Name: Badanie biogenezy fagolizosomów w żywych makrofagach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji biogenezy fagolizosomów w żywych makrofagach myszy przy użyciu fluorescencyjnych sond dextranowych. Technika ta umożliwia ilościową analizę dojrzewania fagosomów z wysoką rozdzielczością czasową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom Laboratorium Biologii Fagosomów za krytyczną lekturę manuskryptu. Praca ta jest wspierana przez grant Helmholtz Young Investigator (fundusze inicjatywy i sieci Stowarzyszenia Helmholtza) oraz grant Niemieckiej Rady ds. Badań Naukowych (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG) w ramach programu priorytetowego SPP1580).

<ol><li>Greenberg, S., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and innate immunity.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).</li>
<li>Jutras, I., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).</li>
<li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+adaptive+immunity+by+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of adaptive immunity by the innate immune system.</a> Science. 327, 291-295 (2010).</li>
<li>Stuart, L., Ezekowitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+elegant+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: elegant complexity.</a> Immunity. 22, 539-550 (2005).</li>
<li>Blander, J. M., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+regulation+of+phagosome+maturation+and+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">On regulation of phagosome maturation and antigen presentation.</a> Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+aging+gracefully%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: aging gracefully.</a> Biochem. J. 366, 689-704 (2002).</li>
<li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagosome%3A+compartment+with+a+license+to+kill%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The phagosome: compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8, 311-330 (2007).</li>
<li>Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+mechanisms+of+phagocytes+and+bacterial+evasion+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).</li>
<li>Luzio, J., Pryor, P., Bright, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes%3A+fusion+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes: fusion and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 622-632 (2007).</li>
<li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Endosome maturation.</a> EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).</li>
<li>Luzio, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome-endosome+fusion+and+lysosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis.</a> J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).</li>
<li>Eissenberg, L., Goldman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+lysosomes+with+phagosomes+containing+Histoplasma+capsulatum%3A+use+of+fluoresceinated+dextran%29%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran).</a> Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).</li>
<li>de Souza Carvalho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization%2C+phagolysosomal+biogenesis+and+killing+of+mycobacteria+in+enucleated+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).</li>
<li>Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+and+sequential+delivery+of+fluorescent+lysosomal+probes+into+phagosomes+in+mouse+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages.</a> J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).</li>
<li>Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosomes+Fuse+with+Late+Endosomes+and%2For+Lysosomes+by+Extension+of+Membrane+Protrusions+along+Microtubules%3A+Role+of+Rab7+and+RILP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP.</a> Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).</li>
<li>Huynh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAMP+proteins+are+required+for+fusion+of+lysosomes+with+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes.</a> EMBO J. 26, 313-324 (2007).</li>
<li>Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+mechanism+of+cargo+sorting+during+lysosome-phagosome+fusion+is+controlled+by+Rab34%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).</li>
<li>Snijder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+context+determines+cell-to-cell+variability+in+endocytosis+and+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection.</a> Nature. 461, 520-523 (2009).</li>
<li>Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).</li>
<li>Hemmi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Toll-like+receptor+recognizes+bacterial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA.</a> Nature. 408, 740-745 (2000).</li>
<li>Underhill, D., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors%3A+key+mediators+of+microbe+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors: key mediators of microbe detection.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).</li>
<li>Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+I+and+class+III+phosphoinositide+3-kinases+are+required+for+actin+polymerization+that+propels+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes.</a> J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).</li>
<li>Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+receptor-ligand+interactions+modulate+gene+expression+and+phagosomal+properties+during+both+early+and+late+stages+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis.</a> Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).</li>
<li>Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+phagosome+maturation+as+a+function+of+phagosome%2Flysosome+fusion+and+acquisition+of+hydrolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity.</a> Traffic. 6, 413-420 (2005).</li>
<li>Savina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOX2+controls+phagosomal+pH+to+regulate+antigen+processing+during+crosspresentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells.</a> Cell. 126, 205-218 (2006).</li>
<li>Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+phagosome+maturation+through+the+real-time%2C+spectrofluorometric+measurement+of+hydrolytic+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities.</a> Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).</li>
<li>Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+marches+on+its+phagosome%3A+dynamic+assays+of+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li>
<li>Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+phagosomal+degradation+and+antigen+presentation+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).</li>
<li>Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Responds+to+Chloride+and+pH+as+Synergistic+Cues+to+the+Immune+Status+of+its+Host+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li>
<li>Aziz, M., Yang, W. -L., Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current protocols in immunology. Coliganet, J. E., et al. 14, (2013).</li>
<li>Rogers, L., Foster, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+phagosomal+proteome+and+the+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).</li>
<li>Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+marches+on+its+phagosome%3A+dynamic+assays+of+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li>
<li>Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -M., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+pH%2C+ROS+production%2C+maturation%2C+and+degradation+in+dendritic+cell+phagosomes+using+cytofluorometry-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays.</a> Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W dalszej części omówimy krytyczne etapy prezentowanej metody i jej ograniczenia. Ponadto połączymy niektóre z typowych problemów z ich rozwiązaniami, wprowadzimy możliwe modyfikacje i rozważymy zalety naszej metody, a także odpowiednie metody uzupełniające dla tego podejścia.
Przygotowanie kulek, w tym sprzężenie IgG z powierzchnią kulki, ma kluczowe znaczenie i należy unikać stosowania nieświeżych preparatów. Ponadto bardzo ważne jest również, aby dekstran był przygotowywany z zamrożonego wy...

Profesjonalne fagocyty, w tym makrofagi, odgrywają kluczową rolę w układzie odpornościowym. Oprócz tego, że są pierwszą linią obrony we wrodzonym układzie odpornościowym, odgrywają również kluczową rolę w aktywacji odporności adaptacyjnej poprzez swoją sygnalizację i rolę prezentującą antygen1-3. Podczas gdy funkcja profesjonalnych fagocytów jest wieloaspektowa, dojrzewanie fagosomów jest krytycznym szkieletem funkcji bakteriobójczej i przetwarzania antygenów przez profesjonalne fagocyty4,5. Po wchłonięciu i wychwycie za pośrednictwem receptora celu fagocytarnego, takiego jak bakterie, powstający fagosom przechodzi przez złożoną i dobrze zaaranżowaną sekwencję interakcji i wymiany z przedziałami sieci endocytarnej i kilkoma innymi organellami komórkowymi6. Charakter związków wymienianych z tymi jednostkami komórkowymi, a także regulacja i czas zdarzeń fuzji determinuje środowisko fagosomalne światła i skład błony fagosomalnej, a tym samym7, los dojrzewającego fagosomu8.
Fizjologiczne znaczenie dojrzewania fagosomu jest zilustrowane przez różnorodne strategie stosowane przez różne patogeny wewnątrzkomórkowe do ucieczki, zatrzymania lub zakłócenia dojrzewania fagosomu9. Większość z tych strategii bezpośrednio lub pośrednio zapobiega końcowemu i krytycznemu etapowi procesu dojrzewania fagosomu: fuzji fagosomu z późnymi przedziałami endosomalnymi / lizosomalnymi, co wyposaża je w większość enzymów hydrolitycznych i czynników przeciwbakteryjnych dojrzałego fagosomu7,8,10. Analiza tego ostatniego i krytycznego kroku może zatem dostarczyć nam silnych wskaźników dotyczących stanu dojrzewania fagosomów i tego, czy naturalny stan fizjologiczny ulega pozytywnemu czy negatywnemu wpływowi w określonych warunkach eksperymentalnych, które są wykorzystywane.
Późne przedziały endosomalne/lizosomalne są ogólnie uważane za końcowe przedziały szlaku endocytarnego, zdefiniowane i odróżnione od wczesnych przedziałów endocytarnych przez obecność różnych, specyficznych dla stadium cząsteczek markerowych. Na przykład enzymy hydrolityczne lub składniki błonowe, takie jak między innymi białka błonowe związane z lizosomami (LAMP)11. Końcowe przedziały endocytarne - odtąd nazywane po prostu lizosomami - służą również jako główne miejsce dla końcowych etapów trawienia na końcu szlaku fagocytarnego / endocytarnego12. W ten sposób niestrawne sondy mogą być ładowane przez endocytozę i makropinocytozę ze środowiska zewnątrzkomórkowego i transportowane szlakiem endocytarnym do lizosomów, gdzie gromadzą13,14 po wykonaniu określonego cyklu wychwytu i pościgu. Sondy sprzężone z fluoroforem do mikroskopii fluorescencyjnej, takie jak organiczny niestrawny polimer dekstran, są powszechnie stosowane jako sondy endocytarne15-17.
W tej metodzie, opisujemy wykorzystanie mikrokulek pokrytych IgG jako ładunku fagocytarnego do badania dojrzewania fagosomu poprzez analizę dostarczania lizosomalnej zawartości światła do fagosomów. Używając sondy dekstranu sprzężonego z fluoroforem jako łatwo wykrywalnego markera lizosomów w żywych makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego (BMM) i obrazowania wideo poklatkowego za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego laserowego, śledzimy dynamiczny proces dostarczania ładunku do fagosomów z wysoką rozdzielczością czasową. Następnie opisujemy, w jaki sposób zebrane dane z obrazowania poklatkowego mogą być oceniane za pomocą otwartego i ogólnodostępnego oprogramowania do analizy obrazu, Fiji (lub ImageJ), analizowane statystycznie za pomocą programu Microsoft Excel i prezentowane za pomocą oprogramowania GraphPad Prism14,18.
Zgodnie z opisem naszej metody, analogiczne eksperymenty mogą być zaprojektowane przy użyciu zmodyfikowanych ustawień i czynników w celu zbadania ich wpływu na dojrzewanie fagosomów; praktycznie każdy inny typ przylegających pierwotnych lub linii komórkowych komórek fagocytarnych, eksperymenty genetycznej utraty funkcji, w tym nokaut i knock-down, mutanty lub ekspresja białek fuzyjnych, cele fagocytarne, związki powlekające mikrogranulki, sondy endosomalne/lizosomalne i czynniki takie jak cytokiny, inhibitory chemiczne, czyli między innymi siRNA, to zmienne, które można zastosować do podstawowego podejścia tej metody.
Definiujemy cel i podstawowe wymagania tej metody w następujący sposób:
<ul type="dysk">
	<li>Cel metody: umożliwienie bezpośredniej, ilościowej i jakościowej obserwacji i analizy dojrzewania fagosomów z wysoką rozdzielczością czasową w żywych komórkach fagocytarnych.</li>
	<li>Ładunek fagocytarny: Odpowiednio pokryta mikrocząstka lub cel biologiczny. Tutaj używamy sferycznych mikrocząstek polistyrenu o grubości 3 μm pokrytych IgG, które są łatwo internalizowane przez fagocytozę za pośrednictwem receptora Fc-γ. Alternatywnie można użyć dowolnego mikroorganizmu lub mikrocząstki powlekanej, dla której receptor fagocytarny jest obecny na komórkach.</li>
	<li>Komórki fagocytarne: Przylegające komórki fagocytarne wyrażające odpowiednie receptory fagocytarne. Tutaj używamy mysich pierwotnych BMM, które obficie eksprymują receptory Fc-γ. Alternatywnie można zastosować komórki dendrytyczne (DC), monocyty lub komórki nabłonka fagocytarnego lub ich mutanty genetyczne lub warianty knock-out.</li>
	<li>Ładunek lizosomalny: Fluorescencyjnie znakowana sonda lizosomalna. Tutaj teksański dekstran o mocy 70 000 kilodaltonów (Dex70kD) jest używany jako ładunek świetlny lizosomów. Alternatywnie, dowolny wykrywalny fluorescencyjnie marker przedziału komórkowego lub organelli lub odpowiednia sonda właściwości fagosomalnych, takich jak kwasowość lub zdolność degradacji, może być wykorzystana do badania postępu dojrzewania fagosomu.</li>
	<li>Czynniki wpływające: Na przykład cząsteczki sygnałowe, związki chemiczne, knock-down genów lub przejściowa ekspresja zmutowanych białek mogą. W tym miejscu zrezygnowaliśmy z użycia takiego czynnika ze względu na prostotę, ale niedawny przykład z ekspresją zmutowanych białek i czynnikami wpływającymi na knock-down można znaleźć w Kasmapour et al. 18 Każdy czynnik, który może wpływać na fagocytozę lub okoliczności i ruchliwość fagosomów i/lub przedziałów, które oddziałują z dojrzewającymi fagosomami, może być potencjalnie wykorzystany.</li>
</ul>

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM)</td><td>PAA, Austria</td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles Medium bez czerwieni fenolowej (D-MEM)</td><td>PAA, Austria</td><td>E15-047</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>PAA, Austria</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>PAA, Austria</td><td>M11-004</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>PAA, Austria</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>PAA, Austria</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>WillCo-dish&reg; Naczynie ze szklanym dnem (35 mm &puste;, #1.5)</td><td>WillCo Wells, Holandia</td><td>GWSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie ze szklanym dnem CELLviewTM, 35 mm</td><td>Greiner Bio one, Niemcy</td><td>627871</td><td>Alternatywa: Dostępne jako segmentowe</td></tr><tr><td>karboksylowane mikrosfery lateksowe</td><td>Polysciences, USA</td><td>#09850</td><td>Dostępne w różnych średnicach, użyliśmy 3 &mu; m</td></tr><tr><td>Mikrocząstki polistyrenu</td><td>Kisker Biotech, Niemcy</td><td>PPs-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>ROTH, Niemcy</td><td>305.1.3</td><td></td></tr><tr><td>mysz cała IgG</td><td>Rockland, USA</td><td>010-0102</td><td></td></tr><tr><td>Sieciownik EDAC</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>E6383-1g</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml Omnifix -F</td><td>B.Braun, Niemcy</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>26&nbsp; Igła G (0,45*25 mm)</td><td>B.Baun, Niemcy</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA, Austria</td><td>E15-039</td><td></td></tr><tr><td>Surowica końska</td><td>Gibco, USA</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat MES</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &mu; Filtr strzykawkowy M</td><td>Sartorius, Niemcy</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie biogenezy fagolizosomów w żywych makrofagach

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Komórki fagocytarne odgrywają główną rolę we wrodzonym układzie odpornościowym, usuwając i eliminując atakujące mikroorganizmy w swoich fagosomach. Dojrzewanie fagosomu to złożony i ściśle regulowany proces, podczas którego powstający fagosom przechodzi drastyczną transformację poprzez dobrze zaaranżowane interakcje z różnymi organellami komórkowymi i przedziałami w cytoplazmie. Proces ten, który jest niezbędny dla fizjologicznej funkcji komórek fagocytarnych poprzez nadanie fagosomom właściwości litycznych i bakteriobójczych, kończy się fuzją fagosomów z lizosomami i biogenezą fagolizosomów, która jest uważana za ostatni i krytyczny etap dojrzewania fagosomów. W niniejszym raporcie opisujemy opartą na obrazowaniu żywych komórek metodę jakościowej i ilościowej analizy dynamicznego procesu dostarczania zawartości lizosomów do fagosomów, co jest cechą charakterystyczną biogenezy fagolizosomów. Podejście to wykorzystuje mikrogranulki pokryte IgG jako model fagocytozy i cząsteczki dekstranu sprzężone z fluoroforem jako luminalną sondę ładunkową lizosomalną, w celu śledzenia dynamicznego dostarczania zawartości lizosmalnej do fagosomów w czasie rzeczywistym w żywych makrofagach przy użyciu obrazowania poklatkowego i konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. W tym miejscu szczegółowo opisujemy tło, etapy przygotowania i konfigurację eksperymentalną krok po kroku, aby umożliwić łatwe i precyzyjne wdrożenie tej metody w innych laboratoriach. Opisana przez nas metoda jest prosta, solidna, a co najważniejsze, można ją łatwo dostosować do badania interakcji fagosomalnych i dojrzewania w różnych systemach i w różnych warunkach eksperymentalnych, takich jak użycie różnych typów komórek fagocytarnych, eksperymenty z utratą funkcji, różne sondy i cząstki fagocytarne.

Prawidłowe przygotowanie komórek i kulek do obrazowania jest kluczowe. Rysunek 1 przedstawia schemat etapów wysiewania, ładowania sond oraz wstępnego obrazowania w tej metodzie, opracowany na podstawie naszego zoptymalizowanego protokołu dla BMM. Niezbędne jest zatem przetestowanie i zoptymalizowanie parametrów protokołu w zależności od rodzaju wykorzystywanych komórek i sond.
Po dodaniu kulek pokrytych IgG do uprzednio przygotowanych komórek, ważne jest wybranie pola widzenia...

Badanie biogenezy fagolizosomów w żywych makrofagach

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest uchwycenie w czasie rzeczywistym dynamicznego procesu dojrzewania fagosomu oraz biogenezy fagolizosomu w fagocytach. Osiąga się to poprzez załadowanie przedziałów lizosomalnych komórek fluorescencyjnie sprzężonymi nićmi dekstranu, co umożliwia wizualizację przedziałów lizosomalnych oraz transfer zawartości ich światła do fagosomów. W drugim kroku dodawane są mikrocząsteczki, które pełnią rolę modelu fagocytozy.Następnie, za pomocą obrazowania żywych komórek i późniejszej cyfrowej obróbki obrazu, analizuje się dostarczanie materiału lizosomalnego do fagosomów. W celu ilościowego określenia procesu dojrzewania fagosomów, wyniki przedstawiają wpływ różnych czynników na ten proces w oparciu o dostarczanie zawartości lizosomalnej do fagosomów. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak ocena dojrzewania makrofagów w komórkach utrwalonych, jest ilościowy odczyt z wysoką rozdzielczością czasową. Należy rozpocząć od rozpuszczenia dekstranu 70 kDa znakowanego Texas Red (Dex 70 KD) w PBS w stężeniu 20 mg/mL, a następnie przechowywać alikwoty w temperaturze -20 °C.Następnie rozcieńcz roztwór stokowy Dex 70 KD w kompletnej pożywce do hodowli komórkowej Docos, zmodyfikowanej pożywce Eagle'a lub DMEM do stężenia około 1 mg/ml. Poddaj alikwot nici DExT sonikacji w kąpieli ultradźwiękowej przez 5 minut. Następnie odwiruj roztwór w mikrocentry fudze z maksymalną prędkością przez 5 minut, aby usunąć z roztworu wszelkie grudki lub zanieczyszczenia.Ostrożnie przenieś SuperAgent do nowej probówki, unikając pobrania osadu z dna. Następnie rozcieńcz roztwór do końcowego stężenia roboczego 20 µg/mL w pełnej pożywce DMEM do hodowli komórkowych i przefiltruj.Sterylizuj roztwór za pomocą filtra strzykawkowego o wielkości porów 0,22 µm. Następnie wysiej 2 mL makrofagów mysich pochodzących z szpiku kostnego do stężenia 5 × 10⁴ komórek/mL. W medium DMEM, w niepowlekanej szalce z szklanym dnem, inkubuj komórki przez co najmniej 12 h w temperaturze 37 °C w atmosferze buforowanej 5% CO2.Aby zapewnić przyleganie i aklimatyzację po adhezji, odessaj pożywkę i dodaj dwa mililitry uprzednio podgrzanego DMEM z DExT do szalki z szklanym dnem, a następnie inkubuj komórki przez od dwóch do ośmiu godzin po inkubacji. Przepłucz komórki trzy razy podgrzanym pełnym DMEM. Po ostatnim płukaniu odessaj pożywkę i dodaj dwa mililitry pełnego DMEM.Inkubować komórki od 4 do 12 godzin. Następnie przemyć komórki podgrzanym do odpowiedniej temperatury, kompletnym medium DMEM bez czerwieni fenolowej i dodać 2 mL kompletnego, filtrowanego medium DMEM bez czerwieni fenolowej co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem obrazowania. Następnie doprowadzić do temperatury pokojowej alikwot zawiesiny kulek powlekanych 1% IgG, przygotowanej zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym.Sonicuj roztwór w kąpieli wodnej z ultradźwiękami przez dwie do trzech minut. Następnie, w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II, dodaj od 1 do 6 µL zawiesiny kuleczek do komórek. Rozprosz gęstą chmurę kuleczek, używając pipety do delikatnego wymieszania zawiesiny w szkiełku z dnem szklanym.Następnie umieść próbkę pod mikroskopem i ustaw ostrość na obszarze zainteresowania. Przed rozpoczęciem obrazowania time-lapse zoptymalizuj ustawienia, w tym skanowanie, prędkość, powiększenie oraz rozdzielczość, aby umożliwić rejestrację jednej klatki co 7 do 20 sekund.Dostosuj ustawienia wzbudzenia i emisji w zależności od użytego systemu obrazowania oraz sond i zoptymalizuj te ustawienia, aby zapobiec nadmiernemu fotobleachingowi. Następnie zarejestruj film time-lapse i zapisz go w natywnym formacie plików Twojego mikroskopu. Unikaj eksportowania filmu w formatach skompresowanych, takich jak JPG lub PNG.Następnie uruchom program Fiji oraz dystrybucję ImageJ zawierającą pakiet do przetwarzania obrazów z zreorganizowanymi menu narzędzi i dodatkowymi wtyczkami natywnymi dostępnymi bezpłatnie. Pobrać. Otwórz plik w programie Fiji i wybierz wideo, które ma zostać poddane ocenie. Następnie ustaw opcje, filtry i parametry pomiarowe zgodnie ze szczegółami opisanymi w towarzyszącym protokole tekstowym.Następnie przejrzyj obrazy, odnotowując klatkę, w której utworzył się w pełni sformowany fagosom z koralikiem oraz zamknął się kwaśny puchar (F acidic cup). Użyj narzędzia zaznaczania owalnego (Oval selection tool), aby wybrać okrągły obszar zainteresowania (ROI) na zinternalizowanym koraliku. Upewnij się, że zaznaczenie ściśle przylega do zewnętrznej krawędzi koralika.Następnie przejdź do sekcji analizy i kliknij przycisk pomiaru, aby przeprowadzić pomiar. Wynik zostanie wyświetlony w osobnym oknie zatytułowanym wyniki. W następnej interesującej klatce dostosuj położenie ROI, jeśli koralik się przemieścił, i powtórz pomiar, który zostanie dodany do listy w oknie wyników.Każdą analizowaną klatkę można zidentyfikować na podstawie wartości w kolumnie label. Po zakończeniu pomiaru wszystkich odpowiednich klatek należy skopiować wartości z kolumny int den do arkusza kalkulacyjnego. Kolumna int den przedstawia intensywności wybranego obszaru.Zastosowanie tych metod pozwoliło na uzyskanie wyraźnych obrazów makrofagów pochodzących z szpiku kostnego, które zostały obciążone sondami nici DExT. Przedstawiony obraz pochodzi z punktu czasowego zero, czyli momentu, w którym komórka zakończyła pobieranie koralika kodowanego IgG, wskazanego w tym miejscu. Prezentowane obrazy zostały poddane pseudokolorowaniu w celu lepszej widoczności i przedstawiają fagosom od zera do 85 minut po pobraniu.Zmierzony fagosom, ROI, jest obrysowany przerywaną linią, a przypadki dostarczenia i akumulacji dekstranu w fagosomie są wskazane strzałkami. Na podstawie tych obrazów wygenerowano wykresy, które wykazują wyraźny trend czasowy powiązania sygnału z fagosomem w czasie. Wykres ten przedstawia średnią z 10 fagosomów pochodzących z dwóch komórek pokazanych tutaj.Chociaż absolutna intensywność sygnału często różni się między poszczególnymi analizowanymi fagosomami, trend czasowy jest zazwyczaj bardzo podobny. W przypadku dostarczania Dex 70 KD do fagosomów, plateau osiągnięto w ciągu 35 do 40 minut po fagocytozie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak oceniać dojrzewanie fagosomów z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii time-lapse.

study-of-phagolysosome-biogenesis-in-live-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Badanie biogenezy fagolizosomowe w żywych makrofagach

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Ten film demonstruje technikę mikroskopii TIRF (total internal reflection fluorescence) o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji w czasie rzeczywistym powstawania i zamykania fagosomów podczas fagocytozy za pośrednictwem makrofagów opsonizowanych IgG-opsonizowanych czerwonych krwinek (RBC) przyczepionych do powierzchni naczynia o szklanym dnie. Makrofagi rozciągają pseudopodia wokół erytrocytów i pochłaniają je wewnątrz fagosomów, odrywając je od powierzchni szkła.

Wizualizacja powstawania i zamykania fagosomów oparta na mikroskopii TIRF

Opisujemy metody wideomikroskopii żywych komórek fagocytozy Candida albicans za pomocą makrofagów.  Metody te umożliwiają specyficzną dla danego etapu analizę migracji, rozpoznawania, pochłaniania i dojrzewania fagosomów oraz ujawniają nowe aspekty fagocytozy.

Mikroskopia wideo żywych komórek fagocytozy patogenów grzybowych

Opisujemy eksperymentalny układ do wizualizacji z bezprecedensową wysoką rozdzielczością tworzenia i zamykania fagosomów w trzech wymiarach u żywych makrofagów, przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Umożliwia monitorowanie podstawy miseczki fagocytarnej, rozciągających się pseudopodów, a także dokładnego miejsca rozszczepienia fagosomu.

"Test zamykania fagosomu" do wizualizacji powstawania fagosomów w trzech wymiarach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM)

Opisujemy metodę pomiaru prędkości fagosomów przemieszczających się w kierunku centrum komórki w żywych komórkach zakażonych lub bez ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) typu 1, używając konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem do identyfikacji fluorescencyjnych zakażonych komórek i mikroskopii jasnego pola do wykrywania fagosomów.

Migracja i prędkość fagosomów mierzona w żywych pierwotnych ludzkich makrofagach zakażonych wirusem HIV-1

Tutaj opisujemy technikę opartą na mikroskopie, aby wizualizować i kwantyfikować wczesne kaskady zdarzeń podczas fagocytozy patogenów, takich jak grzyby Candida albicans i cząstki większe niż 0,5 μm, w tym kulki pokryte zymozanem i IgG.

Wizualizacja wczesnych stadiów fagocytozy

Prezentujemy metody oceny zdolności fagocytarnej pierwotnych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy za pomocą fluorescencyjnie znakowanych resztek mieliny i wewnątrzkomórkowego barwienia kropelkami lipidów.

In vitro Fagocytoza resztek mieliny przez makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego

Opisujemy tutaj prostą i szybką metodę izolacji fagosomów zawierających Salmonella typhimurium od makrofagów poprzez pokrycie bakterii biotyną i streptawidyną.

Izolacja fagosomów zawierających Salmonella typhimurium od makrofagów

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do obrazowania pojedynczych zdarzeń fagocytarnych przez makrofagi otrzewnowe rezydujące u myszy. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki fagocytarne.

Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy

Mechanizm związany z fagocytozą w zakażeniu Leishmania pozostaje słabo poznany. W tym miejscu opisujemy metody oceny wczesnych zdarzeń zachodzących podczas interakcji Leishmania z komórkami gospodarza.

Badanie fagocytozy Leishmania za pomocą mikroskopii konfokalnej

Badanie to wyjaśnia przetwarzanie fagocytarne cząstek Godanti Bhasma (GB) w komórkach ssaków, charakteryzując ich wychwyt komórkowy, dynamikę wakuoli, zakwaszenie i degradację. Odkrycia te nie tylko pogłębiają naszą wiedzę na temat podstawowych mechanizmów fagocytozy, ale także sprawiają, że GB jest obiecującym systemem modelowym do opracowywania nowych strategii terapeutycznych.

Badanie sekwencyjnych zdarzeń komórkowych fagocytozy wywołanej przez Godanti Bhasma w komórkach ssaków

Poznaj metodę wizualizacji biogenezy fagolizosomów w żywych makrofagach myszy przy użyciu fluorescencyjnych sond dextranowych. Technika ta umożliwia ilościową analizę dojrzewania fagosomów z wysoką rozdzielczością czasową.

Badanie biogenezy fagolizosomów w żywych makrofagach

Przeglądaj więcej filmów