Badanie biogenezy fagolizosomów w żywych makrofagach

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest uchwycenie dynamicznego procesu dojrzewania fagosomów i biogenezy fagolizosomów w czasie rzeczywistym w fagocytach. Osiąga się to poprzez obciążenie lizosomalnych przedziałów komórek fluorescencyjną sprzężoną nicią dex, aby umożliwić wizualizację przedziałów lizosomalnych i przeniesienie jego ładunku świetlnego do fagosomów. W drugim etapie dodawane są mikrocząsteczki, które działają jak model fagocytarny.

Następnie dostarczanie materiału lizosomalnego do fagosomów jest analizowane za pomocą obrazowania na żywo i późniejszego cyfrowego przetwarzania obrazu. W celu ilościowego określenia procesu dojrzewania fagosomu wyniki pokazują wpływ różnych czynników na proces dojrzewania fagosomu w oparciu o dostarczanie zawartości lizosomów do fagosomów. Główną zaletą tej techniki istniejących metod, takich jak ocena dojrzewania makrofagów w utrwalonych komórkach, jest ilościowy odczyt z wysoką rozdzielczością czasową Rozpocznij od rozpuszczenia teksańskiej czerwonej nici DExT o grubości 70 kilodaltonów lub Dex 70 KD w PBS w ilości 20 miligramów na mililitr i przechowuj porcje w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Następnie rozcieńczyć zapas Dex 70 KD w kompletnej pożywce Docos do hodowli komórkowej, zmodyfikowanym pożywce dla orłów lub DMEM do około jednego miligrama na mililitr. Sonikować podwielokrotność nici DExT w ultradźwiękowej łaźni wodnej przez pięć minut. Następnie odwiruj roztwór w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez pięć minut, aby usunąć wszelkie grudki lub zanieczyszczenia z roztworu.

Ostrożnie przenieś SuperAgent do świeżej tuby, unikając osadzania się granulek na dnie. Następnie rozcieńczyć roztwór do końcowego stężenia roboczego 20 mikrogramów na mililitr w pełnej hodowli komórkowej. DMEM i filtr.

Wysterylizuj roztwór przez filtr zamontowany w strzykawce o wielkości 0,22 mikrometra. Następnie zobacz dwa mililitry makrofagów myszy pochodzących ze szpiku kostnego do stężenia pięć razy 10 do czwartej komórki na mililitr. W DMEM w naczyniu ze szklanym dnem niepowlekanym inkubować komórki przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze buforowanej 5% dwutlenkiem węgla.

Aby zapewnić przyłączenie i aklimatyzację po przyłączeniu, odessać pożywkę i dodać dwa mililitry przedwojennej nici DExT DMEM do naczynia ze szklanym dnem, a następnie inkubować komórki przez dwie do ośmiu godzin po inkubacji. Umyj komórki trzykrotnie za pomocą wstępnie rozgrzanego kompletnego DMEM. Odessać pożywkę po ostatnim płukaniu i dodać dwa mililitry kompletnego DMEM.

Inkubuj komórki przez cztery do 12 godzin. Następnie przepłucz komórki wstępnie ciepłym kompletnym DMEM wolnym od czerwieni fenolowej i dodaj dwa mililitry kompletnego przefiltrowanego DMEM wolnego od czerwieni fenolowej co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem obrazowania. Następnie doprowadzić podwielokrotność 1% powlekanej zawiesiny buraków przygotowanej zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym do temperatury pokojowej.

Sonikować roztwór w ultradźwiękowej łaźni wodnej przez dwie do trzech minut. Następnie pod szafką bezpieczeństwa biologicznego klasy drugiej dodaj od jednego do sześciu mikrolitrów zawiesiny kulek do komórek. Rozpyl gęstą chmurę kulek za pomocą pipety, aby delikatnie wymieszać zawiesinę w naczyniu ze szklanym dnem.

Następnie przynieś próbkę do mikroskopu i skup się na obszarze zainteresowania. Przed obrazowaniem poklatkowym. Zoptymalizuj ustawienia, w tym skanowanie, szybkie powiększenie i rozdzielczość, aby móc uchwycić jedną klatkę co siedem do 20 sekund.

Dostosuj ustawienia emisji wzbudzenia w oparciu o używany system obrazowania i sondy oraz zoptymalizuj ustawienia, aby zapobiec nadmiernemu wybielaniu zdjęć. Następnie nagraj film poklatkowy i zapisz go w natywnym formacie pliku mikroskopu. Unikaj eksportowania wideo w skompresowanych formatach, takich jak JPG lub PNG.

Następnie uruchom dystrybucję Fiji and Image J zawierającą pakiet do przetwarzania obrazu ze zreorganizowanymi menu narzędzi i dodatkowymi natywnymi wtyczkami dostępnymi za darmo. Pobierać. Otwórz plik w Fidżi i wybierz film, który ma zostać oceniony. Następnie ustaw opcje, filtry i parametry pomiarowe zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym.

Następnie przejrzyj obrazy, zwracając uwagę na ramkę, w której tworzy się w pełni uformowany fagosom z powstającymi kulkami, a kwaśny kubek F jest zamknięty. Użyj narzędzia Owalne zaznaczanie, aby zaznaczyć okrągły obszar zainteresowania lub ROI na zinternalizowanym ściegu. Upewnij się, że zaznaczenie ściśle przylega do zewnętrznej krawędzi ściegu.

Następnie przejdź do sekcji Analizuj i kliknij przycisk Zmierz, aby wykonać pomiar. Wynik zostanie wyświetlony w osobnym oknie zatytułowanym wyniki. W następnej interesującej Cię ramce dostosuj pozycję ROI w przypadku, gdy koralik się przesunął i powtórz pomiar, który zostanie dodany do listy w oknie wyników.

Każdą analizowaną ramkę można zidentyfikować na podstawie wartości w kolumnie etykiety. Po zakończeniu pomiaru wszystkich odpowiednich ramek skopiuj wartości z kolumny int den do aplikacji arkusza kalkulacyjnego. Kolumna int den przedstawia intensywność wybranego obszaru.

Korzystając z tych metod, uzyskano wyraźne obrazy makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego, które zostały załadowane sondami nici DExT. To zdjęcie pochodzi z czasu zero, czyli właśnie wtedy, gdy komórka zakończyła wychwyt koralika kodowanego IgG, wskazanego tutaj. Pokazane tutaj obrazy były pseudo kolorowe dla lepszej widoczności i przedstawiają fagosom od zera do 85 minut po wchłonięciu.

Zmierzony fagosom, ROI jest obrysowany linią przerywaną, a przypadki dostarczania i akumulacji dekstranu w fagosomie są wskazane strzałkami. Na podstawie tych obrazów wygenerowano wykresy, które pokazują wyraźny trend czasowy związku sygnału z fagosomem w czasie. Ten wykres przedstawia średnio 10 fagosomów z dwóch pokazanych tutaj komórek.

Podczas gdy bezwzględna intensywność sygnału często różni się między każdym analizowanym fagosomem, trend czasowy jest zwykle bardzo podobny. Po dostarczeniu Dex 70 KD do fagosomów, plateau osiągnięto w ciągu 35 do 40 minut po fagocytozie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić dojrzewanie fagosomu za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej.