Wydajna produkcja i oczyszczanie rekombinowanego mysiego Kindlin-3 z komórek owadów do badań biofizycznych

Ogólnym celem poniższych eksperymentów jest efektywne wytwarzanie miligramowych ilości trójki Miran Kinlin i hodowli komórek owadów, których nie można wytworzyć w innych gospodarzach ekspresyjnych. Osiąga się to poprzez transektację COT, wektora przenoszenia trzech KINLIN wraz z zmodyfikowanym wirusem bao w połowie w celu stworzenia rekombinowanego wirusa bao przenoszącego gen KINLIN trzy. W drugim etapie wirus jest amplifikowany w komórkach owadów w celu wytworzenia wystarczającej ilości wirionów na przyszłe etapy.

Następnie komórki owadów są infekowane w celu wytworzenia dużych ilości białka Kinlin three, aby umożliwić nam oczyszczenie za pomocą szybkiej chromatografii cieczowej. Uzyskano wyniki, które pokazują, że funkcjonalny kinlin trzy o wysokiej czystości może być wytwarzany w ilościach miligramowych na podstawie analizy strony SDS i chromatografii wykluczania wielkości. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak rozpalanie ekspresji trzech u bakterii, jest to, że ekspresja komórek owadów zakażonych wirusem plamki żółtej zwiększa wydajność rekombinowanego białka dziesięciokrotnie.

Dziewięć komórek SF do tej procedury jest hodowanych i utrzymywanych w zawiesinie przy użyciu pożywki SF 902 uzupełnionej 100 mikrogramami na mililitr penicyliny i 100 mikrogramami na mililitr streptomycyny. W celu wytworzenia wirusa bao komórki powinny być hodowane w zakresie gęstości od pięciu razy 10 do pięciu do jednego razy 10 do sześciu komórek na mililitr. Aby przygotować dziewięć komórek SF do transfekcji, zobacz około 1 razy 10 do sześciu komórek na studzienkę sterylnej sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej w dwóch mililitrach pożywki SF 902 uzupełnionej penicyliną i streptomycyną, pozostawić dziewięć komórek SF na około 20 minut w temperaturze pokojowej w dygestorium, aby przylegały do podstawy studzienek z tworzywa sztucznego i w ten sposób uzyskuje się jednowarstwowe wytwarzanie rekombinowanego wirusa balo przez transektację plazmidu, DNA i DNA BMid na monowarstwową kulturę SF 9.

Wektor ekspresji neuron papinowy firmy T trzy ma mysz KINLIN trzy gen firmy T trzy. Pod kontrolą promotora wirusa P 10 BAO posiada flankujące sekwencje wirusa bao, aby umożliwić rekombinację z tylnym środkiem i koduje końcowy C syczący znacznik sześć do dalszego oczyszczania dla każdej transfekcji, co daje od jednego do dwóch mikrogramów oczyszczonego MFI T trzy z 0,5 mikrograma oczyszczonego B mid i 100 mikrolitrów SF 902 SFM bez antybiotyków. Jest to roztwór A w osobnej probówce, rozcieńczyć sześć mikrolitrów efektu komórkowego w dwóch odczynnikach ze 100 mikrolitrami SF 902 SFM bez antybiotyków.

Dla każdej reakcji transfekcji można w tym miejscu utworzyć mieszankę wzorcową w celu ograniczenia obsługi cieczy, jeśli wymagana jest duża liczba transfekcji. To jest roztwór B. Wymieszać dwa roztwory A i B, używając około 200 mikrolitrów każdego na transfekcję i inkubowaną temperaturę pokojową przez 20 minut, aby utworzyć kompleksy lipidowego DNA po 20 minutach, rozcieńczyć kompleksy lipidowego DNA 800 mikrolitrami na transfekcję SF 902 SFM bez antybiotyków. Następnie ostrożnie odessać dziewięciokomórkowe podłoże jednowarstwowe SF i ostrożnie pipetować roztwór AB i mieszaninę pożywki na wierzchu dziewięciowarstwowej pożywki SF.

Inkubuj transfekowane komórki w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 27 stopni Celsjusza przez noc, aby stworzyć wilgotne środowisko, aby zapobiec wysychaniu komórek. Umieść naczynie z sześcioma dołkami w plastikowym, oświetlonym pojemniku obok wilgotnego ręcznika papierowego. Następnego dnia dodaj dodatkowy jeden mililitr SF 900 do SFM bez antybiotyków Do każdej kultury jednowarstwowej inkubuj komórki w temperaturze 27 stopni Celsjusza przez kolejne pięć dni.

Po pięciu dniach zebrać rekombinowanego wirusa bao bezpośrednio z pożywki hodowlanej i przenieść go do czystej probówki wirówkowej. Sklarować wszelkie szczątki dziewięciu komórek SF przez odwirowanie w temperaturze 1000 G przez pięć minut. W temperaturze pokojowej można założyć, że wirus, który znajduje się w powstałych supernazwach i jest oznaczony jako P jeden, do czystej probówki P jednej generacji wirusa, ma oczekiwane miano wirusa od jednego razy 10 do siedmiu PFU na mililitr.

Chociaż w razie potrzeby można wykonać płytkę nazębną SA, należy przechowywać zapas wirusa P one w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności, aż do użycia dziewięć komórek SF używanych do amplifikacji rekombinowanego wirusa balo w zawiesinie powinno mieć gęstość 1,4 razy 10 do sześciu komórek na mililitr, a hodowla powinna zajmować jedną 20 całkowitej objętości kolby. Na przykład 50 mililitrów w dwulitrowej kolbie. Ogólnie rzecz biorąc, dla optymalnej amplifikacji wirusa vao i produkcji białka, dziewiątka komórek SF powinna być jednolita pod względem wielkości i kulista.

Zakażoną hodowlę dziewięciu komórek SF zapasem wirusa P one przy wielokrotności infekcji lub MOI 0,1 przy użyciu następującego wzoru. Inkubować kulturę owadów zakażonych P one w temperaturze 27 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 100 obr./min przez 72 godziny. Trzy dni później należy zebrać wirusa, oddzielając komórki od pożywki przez wirowanie w temperaturze 1000 g przez pięć minut.

Przy przenoszeniu w temperaturze pokojowej oczyszczony wirus wzbogacił pożywkę do czystej probówki. Ten szczep wirusa jest oznaczony jako P dwa, a przewidywane miano wirusa wynosi dwa razy 10 do ośmiu PFU na mililitr. Przechowuj ten zapas wirusa w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności do momentu użycia, zachowaj powstałe granulki komórek w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w celu późniejszego potwierdzenia produkcji rekombinowanego wirusa.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyhodować odpowiednią objętość dziewięciu kultur komórkowych SF w zawiesinie i SF 902 s fm. Uzupełnione 100 mikrogramami na mililitr penicyliny i 100 mikrogramów na mililitr streptomycyny. Stosunek całkowitej objętości kultury do objętości kolby powinien wynosić od jednego do pięciu.

Inkubować kultury zawiesinowe w temperaturze 27 stopni Celsjusza, wytrząsając przy 100 obr./min, aż osiągną gęstość komórek dwa razy 10 do sześciu komórek na mililitr. Kiedy dziewięć kultur SF ma gęstość dwa razy 10 do sześciu komórek na mililitr, są gotowe na infekcję wirusem balo. Uzupełnij kultury końcowym stężeniem 1% płodowej surowicy bydlęcej, a następnie szczepem wirusa P dwa.

Aby uzyskać MOI jednego inkubować zakażone kultury w temperaturze 27 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 100 obr./min 72 godziny po zakażeniu, zebrać rekombinowaną polihistaminę oznaczoną lin trzy z ekspresją SF dziewięć komórek przez wirowanie w temperaturze 1000 GS przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Powstałe osady komórkowe należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia lub w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza w przypadku długotrwałego przechowywania. Ta procedura rozpoczyna się od rozmrożenia na lodzie.

Zamrożone granulki wirusa vao zainfekowały SF 9 z ekspresją rekombinowanej kinliny 3 i Resus zawieszające granulki z buforem do lizy. Po inkubacji zawieszonych komórek z buforem do lizy przez pięć do 10 minut, wirować, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny resus w celu dalszego rozbijania komórek. Sonikować próbkę w łaźni lodowej.

Klarować lizat przez odwirowanie w temperaturze 48 000 GS przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Załaduj powstałe supernazwy do kolumny pułapki hist o objętości pięciu mililitrów, wstępnie zrównoważonej buforem do lizy w temperaturze czterech stopni Celsjusza z szybkością jednego mililitra na minutę. Kolejne etapy wymiany buforu elucji białek i koncentracji białka nie zostaną tutaj zademonstrowane, ale są szczegółowo opisane w załączonym manuskrypcie.

Po uzyskaniu roztworu białka wymiany buforowej nałóż go na wstępnie zrównoważoną kolumnę HP heparyny o objętości pięciu mililitrów i wysokiej pułapce, używając ACTA FPLC z szybkością 0,5 mililitra na minutę. Związany KINLIN trzy jest oznaczany za pomocą liniowego gradientu chlorku sodu w tym samym buforze, zwiększającego się z szybkością 10 milimoli na mililitr rekombinowanych znaczników histaminy. Oczekuje się, że KINLIN trzeci wymyje się przy około 0,6 molowym chlorku sodu po zagęszczeniu białka, ostatnim krokiem jest wymiana buforowa białka za pomocą chromatografii wykluczania wielkości, nałożenie oczyszczonego białka na kolumnę SUEx S 210 30, oczyszczenie białek zgodnie z wielkością poprzez nałożenie buforu na kolumnę z szybkością 0,5 mililitra na minutę.

Białko pochodzące z kolumny jest frakcjonowane i monitorowane przy użyciu absorbentu o długości 280 nanometrów. Sukces generacji rekombinowanego wirusa zweryfikowano, oceniając obecność rekombinowanych trzech komórek Kinlina i dziewięciu komórek COT TRANSFECTED SF za pomocą strony SDS i zachodniej analizy, jak widać w tej reprezentatywnej zachodniej krwi sześciu małych kultur SF dziewięciu przy użyciu przeciwciała anty hiss six, Wyraźny prążek odpowiadający białku znakowanemu sykiem o mocy 75 kilodaltonów był widoczny w każdej próbce, gdy wirus został amplifikowany i wykorzystany do zakażenia SF dziewięć komórek w eksperymentach na dużą skalę. Rekombinowany KINLIN three został częściowo oczyszczony za pomocą unieruchomionej chromatografii powinowactwa do metalu.

Główny obraz żelu na tym rysunku przedstawia stronę SDS oczyszczonej rekombinowanej mysiej kinliny o powinowactwie do niklu, wyrażonej w zakażonym wirusem BAO dziewięciu wchłoniętych komórkach SF, nawiązano do gradientu ole pokazanego powyżej obrazu żelu. MW oznacza marker masy cząsteczkowej, LYS to lizat całej komórki, FT to przepływ przez WI to mycie pierwsze, a WII to płukanie drugie. Przeprowadzono również analizę Western blot przy użyciu frakcji elucyjnych, aby potwierdzić obecność zmodyfikowanego znacznika na rekombinowanym białku.

Następnie częściowo oczyszczony KINLIN 3 został następnie oczyszczony do prawie jednorodności za pomocą chromatografii jonowymiennej przy użyciu kolumny heparyny. Ten panel pokazuje profil eluzyjny obserwowany w 280 nanometrach na niebiesko, pokazując pojedynczy symetryczny pik wymykający się pod liniowym gradientem chlorku sodu wskazanym na zielono, przy użyciu zakresu stężeń chlorku sodu od 0,05 mola do 1,0 mola. Dolny panel przedstawia wyniki analizy frakcjonowanej elucji na stronie SDS, wykazujące obecność 75-kilodaltonowego białka Kinlin trzy.

Ostatnim etapem było wypolerowanie czystości trzech KINLIN za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość w celu usunięcia agregatów i uzyskania jednorodności. Ten reprezentatywny profil wyjaśniający filtrację żelową składa się z oczyszczonego Kinlina trzy przy użyciu SUEx S 200 w Tris HCL pH 7,5, 150 milimolowym chlorku sodu i jednym milimolowym DTT w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Opierając się na objętości elucji, KINLIN three migruje zgodnie z oczekiwaniami dla białka o mocy 75 kilodaltonów, co sugeruje, że jest ono głównie monomeryczne.

Następny rysunek przedstawia wyniki ze strony SDS wysoce skoncentrowanej, oczyszczonej rekombinowanej chinliny trzy oznaczonej K trzy w stężeniu 14,5 miligrama na mililitr. Produkcja miligramowych ilości mysiego kinlinu trzy o pełnej czystości i hodowli komórek owadów pozwoli na szeroko zakrojone badania strukturalne i analizę biochemiczną białka. W tym badaniu przeprowadzono również test przesunięcia termicznego oparty na podłodze termicznej w celu określenia, które stabilizują się dla KINLIN trzy.

KINLIN 3 rozcieńczono do różnych, zawierających dwuwymiarowy ekran pH w funkcji stężenia chlorku sodu. Górny panel to histogram 3D temperatur przejścia, a dolny panel pokazuje zmianę temperatury przejścia od obliczonej średniej 50,4 stopnia Celsjusza. Paski są pokolorowane zgodnie z zakresem temperatur, którym odpowiadają.

Zaobserwowano, że KINLIN 3 jest stabilny przy wysokich stężeniach chlorku sodu w zakresie PA od 7,0 do 9,0 przy stałej temperaturze przejścia 55 stopni Celsjusza. Zaobserwowano również, że temperatura przejścia Kinlin 3 wynosiła około 55 stopni Celsjusza w zakresie PA od 7,0 do 7,5. Niezależnie od stężenia chlorku sodu.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak produkować wysoce czystą funkcjonalną rekombinowaną rozpałkę. Trzy do dogłębnej charakterystyki biofizycznej i dalszych badań. Podobne podejście można zastosować w przypadku innych trudnych do przygotowania próbek białka i zalecamy jego zastosowanie w takich przypadkach.