Name: Wydajna produkcja i oczyszczanie rekombinowanego mysiego Kindlin-3 z komórek owadów do badań biofizycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-19T14:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 52 s
Description: Poznaj metodę wydajnej produkcji rekombinowanego mysiego Kindlin-3 w komórkach owadów przy użyciu wirusa baculowirusowego. Technika ta zwiększa wydajność dziesięciokrotnie w porównaniu z systemami bakteryjnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Weixan Lu za pomoc techniczną w hodowli i utrzymaniu zasobów komórek Sf9. L.A.Y. było wspierane przez stypendium dla absolwentów Medical Research Council (MRC). R.J.C.G był pracownikiem naukowym Royal Society University. Wydział Biologii Strukturalnej w Oksfordzie jest częścią Wellcome Trust Centre for Human Genetics, Wellcome Trust Core Award Grant Grant Number 090532/Z/09/Z.

Protokół ten zakłada, że gen kindliny-3 myszy (FERMT3) został pomyślnie sklonowany do wektora w pozycji downstream w stosunku do promotora p10 bardzo późnego i że wektor posiada flankujące sekwencje bakulowirusowe umożliwiające rekombinację z bakmidem BAC10KO:1629 opracowanym przez I.M. Jonesa i współpracowników28. W tym protokole gen kindliny-3 sklonowano do pOPINE29, a startery oraz strategię klonowania opisano w innym opracowaniu12. Plazmid został zaprojektowany tak, aby gen FERMT3 (kindlina-3) znajdował się pod kontrolą bakulowirusowego promotora p10, a wektor zawierał 5′ UTR/ORF603 i ORF 1629 oraz kodował C-terminalny znacznik His6 do późniejszej puryfikacji29.
1. Hodowla i utrzymanie hodwel komórek owadziej
<ol>
	<li>Przed amplifikacją rekombinowanego bakulowirusa należy wyhodować i utrzymywać komórki Spodoptera frugiperda zaadaptowane do hodowli w zawiesinie (komórki Sf9). Komórki owadzie należy zawsze obsługiwać z zachowaniem technik aseptycznych w dedykowanej dygestorii do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Kultury zawiesinowe komórek owadzie inkubuje się w bezserwatkowym płynnym medium Sf-900 II (SFM) uzupełnionym o 100 μg/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny w kolbach w temperaturze 27 °C przy wstrząsaniu z prędkością 100 rpm.</li>
	<li>Gęstość hodowli komórek owadziej należy utrzymywać w zakresie od 1 x 106  do 1 x 107  komórek/ml poprzez pasażowanie i rozcieńczanie hodowli świeżym medium Sf-900 II. 
	Uwaga: zdrowe komórki powinny być jednolite pod względem wielkości i mieć kształt sferyczny.</li>
	<li>Należy policzyć komórki w objętości próbki za pomocą hemocytometru i mikroskopii świetlnej, aby obliczyć gęstość komórkową hodowli.</li>
</ol>
2. Generowanie rekombinowanego baculowirusa
<ol>
	<li>Hodować i utrzymywać komórki Sf9 w zawiesinie, używając pożywki Sf-900 II uzupełnionej o 100 μg/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. W celu generowania bakulowirusów komórki owadzie powinny być hodowane do gęstości w zakresie 5 x 105 - 1 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Zasiać około 1 x 106 komórek Sf9 na studzienkę sterylnej 6-dołkowej płytki do hodowli tkanek w 2 ml pożywki Sf-900 II uzupełnionej o 100 μg/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Pozostawić komórki Sf9 w temperaturze pokojowej (RT) w dygestorium, aby przywarły do dna plastikowych studzienek i utworzyły monowarstwę.</li>
	<li>Przeprowadzić generowanie rekombinowanego bakulowirusa poprzez kotransfekcję DNA bacmid i DNA plazmidowego do hodowli monowarstwowej.
	<ol>
		<li>Dla każdej transfekcji zmieszać 1-2 μg oczyszczonego pOPINE-mFERMT3, który posiada elementy bakulowirusa ORF1629, z 0,5 μg oczyszczonego BAC10KO:1629 w 100 μl bezantybiotykowej pożywki Sf-900 II SFM (roztwór A).</li>
		<li>W oddzielnej probówce rozcieńczyć 6 μl odczynnika Cellfectin II w 100 μl bezantybiotykowej pożywki Sf-900 II SFM dla każdej reakcji transfekcji (roztwór B). W przypadku konieczności wykonania wielu transfekcji można przygotować „master mix”, aby ograniczyć liczbę operacji z cieczami.</li>
		<li>Zmieszać oba roztwory (A i B, łącznie około 200 μl) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 min w celu utworzenia kompleksu lipidowo-DNA.</li>
		<li>Rozcieńczyć kompleksy lipidowo-DNA w 800 μl bezantybiotykowej pożywki Sf-900 II SFM. Ostrożnie odessać pożywkę z monowarstwy komórek Sf9 i ostrożnie nanieść pipetą roztwór A/B oraz pożywkę na monowarstwę Sf9.</li>
		<li>Inkubować transfektowane komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 27 °C przez noc (O/N), a następnego dnia dodać kolejny 1 ml bezantybiotykowej pożywki Sf-900 II SFM do każdej hodowli monowarstwowej. Inkubować komórki w temperaturze 27 °C przez kolejne 5 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>zebrać rekombinowanego bakulowirusa bezpośrednio z pożywki hodowlanej (łącznie około 2 ml) i przenieść do czystej probówki wirówkowej (na przykład probówki Falcon 15 ml).
	<ol>
		<li>Usunąć resztki komórek Sf9 poprzez wirowanie przy 1 000 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Przenieść wirusa, znajdującego się w otrzymanym nadsadzie i oznaczonego jako P1, do czystej probówki i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu użycia. Na tym etapie pozostałą monowarstwę Sf9 można wykorzystać do oceny generowania rekombinowanego wirusa poprzez analizę obecności rekombinowanej kindliny-3 w komórkach owadzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Resuspendować monowarstwę w 0,5 ml PBS i rozcieńczyć 10 μl próbki równą objętością 2x buforu do ładowania SDS-PAGE. Podgrzewać próbki w temperaturze &gt;95 °C przez co najmniej 10 min.
	<ol>
		<li>Jeśli próbka jest zbyt lepka do prawidłowego nałożenia na żel, poddać ją sonikacji przez 1 s przy amplitudzie 10% przy użyciu końcówki mikrosonikatora.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Amplifikacja rekombinowanego bakulowirusa
<ol>
	<li>Do amplifikacji wirusa w zawiesinie należy zastosować gęstość komórek wynoszącą 1,4 x 106 cells/ml, co powinno stanowić 1/20 całkowitej objętości kolby (tj. 50 ml hodowli w kolbie o pojemności 2 L).</li>
	<li>Amplifikację wirusa rekombinowanego uzyskuje się poprzez zakażenie hodowli komórek owadziej zapasem wirusa P1 przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 0,1, stosując następujący wzór; 
	<img alt="Schemat wzoru obliczania inokulum dla miana wirusa w eksperymentach z hodowlą komórkową." fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51206/51206eq1.jpg" width="400" data-altupdatedat="1787630408000"> 
	Uwaga: Można przyjąć, że generacja wirusa P1 ma oczekiwane miano wirusa wynoszące 1 x 107 pfu/ml. Przed tym etapem można jednak przeprowadzić test plackowy.</li>
	<li>Zakażoną wirusem P1 hodowlę komórek owadziej inkubować w temperaturze 27 °C przy wytrząsaniu z prędkością 100 rpm przez 3 dni (72 hr).</li>
	<li>Wirus należy zebrać poprzez oddzielenie komórek od pożywki za pomocą wirowania przy 1 000 x g przez 5 min w RT. Otrzymany na tym etapie osad komórkowy należy zachować w celu potwierdzenia produkcji wirusa rekombinowanego poprzez ocenę ekspresji białka kindlin-3 metodą SDS-PAGE i western blottingu.</li>
	<li>Oczyszczoną pożywkę wzbogaconą o wirusa przenieść do czystej probówki i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do momentu użycia. Ten zapas wirusa oznacza się jako P2. 
	Uwaga: Można spodziewać się miana wirusa na poziomie 2 x 108 pfu/ml (lub stopnia amplifikacji wynoszącego 100 pfu/cell).</li>
</ol>
4. Ekspresja kindlin-3 w komórkach Sf9 zainfekowanych baculowirusem
<ol>
	<li>Wyhodować odpowiednią objętość kultur komórek Sf9 w zawiesinie w pożywce Sf-900 II SFM uzupełnionej o 100 μg/ml penicylina i 100 μg/ml streptomycyną przed wielkoskalową ekspresją rekombinowanego kindlinu-3 w celu jego oczyszczenia. Inkubować kultury zawiesinowe w 27 °C przy wytrząsaniu z prędkością 100 obr./min i stosunku całkowitej objętości hodowli do objętości kolby wynoszącym 1:5.</li>
	<li>Zainfekuj hodowle zawiesinowe komórek Sf9 o gęstości 2 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Uzupełnić hodowle Sf9 płodową surowicą bydlęcą (FBS) do stężenia końcowego 1% (v/v), a następnie dodać namnożony wirus rekombinowany (stok wirusowy P2), aby uzyskać wielokrotność infekcji (MOI) równą 1. Inkubować zainfekowane hodowle w 27 °C z wytrząsaniem przy 100 obr./min.</li>
	<li>Zbiór rekombinowanego białka kindlin-3-CHIS6ekspresujące komórki Sf9 72 h po infekcji poprzez wirowanie przy 1000 x g a otrzymany osad komórkowy przechowywano w temperaturze -20 °C do czasu użycia lub -80 °C do długoterminowego przechowywania.</li>
</ol>
5. Oczyszczanie rekombinowanego białka Kindlin-3
<ol>
	<li>Rozmrozić na lodzie zamrożone pellety komórek owadzich (Sf9) zainfekowanych bakulowirusami, wykazujących ekspresję rekombinowanego białka kindlin-3.</li>
	<li>Resuspender rozmrożony osad komórkowy w buforze do lizy (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 1% (v/v) Tween-20) uzupełnionym o koktajl inhibitorów proteaz bez EDTA oraz 1000–2000 j. DNazy I. 
	Uwaga: Alternatywnie można zastosować zmodyfikowany bufor fosforanowo-solny (PBS), w którym stężenie NaCl dostosowano do 500 mM, aby zapobiec nieswoistym oddziaływaniom między endogennymi białkami komórek Sf9 a kolumną do powinowactwa do zimmobilizowanych jonów metali stosowaną podczas późniejszego oczyszczania (patrz poniżej).</li>
	<li>Zlizuj komórki, inkubując zawiesinę komórkową z detergentem, a następnie mieszając na wortexie. W celu dalszej dezintegracji komórek poddaj próbkę sonikacji (amplituda 40%, 10 cykli: 10 s impulsowania i 10 s chłodzenia) w kąpieli lodowej lub alternatywnie użyj homogenizatora Dounce'a.</li>
	<li>Oczyścić lizat poprzez wirowanie przy 48 000 x g przez 1 h w temperaturze 4 °CNaniesienie otrzymanego supernatantu na kolumnę HisTrap (objętość kolumny 5 ml), uprzednio równoważoną buforem do lizy, przy 4 °C z prędkością 1 ml/min. 
	Uwaga: Alternatywnie, klarowny lizat można inkubować z 1–5 ml objętości złoża uprzednio równoważonych kulek niklowego sepharose (np. Ni Sepharose 6 fast flow) w 4 °C przez 1-2 godz. Po etapie wiązania można utworzyć kolumnę z Ni sepharose, używając kolumny do filtracji grawitacyjnej.</li>
	<li>Przemyj kolumnę 10-krotnością objętości kolumny buforu do płukania (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 10 mM imidazolu), aby usunąć nieprzypisane białka.</li>
	<li>Aby eluować związany rekombinowany białko kindlin-3-CHIS, należy zastosować liniowy gradient imidazolu od 10 do 500 mM z szybkością 10 mM/ml (lub w 10 objętościach kolumny), wykorzystując system Äkta FPLC.6.</li>
	<li>Rozdziel eluat na frakcje o objętości 0,5–1 ml przy użyciu systemu Äkta FPLC, wybierając te frakcje, które zawierają kindlin-3-CHIS6 zazwyczaj eluowane przy stężeniu imidazolu wynoszącym 300 mM.</li>
	<li>Ocenić skład białkowy eluatu za pomocą elektroforezy SDS-PAGE, a w przypadku pierwszych oczyszczeń potwierdzić go za pomocą westernu z użyciem przeciwciała anty-His.6 przeciwciało lub przeciwciało anty-mysie przeciwko kindlinie-3.</li>
	<li>Połączyć frakcje zawierające kindlin-3 i przeprowadzić wymianę buforu na 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl poprzez serię rozcieńczeń w buforze i zagęszczanie próbek przy użyciu wirówkowego koncentratora białek z limitem odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) wynoszącym 50 kDa przy 4 °C. 
	Uwaga: Alternatywnie można przeprowadzić dializę roztworu białka, używając kasety do dializy Slide-A-lyzer o MWCO 30 kDa w 4 °C przez 4 h lub przez noc (O/N) do buforu 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl. 
	Uwaga: w przypadku wymiany jonowej (patrz poniżej) należy zastosować niższe stężenie NaCl, t. j. 50 mM, może być i było stosowane na tym etapie.</li>
	<li>Nanieś roztwór białka po wymianie buforu na wcześniej równoważoną kolumnę HiTrap heparin HP (objętość kolumny 5 ml), korzystając z systemu Äkta FPLC przy szybkości przepływu 0,5 ml/min. 
	Uwaga: związany kindlin-3 jest eluowany przy użyciu liniowego gradientu NaCl (od 0,2 M NaCl do 1 M NaCl) w tym samym buforze, przy tempie wzrostu 10 mM/ml. Przewiduje się, że Kindlin-3-CHIS6 zostanie eluowany przy stężeniu NaCl ok. 0,6 M.</li>
	<li>Podziel eluat na frakcje o objętości 0,5–1 ml i oceń skład białkowy za pomocą elektroforezy SDS-PAGE oraz western-blottingu, jeśli jest to zasadne. 
	Uwaga: można spodziewać się czystości białka na poziomie bliskim 95%, ocenianej metodą SDS-PAGE.</li>
	<li>Połączyć frakcje zawierające kindlin-3 i skoncentrować za pomocą koncentratora białek do wirówki z MWCO 50 kDa do objętości końcowej 0,5–2 ml.</li>
	<li>W ostatnim kroku oczyść stężone białko i dokonaj wymiany buforu za pomocą chromatografii wykluczania rozmiarów (SEC).
	<ol>
		<li>Oczyszczone białko należy nałożyć na kolumnę Superdex S200 (16/60) lub (10/30), uprzednio równoważoną w roztworze 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 1 mM DTT, przy szybkości przepływu 1 ml/min lub 0,5 ml/min, w zależności od zastosowanego rozmiaru kolumny. 
		Uwaga: W razie potrzeby chromatografię wykluczania treści można przeprowadzić również w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).</li>
		<li>Oczyścić białka według wielkości, aplikując bufor na kolumnę z przepływem 1 ml/min lub 0,5 ml/min, w zależności od zastosowanego rozmiaru kolumny. 
		Uwaga: Białko wymywane z kolumny jest frakcjonowane, a proces ten jest monitorowany przy użyciu absorbancji przy 280 nm.</li>
		<li>W przypadku SEC należy spodziewać się pojedynczego piku absorbancji; frakcje są następnie poddawane analizie metodą SDS-PAGE w celu określenia homogenności, a typowo jest to &gt;95% czystości po tym kroku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skoncentruj oczyszczone białko kindlin-3-CHIS6 przy użyciu wirówkowego koncentratora białek z MWCO 50 kDa do stężenia ok. 15 mg/ml, określonego spektrofotometrycznie przy użyciu obliczonego współczynnika ekstynkcji (ε) wynoszącego 109 320 M⁻¹cm⁻¹-1 cm-1 (przy założeniu, że wszystkie reszty cysteiny są zredukowane).</li>
	<li>Do przechowywania w temperaturze -20 °C or długoterminowe przechowywanie w temperaturze -80 °Cnależy podzielić białko na aalikwoty w probówkach do PCR, a następnie szybko zamrozić próbki w ciekłym azocie. Alternatywnie białko można wykorzystać bezpośrednio do badań z zastosowaniem szeregu technik biochemicznych i biofizycznych.</li>
</ol>

<ol><li>Moser, M., Legate, K. R., Zent, R., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tail+of+integrins%2C+talin%2C+and+kindlins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The tail of integrins, talin, and kindlins.</a> Science. 895, 899(2009).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindlin+2+forms+a+transcriptional+complex+with+%CE%B2-catenin+and+TCF4+to+enhance+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Kindlin 2 forms a transcriptional complex with β-catenin and TCF4 to enhance Wnt signalling.</a> EMBO Rep. 13, 750-758 (2012).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindlin+2+promotes+breast+cancer+invasion+via+epigenetic+silencing+of+the+microRNA200+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Kindlin 2 promotes breast cancer invasion via epigenetic silencing of the microRNA200 gene family.</a> Int J Cancer. , (2013).</li>
<li>Meves, A., Stremmel, C., Gottschalk, K., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kindlin+protein+family%3A+new+members+to+the+club+of+focal+adhesion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Kindlin protein family: new members to the club of focal adhesion proteins.</a> Trends Cell Biol. 19, 504-513 (2009).</li>
<li>Siegel, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+kindlin-1%2C+a+human+homolog+of+the+Caenorhabditis+elegans+actin-extracellular-matrix+linker+protein+UNC-112%2C+causes+Kindler+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Loss of kindlin-1, a human homolog of the Caenorhabditis elegans actin-extracellular-matrix linker protein UNC-112, causes Kindler syndrome.</a> Am. J. Hum. Genet. 73, 174-187 (2003).</li>
<li>Hart, R., Stanley, P., Chakravarty, P., Hogg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kindlin+3+PH+domain+has+an+essential+role+in+integrin+LFA-1-mediated+B+cell+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The kindlin 3 PH domain has an essential role in integrin LFA-1-mediated B cell adhesion and migration.</a> J. Biol. Chem. , (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+phosphoinositide+binding+to+Kindlin-2+pleckstrin+homology+domain+in+regulating+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural basis of phosphoinositide binding to Kindlin-2 pleckstrin homology domain in regulating integrin activation.</a> J. Biol. Chem. 286, 43334-43342 (2011).</li>
<li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindlin-2+regulates+podocyte+adhesion+and+fibronectin+matrix+deposition+through+interactions+with+phosphoinositides+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Kindlin-2 regulates podocyte adhesion and fibronectin matrix deposition through interactions with phosphoinositides and integrins.</a> J. Cell Sci. 124, 879-891 (2011).</li>
<li>Yates, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+Functional+Characterisation+of+the+Kindlin-1+Pleckstrin+Homology+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural and Functional Characterisation of the Kindlin-1 Pleckstrin Homology Domain.</a> J. Biol. Chem. 287, 43246-43261 (2012).</li>
<li>Bouaouina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+lipid-binding+loop+in+the+kindlin+FERM+F1+domain+is+required+for+kindlin-mediated+%CE%B1IIb%CE%B23+integrin+coactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A conserved lipid-binding loop in the kindlin FERM F1 domain is required for kindlin-mediated αIIbβ3 integrin coactivation.</a> J. Biol. Chem. 287, 6979-6990 (2012).</li>
<li>Goult, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+N-terminus+of+kindlin-1%3A+a+domain+important+for+AlphaIIbBeta3+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The structure of the N-terminus of kindlin-1: a domain important for AlphaIIbBeta3 integrin activation.</a> J. Mol. Biol. 394, 944-956 (2009).</li>
<li>Yates, L. A., Fuzery, A. K., Bonet, R., Campbell, I. D., Gilbert, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+Analysis+of+Kindlin-3+Reveals+an+Elongated+Conformation+and+Maps+Integrin+Binding+to+the+Membrane-Distal+%CE%B2-Subunit+NPXY+motif%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biophysical Analysis of Kindlin-3 Reveals an Elongated Conformation and Maps Integrin Binding to the Membrane-Distal β-Subunit NPXY motif.</a> J. Biol. Chem. 287, 37715-37731 (2012).</li>
<li>Anthis, N. J., Campbell, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tail+of+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">The tail of integrin activation.</a> Trends Biochem. Sci. 36, 191-198 (2011).</li>
<li>Harburger, D. S., Bouaouina, M., Calderwood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindlin-1+and+-2+directly+bind+the+C-terminal+region+of+beta+integrin+cytoplasmic+tails+and+exert+integrin-specific+activation+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Kindlin-1 and -2 directly bind the C-terminal region of beta integrin cytoplasmic tails and exert integrin-specific activation effects.</a> J. Biol. Chem. 284, 11485-11497 (2009).</li>
<li>Tadokoro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Talin+binding+to+integrin+beta+tails%3A+a+final+common+step+in+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Talin binding to integrin beta tails: a final common step in integrin activation.</a> Science. 302, 103-106 (2003).</li>
<li>Garcia-Alvarez,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+integrin+recognition+by+talin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of integrin recognition by talin.</a> Mol. Cell. 11, 49-58 (2003).</li>
<li>Perera, H. D., Ma, Y. Q., Yang, J., Hirbawi, J., Plow, E. F., Qin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+binding+of+the+N-terminal+ubiquitin-like+domain+of+kindlin-2+is+crucial+for+its+regulation+of+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Membrane binding of the N-terminal ubiquitin-like domain of kindlin-2 is crucial for its regulation of integrin activation.</a> Structure. 19, 1664-1671 (2011).</li>
<li>Ussar, S., Wang, H. V., Linder, S., Fassler, R., Moser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kindlins%3A+subcellular+localization+and+expression+during+murine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The Kindlins: subcellular localization and expression during murine development.</a> Exp. Cell Res. 312, 3142-3151 (2006).</li>
<li>Bialkowska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+integrin+co-activator+Kindlin-3+is+expressed+and+functional+in+a+non-hematopoietic+cell%2C+the+endothelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The integrin co-activator Kindlin-3 is expressed and functional in a non-hematopoietic cell, the endothelial cell.</a> J. Biol. Chem. 285, 18640-18649 (2010).</li>
<li>Moser, M., Nieswandt, B., Ussar, S., Pozgajova, M., Fassler, R. Kindlin-3 is essential for integrin activation and platelet aggregation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoser%2C+M+%22Nat.+Med%22">Nat. Med</a>. 14, 325-330 (2008).</li>
<li>Lefort, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+talin-1+and+kindlin-3+in+LFA-1+extension+and+affinity+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation.</a> Blood. 119, 4275-4282 (2012).</li>
<li>Moser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindlin-3+is+required+for+beta2+integrin-mediated+leukocyte+adhesion+to+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Kindlin-3 is required for beta2 integrin-mediated leukocyte adhesion to endothelial cells.</a> Nat. Med. 15, 300-305 (2009).</li>
<li>Schmidt, S., Nakchbandi, I., Ruppert, R., Kawelke, N., Hess, M. W., Pfaller, K., Jurdic, P., Fassler, R., Moser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindlin-3-mediated+signaling+from+multiple+integrin+classes+is+required+for+osteoclast-mediated+bone+resorption%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kindlin-3-mediated signaling from multiple integrin classes is required for osteoclast-mediated bone resorption.</a> J. Cell Biol. 192, 883-897 (2011).</li>
<li>Malinin, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+point+mutation+in+KINDLIN3+ablates+activation+of+three+integrin+subfamilies+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A point mutation in KINDLIN3 ablates activation of three integrin subfamilies in humans.</a> Nat. Med. 15, 313-318 (2009).</li>
<li>Svensson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+adhesion+deficiency-III+is+caused+by+mutations+in+KINDLIN3+affecting+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Leukocyte adhesion deficiency-III is caused by mutations in KINDLIN3 affecting integrin activation.</a> Nat. Med. 15, 306-312 (2009).</li>
<li>Liu, Y., Zhu, Y., Ye, S., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+kindlin-2+PH+domain+reveals+a+conformational+transition+for+its+membrane+anchoring+and+regulation+of+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of kindlin-2 PH domain reveals a conformational transition for its membrane anchoring and regulation of integrin activation.</a> Protein Cell. 3, 434-440 (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+phosphoinositide+binding+to+kindlin-2+protein+pleckstrin+homology+domain+in+regulating+integrin+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural basis of phosphoinositide binding to kindlin-2 protein pleckstrin homology domain in regulating integrin activation.</a> J. Biol. Chem. 286, 43334-43342 (2011).</li>
<li>Zhao, Y., Chapman, D. A., Jones, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+baculovirus+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Improving baculovirus recombination.</a> Nucleic Acids Res. 31, (2003).</li>
<li>Berrow, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+ligation-independent+cloning+method+suitable+for+high-throughput+expression+screening+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications.</a> Nucleic Acids Res. 35, 45 (2007).</li>
<li>Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+production+of+proteins+in+insect+and+mammalian+cells+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology.</a> J Struct. Biol. 172, 55-65 Forthcoming.</li>
<li>Wasilko, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+titerless+infected-cells+preservation+and+scale-up+%28TIPS%29+method+for+large-scale+production+of+NO-sensitive+human+soluble+guanylate+cyclase+%28sGC%29+from+insect+cells+infected+with+recombinant+baculovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">The titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus.</a> Protein Expr. Purif. 65, 122-132 (2009).</li>
<li>Yates, L. A., Fleurdépine, S., Rissland, O. S., De Colibus, L., Harlos, K., Norbury, C. J., Gilbert, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+for+the+activity+of+a+cytoplasmic+RNA+terminal+uridylyl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural Basis for the activity of a cytoplasmic RNA terminal uridylyl transferase.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 782-787 (2012).</li>
<li>Sainsbury, S., Ren, J., Saunders, N. J., Stuart, D. I., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+CrgA%2C+a+LysR-type+transcriptional+regulator+from+pathogenic+Neisseria+meningitidis+MC58%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+F.+Struct.+Biol.+Cryst.+Commun%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray analysis of CrgA, a LysR-type transcriptional regulator from pathogenic Neisseria meningitidis MC58.</a> Acta Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 797-801 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell+adhesion+and+migration+by+Kindlin-3+cleavage+by+calpain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell adhesion and migration by Kindlin-3 cleavage by calpain.</a> J. Biol. Chem. 287, 40012-40020 Forthcoming.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Systemy ekspresji bakulowirusa stają się coraz bardziej popularne i stanowią ważne narzędzie do produkcji miligramowych ilości rekombinowanego białka do charakteryzowania białek za pomocą badań biofizycznych, w tym krystalografii rentgenowskiej. Pomimo tego, że są bardziej wymagające eksperymentalnie, systemy ekspresji bakulowirusa mają kilka zalet w porównaniu z E. coli , jedną z nich jest prawie natywne środowisko dla białek pochodzenia eukariotycznego , np. obecność odpowiednich białek opiekuńczych i możliwość modyfikacji potranslacyjnej. W naszych własnych wysiłkach na rzecz ekspresji kindlin-3 użyto alternatywnych gospodarzy ekspresji, w tym linii komórkowych ssaków i szczepów ekspresyjnych bakterii (niepublikowane obserwacje). Ogólnie rzecz biorąc, wiele testowanych szczepów E. coli wytwarzało bardzo małe ilości rekombinowanego kindlinu-3 (~0,5 mg/L hodowli; obserwacje niepublikowane). Jednak ekspresja sterowana przez bakulowirusa w komórkach owadów była szczególnie skuteczna i, w porównaniu z przejściową ekspresją w komórkach ssaków, bardziej podatna na generowanie dużej biomasy wymaganej do wyizolowania miligramów rekombinowanych białek cytoplazmatycznych (obserwacje niepublikowane). Spekulujemy, że obecność eukariotycznych białek opiekuńczych może pozwolić na wydajną produkcję kindlin-3.
Baculoviridae infekują komórki owadów, a do rekombinowanej ekspresji białek bakulowirus użyty w tej pracy jest oparty na wirusie polihedrozy jądrowej Autographa californica (AcNPV). W naturze AcNPV, który infekuje larwy owadów Autographa californica (lucerna nożycowata), wymaga białka polihedryny do tworzenia okluzji, w wyniku których wirony są zamknięte w krystalicznej matrycy białkowej, zapewniając w ten sposób niezbędną ochronę do ich uwalniania. W hodowanych komórkach tworzenie ciał okluzyjnych nie jest wymagane do replikacji i dlatego jest zbędne. W przypadku ekspresji obcych białek gen białka polihedryny może zostać zastąpiony rekombinowanym AcNPV genem białka będącego przedmiotem zainteresowania. AcNPV może infekować inne gatunki Lepidopteron i do celów rekombinowanej ekspresji białek stosuje się komórki jajnika Spodoptera frugiperda . W przedstawionym tutaj podejściu, bakmid AcNPV (BAC10) jest modyfikowany w taki sposób, że niezbędny gen wirusa, ORF1629, jest inaktywowany przez wprowadzenie acetylotransferazy chloramfenikolu, co prowadzi do nokautującego bakmidu (BAC10: KO1629), tak że nie jest on w stanie tworzyć zakaźnych bakulawirionów28. Kotransfekcja komórek Sf9 ze zlinearyzowanym BAC10: KO1629 i wektorem transferowym zawierającym FERMT3 naprawia nieaktywne ORF1629 poprzez transpozycję, w wyniku czego powstaje żywotny genom, który zawiera również gen FERMT3 pod kontrolą promotora polihedryny28.
Opisujemy protokół oczyszczania do izolacji wysoce czystego rekombinowanego mysiego kindlin-3 za pomocą trzyetapowego podejścia chromatograficznego. Metody zastosowane tutaj można z łatwością zastosować do innych białek znakowanych przez Hisa. Zastosowaliśmy etap wymiany jonowej w celu dalszego oczyszczenia kindlin-3, ale uważamy, że jest to kolejny etap pseudo-powinowactwa, ponieważ kindlin-3 posiada dużą liczbę podstawowych reszt, w tym rozciąganie polilizyny w domenie F1. Ponadto uważa się, że kindlin-3 wiąże się i oddziałuje z cytoplazmatyczną powierzchnią błony plazmatycznej, gdzie funkcjonuje, dlatego przewidujemy, że grupowanie podstawowych reszt pozwoli białku przeciwdziałać ujemnie naładowanej błonie.
opisane w protokołach oczyszczania są uważane za standardowe i są często stosowane w biologii strukturalnej. Test termofluorowy (ryc. 5) pokazuje, że kindlin-3 jest stabilny w większości warunków buforowych powyżej pH 6,0. Było to szczególnie przydatne i ważne dla informowania o naszych eksperymentach podczas badania interakcji ogona kinldin-3:β1A za pomocą NMR, która dała doskonałe widma przy pH 6,1 przy niskich stężeniach NaCl12.
Zanim będzie można przeprowadzić jakiekolwiek badanie biofizyczne, ważne jest, aby wykazać, że oczyszczone białko, które jest przedmiotem zainteresowania, jest rzeczywiście prawidłowo sfałdowane i jest funkcjonalnie aktywne. W poprzedniej publikacji wykazaliśmy, że rekombinowany kindlin-3 wyrażany i oczyszczany tą metodą był monomerem i monodyspersją w roztworze, co oceniano za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar, dynamicznego rozpraszania światła, analitycznego ultrawirowania i rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem, a także był zdolny do wiązania i rozpoznawania dystalnego NPxY błony i poprzedzającego klastra seryny / treoniny ogonów cytoplazmatycznych β1A 14, potwierdzając w ten sposób, że zachowuje się jak białko natywne, co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami komórkowymi i fizjologicznymi14,20,22. Zastosowanie testu stabilności termicznej jest dodatkowym sposobem sugerowania prawidłowego fałdowania białka będącego przedmiotem zainteresowania, ponieważ nieprawidłowo sfałdowane białko spowoduje tło o wysokiej fluorescencji z powodu odsłoniętych reszt hydrofobowych.
Rodzina białek kindlin znalazła się w centrum uwagi od czasu odkrycia ich nieoczekiwanej roli jako niezbędnych koaktywatorów integryn in vivo . Spowodowało to wiele wysiłku, aby wyrazić je rekombinacyjnie i rozwiązać ich struktury. Do tej pory odnotowano ograniczone sukcesy w ekspresji miligramowych ilości rekombinowanego białka o pełnej długości, ale tutaj opisaliśmy zastosowanie systemu bakulowirusa, który pozwala na ekspresję na dużą skalę na poziomach, na których możliwe stają się badania strukturalne. Spodziewamy się, że wytwarzając duże ilości rekombinowanego kindlinu-3, pomoże to w dalszych badaniach nad tym białkiem. Metoda oparta na bakulowirusie i opisany tutaj przepływ oczyszczania dla rekombinowanego mysiego kindlin-3 może być również wykorzystana do ekspresji i oczyszczania innych izoform kindlin, które są również trudne do ekspresji, a także posiadają odcinki polilizyny, i mogą być dalej przystosowane do innych białek cytoplazmatycznych, takich jak białka wiążące kwasy nukleinowe, które nie ulegają ekspresji w szczepach bakteryjnych.

Białka z rodziny kindlin są kluczowym składnikiem ogniskowego montażu adhezyjnego, a zatem niezbędnym dla złożonego życia. Kindliny, z których występują 3 izoformy u ssaków (kindlin-1, kindlin-2 i kindlin-3), są uważane za koaktywatory integryn receptorów zewnątrzkomórkowych wraz z taliną1. Adhezja komórkowa za pośrednictwem integryny łączy powierzchnię komórki z macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) u wyższych eukariontów. Jest to krytyczny i powszechny proces w wielu zjawiskach fizjologicznych, które obejmują integralność tkanek, embriogenezę, metabolizm kości, hemostazę i odporność. Adhezja komórkowa za pośrednictwem integryny jest aktywowana poprzez transdukcję sygnału od wewnątrz na zewnątrz poprzez wiązanie taliny i kindliny z ogonami cytoplazmatycznymi (CT) podjednostki integryny β w ich konserwatywnych motywach NPxY. Biomedyczne znaczenie białek kindlin rozciąga się jednak aż do jądra, gdzie w kilku ostatnich doniesieniach wykazano, że kindlin-2 bierze udział w kontroli transkrypcji2,3.
Kindlins to wielodomenowe białka o masie około 75 kDa, charakteryzujące się posiadaniem dwudzielnej C-końcowej domeny FERM (pasmo 4.1, ezryna, radixin, moesin), która jest przerywana przez domenę homologii pleckstrin (PH) w centrum jej subdomeny F24,5. Badania domen PH kindlin-2 i kindlin-3 wykazały, że wiąże się on z drugimi przekaźnikami lipidowymi fosfatydyloinozytolem-(3,4,5)-trifosforanem i fosfatydyloinozytolem-(4,5)-bisfosforanem6-8. Jednak badania domeny PH kindlin-1 pokazują, że wiąże się ona z PtdIns(3,4,5)P3 ze znacznie niższym powinowactwem, co można wytłumaczyć w kindlin-1 specyficznym dla izoformy mostkiem solnym, zapobiegającym wiązaniu lipidów9. Ponadto w domenie F1 kindlinów znajduje się pętla aminokwasowa ~100, która zgodnie z przewidywaniami zostanie rozwinięta, ale wiąże się z fosfatydyloseryną w wewnętrznej płatku błony komórkowej10,11. Domena FERM Kinklin jest uważana za homologiczną do domeny FERM talin, chociaż domena FERM talin nie posiada domeny homologii pleckstrin. Zarówno kindliny, jak i talin oddziałują z motywami NPxY na ogonach β integryny za pośrednictwem regionu F3 ich domeny FERM, ale kindlin wiąże się z motywem dystalnym błony, podczas gdy talin celuje w błonę proksymalną12-16. Kindlins i talin posiadają ponadto N-końcową domenę F0 z fałdem podobnym do ubikwityny, którego nie ma w innych białkach FERM11,17. Badania nad domeną F0 kindlin-2 wykazały, że niezależnie wiąże się ona z błonami wzbogaconymi fosfatydyloinozytolem-(4,5)-bisfosforanem17.
Kingliny wykazują specyficzne dla paralogu wzorce ekspresji tkanek i niezbędne funkcje fizjologiczne. Kindlin-1 ulega ekspresji przede wszystkim w naskórku, ale także w mniejszym stopniu w okrężnicy, żołądku i nerkach; Kinglina-2 ulega wszechobecnej ekspresji, ale jest skoncentrowany w mięśniach prążkowanych i gładkich i jest jedynym Kinglinem wyrażanym w rozwoju embrionalnym4; A Kinglina-3 ulega ekspresji w tkankach krwiotwórczych, przy czym najwyższe stężenie Kindlin-3 występuje w megakariocytach18. Jednak nowsze badania sugerują, że funkcjonalne białko ulega ekspresji również w tkankach śródbłonka19.
Kindlin-3 ma duże znaczenie medyczne ze względu na jego ważną rolę fizjologiczną we krwi. Ma to kluczowe znaczenie dla agregacji i rozprzestrzeniania się płytek krwi podczas tworzenia skrzepliny20, toczenia leukocytów w odpowiedzi na zakażenie i stan zapalny21,22 oraz tworzenia podocytów osteoklastów w resorpcji kości23. Ponadto wyczerpanie kindlin-3 u ludzi prowadzi do niedoboru adhezji leukocytów typu III - choroby charakteryzującej się zagrażającymi życiu zaburzeniami krzepnięcia i nawracającymi infekcjami bakteryjnymi20,24,25. Badania nokautujące Kindlin-3 na myszach ujawniły kluczową funkcję białka w adhezji komórek. Myszy KIND3-/- wykazują różne fenotypy, takie jak ciężkie krwawienie z powodu nieaktywnych integryn płytkowych, ciężka osteopetroza i upośledzona adhezja leukocytów20,22, przypominające objawy u ludzi pozbawionych kindlin-3.
Do tej pory dane strukturalne o wysokiej rozdzielczości na kindlinach były ograniczone do indywidualnych subdomen, takich jak domena homologii pleckstrin (PH) kindlin-19 i kindlin-226,27 oraz domena F0 kindlin-111 i kindlin-217. Większość subdomen każdego polipeptydu kindlin oparła się jednak klonowaniu i analizie strukturalnej (Yates i Gilbert, niepublikowane obserwacje), a badania białek o pełnej długości były utrudnione przez trudności w ekspresji i oczyszczaniu wystarczających ilości przy użyciu E. coli (niepublikowane obserwacje i Harburger i wsp.14). Istnieje znaczne zainteresowanie medyczne kindlin-3 i jego funkcją, wraz z pozostałymi dwoma członkami rodziny, a ostatnio wygenerowaliśmy miligramowe ilości tego leku przez rekombinowaną ekspresję w komórkach Spodoptera frugiperda napędzanych przez zakażenie bakulowirusem12. Dlatego opisujemy tutaj metody produkcji miligramowych ilości rekombinowanego mysiego kindlin-3 w hodowli komórek owadów, odpowiednie do rozległych badań strukturalnych i analizy biochemicznej.
W tym protokole używamy zaprojektowanego bakimdu nokautującego (BAC10KO:1629), który sam w sobie nie jest w stanie wyprodukować żywotnych wirionów28. DNA wirusa jest zatem ratowane przez rekombinację z wektorem transferowym, który w tym przypadku obejmuje również gen kindlin-3 (FERMT3) i powoduje, że gen FERMT3 zastępuje bardzo późny gen wirusa, który jest wysoce eksprymowany, ale zbędny, w wyniku czego powstaje rekombinowany wirus, który wyraża mysi kindlin-3 w ramach cyklu życiowego wirusa28. Zidentyfikowaliśmy tę metodę do produkcji kindlin-3 po tym, jak próby ekspresji i oczyszczenia go w innych gospodarzach ekspresji okazały się zbyt trudne (niepublikowane obserwacje), ale także ze względu na wszechstronność zestawu wektorów pPIN, którego użyliśmy do klonowania i który może zostać wdrożony w wielu gospodarzach ekspresji29.

<table><tbody><tr><td>Sf-900 II pożywka bez surowicy (SFM) 1x płyn</td><td>Life Technologies</td><td>10902-096</td><td>przechowywać w 4 stopniach; C i podgrzać do RT przed użyciem</td></tr><tr><td>Odczynnik Cellfectin II</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>Alternatywnie można użyć odczynnika do transfekcji GeneJuice (EMD)</td></tr><tr><td>Siarczan streptomycyny (stały)</td> <td>Melford</td><td>S0148</td><td>Filtr sterylizacyjny (0,22 &mu; m filtr) przed użyciem</td></tr><tr><td>Penicylina G, sól potasowa (stała)</td><td>Melford</td><td>P0580</td><td>Sterylizuj filtr (0,22 &mu; m filter) przed użyciem</td></tr><tr><td>CELLSTAR Sterylna 6-dołkowa płytka hodowlana</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10100-147</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma</td><td>P8849</td><td>Uwaga: Inhibitory proteazy rozpuszcza się w DMSO</td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza (Dnaza) z trzustki bydlęcej (Dnaza) I&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap FF (5 ml)</td><td>GE Heathcare</td><td>17-5286-01</td><td>Wymaga &Auml; kta FPLC</td></tr><tr><td>maszyna HiTrap Heparyna (5 ml)</td><td>GE Heathcare</td><td>17-0407-01</td><td>Wymaga &Auml; Maszyna kta FPLC</td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15 (z membraną Ultracel-50)</td><td>Milipora</td><td>UFC905024</td><td>pojemności 15 ml i MWCO koncentratora białek 50 kDa</td></tr></tbody></table>

wydajna produkcja i oczyszczanie rekombinowanego mysiego kindlin-3 z komórek owadów do badań biofizycznych

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins są niezbędnymi koaktywatorami, wraz z taliną, integryn receptorów na powierzchni komórki, a także uczestniczą w sygnalizacji zewnętrznej integracji i kontroli transkrypcji genów w jądrze komórkowym. Kingliny są białkami wielodomenowymi o masie ~75 kDa i wiążą się z motywem NPxY i klastrem T / S ogona cytoplazmatycznego podjednostki integryny β. Ważna hematopoetycznie izoforma kindliny, kindlin-3, ma kluczowe znaczenie dla agregacji płytek krwi podczas tworzenia skrzepliny, toczenia leukocytów w odpowiedzi na infekcję i stan zapalny oraz tworzenia podocytów osteoklastów w resorpcji kości. Rola Kindlin-3 w tych procesach zaowocowała szeroko zakrojonymi badaniami komórkowymi i fizjologicznymi. Istnieje jednak potrzeba opracowania skutecznej metody pozyskiwania wysokiej jakości miligramowych ilości białka do dalszych badań. Opracowaliśmy opisany tutaj protokół do efektywnej ekspresji i oczyszczania rekombinowanego mysiego kindlin-3 za pomocą systemu ekspresji opartego na bakulowirusie w komórkach Sf9, dających wystarczające ilości białka o pełnej długości o wysokiej czystości, aby umożliwić jego biofizyczną charakterystykę. To samo podejście można zastosować w badaniach nad innymi izoformami kindlin ssaków.

Wielkoskalowa ekspresja rekombinowanego białka kindlin-3 myszy przy użyciu zakażonych bakulowirusem komórek Sf9 pozwala na uzyskanie ilości miligramowych w czasie krótszym niż dwa tygodnie, co zilustrowano na schemacie Rysunek 1A, i wymaga jedynie niewielkiej ilości plazmidowego DNA, np. z zestawu QIAprep Miniprep. Generowanie rekombinowanego bakulowirusa odbywa się poprzez kotransfekcję komórek Sf9 plazmidem zawierającym mysi kindlin-3 (FERMT3) wraz z engineered liniowym bacmidem (BAC10:KO1629) oraz odzyskanie nowo powstałych wirionów po 5-7 dniach, jak pokazano na Rysunku 1A. Ta metoda generowania bakulowirusów prowadzi do uzyskania 100% wirusów rekombinowanych i w zasadzie eliminuje konieczność oczyszczania metodą plackową28,30. Reprezentatywna hodowla w małej skali (monowarstwa 2 ml) pozwoli na uzyskanie roztworu zawierającego wirusa rekombinowanego z oczekiwanym mianem wirusa wynoszącym 1 x 107 jednostek tworzących placki (pfu) na ml hodowli. Można przeprowadzić test plackowy w celu określenia rzeczywistego miana wirusa, jednak może to być zbyt pracochłonne w przypadku badania dużej liczby konstruktów do studiów strukturalnych. Sukces etapu generowania wirusa można ocenić, stosując równolegle plazmid zawierający eGFP lub, w przypadku tego konstruktu kindlin-3, monowarstwę Sf9 można resuspendować w PBS i ocenić za pomocą SDS-PAGE i western blotu, co zazwyczaj wykazuje wyraźny prążek odpowiadający białku z tagiem His o masie 75 kDa, jak pokazano na Rysunku 1B>. Wirus jest następnie amplifikowany w celu uzyskania ilości wystarczających do zakażenia komórek owadzich w dużej skali (objętości w litrach) i izolacji białka rekombinowanego. Wirus z drugiego pasażu (P2) jest generowany poprzez zakażenie hodowli zawiesinowych przy szacowanym MOI wynoszącym 0,1 (patrz protokół). Kluczowe jest, aby amplifikacyjna hodowla zawiesinowa Sf9 zajmowała jedynie jedną dwudziestą całkowitej objętości kolby. To dodatkowe napowietrzanie zapewnia, że uzyskane medium zawierające wirusa, odzyskane po 3 dniach (72 hr) od zakażenia, pozwoli na uzyskanie wystarczających ilości kindlin-3 w późniejszej hodowli ekspresyjnej. Przyjmuje się, że zamplifikowany zapas wirusa (P2) posiada oczekiwane miano wirusa 2 x 108 pfu/ml, opierając się na ostrożnym szacunku 100 pfu/komórkę przy gęstości komórkowej 2 x 106 komórka/ml podczas amplifikacji31. Zazwyczaj dla optymalnej amplifikacji bakulowirusa i produkcji białka komórki Sf9 powinny mieć jednolity rozmiar i kształt sferyczny, jak pokazano na Rysunku 1C. Ponadto amplifikacja wirusa i ekspresja białka są maksymalne w 72 hr po zakażeniu, a oba procesy są znacząco zredukowane w 96 hr po zakażeniu.
Po namnożeniu wirusa i wykorzystaniu go do zakażenia komórek Sf9 w eksperymentach na dużą skalę, rekombinowana kindlina-3 jest częściowo oczyszczana dzięki wprowadzonym do jej sekwencji C-końcowej znacznikom His.6-znacznik przy użyciu chromatografii powinowactwa do zimmobilizowanych jonów metali, jak pokazano w Rysunek 2Ważne jest, aby przeprowadzić oczyszczanie w 4 °C oraz upewniono się, że dodano wystarczającą ilość inhibitorów proteaz, aby zapobiec proteolizie. Częściowo oczyszczoną kindlinę-3 poddano dalszemu oczyszczaniu do stanu bliskiego homogenności za pomocą chromatografii wymiany jonowej (IEC) z użyciem kolumny heparynowej, jak pokazano w Rysunek 3Zastosowaliśmy kolumnę z heparyną zamiast konwencjonalnej kolumny wymiany jonowej, ponieważ przewidywaliśmy, że duża liczba reszt zasadowych, w tym odcinek poli-lizynowy w domenie F1 białka kindlin-3, będzie silnie oddziaływać z ujemnie naładowanymi grupami siarczanowymi kolumny. Strategia ta jest szczególnie przydatna w przypadku białek wiążących DNA i RNA z zasadowymi regionami wiążącymi kwasy nukleinowe, na przykład w przypadku wiążącej RNA terminalowej urydylylotransferazy Cid1.32W końcu czystość kindlin-3 jest „doszlifowana” za pomocą chromatografii wykluczania molekularnego w celu usunięcia agregatów i uzyskania homogeniczności, co przedstawiono w Rycina 4Bufory określone w protokołach to standardowe bufory często stosowane w oczyszczaniu białek do analiz strukturalnych. Zazwyczaj unika się buforów fosforanowych podczas oczyszczania białek do badań strukturalnych, zwłaszcza w przypadku przesiewania krystalizacji, ze względu na tworzenie się kryształów fosforanów w kroplach krystalizacyjnych (szczególnie w eksperymentach przy 4 °C). Przeprowadziliśmy jednak analizę przesunięcia termicznego w oparciu o metodę Thermofluor, aby określić, które bufory stabilizują kindlin-3, co przedstawiono w Rycina 5Krótko mówiąc, oczyszczony roztwór białka rozcieńcza się w buforach o różnych wartościach pH i stężeniach chlorku sodu, tworząc w ten sposób ekran dwuwymiarowy. Topnienie białka mierzy się poprzez obserwację fluorescencji barwnika Sypro orange (sond molekularnych), który wiąże się z resztami hydrofobowymi w rdzeniu sfałdowanego białka, w zakresie temperatur 20-95 °C (293-368 K). Średni punkt temperatury, w którym białko ulega rozfałdowaniu (temperatura przejścia, Tm) obliczono przy użyciu Monitor Opticon oprogramowania i został opisany w innym opracowaniu33Zaobserwowano, że Kindlin-3 pozostaje stabilna przy wysokich stężeniach chlorku sodu (500 mM) w zakresie pH 7,0–9,0, przy stałej temperaturze przejścia (Tm) z 55 °CZaobserwowano również, że Tm Kindlin-3 wynosiło w przybliżeniu 55 °C w zakresie pH 7,0–7,5, niezależnie od stężenia chlorku sodu.
Stwierdzono, że podczas oczyszczania następowała ograniczona proteoliza kindlin-3, jednak analiza SDS-PAGE wysoko skoncentrowanego białka (~15 mg/ml) wykazała niewielkie zanieczyszczenie dwoma dodatkowymi polipeptydami o tej samej intensywności. Co dziwne, chromatografia wykluczania wielkości nie wskazała na obecność dodatkowych gatunków, co pokazano na Rysunku 4. Przypuszcza się zatem, że białko uległo nacięciu przez proteazy, lecz pozostało zwinięte i hydrodynamicznie nieodróżnialne od białka o pełnej długości. Co ciekawe, kalpainy są znanymi proteazami, które rozszczepiają kindlin-3 w pozycji Tyrozyny 373, znajdującej się w pętli β1-β2 domeny homologii plekcstryny (PH)34, co może wyjaśniać nasze obserwacje. Ponadto western blotting wykazał, że jeden z dubletów polipeptydowych posiada His-tag na końcu C, a suma pozornych mas cząsteczkowych dubletu wynosi 75 kDa, czyli tyle samo, ile masa cząsteczkowa białka natywnego. Wydajność oczyszczonej rekombinowanej kindlin-3 na litr komórek Sf9 (~2 g masy komórek) wynosi w najlepszym przypadku 5 mg.
<img alt="Baculovirus protein production diagram, gel electrophoresis results, and Sf9 cells microscope image." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Rycina 1. Przegląd heterologicznej ekspresji białek w komórkach owadziech zainfekowanych bakulowirusami. (A) Schematyczny przegląd generowania bakulowirusa i ekspresji kindliny-3 w komórkach Sf9. Na schematach wektorów DNA 5'UTR/ORF603 zaznaczono kolorem czerwonym, ORF1629 kolorem zielonym, a gen białka docelowego (P.O.I.) kolorem niebieskim. (B) Western blot z użyciem przeciwciała anty-His6 przeciwciało, z sześciu kultur w małej skali (monowarstwa 2 ml) (ścieżki oznaczone zgodnie z kulturą) komórek Sf9 produkujących rekombinowany bakulowirusa oraz rekombinową mysią kindlinę-3. (C) Zdjęcie mikroskopowe (mikroskopia świetlna) zdrowych komórek Sf9 hodowanych w zawiesinie w pożywce Sf-900 II SFM z dodatkiem antybiotyków i przeniesionych do 35-milimetrowej płytki hodowlanej z dołkami (patrz protokół). Powiększenie obrazu wynosi 20X.
<img alt="Wynik oczyszczania białka metodą SDS-PAGE; gradient elucji imidazolem; markery masy cząsteczkowej." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Reprezentatywne oczyszczanie kindliny-3 za pomocą chromatografii powinowactwa do zimmobilizowanych jonów metali (IMAC). SDS-PAGE rekombinowanej mysiej kindliny-3 oczyszczonej za pomocą powinowactwa do niklu, wyekspresjonowanej w komórkach Sf9 zainfekowanych bakulowirusami (~2 g masy komórek). Zaadsorbowane białko eluowano przy użyciu gradientu imidazolu (przedstawionego nad żelem). Oznaczenia ścieżek są następujące: MW, marker masy cząsteczkowej; Lys, lizat całych komórek; FT, frakcja przepływowa (niezwiązana); WI, przemywanie 1; WII, przemywanie 2. Analiza Western blot (poniżej) została również przeprowadzona na frakcjach elucyjnych w celu potwierdzenia obecności wprowadzonej inżynieryjnie znacznikowej sekwencji His-tag na białku rekombinowanym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki chromatografii oczyszczania białka; wykres Abs\(_{280nm}\) i przewodności; analiza SDS-PAGE." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Reprezentatywne oczyszczanie kindlin-3 za pomocą chromatografii powinowactwa do heparyny. (A) Profil elucji obserwowany przy 280 nm (kolor niebieski) wykazujący pojedynczy symetryczny piki eluowany w liniowym gradiencie chlorku sodu (kolor zielony) w zakresie stężeń NaCl od 0,05-1,0 M. (B) Analiza SDS-PAGE frakcjonowanej elucji wykazująca obecność białka 75 kDa, kindlin-3 (oznaczonego jako K3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wynik chromatografii wykluczania rozmiarów; wykres absorbancji w funkcji objętości; analiza masy cząsteczkowej białka." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Rycina 4. Reprezentatywna chromatografia żelowa oraz skoncentrowana kindlina-3. (A) Profil elucji w chromatografii żelowej oczyszczonej kindliny-3 z użyciem Superdex S200 (16/60) w buforze Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl i 1 mM DTT w temperaturze 20 °C. Na podstawie objętości elucji kindlina-3 migruje zgodnie z oczekiwaniami dla białka o masie 75 kDa, co sugeruje, że występuje ona głównie w formie monomerycznej. (B) SDS-PAGE silnie skoncentrowanej, oczyszczonej rekombinowanej kindliny-3 o stężeniu 14.5 mg/ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza stabilności termicznej; Tm względem NaCl, pH; wpływ temperatury; wykres słupkowy; dane naukowe." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Analiza przesunięcia termicznego (Thermal Shift Assay) oparta na metodzie Thermofluor w celu screeningu buforów. Kindlin-3 rozcieńczono w różnych buforach obejmujących dwuwymiarowy screening pH względem stężenia chlorku sodu. Temperatury przejścia (punkty środkowe temperatury) obserwowano za pomocą fluorescencji barwnika wiążącego się hydrofobowo, Sypro orange (sondy molekularne), a obliczono przy użyciu oprogramowania Opticon Monitor. (A) Przedstawiono trójwymiarowy histogram temperatur przejścia wraz z (B) zmianą temperatury przejścia względem obliczonej średniej wynoszącej 50.4 °C. Dla przejrzystości słupki zostały pokolorowane zgodnie z zakresem odpowiadających im temperatur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig5highres.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Kindliny mają fundamentalne znaczenie dla adhezji komórek poprzez integryny, ale badania nad nimi były utrudnione z powodu trudności napotkanych podczas ich rekombinacyjnej ekspresji u gospodarzy bakteryjnych. Opisujemy tutaj metody ich efektywnej produkcji w komórkach owadów zakażonych bakulowirusem.

Wydajna produkcja i oczyszczanie rekombinowanego mysiego Kindlin-3 z komórek owadów do badań biofizycznych

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Ogólnym celem poniższych eksperymentów jest wydajne otrzymanie ilości miligramowych białka Kinlin 3 w kulturze komórek owadów, którego nie można wytworzyć w innych gospodarzach ekspresyjnych. Osiąga się to poprzez transdukcję wektora transferowego KINLIN 3 wraz z zmodyfikowanym wektorem baculowirusowym w celu stworzenia rekombinowanego baculowirusa niosącego gen KINLIN 3. W drugim kroku wirus jest amplifikowany w komórkach owadów, aby uzyskać wystarczającą liczbę wirionów do kolejnych etapów.Następnie zainfekowano komórki owadzie w celu produkcji dużych ilości białka Kinlin three, aby umożliwić jego oczyszczenie za pomocą szybkiej chromatografii cieczowej. Uzyskane wyniki, oparte na analizie SDS-PAGE oraz chromatografii wykluczania rozmiarów, wykazują, że funkcjonalne białko kinlin three o wysokiej czystości może być otrzymywane w ilościach wyrażonych w miligramach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ekspresja kinlin three w bakteriach, jest dziesięciokrotny wzrost wydajności białka rekombinowanego dzięki ekspresji w komórkach owadzich zainfekowanych wirusem baculovirus.Komórki SF nine do tej procedury są hodowane i utrzymywane w zawiesinie w pożywce SF 902 uzupełnionej o 100 µg/mL penicyliny oraz 100 µg/mL streptomycyny. W celu generowania wirusa baculovirus, komórki należy hodować do gęstości w zakresie od 5×10⁵ do 1×10⁶ komórek/mL. Aby przygotować komórki SF nine do transfekcji, należy wysiać około 1×10⁶ komórek na dołek sterylnej 6-dołkowej płytki do hodowli tkanek w 2 mL pożywki SF 902 z dodatkiem penicyliny i streptomycyny; pozostawić komórki SF nine na około 20 minut w temperaturze pokojowej w dygestorium, aby przylgnęły do dna plastikowych dołków i utworzyły monowarstwę. Generowanie rekombinowanego wirusa baculovirus osiąga się poprzez kotransfekcję plazmidowego DNA oraz DNA BMid na monowarstwy hodowli SF nine.Wektor ekspresyjny papine neuron firm T three zawiera mysi gen KINLIN three formy T three. Znajdując się pod kontrolą wirusowego promotora P 10 BAO, posiada flankujące sekwencje wirusowe bao, aby umożliwić rekombinację z back mid, i koduje C-terminalny znacznik hiss six dla późniejszego oczyszczania. Dla każdej transfekcji przygotowuje się od 1 do 2 µg oczyszczonego MFI T three z 0,5 µg oczyszczonego B mid i 100 µL SF 902 SFM bez antybiotyków. Jest to roztwór A. W oddzielnej probówce rozcieńcza się 6 µL odczynnika cell effect in two w 100 µL SF 902 SFM bez antybiotyków.W przypadku wielu transfekcji, w celu ograniczenia ilości operacji pipetowania, można przygotować roztwór główny (master mix) dla każdej reakcji. Jest to roztwór B. Należy zmieszać dwa roztwory, A i B, używając około 200 µl każdego z nich na jedną transfekcję, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut w celu sformowania kompleksów lipidowo-DNA. Po 20 minutach kompleksy lipidowo-DNA należy rozcieńczyć 800 µl SF 902 SFM bez antybiotyków na jedną transfekcję. Następnie należy ostrożnie odessać pożywkę z monowarstwy komórek SF 9, a po niej ostrożnie nanieść pipetą mieszaninę roztworu AB i pożywki na monowarstwę SF 9.Transfektowane komórki inkubuj w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 27 °C przez noc, aby zapewnić wilgotne środowisko zapobiegające wysychaniu komórek. Płytkę sześciodołkową umieść w plastikowym pojemniku z pokrywką wraz z wilgotnym ręcznikiem papierowym. Następnego dnia do każdej hodowli monowarstwowej dodaj dodatkowy 1 mL SF 900 w SFM bez antybiotyków i inkubuj komórki w temperaturze 27 °C przez kolejne pięć dni.Po pięciu dniach zebrać rekombinowany wirus bao bezpośrednio z pożywki hodowlanej i przenieść go do czystej probówki wirówkowej. Usunąć resztki komórek SF nine poprzez wirowanie przy 1000 Gs przez pięć minut. W temperaturze pokojowej przenieść wirusa, który znajduje się w otrzymanym nadłożu i jest oznaczony jako P1, do czystej probówki. Można przyjąć, że generacja wirusa P1 posiada oczekiwany miano wirusa na poziomie 1×10⁷ PFU/ml.Choć w razie potrzeby można przeprowadzić test plackowy SA, zapas wirusa P one należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsius w ciemności do momentu użycia. Komórki SF nine stosowane do amplifikacji rekombinowanego wirusa balo w zawiesinie powinny osiągnąć gęstość 1,4 × 10⁶ komórek na mililitr, a kultura powinna zajmować 1/20 całkowitej objętości kolby. Na przykład 50 ml w kolbie o pojemności dwóch litrów. Zazwyczaj dla optymalnej amplifikacji wirusa vao i produkcji białka komórki SF nine powinny być sferyczne i jednorodne pod względem wielkości.Zainfekuj hodowlę komórek SF nine zapasem wirusa P one, stosując wielokrotność infekcji (MOI) wynoszącą 0,1 zgodnie z poniższym wzorem. Inkubuj zainfekowaną kulturę owadów P one w temperaturze 27 °C przy wytrząsaniu z prędkością 100 RPM przez 72 godziny. Po trzech dniach odzyskaj wirusa, oddzielając komórki od medium poprzez wirowanie przy 1000 ×g przez pięć minut.W temperaturze pokojowej przenieś klarowane medium wzbogacone w wirusa do czystej probówki. Ten stok wirusa oznacza się jako P2, a przewidywany miano wirusa wynosi 2 × 10⁸ PFU/ml. Przechowuj ten stok wirusa w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu użycia, a otrzymane pellety komórkowe przechowuj w temperaturze -20 °C w celu późniejszego potwierdzenia produkcji wirusa rekombinowanego.Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyhodować odpowiednią objętość kultur komórek SF nine w zawiesinie w pożywce SF 902 s fm, uzupełnionej o 100 µg/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyny. Stosunek całkowitej objętości hodowli do objętości kolby powinien wynosić 1:5.Inkubować kultury zawiesinowe w temperaturze 27 °C przy wytrząsaniu z prędkością 100 RPM, aż osiągną gęstość komórkową rzędu 2 × 10⁶ komórek/ml. Gdy kultury SF9 osiągną gęstość 2 × 10⁶ komórek/ml, są gotowe do infekcji wirusem baculowirusa. Uzupełnić kultury tak, aby końcowe stężenie płodowej surowicy bydlęcej wynosiło 1%, a następnie dodać zapas wirusa P2.Aby uzyskać MOI równą 1, inkubować zainfekowane kultury w temperaturze 27°C przy wytrząsaniu z prędkością 100 RPM. 72 godziny po infekcji zebrać komórki SF9 wykazujące ekspresję rekombinowanego białka lin-3 z poli-histydynowym znacznikiem poprzez wirowanie przy 1000 ×g przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Otrzymany osad komórkowy przechowywać w temperaturze -20°C do czasu użycia lub w temperaturze -80°C w przypadku przechowywania długoterminowego. Niniejsza procedura rozpoczyna się od rozmrażania na lodzie.Zamrożone pellety komórek SF nine zainfekowanych wirusem vao, wykazujących ekspresję rekombinowanego kinlinu 3, resuspenderowano w buforze lizującym. Po inkubacji resuspenderowanych komórek w buforze lizującym przez 5 do 10 minut, próbkę mieszano w wstrząsarzu wirowym (vortex) do uzyskania homogenicznej zawiesiny w celu dalszej dysrupcji komórek. Próbkę poddano sonikacji w łaźni lodowej.Oczyszczono lizat poprzez wirowanie przy 48 000 GS przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Uzyskany nadsącz naniesiono na kolumnę hist trap o objętości pięciu mililitrów, uprzednio równoważoną buforem do lizy w temperaturze czterech stopni Celsjusza, z przepływem jeden mililitr na minutę. Kolejne etapy elucji białka, wymiany buforu oraz zagęszczania białka nie zostaną tutaj przedstawione, lecz są szczegółowo opisane w towarzyszącym manuskrypcie.Po otrzymaniu roztworu białka po wymianie buforu, należy go nanieść na uprzednio równoważoną kolumnę HiTrap Heparin HP o objętości 5 ml, korzystając z systemu ACTA FPLC przy szybkości przepływu 0,5 ml/min. Związane białko KINLIN 3 eluje przy użyciu liniowego gradientu chlorku sodu w tym samym buforze, zwiększanego w tempie 10 mM/ml. Przewiduje się, że KINLIN 3 eluje przy stężeniu chlorku sodu wynoszącym około 0,6 M. Po zagęszczeniu białka ostatnim krokiem jest wymiana buforu za pomocą chromatografii wykluczania rozmiarowego; oczyszczone białko nanosi się na kolumnę Superdex 200 10/300 GL, a następnie oczyszcza białka według rozmiaru, aplikując bufor na kolumnę z szybkością 0,5 ml/min.Białko eluowane z kolumny jest frakcjonowane i monitorowane przy użyciu absorbancji przy 280 nanometrach. Powodzenie generacji wirusa rekombinowanego zweryfikowano poprzez ocenę obecności rekombinowanego Kinlin 3 w komórkach SF9 poddanych transfekcji za pomocą SDS-PAGE i analizy Western, co przedstawiono na tym reprezentatywnym obrazie Western blot z sześciu małoskalowych kultur SF9 z użyciem przeciwciała anty-His6. Wyraźny prążek odpowiadający białku z tagiem His o masie 75 kilodaltonów był widoczny w każdej próbce po tym, jak wirus został namnożony i wykorzystany do zakażenia komórek SF9 w eksperymentach na dużą skalę. Rekombinowany KINLIN 3 został częściowo oczyszczony za pomocą chromatografii powinowactwa do zimmobilizowanych jonów metali.Główny obraz żelu na tej rycinie przedstawia elektroforezę SDS-PAGE rekombinowanego mysiego kinlinu 3 oczyszczonego metodą powinowactwa do niklu, wyrażonego w komórkach SF nine zainfekowanych wirusem BAO; zaabsorbowane białko eluowano przy użyciu gradientu imidazolu przedstawionego nad obrazem żelu. MW oznacza marker masy cząsteczkowej, LYS to lizat całych komórek, FT to frakcja przepływowa (flow-through), WI to pierwsze płukanie, a WII to drugie płukanie. Przeprowadzono również analizę Western blot z wykorzystaniem frakcji elucyjnych, aby potwierdzić obecność wprowadzonego znacznika His na białku rekombinowanym.Następnie częściowo oczyszczony białko KINLIN three poddano dalszemu oczyszczaniu do poziomu niemal pełnej homogeniczności za pomocą chromatografii wymiany jonowej z użyciem kolumny z heparyną. Ten panel przedstawia profil elucji obserwowany przy 280 nanometrach (kolor niebieski), wykazujący pojedynczy symetryczny pik eluujący w liniowym gradiencie chlorku sodu (kolor zielony), w zakresie stężeń chlorku sodu od 0,05 molar do 1,0 molar. Dolny panel przedstawia wyniki analizy SDS-PAGE frakcjonowanej elucji, potwierdzające obecność białka Kinlin three o masie 75 kilodalton.W końcowym etapie czystość białka KINLIN three została dopracowana za pomocą chromatografii wykluczania cząsteczkowego w celu usunięcia agregatów i uzyskania homogeniczności. Przedstawiony profil elucji z filtracji żelowej dotyczy oczyszczonego białka Kinlin three z zastosowaniem kolumny SUEx S 200 w buforze Tris HCL pH 7.5 zawierającym 150 mM NaCl i 1 mM DTT w temperaturze 20 °C. Na podstawie objętości elucji KINLIN three migruje zgodnie z oczekiwaniami dla białka o masie 75 kDa, co sugeruje, że występuje ono głównie w formie monomeru.Kolejna rycina przedstawia wyniki elektroforezy SDS-PAGE silnie skoncentrowanego oczyszczonego rekombinowanego kinlinu 3, oznaczonego jako K3, w stężeniu 14,5 mg/ml. Produkcja miligramowych ilości pełnowymiarowego mysiego kinlinu 3 o wysokiej czystości w hodowli komórek owadzich umożliwi przeprowadzenie szeroko zakrojonych badań strukturalnych oraz analizy biochemicznej białka. W badaniu tym wykonano również analizę przesunięcia termicznego opartą na urządzeniu ThermoFluor, aby określić, które bufory stabilizują kinlin 3.Białko KINLIN three rozcieńczono w różnych buforach, tworząc dwuwymiarowy screening zależności pH od stężenia chlorku sodu. Górny panel przedstawia histogram 3D temperatur przejścia, a dolny panel pokazuje zmianę temperatury przejścia względem obliczonej średniej wynoszącej 50.4 °C. Słupki zostały pokolorowane zgodnie z zakresem temperatur, którym odpowiadają.Zaobserwowano, że KINLIN three wykazuje stabilność przy wysokich stężeniach chlorku sodu w zakresie pH od 7,0 do 9,0, z niezmienną temperaturą przejścia wynoszącą 55 °C. Zaobserwowano również, że temperatura przejścia Kinlin three wynosiła około 55 °C w zakresie pH od 7,0 do 7,5, niezależnie od stężenia chlorku sodu.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak otrzymywać wysokiej czystości, funkcjonalne białka rekombinowane do szczegółowej charakterystyki biofizycznej i dalszych badań. Podobne podejścia można zastosować w przypadku innych trudnych do przygotowania próbek białek i zalecamy ich stosowanie w takich sytuacjach.

efficient-production-purification-recombinant-murine-kindlin-3-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Skuteczne produkowanie i oczyszczanie rekombinantowego muryny Kindlin-3 z komórek owadów do badań biofizycznych

Metoda przygotowania komórek owadzie i zakażania ich bakulowirusem w celu produkcji rekombinowanego białka mCD1d oraz generowania tetramerów mCD1d.

Metoda produkcji rekombinowanego białka mCD1d w komórkach owadzych.

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Film wyjaśnia proces wytwarzania przeciwciał w komórkach gospodarza ssaków, od ekspresji genów do wydzielania. Obejmuje transkrypcję, translację, rozpoznawanie sygnału, prawidłowe fałdowanie i ostateczne uwolnienie do ośrodka zewnątrzkomórkowego przez pęcherzyki wydzielnicze.

Produkcja i oczyszczanie rekombinowanych przeciwciał z komórek ssaków

Ekspresja białek rekombinowanych przez systemy ssaków staje się atrakcyjną metodą wytwarzania kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej. W tym artykule przedstawiamy prosty, ale bardzo wydajny system ekspresji wykorzystujący hodowane w zawiesinie komórki ssaków do oczyszczania kompleksów białkowych do badań strukturalnych.

Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

To jest szybki, efektywny kosztowo protokół produkcji wydzielanych, glikozylowanych białek ssaków i późniejszego jednoetapowego oczyszczania z wystarczającą wydajnością jednorodnego białka do krystalografii rentgenowskiej i innych badań biofizycznych.

Wydajna ekspresja komórek ssaków i jednoetapowe oczyszczanie zewnątrzkomórkowych glikoprotein do krystalizacji

Kinaza IκB 1/α (IKK1/α CHUK) to kinaza białkowa Ser/Thr, która bierze udział w niezliczonych aktywnościach komórkowych, głównie poprzez aktywację czynników transkrypcyjnych NF-κB. W tym miejscu opisujemy główne etapy niezbędne do produkcji i określenia struktury krystalicznej tego białka.

Przewodnik po produkcji, krystalizacji i określaniu struktury ludzkiego IKK1/α

Tutaj prezentujemy protokół masowej produkcji mysich komórek NK wyciszających geny za pomocą systemu różnicowania bez karmienia do mechanistycznych badań in vitro i in vivo.

Nowatorski system bez podajnika do masowej produkcji mysich komórek NK in vitro

Rekombinowany BDNF zawierający sekwencję Avi (BDNFAvi) jest wytwarzany w komórkach HEK293 w opłacalny sposób i oczyszczany przez chromatografię powinowactwa. BDNFavi jest następnie bezpośrednio monobiotynylowany enzymem BirA w probówce. BDNFavi i monobiotynylowany BDNFavi zachowują swoją aktywność biologiczną w porównaniu z dostępnym na rynku BDNF.

Ulepszony protokół oczyszczania i bezpośredniego monobiotynylowania rekombinowanego BDNF w probówce do badań nad transportem komórkowym w neuronach

Oczyszczanie, dializa i aktywacja znacznika his-tag są stosowane w celu zwiększenia wydajności rozpuszczalnej, aktywnej metaloproteinazy-3 domeny katalitycznej ekspresji białka u bakterii. Frakcje białkowe są analizowane za pomocą żeli SDS-PAGE.

Bakteryjna ekspresja i oczyszczanie metaloproteinazy ludzkiej macierzy-3 za pomocą chromatografii powinowactwa

Protokół ten opisuje produkcję rekombinowanej ludzkiej rybonukleazy SLFN14 oraz jej stechiometryczną analizę za pomocą fotometrii masowej.<br...

Szybka produkcja rekombinowanego rybonukleazy SLFN14 u człowieka oraz analiza stechiometryczna za pomocą fotometrii masowej

Poznaj metodę wydajnej produkcji rekombinowanego mysiego Kindlin-3 w komórkach owadów przy użyciu wirusa baculowirusowego. Technika ta zwiększa wydajność dziesięciokrotnie w porównaniu z systemami bakteryjnymi.

Wydajna produkcja i oczyszczanie rekombinowanego mysiego Kindlin-3 z komórek owadów do badań biofizycznych

Przeglądaj więcej filmów