Name: Monitorowanie konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych poprzez kohodowlę szczepów znakowanych fluorescencyjnie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Poznaj metodę kohodowli szczepów Bacillus subtilis znakowanych fluorescencyjnie do monitorowania konkurencji wewnątrzgatunkowej. Technika ta umożliwia wizualizację dynamiki klonalnej i kwantyfikację przeżywalności bakterii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca w laboratorium autorów była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de; CO 1139/1-1), Fonds der Chemischen Industrie (http://www.vci.de/fonds) oraz Centrum Biologii Molekularnej w Getyndze (GZMB). Autorzy dziękują Jörgowi Stülke za pomocne uwagi i krytyczną lekturę manuskryptu.

1. Przygotowanie płytek agarowych, pożywek hodowlanych, kriozapasów i prekultur
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę wzrostową i wymagane odczynniki (patrz tabela materiałów i odczynników).</li>
	<li>Prążkować szczepy B. subtilis (np. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) i BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) wykazujące ekspresję odpowiednio jednego i dwóch aktywnych GDH)2, które zostaną użyte w eksperymencie konkursowym na płytkach agarowych SP w celu uzyskania pojedynczych kolonii. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Weź pojedyncze kolonie i zaszczep sterylne probówki hodowlane zawierające 4 ml płynnej pożywki LB. Hoduj bakterie przez noc w temperaturze 28 °C i 220 obr./min.</li>
	<li>Hodować kultury przez noc w temperaturze 28 °C, aby uniknąć lizy lub zarodnikowania komórek.</li>
	<li>Zmierzyć gęstość optyczną kultur przy długości fali 600 nm (OD600) za pomocą standardowego spektrofotometru.</li>
	<li>Jeśli kultury osiągnęły OD600 2,0, zmieszać 0,75 ml kultur z 0,75 ml sterylnego 50% roztworu glicerolu w 1,5 ml probówkach reakcyjnych. Końcowa wartość OD600 powinna wynosić 1,0, aby uzyskać kriozasoby zawierające około 108 komórek/ml.</li>
	<li>Przechowywać probówki w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Wykonaj trzy prekultury każdego szczepu oznaczone genami fluoroforu kodującymi cfp i yfp. Zaszczepić prekultury (sterylne probówki hodowlane zawierające 4 ml płynnej pożywki LB) 1 μl komórek z kriozapasu o temperaturze -80 °C. Inkubować kultury przez noc w temperaturze 28 °C i 220 obr./min.</li>
</ol>
2. Współhodowla bakterii, pobieranie próbek i przechowywanie próbek
<ol>
	<li>Świeżo przygotować 100 ml minimalnej pożywki C-Glc i CE-Glc (patrz tabela odczynników i materiałów) i przenieść 20 ml każdej pożywki do sterylnych kolb wstrząsowych o pojemności 100 ml.</li>
	<li>Weź 0,1 ml kultur wstępnych, które były hodowane przez noc, rozcieńcz je 0,9 ml pożywki LB w kuwecie o pojemności 1,5 ml i oznacz OD600.</li>
	<li>Do eksperymentu konkursowego weź te prekultury różnych szczepów, które mają podobny OD600 w zakresie 1,0-1,5.</li>
	<li>Aby otrzymać mieszane populacje komórek, należy rozcieńczyć komórki prekultur, które miały odpowiedni OD600 do OD600 0,05 w 20 ml minimalnej pożywki C-Glc i CE-Glc uzupełnionej w 100 ml kolbach do wytrząsania. W eksperymencie konkursowym oba szczepy należy wymieszać w stosunku 1:1.</li>
	<li>Pobrać 10 ml próbek z kolb, przenieść je do plastikowych probówek o pojemności 15 ml, zebrać komórki przez odwirowanie przez 10 minut przy 4 000 x g w standardowej wirówce stołowej i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml świeżej pożywki LB i przenieść komórki do sterylnego kubka reakcyjnego o pojemności 1,5 ml. Dodać 0,5 ml 50% sterylnego glicerolu, wymieszać zawiesinę przez rygorystyczne wirowanie i przechowywać próbki w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu dalszej obróbki.</li>
	<li>Inkubować komórki pozostawione w kolbach do wytrząsania przez okres do 24 godzin w temperaturze 37 °C i 220 obr./min. Kolby do wytrząsania należy przechowywać w ciemności, aby zapobiec fotobieleniu fluoroforów.</li>
	<li>Kolejne próbki o objętości 0,1 ml należy pobrać po 7 godzinach i 24 godzinach wzrostu. Zmierzyć i zanotować OD600 rozcieńczeń 1:10 (w minimalnym podłożu C-Glc lub CE-Glc) próbek.</li>
	<li>Weź odpowiednią ilość komórek z każdej kultury, aby wytworzyć kriomagazyny, które mają OD600 równe 1,0. Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu dalszej obróbki.</li>
</ol>
3. Obróbka próbek, posiewanie i inkubacja do analiz ilościowych
<ol>
	<li>Po pobraniu wszystkich próbek rozmrozić kriozapasy i rozcieńczyć komórki w 0,9% roztworze soli fizjologicznej (patrz tabela odczynników i materiałów) do 10-3.</li>
	<li>Umieścić 0,1 ml 10-3 rozcieńczeń na pożywce SP na płytkach agarowych SP i rozprowadzić komórki za pomocą sterylnych szklanych pipet.</li>
	<li>Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C w ciemności, aż pojawią się pojedyncze kolonie.</li>
</ol>
4. Liczenie ocalałych za pomocą stereofonicznej mikroskopii fluorescencyjnej do analizy ilościowej
<ol>
	<li>Podziel dolną część płytki agarowej czarnym pisakiem na cztery części, aby uzyskać lepszą orientację podczas liczenia osób, które przeżyły, pod stereoskopowym mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
	<li>Umieść płytkę do góry nogami pod mikroskopem i ustaw ostrość kolonii za pomocą zimnego źródła światła.</li>
	<li>Gdy kolonie są w ostrości, przełącz się na odpowiedni zestaw filtrów dla CFP, aby uwidocznić ocalałe komórki szczepu znakowanego CFP. Policz osoby, które przeżyły ten szczep, oznaczając kolonie długopisem i zanotuj liczbę.</li>
	<li>Usuń etykiety z etanolem i przełącz się na zestaw filtrów YFP, aby uwidocznić ocalałe komórki szczepu znakowanego yfp. Policz ocalałych ponownie, oznaczając kolonie długopisem i zanotuj liczbę.</li>
</ol>
5. Obróbka próbek i mikroskopia do analiz półilościowych
<ol>
	<li>Dla ilustracji, umieścić 10 μl rozcieńczenia 10-4 (około 100 komórek) z kroku 3.1 na płytce agarowej SP (patrz rysunek 3).</li>
	<li>Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C w ciemności, aż pojawią się pojedyncze kolonie.</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego bez pokrywki pod mikroskopem i ustaw ostrość plamki za pomocą zimnego źródła światła.</li>
	<li>Zrób zdjęcia miejsc na ilustracyjne postacie. Wybierz odpowiedni czas naświetlania do robienia zdjęć kolonii przy zimnym źródle światła.</li>
	<li>Nie przesuwając płytki, zmień na zestaw filtrów CFP, wyreguluj czas naświetlania i zrób zdjęcie. Zrób to samo z zestawem filtrów YFP i zapisz zdjęcia do dalszych analiz.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Korzystaj z oprogramowania takiego jak Excel do ilościowych analiz danych. Na podstawie zliczonych kolonii oblicz procent kolonii żółtych i niebieskich w stosunku do całkowitej liczby kolonii, które są ustawione na 100%.</li>
	<li>Użyj obliczonych liczb, aby utworzyć skumulowany diagram słupkowy (patrz Rysunek 4 i Rysunek 5). Użyj programu do przetwarzania obrazów, takiego jak Adobe Photoshop, aby skonstruować scalone obrazy zdjęć zrobionych z różnych miejsc. Alternatywnie, do przetwarzania obrazu można użyć bezpłatnie dostępnego oprogramowania ImageJ, które można pobrać ze strony <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>.</li>
	<li>Otwórz zdjęcia z jednego miejsca, które zostały zrobione za pomocą zestawu filtrów CFP i zestawu filtrów YFP. Zoptymalizuj kontrast i jasność, aby zredukować fluorescencję tła z nośnika.</li>
	<li>Przejdź do jednego ze zdjęć i zaznacz wszystkie. Skopiuj zdjęcie i wklej je do drugiego obrazu.</li>
	<li>Użyj funkcji "rozjaśnianie kolorów", aby scalić zdjęcia lub nałóż obrazy fluorescencyjne za pomocą zakładki kanały. Połączone zdjęcia kolonii z różnych pożywek i różnych punktów czasowych reprezentują wzrost różnych szczepów w płynnej kulturze.</li>
</ol>
7. Szczegółowe wskazówki: eksperyment z zamianą barwnika i wspólna uprawa szczepów izogenicznych oznaczonych cfp i yfp
Ekspresja jednego z dwóch genów kodujących fluorofory u B. subtilis może wpływać na dopasowanie, a tym samym na tempo wzrostu bakterii. Dlatego zaleca się przeprowadzenie następujących eksperymentów w celu wykluczenia, że eliminacja jednego konkurencyjnego szczepu z populacji komórek podczas hodowli jest po prostu spowodowana negatywnym wpływem fluoroforu:
<ol>
	<li>Powtórz cały eksperyment i współhoduj odwrotnie znakowane szczepy (np. wcześniejszy szczep znakowany cfp jest teraz znakowany genem yfp i odwrotnie). Chociaż odwrotnie, uzyskane wyniki powinny być porównywalne z poprzednią obserwacją, że jeden szczep ma selektywną przewagę wzrostu nad drugim szczepem.</li>
	<li>Powtórzyć całe doświadczenie i współhodować szczepy izogeniczne znakowane yfp i cfp (np. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) i BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)). Oszacuj negatywny wpływ jednego z dwóch fluoroforów na przydatność bakterii, śledząc skład populacji komórek w czasie.</li>
</ol>

<ol><li>Buescher, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+network+reorganization+during+dynamic+adaptations+of+Bacillus+subtilis+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global network reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism.</a> Science. 335, 1099-1103 (2012).</li>
<li>Gunka, K., Stannek, L., Care, R. A., Commichau, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection-driven+accumulation+of+suppressor+mutants+in+Bacillus+subtilis%3A+the+apparent+high+mutation+frequency+of+the+cryptic+gudB+gene+and+the+rapid+clonal+expansion+of+gudB%2B+suppressors+are+due+to+growth+under+selection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Selection-driven accumulation of suppressor mutants in Bacillus subtilis: the apparent high mutation frequency of the cryptic gudB gene and the rapid clonal expansion of gudB+ suppressors are due to growth under selection.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Al Mamum, A. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity+and+function+of+a+large+gene+network+underlying+mutagenic+repair+of+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identity and function of a large gene network underlying mutagenic repair of DNA breaks.</a> Science. 338, 1344-1348 (2012).</li>
<li>Koeppel, A. F., Wertheim, J. O., Barone, L., Gentile, N., Krizanc, D., Cohan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speedy+speciation+in+a+bacterial+microcosm%3A+new+species+can+arise+as+frequently+as+adaptations+within+a+species%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Speedy speciation in a bacterial microcosm: new species can arise as frequently as adaptations within a species.</a> ISME J. 7, 1080-1091 (2013).</li>
<li>Maughan, H., Nicholson, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+fitness+and+alteration+of+metabolic+pathways+during+Bacillus+subtilis+evolution+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Increased fitness and alteration of metabolic pathways during Bacillus subtilis evolution in the laboratory.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 4105-4118 (2011).</li>
<li>Burkholder, P. R., Giles, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+biochemical+mutations+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Bot%22%5BJournal%5D)">Induced biochemical mutations in Bacillus subtilis.</a> Am. J. Bot. 34, 345-348 (1947).</li>
<li>McLoon, A. L., Guttenplan, S. B., Kearns, D. B., Kolter, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+domestication+of+a+biofilm-forming+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tracing the domestication of a biofilm-forming bacterium.</a> J. Bacteriol. 193, 2027-2034 (2011).</li>
<li>Zeigler, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+of+168%2C+W23%2C+and+other+Bacillus+subtilis+legacy+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The origins of 168, W23, and other Bacillus subtilis legacy strains.</a> J. Bacteriol. 190, 6983-6995 (2008).</li>
<li>Gunka, K., Tholen, S., Gerwig, J., Herzberg, C., Stülke, J., Commichau, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-frequency+mutation+in+Bacillus+subtilis%3A+requirements+for+the+decryptification+of+the+gudB+glutamate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A high-frequency mutation in Bacillus subtilis: requirements for the decryptification of the gudB glutamate dehydrogenase.</a> 194, 1036-1044 (2012).</li>
<li>Commichau, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Bacillus+subtilis+mutants+with+carbon+source-independent+glutamate+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Bacillus subtilis mutants with carbon source-independent glutamate biosynthesis.</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 12, 106-113 (2007).</li>
<li>Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+suppressors+and+recovery+of+repressed+biochemical+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetic suppressors and recovery of repressed biochemical memory.</a> J. Biol. Chem. 284, 12585-12592 (2009).</li>
<li>Gunka, K., Commichau, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+glutamate+homeostasis+in+Bacillus+subtilis%3A+a+complex+interplay+between+ammonium+assimilation%2C+glutamate+biosynthesis+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Control of glutamate homeostasis in Bacillus subtilis: a complex interplay between ammonium assimilation, glutamate biosynthesis and degradation.</a> Mol. Microbiol. 85, 213-224 (2012).</li>
<li>Yan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+the+glutamate+pool+concentrations+in+enteric+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Protection of the glutamate pool concentrations in enteric bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9475-9480 (2007).</li>
<li>Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+and+regulation+of+Bacillus+subtilis+glutamate+dehydrogenase+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Role and regulation of Bacillus subtilis glutamate dehydrogenase genes.</a> J. Bacteriol. 180, 6298-6305 (1998).</li>
<li>Commichau, F. M., Herzberg, C., Tripal, P., Valerius, O., Stülke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+protein-protein+interaction+governs+glutamate+biosynthesis+in+Bacillus+subtilis%3A+the+glutamate+dehydrogenase+RocG+moonlights+in+controlling+the+transcription+factor+GltC%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A regulatory protein-protein interaction governs glutamate biosynthesis in Bacillus subtilis: the glutamate dehydrogenase RocG moonlights in controlling the transcription factor GltC.</a> Mol. Microbiol. 65, 642-654 (2007).</li>
<li>Gordo, I., Perfeito, L., Sousa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+effects+of+mutations+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fitness effects of mutations in bacteria.</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 21, 20-35 (2011).</li>
<li>Rabatinová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B4+subunit+of+RNA+polymerase+is+required+for+rapid+changes+in+gene+expression+and+competitive+fitness+of+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The δ subunit of RNA polymerase is required for rapid changes in gene expression and competitive fitness of the cell.</a> J. Bacteriol. 195, 2603-2611 (2013).</li>
<li>Capra, E. J., Perchuk, B. S., Skerker, J. M., Laub, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+mutations+that+prevent+crosstalk+enable+the+expansion+of+paralogous+signalling+protein+families%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adaptive mutations that prevent crosstalk enable the expansion of paralogous signalling protein families.</a> Cell. 150, 222-232 (2012).</li>
<li>García-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (15), (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opracowano kilka metod analizy konkurencyjności bakterii16. W wielu przypadkach bakterie były znakowane różnymi kasetami oporności na antybiotyki17. Podobnie jak w przypadku naszego podejścia, znakowanie komórek za pomocą kaset oporności na antybiotyki pozwala na ocenę konkurencyjności bakterii podczas kohodowli w określonych warunkach wzrostu. Co więcej, metoda ta może być stosowana do określania dopasowania konkurencyjnego komórek, które różnią się od siebie określonym locus na chromosomie17<...

Bakterie glebowe są zazwyczaj wyposażone w elastyczne sieci regulacyjne i szerokie zdolności metaboliczne. Obie cechy umożliwiają komórkom dostosowanie swoich szlaków katabolicznych i anabolicznych do konkurowania z innymi mikroorganizmami i innymi mikroorganizmami o składniki odżywcze, które są dostępne w danej niszy ekologicznej1. Jeśli jednak bakterie nie są w stanie przystosować się do środowiska, za przetrwanie gatunku mogą odpowiadać inne mechanizmy. Rzeczywiście, ponieważ wiele bakterii rozmnaża się szybko, a populacje mogą osiągać wysokie zagęszczenie komórek, subpopulacje mogą spontanicznie gromadzić korzystne mutacje, które zapewniają komórkom selektywną przewagę wzrostu, a tym samym zwiększają ich przydatność. Co więcej, ogniska mutacji i mutageneza adaptacyjna wywołana stresem mogą ułatwiać ewolucję nieprzystosowanej bakterii2,3. Tak więc akumulacja mutacji i wzrost w wyniku ciągłej selekcji jest źródłem ogromnej różnorodności mikrobiologicznej, nawet w obrębie tego samego rodzaju4,5. Podobnie jak w naturze, kształtowanie genomów bakteryjnych zachodzi również w laboratorium ze względu na ciągłą hodowlę w ramach selekcji. Przykładem tego jest udomowienie bakterii Gram-dodatniej B. subtilis, która jest stosowana na całym świecie w badaniach podstawowych i w przemyśle. W latach czterdziestych XX wieku B. subtilis poddano działaniu niszczących DNA promieni rentgenowskich, a następnie wyhodowano w określonych warunkach wzrostu6. Mutacje, które nagromadziły się w bakteriach podczas ich udomowienia, odpowiadają za utratę wielu cech wzrostu, tj. szczep laboratoryjny B. subtilis 168 utracił zdolność do tworzenia złożonych kolonii7,8.
Obecnie, dla najlepiej zbadanych bakterii modelowych Escherichia coli i B. subtilis, dostępnych jest wiele potężnych narzędzi do genetycznego manipulowania ich genomami w celu rozwiązania konkretnych pytań naukowych. Czasami inaktywacja interesującego genu powoduje poważną wadę wzrostu, która jest wtedy wyraźnie widoczna na standardowej pożywcewzrostowej 9. Natomiast mutacje, które powodują słaby defekt wzrostu, a tym samym tylko nieznacznie wpływają na przydatność szczepu, są często ignorowane. Jednak w obu przypadkach przedłużona inkubacja i pasażowanie zmutowanych szczepów przez kilka pokoleń zwykle prowadzi do akumulacji mutantów supresorowych, które przywróciły fenotyp szczepu rodzicielskiego2,9. Charakterystyka mutantów supresorowych i identyfikacja mutacji, które przywróciły wadę wzrostu rodzicielskiego zmutowanego szczepu, jest bardzo pomocnym podejściem, które pozwala na wyjaśnienie ważnych i często nowych procesów komórkowych10,11.
Jesteśmy zainteresowani kontrolą homeostazy glutaminianu u B. subtilis12. Podobnie jak E. coli, B. subtilis reaguje na zaburzenie homeostazy glutaminianu (tj. blokuje degradację glutaminianu2) przez akumulację mutantów supresorowych. Wykazano, że zmiany genomowe w tych mutantach supresorowych, które zostały nabyte w wyniku spontanicznej mutacji, szybko przywracają homeostazę glutaminianu9,13. Dlatego nie jest zaskakujące, że adaptacja B. subtilis do określonych warunków wzrostu podczas udomowienia bakterii znajduje odzwierciedlenie w syntezie enzymów i w wyewoluowanych aktywnościach enzymatycznych, które są zaangażowane w metabolizm glutaminianu12. Zasugerowano, że brak egzogennego glutaminianu w pożywce wzrostowej podczas procesu udomowienia był siłą napędową powstania i utrwalenia się genu CR dehydrogenazy glutaminianu (GDH) w szczepie laboratoryjnym 1682,14. Hipoteza ta jest poparta naszą obserwacją, że zmniejszona ilość aktywności GDH w szczepie laboratoryjnym zapewnia bakteriom selektywną przewagę wzrostu, gdy egzogenny glutaminian jest rzadki2. Co więcej, hodowla szczepu B. subtilis, syntetyzującego GDH GudB, przy braku egzogennego glutaminianu powoduje akumulację mutantów supresorowych, które inaktywowały gen gudB 2. Oczywiście obecność katabolicznie aktywnego GDH jest niekorzystna dla komórki, ponieważ endogennie wytwarzany glutaminian, który w przeciwnym razie mógłby być wykorzystany do anabolizmu, jest degradowany do amonu i 2-oksoglutaranu (ryc. 1). W przeciwieństwie do tego, gdy glutaminian jest dostarczany przez pożywkę, szczep B. subtilis wyposażony w wysoki poziom aktywności GDH ma selektywną przewagę wzrostu nad szczepem, który syntetyzuje tylko jeden funkcjonalny GDH. Rozsądne jest założenie, że wysoki poziom aktywności GDH pozwala bakteriom na wykorzystanie glutaminianu jako drugiego źródła węgla oprócz innych źródeł węgla dostarczanych przez pożywkę2 (patrz rysunek 1). Tak więc aktywność GDH silnie wpływa na kondycję bakterii, w zależności od dostępności egzogennego glutaminianu.
Tutaj prezentujemy bardzo obrazową metodę monitorowania i wizualizacji wewnątrzgatunkowej konkurencji między dwoma szczepami B. subtilis, które różnią się pojedynczym locus na chromosomie (Rysunek 2). Dwa szczepy zostały oznaczone genami yfp i cfp kodującymi fluorofory YFP i CFP i były współhodowane w różnych warunkach żywieniowych. Poprzez pobieranie próbek w czasie i poprzez posiewanie odpowiednich rozcieńczeń na płytkach agarowych, osoby, które przeżyły w każdej z kultur, mogą być łatwo monitorowane za pomocą zwykłego mikroskopu stereofluorescencyjnego. Procedura opisana w tym artykule jest łatwa do wykonania i odpowiednia do wizualizacji szybkiej ekspansji klonalnej i eliminacji korzystnych i szkodliwych mutacji, odpowiednio, w populacji komórek w czasie.

<table><tbody><tr><td>(NH4)2SO4&nbsp;</td><td>Roth, Niemcy</td><td>3746</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Difco, USA</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian amonu żelazowego (CAF)</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>9714</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp; </td><td>Roth, Niemcy</td><td>5239</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Applichem, Niemcy</td><td>A3617</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Roth, Niemcy</td><td>4043</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4&bull; 3H2O</td><td>Roth, Niemcy</td><td>6878</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Applichem, Niemcy</td><td>A3582</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth, Niemcy</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Roth, Niemcy</td><td>6751</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O&nbsp;</td><td>Roth, Niemcy</td><td>P027</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&nbsp;</td><td>Roth, Niemcy</td><td>T881</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4&bull; 4H2O</td><td>Merck Millipore, Niemcy</td><td>102786</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth, Niemcy</td><td>9265</td><td></td></tr><tr><td>Bulion odżywczy</td><td>Roth, Niemcy</td><td>X929</td><td></td></tr><tr><td>Glutaminian potasu</td><td>Applichem, Niemcy</td><td>A3712</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Roth, Niemcy</td><td>8952</td><td></td></tr><tr><td>Aplikacja tryptofanu</td><td>, Niemcy</td><td>A3445</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Roth, Niemcy</td><td>2363</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówki reakcyjne</td><td>Sarstedt, Niemcy</td><td>72,690,001</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml Probówki reakcyjne</td><td>Sarstedt, Niemcy</td><td>72,691</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówki plastikowe z nakrętką</td><td>Sarstedt, Niemcy</td><td>62,554,001</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Sarstedt, Niemcy</td><td>82.1473</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Kuwety polistyrenowe</td><td>Sarstedt, Niemcy</td><td>67,742</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Szklane probówki hodowlane&nbsp;</td><td>Marka, Niemcy</td><td>7790 22</td><td></td></tr><tr><td>100 ml Kolby do wytrząsania z aluminiowymi nakrętkami</td><td>Marka, Niemcy</td><td>928 24</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne szklane pipety 10 ml</td><td>Marka, Niemcy</td><td>278 23</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator (28 i 37 &deg; C)</td> Standardowy zestaw pipet <td>New Brunswick</td><td>M1282-0012</td><td></td></tr><tr><td>(2-20 &mu; l, 10-100 &mu; l, 100-1,000 &mu; l)</td> <td>Eppendorf, Niemcy</td><td>4910 000.034, 4910 000.042,</td><td></td></tr> <tr><td>Wirówka stołowa do probówek reakcyjnych 1,5 i 2 ml</td><td>Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Niemcy</td><td>75002425</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa do probówek plastikowych 15 ml</td><td>Heraeus Biofuge Primo R, Niemcy</td><td>75005440</td><td></td></tr><tr><td>Standardowy spektrofotometr</td><td>Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Niemcy</td><td>80-2112-21</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereofluorescencyjny&nbsp;</td><td>Zeiss SteREO Lumar V12, Niemcy</td><td>495008-0009-000</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka (-20 i -80 &deg; C)</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Lodówka (4 &stopnie; C)</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Autoklaw</td><td>Zirbus, LTA 2x3x4,</td> <td>Niemcy-pH-metr</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>pH-metr 766, Calimatic, Knick, Niemcy</td><td>766</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Vortex 3, IKA, Niemcy</td><td>3340000</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>CP2202S, Sartorius, Niemcy</td><td>zastąpiony</td> przez <td></td></tr><tr><td>długopis (marker permanentny)</td> <td>Staedler, Niemcy</td><td>317-9</td><td></td></tr><tr><td>Program Powerpoint</td><td></td> <td>Microsoft, USA-Office</td><td></td></tr> <tr><td>Program Excel</td><td>Microsoft, USA-Program</td><td></td> <td>do przetwarzania danych</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS5</td><td>Adobe, USA</td><td>zastąpiony przez CS6, pobierz</td><td>Program komputerowy do przetwarzania obrazu</td></tr><tr><td>Komputer</td><td>PC lub</td> <td>Mac-ZEN</td><td></td></tr> <tr><td>pro 2011 oprogramowanie do mikroskopu</td> <td>stereofluorescencyjnegoZeiss, Niemcy</td><td>410135 1002 110</td><td>AxioCam MRc Rev. Uzyskany przez Zeiss</td></tr><tr><td colspan="4">Przepisy na konkretne roztwory</td></tr><tr><td colspan="4">SP Średni</td></tr><tr><td>8 g Bulion</td><td></td><td></td><td></td>odżywczy</tr><tr><td>0,25 mg MgSO4&bull; 7H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 g KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 g agaru dla stałej pożywki</td><td></td><td></td> SP, <td>w razie potrzeby</td></tr><tr><td>dodać 1 l z autoklawem H2O</td><td></td><td></td><td>przez 20 minut w temperaturze 121 stopni; C</td></tr><tr><td>1 ml CaCl2 (0,5 M), sterylizowany przez filtrację</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml MnCl2 (10 mM), sterylizowany przez filtrację</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml cytrynianu amonu żelazowego (CAF, 2,2 mg/ml), sterylizowany przez filtrację</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">LB Medium</td></tr><tr><td>10 g Trypton</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 g ekstraktu</td><td></td><td></td><td></td>drożdżowego</tr><tr><td>10 g NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 g agaru dla stałego podłoża</td><td></td><td></td> LB <td>w razie potrzeby</td></tr><tr><td>dodać 1 l z autoklawem H2O</td><td></td><td></td><td>przez 20 minut w temperaturze 121 stopni; C</td></tr><tr><td colspan="4">C-Glc Minimal Medium</td></tr><tr><td>200 ml 5 x sole</td><td></td><td></td><td></td>C</tr><tr><td>10 ml L-tryptofanu (5 mg/ml), sterylizowane przez filtrację</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml cytrynianu amonowo-żelazowego (CAF, 2,2 mg/ml), sterylizowane przez filtrację</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml soli</td><td></td><td></td><td></td>III'</tr><tr><td>25 ml Glukoza (20%)</td><td></td><td></td><td>Autoklawowane przez 20 min w temperaturze 121 stopni; C</td></tr><tr><td>dodać 1 L ze sterylnym H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">CE-Glc Minimal Medium</td></tr><tr><td>200 ml 5 x sole</td><td></td><td></td><td></td>C</tr><tr><td>10 ml L-tryptofanu (5 mg/ml), sterylizowane przez filtrację</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml cytrynianu amonowo-żelazowego (CAF, 2,2 mg/ml), sterylizowane przez filtrację</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml III&rsquo; </td><td></td><td></td><td></td>sole</tr><tr><td>20 ml glutaminianu (40%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 ml glukozy (20%), autoklawowane przez 20 min w temperaturze 121 stopni; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dodać 1 L z jałowymi solami H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 x C sole&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 g KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>80 g K2HPO4&bull; 3H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16,5 g (NH4)2SO4</td><td></td><td></td><td></td></tr>dodać <tr><td>1 l w sterylnym autoklawie H2O</td><td></td><td></td><td>przez 20 min w temperaturze 121 stopni; Sole</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>C<td>III'</td></tr><tr><td>0,232 g MnSO4&bull; 4H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12,3 g MgSO4&bull; 7H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dodać 1 l sterylnym H2O, autoklaw przez 20 min w temperaturze 121 &deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40% roztwór glutaminianu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 g kwasu</td><td></td><td></td><td></td>L-glutaminowego</tr><tr><td>dostosować pH do 7,0 dodając około 80 g KOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dodać 0,5 l w sterylnym autoklawie H2O</td><td></td><td></td><td>przez 20 min w temperaturze 121 stopni; C</td></tr><tr><td colspan="4">0,9% roztwór soli fizjologicznej (NaCl)</td></tr><tr><td>dodać 1 l w sterylnym autoklawie H2O</td><td></td><td></td><td>przez 20 min w temperaturze 121 stopni; C</td></tr><tr><td>50% Roztwór</td><td></td><td></td><td></td>glicerolu</tr><tr><td>295 ml Glicerol (87%)dodać</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>0,5 l w sterylnym autoklawie H2O</td><td></td><td></td><td>przez 20 min w temperaturze 121 stopni; C</td></tr><tr><td colspan="4">Bakterie (Wszystkie szczepy są oparte na Bacillus subtilis szczep 168)</td></tr><tr><td>Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-yfp)&nbsp;</td><td>Laboratoryjne zbieranie</td><td></td><td></td> szczepów</tr><tr><td>Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-cfp)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-cfp)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-yfp)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

monitorowanie konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych poprzez kohodowlę szczepów znakowanych fluorescencyjnie

Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains

Wiele mikroorganizmów, takich jak bakterie, rozprzestrzenia się bardzo szybko i populacje mogą osiągać wysokie zagęszczenie komórek. Małe frakcje komórek w populacji zawsze mają nagromadzone mutacje, które są albo szkodliwe, albo korzystne dla komórki. Jeśli efekt dopasowania mutacji zapewnia subpopulacji silną selektywną przewagę wzrostu, osobniki tej subpopulacji mogą szybko prześcignąć, a nawet całkowicie wyeliminować swoich bezpośrednich pobratymców. Tak więc niewielkie zmiany genetyczne i sterowana selekcją akumulacja komórek, które nabyły korzystne mutacje, mogą prowadzić do całkowitej zmiany genotypu populacji komórek. W tym miejscu przedstawiamy procedurę monitorowania szybkiej ekspansji klonalnej i eliminacji korzystnych i szkodliwych mutacji, odpowiednio, w populacji komórek bakteryjnych w czasie poprzez kohodowlę znakowanych fluorescencyjnie osobników modelu Gram-dodatniego Bacillus subtilis. Metoda jest łatwa do wykonania i bardzo obrazowa, aby pokazać wewnątrzgatunkową konkurencję między osobnikami w populacji komórek bakteryjnych.

Opisana tutaj metoda została z sukcesem zastosowana do wizualizacji konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek składającej się ze szczepów B. subtilis, które zostały oznakowane genami cfp i yfp, kodującymi odpowiednio fluorofory CFP i YFP. Jak pokazano na Ryc. 3, metoda ta może być wykorzystana do wizualizacji konkurencji wewnątrzgatunkowej w sposób bardzo obrazowy. Poprzez nakładanie próbek na niewielkie obszary, skład klonalny populacji komórek stał się widoczny na pi...

Bakterie mogą gromadzić zarówno szkodliwe, jak i korzystne mutacje w ciągu swojego życia. W populacji komórek osobniki, które zgromadziły korzystne mutacje, mogą szybko prześcignąć swoich pobratymców. W tym miejscu przedstawiamy prostą procedurę wizualizacji konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych w czasie przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych osobników.

Monitorowanie konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych poprzez kohodowlę szczepów znakowanych fluorescencyjnie

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a ...

Metoda ta wykorzystuje kokultywację fluorescencyjnie znakniczonych szczepów bacillus sutilis do monitorowania szybkiej ekspansji klonalnej oraz eliminacji korzystnych i niekorzystnych mutacji w populacji komórek bakteryjnych w czasie. Najpierw należy przygotować prekultury bakterii do eksperymentu konkurencyjnego. Następnie wymieszaj równe ilości fluorescencyjnie znakniczonych szczepów i prowadź kokultywację bakterii w różnych warunkach odżywczych.Następnie należy zebrać próbki w różnych punktach czasowych, odpowiednio je rozcieńczyć i wysiać komórki na płytkach z agarem. Teraz należy zwizualizować i policzyć przeżyłe szczepy za pomocą stereomikroskopii fluorescencyjnej. Ostatecznie wyniki pozwolą określić procent przeżytych bakterii w stosunku do całkowitej liczby policzonych kolonii.W przeciwieństwie do monitorowania konkurencji wewnątrzgatunkowej z wykorzystaniem różnych kaset antybiotykowych do znakowania szczepów, w tej metodzie fluorescencyjnie znakowane szczepy konkurencyjne są niemal całkowicie izotoniczne i mogą rosnąć na tych samych płytkach AGA. Procedurę wstępną przedstawi Lorena, doktorantka w moim laboratorium: zaszczep 4 mL medium LB za pomocą 1 µL bakterii z krio-probówek przechowywanych w temperaturze -80 °C, a następnie inkubuj prekultury przez noc w temperaturze 28 °C przy 220 RPM. Rozcieńcz 0,1 mL kultury w 0,9 mL medium LB w probówce typu Eppendorf o pojemności 1,5 mL i wyznacz gęstość optyczną.Następnie, aby uzyskać mieszane populacje komórek do eksperymentów konkurencyjnych, zaszczep kolby z wytrząsarką o pojemności 100 ml zawierające 20 ml pożywki CGLC i CGLC. Minimal medium w stosunku jeden do jednego, a następnie przenieś 10 ml kultur do plastikowych probówek o pojemności 15 ml. Zbierz komórki poprzez wirowanie przez 10 minut przy 4 000 ×g i odrzuć nadsącz.Następnie resuspenduj komórki w 0,5 ml świeżej pożywki LB, przenieś je do sterylnego naczynia reakcyjnego o pojemności 1,5 ml i dodaj 0,5 ml 50% sterylnego glicerolu. Wymieszaj zawiesinę poprzez intensywne wstrząsanie w wirówce (vortexing) i przechowuj próbki w zamrażarce w temperaturze -80 °C. Następnie hoduj pozostałe bakterie w kolbach z wytrząsaniem.Kolby z wytrząsarką należy przechowywać w ciemności, aby zapobiec fotoblaknięciu próbek flora force. Po siedmiu oraz 24 godzinach wzrostu pobrać 0,1 ml kultur, a następnie zmierzyć i odnotować gęstość optyczną próbek po rozcieńczeniu 1:10. Przygotować mrożone zapasy próbek do przechowywania w temperaturze -80 °C. Po zebraniu wszystkich próbek rozmrozić zapasy i rozcieńczyć komórki w 0,9% roztworze soli fizjologicznej. Dla każdego szczepu wysiać 0,1 ml rozcieńczenia 10⁻⁵ na płytkę z agarem w pożywce SP, rozprowadzając komórki za pomocą sterylnej pipety szklanej.Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C w ciemności, aż pojawią się pojedyncze kolonie, zaznaczając je czarnym pisakiem. Podzielić spód płytki z agarem na cztery części, aby ułatwić orientację podczas liczenia ocalałych komórek pod stereomikroskopem fluorescencyjnym. Następnie umieścić płytkę odwróconą do góry dnem pod mikroskopem i ustawić ostrość na koloniach, korzystając z zimnego źródła światła.Po ustawieniu ostrości na koloniach, należy przełączyć się na odpowiedni zestaw filtrów dla CFP Flora four. Aby zwizualizować przeżyłe komórki szczepu znakowanego CFP, należy policzyć przeżywalniki tego szczepu, zaznaczając kolonie pisakiem i zapisując ich liczbę.Usuń etykiety za pomocą etanolu. Następnie przełącz się na zestaw filtrów YFP, aby zwizualizować przeżyłe komórki szczepu znakowanego YFP.Ponownie policz przeżyłe komórki, zaznaczając kolonie pisakiem, a następnie zapisz uzyskaną liczbę. Otwórz zdjęcia tego samego obszaru, które zostały wykonane z użyciem zestawów filtrów CFP i YFP.Zoptymalizuj kontrast i jasność, aby zredukować autofluorescencję tła pochodzącą z medium. Przejdź do jednego z obrazów i zaznacz wszystko. Skopiuj ten obraz i wklej go na drugi obraz.Połącz zdjęcia, wybierając w menu warstw opcję jaśniejszy kolor. W tym eksperymencie populacja komórek składająca się z dwóch szczepów BCI została oznakowana fluoroforami CFP i YFP, aby ocenić wpływ różnych źródeł azotu na wzrost poprzez wysianie odpowiednich rozcieńczeń na płytki agarowe. Skład klonalny populacji komórek w czasie można precyzyjnie określić po prostu poprzez zliczenie żółtych i niebieskich kolonii fluorescencyjnych.Aktywność enzymu dehydrogenazy glutaminianowej silnie wpływa na dostosowanie otus w zależności od dostępności egzogennego glutaminianu. W przypadku braku egzogennego glutaminianu wysoki poziom aktywności GDH jest niekorzystny dla bakterii, ponieważ enzymy G i B degradują glutaminian niezbędny w anabolizmie. Z kolei synteza dwóch funkcjonalnych gdhs jest korzystna dla bakterii, gdy dostępny jest egzogenny glutaminian, ponieważ oprócz glukozy, glutaminian jest wykorzystywany jako źródło węgla.Podobne wyniki uzyskano w eksperymencie z wymianą matrycy. Ponownie bakterie charakteryzujące się wysoką aktywnością GDH zostały wyparte przez komórki z obniżoną aktywnością GDH w pożywkach wzrostowych pozbawionych glutaminianu. Z kolei bakterie syntetyzujące tylko jedną aktywną formę GDH zostały wyeliminowane z hodowli.Kiedy pożywkę uzupełniono o glutaminian, początkowy skład mieszanej populacji komórek pozostał wyraźnie niemal stały w czasie. Niezależnie od Fluor przyjętego łącznie. Zastosowanie Flora Force stanowi potężne narzędzie do monitorowania konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych po wygenerowaniu siły konkurentów.Tę technikę można przeprowadzić w ciągu pięciu dni, jeśli zostanie ona wykonana prawidłowo.

monitoring-intraspecies-competition-bacterial-cell-population

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Monitorowanie konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych poprzez współhodowlę szczepów znakowanych fluorescencyjnie

Źródło: Speare, L., et al. Test komonetacyjności do ilościowego określania konkurencyjnych interakcji między izolatami Vibrio fischeri.  J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia test współinkubacji używany do badania, w jaki sposób szczepy bakteryjne konkurują ze sobą we wspólnym środowisku. Jest szeroko stosowany w mikrobiologii do identyfikacji mechanizmów, takich jak zabijanie zależne od kontaktu lub niezależne od kontaktu, które napędzają te interakcje.

Test Coincubation do badania konkurencyjnych interakcji między szczepami bakterii

Ten film demonstruje metodę opartą na mikroskopii fluorescencyjnej do badania konkurencji bakterii na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta dostarcza informacji na temat struktury i funkcji społeczności bakteryjnych.

Test koinkubacji bakterii: technika oparta na mikroskopii fluorescencyjnej do wizualizacji wewnątrzgatunkowej konkurencji bakteryjnej na poziomie pojedynczej komórki

Opisujemy jakościowy test do monitorowania konkurencji bakteryjnej, w której pośredniczy system sekrecji Pseudomonas aeruginosa typu VI (T6SS). Test opiera się na przeżyciu/zabiciu komórek docelowych Escherichia coli zawierających lacZ-reporter. Technika ta jest regulowana w celu oceny aktywności bakteriobójczej/bakteriostazy mikroorganizmów biegłych w T6SS.

Test wizualny do monitorowania konkurencji bakteryjnej za pośrednictwem T6SS

Bakterie wytwarzają wydzielane związki, które mogą wpływać na fizjologię swoich mikrobiologicznych sąsiadów. W tym miejscu opisujemy badanie przesiewowe kokultury, które umożliwia wykrywanie takich chemicznie zapośredniczonych interakcji międzygatunkowych poprzez mieszanie mikroorganizmów glebowych z fluorescencyjnymi transkrypcyjnymi szczepami reporterowymi Bacillus subtilis na podłożach stałych.

Wykorzystanie kokultury do wykrywania interakcji międzygatunkowych o podłożu chemicznym

Rola asortymentu (segregacji przestrzennej) w scenariuszach ewolucyjnych może być badana za pomocą prostych systemów mikrobiologicznych w laboratorium, które pozwalają na kontrolowane dostosowanie rozkładu przestrzennego. Modyfikując gęstość komórek założycielskich, można wizualizować różne poziomy asortymentu przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie szczepów bakteryjnych w biofilmach kolonii Bacillus subtilis.

Monitorowanie segregacji przestrzennej w kolonizujących powierzchniowo populacjach drobnoustrojów

Bakterie kodują różne mechanizmy do angażowania się w międzybakteryjną rywalizację. W tym miejscu przedstawiamy oparty na kulturze protokół charakteryzujący konkurencyjne interakcje między izolatami bakteryjnymi i ich wpływ na strukturę przestrzenną populacji mieszanej.

Test komonetacyjności do ilościowego określania konkurencyjnych interakcji między izolatami Vibrio fischeri

Ten protokół obrazowania żywych komórek bakteryjnych pozwala na wizualizację interakcji między wieloma gatunkami bakterii na poziomie pojedynczej komórki w czasie. Obrazowanie poklatkowe pozwala na obserwację każdego gatunku bakterii w monokulturze lub kokulturze w celu zbadania interakcji międzygatunkowych w wielogatunkowych społecznościach bakteryjnych, w tym ruchliwości i żywotności poszczególnych komórek.

Kinetyczna wizualizacja jednokomórkowych międzygatunkowych interakcji bakteryjnych

Ten manuskrypt opisuje metodę wykorzystania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej komórki do wizualizacji i ilościowego określenia konkurencji bakterii w kokulturze.

Kwantyfikacja konkurencji międzybakteryjnej za pomocą obrazowania fluorescencyjnego pojedynczych komórek

Tytuł: Enkapsulacja komórek w kropelkach

Zdolność ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do samoodnawiania oraz różnicowania się we wszystkie typy komórek organizmu sprawia, że stanowią one ogromną obietnicę zarówno w zastosowaniach medycznych, jak i jako narzędzie badawcze służące do odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące rozwoju i chorób. W niniejszym materiale przedstawiamy zwięzły, szczegółowy protokół izolacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z embrionów poprzez immunosurgicalną izolację masy komórkowej...

Wytwarzanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych metodą immunochirurgii

Poznaj metodę kohodowli szczepów Bacillus subtilis znakowanych fluorescencyjnie do monitorowania konkurencji wewnątrzgatunkowej. Technika ta umożliwia wizualizację dynamiki klonalnej i kwantyfikację przeżywalności bakterii.

Monitorowanie konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych poprzez kohodowlę szczepów znakowanych fluorescencyjnie (Wideo) | JoVE Journal

Monitorowanie konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych poprzez kohodowlę szczepów znakowanych fluorescencyjnie

Przeglądaj więcej filmów