Monitorowanie konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych poprzez kohodowlę szczepów znakowanych fluorescencyjnie

Metoda ta wykorzystuje ko-hodowlę znakowanych fluorescencyjnie Bacillus sutilis do monitorowania szybkiej ekspansji klonalnej i eliminacji korzystnych i szkodliwych mutacji w populacji komórek bakteryjnych w czasie. Najpierw przygotuj prekultury bakterii do eksperymentu konkursowego. Wymieszaj równe ilości fluorescencyjnie znakowanych szczepów i wspólnie hoduj bakterie w różnych warunkach odżywczych.

Następnie zbierz próbki w różnych punktach czasowych, odpowiednio rozcieńcz i rozmnoż komórki na płytkach agarowych. Teraz wizualizuj i policz szczepy, które przeżyły, za pomocą stereomikroskopowej mikroskopii fluorescencyjnej. Ostatecznie wyniki mogą określić procent bakterii, które przeżyły, w stosunku do całkowitej liczby zliczonych kolonii.

W przeciwieństwie do monitorowania konkurencji wewnątrzgatunkowej przy użyciu różnych kaset z antybiotykami do oznaczania szczepów. W tej metodzie znakowane fluorescencyjnie szczepy konkurencji są prawie całkowicie izotoniczne i zdolne do warzenia na tych samych płytkach AGA. Procedura wstępna zostanie przedstawiona przez Lorenę, która jest doktorantką w moim laboratorium, zaszczepia cztery mililitry pożywki LB jednym mikrolitrem bakterii z minus 80 stopni Celsjusza, bulionów kriogenicznych i hoduje kultury wstępne przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza i 220 obr./min, rozcieńczyć 0,1 mililitra kultury do 0,9 mililitra pożywki LB w 1,5 mililitra wete, i określ gęstość optyczną.

Następnie, aby uzyskać mieszane populacje komórek do eksperymentów konkursowych, zaszczepić 100-mililitrowe kolby do wytrząsania zawierające 20 mililitrów CGLC i CGLC. Minimalne podłoże w stosunku jeden do jednego, przenieś 10 mililitrów kultur do 15 mililitrowych plastikowych probówek. Zebrać komórki przez odwirowanie przez 10 minut przy 4 000 razy większej grawitacji i wyrzucić supernatant.

Następnie ponownie zawieś komórki w 0,5 mililitra świeżej pożywki LB i przenieś komórki do sterylnego kubka reakcyjnego o pojemności 1,5 mililitra, dodaj 0,5 mililitra 50% sterylnego glicerolu. Wymieszaj zawiesinę przez rygorystyczne wirowanie i przechowuj próbki w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie należy przeprowadzić hodowlę, pozostałe bakterie w kolbach wstrząsowych.

Trzymaj kolby wstrząsowe w ciemności, aby zapobiec fotowybielaniu próbki siły flory 0,1 mililitra kultur po siedmiu godzinach i 24 godzinach pomiaru wzrostu i zwróć uwagę na gęstość optyczną od jednego do 10 rozcieńczeń próbek, przygotuj zapasy kriogeniczne próbek do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po zebraniu wszystkich próbek rozmrozić wywary kriogeniczne i rozcieńczyć komórki w 0,9% roztworze soli fizjologicznej dla każdej płytki szczepowej. 0,1 mililitra 10 do ujemnego piątego rozcieńczenia na pożywce SP na płytce agarowej SP i rozprowadzić komórki za pomocą sterylnej szklanej pipety.

Inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności, aż pojawią się pojedyncze kolonie za pomocą czarnego długopisu. Podziel spód płytki agarowej na cztery części, aby uzyskać lepszą orientację, licząc osoby, które przeżyły pod mikroskopem stereofluorescencyjnym. Teraz umieść płytkę do góry nogami pod mikroskopem i ustaw ostrość kolonii za pomocą zimnego źródła światła.

Gdy kolonie są już w ostrości, przełącz się na odpowiedni zestaw filtrów dla CFP Flora cztery. Aby zwizualizować ocalałe komórki szczepu oznaczonego CFP, policz osoby, które przeżyły ten szczep, oznaczając kolonie długopisem. I zwróć uwagę na liczbę.

Usuń etykiety etanolem. Następnie przełącz się na zestaw filtrów YFP. Wizualizacja komórek szczepu znakowanego YFP, które przeżyły.

Policz ponownie ocalałych, oznaczając kolonie długopisem. I zwróć uwagę na liczbę. Otwórz zdjęcia z jednego miejsca, które zostały zrobione za pomocą zestawu filtrów CFP i zestawu filtrów YFP.

Zoptymalizuj kontrast i jasność, aby zredukować fluorescencję tła z nośnika. Przejdź do jednego ze zdjęć i zaznacz wszystkie. Skopiuj zdjęcie i wklej je do drugiego obrazu.

Scal zdjęcia, wybierając w menu warstw opcję jaśniejszy kolor. W tym eksperymencie populacja komórek składająca się z dwóch szczepów BCI została znakowana za pomocą Fluor CFP i YFP w celu oceny wpływu różnych źródeł azotu na wzrost poprzez posiew odpowiedniego rozcieńczenia na płytkach agarowych. Skład klonalny populacji komórek w czasie można precyzyjnie określić, po prostu licząc kolonie żółtej i niebieskiej fluorescencji.

Aktywność enzymu dehydrogenazy glutaminianu silnie wpływa na sprawność OTUS w zależności od dostępności egzogennego glutaminianu. W przypadku braku egzogennego glutaminianu, wysoki poziom aktywności GDH jest niekorzystny dla bakterii, ponieważ enzymy G i dobry B rozkładają glutaminian, który jest potrzebny w anabolizmie. Natomiast synteza dwóch funkcjonalnych gdh jest korzystna dla bakterii, gdy dostępny jest egzogenny glutaminian, ponieważ oprócz G glutaminian glukozy jest używany jako źródło węgla.

Podobne wyniki uzyskano w eksperymencie z przełącznikiem matrycy. Ponownie, bakterie wyposażone w wysoki poziom aktywności GDH były konkurowane przez komórki o zmniejszonej aktywności GDH w pożywkach wzrostowych pozbawionych glutaminianu. Natomiast bakterie syntetyzujące tylko jeden aktywny GDH zostały wyeliminowane z hodowli.

Kiedy pożywka została uzupełniona glutaminianem, wyraźnie widać, że początkowy skład populacji mieszanych komórek pozostał prawie stały w czasie. Niezależnie od tego, czy Fluor jest traktowany razem. Zastosowanie Flora Force jest potężnym narzędziem do monitorowania konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych Po wygenerowaniu mocnych stron konkurenta.

Tę technikę można wykonać w ciągu pięciu dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.