakcyjnej mikrowzorców

Tradycyjnie, hodowla komórkowa jest przeprowadzana na płaskich podłożach, które słabo naśladują naturalne środowisko komórek in vivo. W tym miejscu opisujemy metodę wytwarzania substratów do hodowli komórkowych o fizjologicznie istotnych zakrzywionych geometriach i mikrowzorach białek zewnątrzkomórkowych, co pozwala na systematyczne badania nad komórkowym wykrywaniem tych zewnątrzkomórkowych sygnałów.

Generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych

Ten protokół opisuje metodę tworzenia wzorców komórkowych bez tuszu, bez etykiet, niezależną od podłoża, opartą na efekcie magnetycznym Archimedesa.

Wzorcowanie komórek przy użyciu strategii magnetyczno-archimedesowej

Tutaj prezentujemy wszechstronne urządzenie do rozciągania równoosiowego, które jest uruchamiane pneumatycznie i kompatybilne z mikroskopią o wysokiej rozdzielczości.

Równoosiowe urządzenie rozciągające do konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek o dużym powiększeniu

Przedstawiamy dynamiczną i odwracalną platformę do testowania sztywności wykonaną z ultramiękkiego silikonowego elastomeru (polidimetylosiloksan, PDMS) z osadzonymi cząstkami żelaza. Ten nowatorski test nadaje się do badania pojawiających się czasowo zależnych zmian fizycznych w fenotypach komórek, w tym naprowadzania kontaktowego. Tutaj mierzymy wyrównanie kardiomiocytów noworodków szczurów po usztywnieniu macierzy za pomocą magnetyki.

Mikrowzorowane elastomery magneto-reologiczne do wywoływania zmian w ustawieniu kardiomiocytów

Poznaj technikę rozciągania komórek na mikrowzorzystej błonie PDMS do badań biomechaniki komórek. Ta metoda pozwala obserwować deformację komórek ssaczych podczas mitozy przy użyciu mikroskopii wideo.

Rozciąganie komórek z mikrowzorem na błonie PDMS

Przeglądaj więcej filmów