Name: Badania przesiewowe przeciwciał przeciwjądrowych przy użyciu komórek HEp-2 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-23T18:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: Poznaj metodę pośredniej immunofluorescencji do wykrywania przeciwciał przeciwjądrowych w surowicy pacjenta przy użyciu komórek HEp-2. Technika ta wspiera diagnostykę chorób tkanki łącznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Cassandrze Bryant za przeprowadzenie eksperymentu IIF i Carol Buchner za jej ekspercki przegląd techniczny.

1. Przygotowanie próbki i wybór podłoża
<ol>
	<li>Wyjmij odczynniki z opakowania i pozwól, aby każdy przedmiot osiągnął temperaturę pokojową. Przygotować odczynniki i rozcieńczyć surowice pacjenta zgodnie z ulotką kierunkową. Uwaga: Szkiełka NOVA Lite są oznaczone kodami kreskowymi i można je łatwo zintegrować z automatycznymi systemami w połączeniu z laboratoryjnym systemem informacyjnym LIS. Ta procedura ilustruje ręczne przetwarzanie slajdów; Laboratoria o wysokiej przepustowości mogą jednak zdecydować się na zautomatyzowane urządzenia do obróbki szkiełek.</li>
</ol>
2. Dodawanie kontroli i próbek
<ol>
	<li>Dozować 1 kroplę kontroli dodatniej i 1 kroplę kontroli ujemnej do odpowiednich studzienek szkiełkowych. Odpipetować 20-25 μl rozcieńczonej surowicy pacjenta do pozostałych studzienek. Przetwarzaj jeden slajd na raz.</li>
	<li>Umieść szkiełko (szkiełka) w pojemniku do barwienia z wilgotnym ręcznikiem papierowym na dnie. Przykryj pojemnik i inkubuj szkiełko (szkiełka) przez 30 minut. Uwaga: Wilgotne warunki zapobiegną wysychaniu podłoża. Wysuszenie studzienek może spowodować sztuczne przebarwienia. Podczas tego okresu inkubacji przeciwciała przeciwjądrowe w surowicy pacjenta będą wiązać się z antygenami komórek, które są przymocowane do każdej studzienki.</li>
	<li>Po okresie inkubacji spłukać surowicę delikatnym strumieniem buforu do płukania. Aby uniknąć uszkodzenia podłoża i zapobiec przenikaniu próbek między studzienkami, należy lekko pochylić szkiełko, aby uniknąć kierowania strumienia bezpośrednio na studzienki. Strząśnij nadmiar buforu do płukania i umieść szkiełko w słoiku Coplin zawierającym bufor do płukania na około 5 minut.</li>
</ol>
3. Dodawanie koniugatu fluorescencyjnego
<ol>
	<li>Jeden po drugim wyjmij szkiełka z bufora myjącego i delikatnie postukaj, aby usunąć nadmiar bufora do mycia. Nałóż 1 kroplę koniugatu fluorescencyjnego (znakowanego FITC anty-ludzkiego IgG) na każdą studzienkę. Inkubuj szkiełka przez 30 minut w nawilżonym pojemniku i pamiętaj o założeniu pokrywy pojemnika do barwienia. Uwaga: Do badania ANA zaleca się stosowanie koniugatu specyficznego dla IgG Fc. Koniugat jest wrażliwy na światło, a osłona chroni szkiełka przed ekspozycją na światło, a także utrzymuje wilgotne środowisko. Podczas tego okresu inkubacji koniugat zwiąże się z przeciwciałami przeciwjądrowymi pacjenta, które związały się z antygenami komórkowymi. To sprzężone wiązanie powoduje obecność fluorescencji w studzienkach.</li>
	<li>Opłucz i umyj szkiełko w sposób opisany powyżej.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na ręczniku papierowym i nałóż medium mocujące w linii ciągłej na dolną krawędź szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Wyjmij każdy szkiełko z bufora myjącego i delikatnie postukaj w szkiełko, aby usunąć nadmiar buforu do płukania. Przyłóż dolną krawędź szkiełka do krawędzi szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Delikatnie opuścić szkiełko nakrywkowe na szkiełko nakrywkowe w taki sposób, aby medium mocujące na szkiełku nakrywkowym spływało do górnej krawędzi szkiełka bez tworzenia się pęcherzyków powietrza. Uwaga: Szkiełko nakrywkowe, w tym użycie optymalnej ilości medium montażowego, jest techniką, której doskonalenie wymaga praktyki.</li>
</ol>
4. Identyfikacja pozytywnych i negatywnych wyników
Interpretacja manualna
<ol>
	<li>Obejrzyj szkiełka z mikroskopem fluorescencyjnym, umieszczonym w ciemnym pomieszczeniu. Wykonaj skanowanie całej studzienki za pomocą obiektywu 20X lub 25X, aby ocenić rozmieszczenie komórek i jednorodność fluorescencji</li>
	<li>Przełącz się na obiektyw 40X, aby dokonać ostatecznej interpretacji dotyczącej pozytywności i wzorca.</li>
	<li>Spójrz na kontrole pozytywne i negatywne. Oceń pozytywność za pomocą skali oceny reaktywności od 1+ do 4+. Uwaga: Kontrola ujemna może nie wydawać się całkowicie ciemna, ale często wykazuje niski poziom niespecyficznej fluorescencji. Kontrola pozytywna wykaże jasnozieloną fluorescencję jabłka w jądrze (ryc. 1).</li>
</ol>
Tłumaczenie automatyczne
Uwaga: Oprócz ręcznej interpretacji, załaduj i zeskanuj preparaty za pomocą automatycznego mikroskopu fluorescencyjnego NOVA View lub innego automatycznego instrumentu do obrazowania cyfrowego; ciemnia nie jest konieczna. Po utworzeniu projektu poprzez wybór odpowiedniego typu szkiełka, urządzenie pozyskuje i przechowuje cyfrowe obrazy komórek w każdej studzience w wysokiej rozdzielczości. Dodatkowo NOVA View mierzy natężenie światła fluorescencyjnego i kategoryzuje wyniki jako pozytywne lub ujemne oraz zapewnia rozpoznawanie wzorców dla próbek dodatnich. Obrazy są oglądane przez operatora na monitorze komputerowym o wysokiej rozdzielczości, co pozwala na ostateczną interpretację, korektę i potwierdzenie wyniku NOVA View. Na podstawie potwierdzonych wyników można generować raporty. Mikroskopia cyfrowa powinna być stosowana w połączeniu z doświadczonym technikiem laboratoryjnym, ponieważ ma na celu pomoc w interpretacji wyników.

<ol><li>Meroni, P. L., Schur, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANA+screening%3A+an+old+test+with+new+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">ANA screening: an old test with new recommendations.</a> Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).</li>
<li>Tan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+to+nuclear+antigens+%28ANA%29%3A+Their+immunobiology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine.</a> Advances in immunology. 33, 167-240 (1982).</li>
<li>Sack, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibody+detection+using+indirect+immunofluorescence+on+HEp-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+NY+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Autoantibody detection using indirect immunofluorescence on HEp-2 cells.</a> Ann NY Acad Sci. 1173, 166-173 (2009).</li>
<li>Watanabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-DFS70+antibodies+in+597+healthy+hospital+workers%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers.</a> Arthritis Rheum. 50 (3), 892-900 (2004).</li>
<li>Mahler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+the+dense+fine+speckled+pattern+on+HEp-2+cells+and+anti-DFS70+antibodies+for+the+diagnosis+of+systemic+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun+Revi%22%5BJournal%5D)">Importance of the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells and anti-DFS70 antibodies for the diagnosis of systemic autoimmune diseases.</a> Autoimmun Revi. 11 (9), 642-645 (2012).</li>
<li>Mahler, M., Fritzler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+significance+of+the+dense+fine+speckled+immunofluorescence+pattern+on+HEp-2+cells+for+the+diagnosis+of+systemic+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The clinical significance of the dense fine speckled immunofluorescence pattern on HEp-2 cells for the diagnosis of systemic autoimmune diseases.</a> Clin Dev Immunol. , (2012).</li>
<li>Miyara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+phenotypes+of+patients+with+anti-DFS70%2FLEDGF+antibodies+in+a+routine+ANA+referral+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clinical phenotypes of patients with anti-DFS70/LEDGF antibodies in a routine ANA referral cohort.</a> Clin Dev Immunol. , (2013).</li>
<li>Mariz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+on+the+antinuclear+antibody-HEp-2+test+is+a+critical+parameter+for+discriminating+antinuclear+antibody+positive+healthy+individuals+and+patients+with+autoimmune+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis Rheum. 63 (1), 191-200 (2011).</li>
<li>Muro, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+concomitance+of+disease+marker+autoantibodies+in+anti-DFS70%2FLEDGF+autoantibody-positive+patients+with+autoimmune+rheumatic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lupus%22%5BJournal%5D)">High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease.</a> Lupus. 17 (3), 171-176 (2008).</li>
<li>Agmon-Levin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+recommendations+for+the+assessment+of+autoantibodies+to+cellular+antigens+referred+to+as+anti-nuclear+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies.</a> Ann Rheum Dis. 73 (1), 17-23 (2014).</li>
<li>Craft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+U2+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+as+an+autoantigen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The U2 small nuclear ribonucleoprotein particle as an autoantigen.</a> J Clin Invest. 81 (6), 1716-1724 (1998).</li>
<li>Salomonsson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serologic+marker+for+fetal+risk+of+congenital+heart+block%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">A serologic marker for fetal risk of congenital heart block.</a> Arthritis Rheum. 46 (5), 1233-1241 (2002).</li>
<li>Miyawaki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+serological+heterogeneity+in+patients+with+anticentromere+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Clinical and serological heterogeneity in patients with anticentromere antibodies.</a> J Rheumatology. 32 (8), 1488-1494 (2005).</li>
<li>Raijamkers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PM-Scl-75+is+the+main+autoantigen+in+patients+with+the+polymyositis%2Fscleroderma+overlap+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">PM-Scl-75 is the main autoantigen in patients with the polymyositis/scleroderma overlap syndrome.</a> Arthritis Rheum. 50 (2), 565-569 (2004).</li>
<li>Yang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+scleroderma+sera+contain+autoantibodies+to+protein+components+specific+to+the+UC+small+nucleolar+RNP+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Human scleroderma sera contain autoantibodies to protein components specific to the UC small nucleolar RNP complex.</a> Arthritis Rheum. 48 (1), 210-217 (2003).</li>
<li>Granito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinuclear+antibodies+as+ancillary+markers+in+primary+biliary+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Antinuclear antibodies as ancillary markers in primary biliary cirrhosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 12 (1), 65-74 (2012).</li>
</ol>

Autorki Gabriella Lakos, Cassandra Bryant, Carol Buchner i Anna Eslami są pracownicami INOVA Diagnostics.

Badania przesiewowe za pomocą komórek HEp-2 są kluczowym pierwszym krokiem w diagnostyce pacjentów z SARD. Metody IIF nie są jednak zharmonizowane. Źródłami zmienności są m.in. przygotowanie preparatów, swoistość sprzężona i sprawność mikroskopu fluorescencyjnego oraz doświadczenie czytelnika. Pomimo tych obaw, IIF pozostaje "złotym standardem" dla testów ANA. Komórki HEp-2 zawierają dużą różnorodność autoantygenów i stanowią idealny substrat do wykrywania tych autoprzeciwciał. W niektórych laboratoriach IIF został zastąpiony metodami badań przesiewowych w fazie stałej, takimi jak test multipleksowy lub ELISA. Wadą takich testów jest to, że nie wyświetlają one pełnego zakresu antygenów, aby były wystarczająco czułe. W konsekwencji pacjenci z wynikiem prawdziwie dodatnim mogą zostać pominięci, co może mieć szkodliwe konsekwencje Oprócz problemów związanych z opóźnieniami w leczeniu i błędną diagnozą, mogą wystąpić dodatkowe koszty opieki zdrowotnej z powodu powtarzania testów potwierdzających lub niepotrzebnych badań diagnostycznych. Biorąc pod uwagę nieodłączne wyzwania związane z IIF, niezwykle ważne jest, aby prawidłowo wykonać tę technikę, aby uniknąć subiektywizmu w wynikach.
Aby zapewnić dokładną interpretację i raportowanie wyników badań przesiewowych ANA, konieczne jest użycie podłoża najwyższej jakości. Przy wyborze substratu HEp-2 bardzo ważne jest, aby komórki były zoptymalizowane pod kątem ekspresji klinicznie istotnych epitopów w ich natywnym stanie białkowym. Transfekowane lub w inny sposób zmodyfikowane linie komórkowe HEp-2 mogą nie pozwalać na prawidłowe wiązanie przeciwciało-antygen. Ponadto, gdy jednocześnie obecnych jest kilka różnych autoprzeciwciał, komórki rekombinowane mogą maskować jeden lub więcej wzorców. W podłożu powinna być również obecna duża liczba komórek mitotycznych. Odpowiednia liczba komórek mitotycznych pozwala na szybką i dokładną identyfikację wzorców. 
Oprócz atrybutów substratu, celem tego protokołu wideo jest opisanie techniki IIF poprzez pokazanie krytycznych etapów, takich jak dodanie próbki, mycie szkiełka, dodanie koniugatu, ślizganie się okładki oraz określenie wyników pozytywnych i negatywnych. Wyniki mogą być zagrożone, jeśli nie zostanie użyta odpowiednia technika dla każdego z tych kroków. Prawidłowe mycie jest ważne, aby usunąć wszystkie niezwiązane przeciwciała. Niektórzy pacjenci wykazują bardzo duże ilości autoprzeciwciał i w takich przypadkach ważne jest, aby wypłukać surowicę ze studzienek, aby nie zanieczyszczała innych studzienek. 
Chociaż IIF jest tradycyjnie bardzo pracochłonną i subiektywną metodą laboratoryjną, nowe technologie, takie jak procesory preparatów, preparaty z kodami kreskowymi i zautomatyzowana mikroskopia cyfrowa, mogą znacznie uprościć przepływ pracy, zwiększyć spójność i zmniejszyć źródła zmienności interpretacji.

Termin przeciwciało przeciwjądrowe (ANA) opisuje różnorodność autoprzeciwciał, które reagują ze składnikami jąder komórkowych, w tym DNA, białkami i rybonukleoproteinami 1,2. Komórka HEp-2, natywna matryca białkowa z setkami antygenów, stanowi idealny substrat do wykrywania ANA1. Wykrywanie ANA w surowicy ludzkiej jest ważnym narzędziem przesiewowym w kierunku chorób tkanki łącznej, a IIF jest metodą referencyjną dla badania ANA1. Ostatnio IIF na komórkach HEp-2 został zastąpiony w niektórych laboratoriach testami immunologicznymi specyficznymi dla antygenu i metodami multipleksowymi. Ze względu na obawy związane z fałszywie ujemnymi wynikami i brakiem przejrzystości dla klinicystów, American College of Rheumatology utworzył grupę zadaniową, która doszła do wniosku, że IIF przy użyciu komórek HEp-2 powinien być "złotym standardem" dla badań przesiewowych ANA1.
Ze względu na subiektywny charakter badań przesiewowych ANA, jakość komórek HEp-2 jest integralną częścią dokładnego i pewnego raportowania wyników. Szczególnie ważna jest obecność dużej liczby komórek mitotycznych, optymalna morfologia komórek, wystarczająca konfluencja i ekspresja odpowiednich antygenów. Rozpoznawanie wzorców IIF służy jako ważne narzędzie pomagające w diagnozowaniu pacjenta. Zrozumienie znaczenia różnych wzorców umożliwia klinicystom i personelowi laboratoryjnemu przeprowadzenie odpowiednich badań kontrolnych w celu potwierdzenia diagnozy. Na przykład jednorodny wzór ANA może wystąpić w obecności przeciwciał anty-dsDNA lub chromatyny i może być związany z toczniem rumieniowatym układowym (SLE)3. Z drugiej strony, niedawno opisano, że tak zwany gęsty wzór drobno nakrapiany (DFS), który jest powszechnie obserwowany w 12% rutynowych próbek, jest głównie związany z przeciwciałami anty-DFS70. Te autoprzeciwciała, gdy zostaną znalezione w izolacji (bez innych specyficznych dla choroby ANA), nie są związane z układowymi autoimmunologicznymi chorobami reumatycznymi4-9. W ten sposób testy potwierdzające na obecność przeciwciał anty-DFS70 mogą pomóc w ograniczeniu niepotrzebnych testów odruchowych, zaoferować znaczne oszczędności kosztów i złagodzić niepokój pacjenta.
Biorąc pod uwagę, że IIF jest metodologią pierwszego rzutu do wykrywania autoprzeciwciał, najważniejsze jest, aby użytkownik zrozumiał, jak wybór odczynników i substratów tkankowych może wpłynąć na wyniki. Ponieważ technika IIF jest z natury subiektywna, ważne jest, aby stosowane odczynniki zapewniały najwyższą jakość wyników.
Celem tego protokołu wideo jest zapoznanie użytkownika z prawidłowymi krokami potrzebnymi do wykonania metody IIF, powszechnymi wzorcami związanymi z ANA, oraz wprowadzenie nowych ulepszeń, które mogą usprawnić przepływ pracy w laboratorium i ustandaryzować wyniki.

<table><tbody><tr><td>NOVA Lite HEp-2 IgG (koniugat DAPI)</td><td>INOVA Diagnostics</td><td>708102</td><td></td></tr><tr><td>NOVA View Instrument</td><td>INOVA Diagnostics</td><td>NV2000</td><td></td></tr><tr><td>Stacja robocza QUANTA Link</td><td>Diagnostyka INOVA</td><td>LINK010</td><td></td></tr><tr><td>Licencja na stację roboczą QUANTA Link Skaner</td> kodów kreskowych <td>INOVA Diagnostics</td><td>LINK001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>INOVA Diagnostics</td><td>LINK019</td><td></td></tr></tbody></table>

badania przesiewowe przeciwciał przeciwjądrowych przy użyciu komórek hep-2

Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

Stanowisko American College of Rheumatology w sprawie testów ANA przewiduje użycie IIF jako złotego standardu dla badań przesiewowych ANA1. Chociaż IIF jest doskonałym testem przesiewowym w rękach ekspertów, trudności techniczne związane z przetwarzaniem i odczytywaniem preparatów IIF – takie jak pracochłonne przetwarzanie preparatów, ręczny odczyt, potrzeba doświadczonych, przeszkolonych technologów i korzystanie z ciemni – sprawiają, że metoda IIF jest trudna do dopasowania do przepływu pracy nowoczesnych, zautomatyzowanych laboratoriów.
Pierwszym i kluczowym krokiem w kierunku wysokiej jakości badań przesiewowych ANA jest staranne przetwarzanie preparatów. Ta procedura jest pracochłonna i wymaga pełnego zrozumienia procesu, a także dbałości o szczegóły i doświadczenia.
Czytanie slajdów odbywa się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w ciemnych pomieszczeniach i jest wykonywane przez wyszkolonych technologów, którzy są zaznajomieni z różnymi wzorcami, w kontekście cyklu komórkowego i morfologii interfazy i podziału komórek. Biorąc pod uwagę, że IIF jest pierwszym narzędziem przesiewowym w kierunku SARD, zrozumienie kroków niezbędnych do prawidłowego wykonania tej techniki ma kluczowe znaczenie.
Ostatnio opracowano cyfrowe systemy obrazowania do automatycznego odczytywania slajdów IIF. Systemy te, takie jak zautomatyzowany mikroskop fluorescencyjny NOVA View, zostały zaprojektowane w celu usprawnienia rutynowego przepływu pracy IIF. NOVA View pozyskuje i przechowuje cyfrowe obrazy odwiertów w wysokiej rozdzielczości, oddzielając w ten sposób akwizycję obrazu od interpretacji; Obrazy są oglądane i interpretowane na monitorach komputerowych o wysokiej rozdzielczości. Przechowuje obrazy do wykorzystania w przyszłości i wspiera interpretację operatora, dostarczając dane o natężeniu światła fluorescencyjnego na obrazach. Wstępnie kategoryzuje również wyniki jako pozytywne lub ujemne i zapewnia rozpoznawanie wzorców dla próbek dodatnich. Podsumowując, eliminuje potrzebę korzystania z ciemni oraz automatyzuje i usprawnia przepływ pracy odczytu/interpretacji IIF. Co najważniejsze, zwiększa spójność między czytelnikami a czytaniami. Ponadto, dzięki zastosowaniu preparatów z kodami kreskowymi, eliminowane są błędy transkrypcji poprzez zapewnienie identyfikowalności próbki i pozytywnej identyfikacji pacjenta. Skutkuje to zwiększoną integralnością i bezpieczeństwem danych pacjenta.
Ogólnym celem tego filmu jest zademonstrowanie procedury IIF, w tym przetwarzania preparatów, identyfikacji typowych wzorców IIF oraz wprowadzenia nowych osiągnięć w celu uproszczenia i harmonizacji tej techniki.

Podczas oceny wyników barwienia komórek HEp-2 najczęściej zgłaszanych jest pięć głównych wzorców jądrowych: jednorodny, plamisty, centromerowy, jąderkowy oraz w postaci kropek jądrowych. Wzorce te są wynikiem wiązania autoprzeciwciał ze specyficznymi składnikami jądra. Chociaż badanie ANA jest specyficzne dla struktur jądrowych, mogą być również obserwowane wzorce cytoplazmatyczne związane z autoprzeciwciałami przeciwko strukturom cytoplazmatycznym. W niektórych przypadkach w próbce może występować kilka autoprzeciwciał, a obraz może przedstawiać wzorzec mieszany.
Metodą IIF można wykryć inne, rzadziej obserwowane i często specyficzne dla cyklu komórkowego wzorce; ostatnio w niektórych serum ANA-dodatnich opisano tzw. gęsty, drobnoziarnisty wzorzec o szczególnym znaczeniu klinicznym.
Jednorodny wzór
Aby zidentyfikować wzór homogenny, należy przeskanować dołek i zlokalizować komórki w stanie mitozy lub komórki dzielące się. Skondensowana chromatyna komórek mitotycznych (Rysunek 2, pomarańczowa strzałka) wykazuje silną, jednolitą fluorescencję, która często jest bardziej wyraźna niż w jadrach komórek w stanie spoczynku. W wzorze homogenicznym komórki w stanie spoczynku wykazują jednolitą, rozlaną fluorescencję całego jądra (Rysunek 2, biała strzałka). Ten charakterystyczny wzór jest często wynikiem obecności przeciwciał anty-dsDNA10.
Wzór nakrapiany
W przypadku grubego wzoru plamistego komórki mitotyczne nie wykazują barwienia skondensowanych obszarów chromosomowych (Rycina 3, pomarańczowa strzałka). Komórki w stanie spoczynku wykazują fluorescencję ziarnistą w całym jądrze. Plamistość jądrową można zdefiniować jako grubą lub drobną. Gruby wzór plamistości jest często wynikiem obecności przeciwciał anty-Sm i anty-RNP11.
W obrazie drobnokropkowatym komórki w spoczynku wykazują drobne lub rozproszone nakrapianie w obrębie jąder, zazwyczaj o jednolitym rozkładzie (Rysunek 4, biała strzałka). Obraz drobnokropkowaty często jest wynikiem obecności przeciwciał anty-SSA i anty-SSB12.
Gęsty, drobny wzór kropkowy
Obecnie uznaje się, że gęsty, drobnoziarnisty obraz plamisty (DFS) jest powszechny w rutynowych badaniach, a nawet 12% próbek wykazuje obecność autoprzeciwciał przeciwko DFS70. Jednakże autoprzeciwciała te, gdy występują w izolacji, nie są powiązane z systemowymi reumatycznymi chorobami autoimmunologicznymi4-6. Przeciwciała te są powszechne u zdrowych osób oraz u pacjentów z chorobami niezwiązanymi z SARD6. Badania potwierdzające obecność przeciwciał przeciwko DFS70 mogą pomóc w ograniczeniu niepotrzebnych badań odruchowych, przynieść znaczne oszczędności kosztów oraz zmniejszyć niepokój pacjentów.
Ponieważ wzór DFS jest trudny do zidentyfikowania, a pozytywny wynik testu ANA może budzić niepokój zarówno u pacjentów, jak i lekarzy, wysoce zaleca się wykonanie testu potwierdzającego po zidentyfikowaniu wzoru sugerującego obecność przeciwciał anty-DFS70, aby wyjaśnić znaczenie kliniczne dodatniego wyniku ANA5,6.
W tym wzorcu komórki mitotyczne (Rysunek 5, pomarańczowa strzałka) wykazują pozytywne, nakrapiane barwienie chromatyny w metafazie, natomiast jądra komórek spoczynkowych (Rysunek 5, biała strzałka) wykazują równomiernie rozproszone drobne kropki w całym jądrze.

Wzór centromerowy
Aby zidentyfikować wzór centromerów, należy przeskanować studzienki i zidentyfikować komórki w fazie mitozy lub komórki dzielące się. W komórkach mitotycznych (Rysunek 6, pomarańczowa strzałka) te oddzielne kropki zbliżają się do siebie, tworząc strukturę często opisywaną jako „pasek metafazowy”. W przypadku wzoru centromerów, komórki w stanie spoczynku (Rysunek 6, biała strzałka) wykazują około 40-60 oddzielnych kropek rozmieszczonych w całej jąderku. Wzór centromerów jest wynikiem zastosowania przeciwciał anty-CENP A,B,C13.
Wzór jąderkowy
Niektóre wzorce jąderkowe wiążą się z rozproszonym barwieniem cytoplazmy w komórkach mitotycznych (Rysunek 7, pomarańczowa strzałka) i ujemnym barwieniem regionu chromosomalnego, podczas gdy inne wzorce jąderkowe wykazują dodatnie barwienie regionu chromosomalnego. Wzorzec jąderkowy wiąże się z jednorodnym lub ziarnistym barwieniem jąderek (Rysunek 7, biała strzałka), wraz ze słabym ziarnistym lub jednorodnym barwieniem nukleoplazmy. Wzorce te wiążą się z przeciwciałami anty-polimeraza RNA III, anty-fibrylaryna, anty-Th/To oraz anty-PM/Scl14,15.
Wzór kropek jądrowych
Wzorzec kropkowy jądra wiąże się z ujemnym wynikiem w komórkach mitotycznych w metafazie (Rysunek 8, pomarańczowa strzałka) oraz z niewielką liczbą dyskretnych plamek w jądrach komórek w stanie spoczynku (Rysunek 8, biała strzałka). Ten charakterystyczny wzorzec jest często wynikiem obecności autoprzeciwciał przeciwko sp-100, PML lub p80 colin. Przeciwciała te wiążą się z pierwotnym marskością żółciową oraz autoimmunologicznym zapaleniem wątroby16.
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej, zielone świecące komórki wskazujące wyniki analizy ekspresji genów." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Kontrola negatywna (lewa): Komórki wykazują niski poziom nieswoistej fluorescencji, ale brak jest swoistego barwienia jąder. Kontrola pozytywna (prawa): Komórki wykazują jasnozieloną fluorescencję jąder.
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej barwionych jąder DNA w hodowli komórkowej, wizualizujący podziały komórek." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Wzorzec homogenny. Komórki w fazie mitozy (pomarańczowa strzałka) wykazują jednolitą fluorescencję. Komórki w stanie spoczynku wykazują równomierne, rozproszone barwienie (biała strzałka).
<img alt="Podział komórek w mikroskopii fluorescencyjnej; jądra barwione, komórki mitotyczne zaznaczone; analiza biologiczna." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Gruboziarnisty wzór plamisty. Komórki mitotyczne (pomarańczowa strzałka) wykazują brak barwienia. Komórki w stanie spoczynku wykazują wyraźne plamiste barwienie (biała strzałka).
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej z oznakowanymi komórkami; biologia komórki, badanie lokalizacji białek." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Drobny prążkowany wzór. Komórki w stanie mitozy (pomarańczowa strzałka) wykazują brak barwienia. Komórki w stanie spoczynku wykazują wyraźne, drobne prążkowane barwienie (biała strzałka).
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej, zaznaczone jądra komórkowe, podkreślające lokalizację białka." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig5highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Gęsty, drobny wzór nakrapiany. Komórki w fazie mitozy (pomarańczowa strzałka) wykazują drobne, ziarniste barwienie lite. Komórki w stanie spoczynku wykazują bardzo drobne, rozproszone barwienie nakrapiane (biała strzałka).
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej jąder komórkowych z markerami DNA; podkreśla lokalizację białek." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig6highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Wzór centromerów. Komórki w fazie mitotycznej (pomarańczowa strzałka) wykazują jednorodne, dyskretne punkty. Komórki w stanie spoczynku (biała strzałka) wykazują od 40 do 60 dyskretnych punktów na jądro komórkowe.
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej komórek, z zaznaczonymi strukturami błony komórkowej i jądra." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig7highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Wzór jąderkowy. Komórki w fazie mitozy (pomarańczowa strzałka) widoczne są jako duże skupiska granulacyjnego barwienia. Jądro komórki w stanie spoczynku wykazuje fluorescencję w obrębie jąderek (biała strzałka).
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej komórek wykazujący lokalizację białek; badanie komórkowe; zielona fluorescencja." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig8highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8. Nuklearny wzór kropkowy. Komórki w fazie mitozy (pomarańczowa strzałka) wydają się negatywne. Komórki w stanie spoczynku wykazują kilka dyskretnych plamek w jądrze komórkowym (biała strzałka). Ponadto nuklearny wzór kropkowy może współistnieć z barwieniem cytoplazmatycznym związanym z autoprzeciwciałami przeciwko antygenom mitochondrialnym (czerwona strzałka).

Testy immunofluorescencyjne pośrednie (IIF) były tradycyjnie używane do wykrywania przeciwciał przeciwjądrowych (ANA) w ludzkiej surowicy. Obecność tych przeciwciał może pomóc w diagnostyce układowych autoimmunologicznych chorób reumatycznych (SARD). Protokół ten pokazuje, jak skutecznie wykonać technikę IIF w celu dokładnego wykrycia tych autoprzeciwciał.

Badania przesiewowe przeciwciał przeciwjądrowych przy użyciu komórek HEp-2

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wykorzystanie pośredniej metody immunofluorescencji do przesiewowego wykrywania przeciwciał przeciwjądrowych. Osiąga się to poprzez inkubację surowicy pacjenta z preparatami na szkiełkach zawierającymi substrat HEp-2. Niezwiązana surowica pacjenta zostaje wypłukana, a następnie związane autoprzeciała inkubuje się ze specyficznym koniugatem znakowanym fluoresceiną, po czym niezwiązany odczynnik zostaje wypłukany.Podczas obserwacji pod mikroskopem fluorescencyjnym próbki dodatnie pod kątem autoprzeciwciał będą wykazywać jabłkowo-zieloną fluorescencję, odpowiadającą obszarom komórek lub jąder, w których autoprzeciwciała związały się w wzorcu fluorescencji wskazującym na obecność antygenu. Ostatecznie obecność ANA może wspomóc diagnostykę chorób tkanki łącznej. Główną zaletą pośredniej metody immunofluorescencyjnej w stosunku do innych metod, takich jak ELISA w fazie stałej, jest fakt, że substrat komórkowy Hep-2 zawiera ponad 100 antygenów wykazanych w ich natywnej konfiguracji.Umożliwia to identyfikację prawie wszystkich klinicznie istotnych przeciwciał O, co nie jest możliwe przy zastosowaniu technik z powierzchnią stałą, ponieważ metoda pośredniej immunofluorescencji jest techniką bardzo specjalistyczną. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą potrzebują czasu i praktyki, aby opanować procedurę przygotowania preparatów. Interpretacja obrazów mikroskopowych oraz nauka rozpoznawania odpowiednich wzorów to również umiejętności, których opanowanie wymaga czasu.Dzięki zastosowaniu odpowiednich odczynników i narzędzi wyniki są bardziej spójne i łatwiejsze do interpretacji. Procedurę zaprezentuje Cassandra Bryant, technolog z Laboratorium Rozwoju Testów Immunofluorescencyjnych. Należy wyjąć odczynniki z opakowań i pozwolić każdemu elementowi osiągnąć temperaturę pokojową, przygotować odczynniki oraz rozcieńczyć surowicę pacjenta zgodnie z ulotką; slajdy posiadają kody kreskowe i mogą zostać łatwo zintegrowane z systemami zautomatyzowanymi.Niniejsza procedura przedstawia manualne przygotowanie preparatów na szkiełkach. Laboratoria o wysokiej przepustowości mogą jednak zdecydować się na zastosowanie zautomatyzowanego sprzętu do przetwarzania szkiełek z funkcją skanowania kodów kreskowych. Instrumenty Inova są połączone poprzez scentralizowaną inteligentną sieć, która zapewnia kontrolę nad wynikami procesów i raportowaniem.Do metody IFA. Zapewnia to pozytywną identyfikację pacjenta podczas przetwarzania oraz eliminuje błędy transkrypcyjne i pokrewne. Nanieś jedną kroplę kontroli pozytywnej i jedną kroplę kontroli negatywnej na odpowiedni preparat.Do pozostałych dołków pipetujemy od 20 do 25 µL rozcieńczonej surowicy pacjenta. Każdy preparat na szkiełku przetwarzamy pojedynczo. Szkiełko umieszczamy w pojemniku do barwienia z wilgotnym ręcznikiem papierowym na dnie, zamykamy pojemnik i inkubujemy preparat przez 30 minut.Warunki wysokiej wilgotności zapobiegną wysychaniu podłoża, co mogłoby doprowadzić do powstania artefaktów barwienia. Podczas tego okresu inkubacji przeciwciała przeciwjądrowe w surowicy pacjenta zwiążą się z antygenami komórek unieruchomionych w każdej studzience. Po zakończeniu inkubacji należy wypłukać surowicę, używając łagodnego strumienia buforu myjącego, aby uniknąć uszkodzenia podłoża.Ustaw slajd pod lekkim kątem, tak aby strumień nie był skierowany bezpośrednio na podłoże. Taka orientacja slajdów pomoże również zapobiec przenoszeniu się próbek między dołkami. Odlej nadmiar buforu płuczącego i umieść slajd w naczyniu Copelanda zawierającym bufor płuczący.Czas inkubacji dla etapu płukania powinien wynosić około pięciu minut. Wyjąć preparaty z buforu płuczącego i delikatnie nimi stuknąć. Aby usunąć nadmiar buforu płuczącego, nanieść jedną kroplę koniugatu fluorescencyjnego do każdej dołki.Do testów NA zaleca się stosowanie koniugatu specyficznego dla fragmentu FC IgG. Inkubować preparaty przez 30 minut w nawilżonym pojemniku, pamiętając o ponownym założeniu pokrywy do barwienia. Koniugat jest światłoczuły, a pokrywa chroni preparaty przed ekspozycją na światło.W czasie tego okresu inkubacji koniugat zwiąże się z przeciwciałami przeciwjądrowymi pacjenta, które związały się z antygenami komórkowymi. Wiązanie koniugatu prowadzi do wystąpienia fluorescencji w dołkach po inkubacji. Przemyj preparat buforem do mycia.Podobnie jak poprzednio, należy położyć szkiełko nakrywkowe na ręczniku papierowym i nanieść medium montażowe w ciągłej linii wzdłuż dolnej krawędzi nakrywki. Wyjmij każdy preparat z buforu płuczącego i delikatnie nim stuknij. Aby usunąć nadmiar buforu płuczącego, dotknij dolnej krawędzi preparatu do krawędzi szkiełka nakrykowego.Ostrożnie opuść szkiełko na szkiełko nakrywkowe w taki sposób, aby medium montażowe na szkiełku nakrywkowym rozprzestrzeniło się do górnej krawędzi szkiełka bez powstawania pęcherzyków powietrza; uzyskanie optymalnej ilości medium montażowego jest techniką, która wymaga wprawy w celu osiągnięcia idealnego efektu. Szkiełka należy oglądać za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego znajdującego się w ciemni, a skanowanie całego dołka powinno być wykonane przy użyciu obiektywu 20 x lub 25 x. Aby ocenić rozkład komórek i jednorodność fluorescencji, należy przełączyć na obiektyw 40 x.Aby dokonać ostatecznej interpretacji w zakresie pozytywności i wzorca, należy przeanalizować kontrole pozytywne i negatywne. Kontrola negatywna może nie być całkowicie ciemna, ale często wykazuje niespecyficzną fluorescencję o niskim natężeniu. Kontrola pozytywna wykaże jasną, jabłkowo-zieloną fluorescencję w jądrze komórkowym.Poziom pozytywności można ocenić, stosując skalę reaktywności od jeden plus do czterech plus. Oprócz interpretacji manualnej, preparaty mogą zostać wczytane i przeskanowane przez zautomatyzowany mikroskop fluorescencyjny. Nie jest wymagana ciemnia.Po utworzeniu projektu poprzez wybór odpowiedniego typu slajdu, urządzenie pozyskuje i przechowuje cyfrowe obrazy komórek w każdej studzience w wysokiej rozdzielczości. Dodatkowo Nova view mierzy intensywność światła fluorescencyjnego, klasyfikuje wyniki jako pozytywne lub negatywne oraz zapewnia rozpoznawanie wzorców dla próbek pozytywnych. Obrazy są przeglądane przez operatora na monitorze komputerowym o wysokiej rozdzielczości, co umożliwia ostateczną interpretację, korektę i potwierdzenie wyników Nova View.Raporty z wyników mogą być generowane na podstawie potwierdzonych rezultatów. Wiązanie autoprzeciwciał z białkowymi strukturami w obrębie jądra prowadzi do powstania pięciu głównych wzorców jądrowych, w tym jednorodnego, drobnoziarnistego, centromerycznego, jąderkowego oraz punktowego. Aby zidentyfikować wzorzec jednorodny, taki jak przedstawiono tutaj, należy zidentyfikować komórki w fazie mitozy lub komórki dzielące się.Komórki w stanie mitozy wykazują jednorodną, intensywną fluorescencję, która często jest bardziej wyraźna niż w komórkach spoczywających. Jądra komórek spoczywających powinny być jednorodne z rozproszonym barwieniem. Ten charakterystyczny wzór jest najprawdopodobniej wynikiem obecności autoprzeciwciał przeciwko dwuniciowemu DNA.Kluczową cechą wzoru cętkowanego jest wygląd komórek mitotycznych w metafazie przypominający szczelinę w monecie. Region chromosomalny tych komórek jest ujemny. Komórki spoczynkowe wykazują wzór cętkowania w całym obrębie jąder.Kropkowanie może być zdefiniowane jako gruboziarniste lub drobnoziarniste. Kropkowanie gruboziarniste jest wynikiem obecności autoprzeciwciał przeciwko SM i RNP. Kropkowanie drobnoziarniste może wynikać z obecności autoprzeciwciał przeciwko S-S-A-S-S-B, a także polimerazie RNA.Wzorzec DFS określany jest jako gęsty, drobnoziarnisty (dense, fine speckled) i wskazuje na obecność autoprzeciwciał przeciwko DFS 70. Komórki w fazie mitozy wykazują barwienie ziarniste, natomiast komórki w fazie spoczynku prezentują równomiernie rozmieszczone drobne ziarna w całym jądrze komórkowym. W takich przypadkach należy przeprowadzić testy potwierdzające, ponieważ autoprzeciwciała DFS 70 występują powszechnie u osób zdrowych w porównaniu z pacjentami z chorobami tkanki łącznej.Aby zidentyfikować wzór centromerów, należy przeskanować dołki i odnaleźć komórki w fazie mitozy lub komórki dzielące się. Komórki dzielące się posiadają liczne, oddzielne punkty położone blisko siebie, często określane jako pręt metafazowy. Komórki w stanie spoczynku wykazują od około 40 do 60 oddzielnych punktów rozmieszczonych w całej objętości jądra.Wzór centromerowy wiąże się z autoprzeciwciałami przeciwko białkom centromerów, podobnie jak wzór nukleolarny. Barwienie regionu chromosomowego w komórkach mitotycznych jest zmienne. Wzór nukleolarny wiąże się z jednorodnym lub ziarnistym barwieniem jąder, wraz ze słabym, ziarnistym lub jednorodnym barwieniem nukleoplazmy jąder komórek w stanie spoczynku.Wzorzec ten wiąże się z autoprzeciwciałami przeciwko polimerazie RNA III, fibrylinie oraz przeciwciałami PM-SCL. Wzorzec kropkowy jądrowy wiąże się z ujemnym wynikiem w komórkach w metafazie i mitozie oraz niewielką liczbą pojedynczych kropek w jądrach komórek w stanie spoczynku. Ten charakterystyczny wzorzec jest często wynikiem obecności autoprzeciwciał przeciwko SP 100, PML lub P 80 colan.Przeciwciała te są związane z pierwotną marskością żółciową oraz autoimmunologicznym zapaleniem wątroby. Na przedstawionym obrazie kropkowaty wzór jądrowy wykazuje barwienie cytoplazmatyczne wynikające z obecności autoprzeciwciał przeciwko antygenom mitochondrialnym. Wykrywanie przeciwciał przeciwjądrowych oraz rozpoznawanie ich wzorów stanowi istotne narzędzie wspomagające diagnostykę pacjentów.Zrozumienie znaczenia poszczególnych obrazów pozwala klinicystom i personelowi laboratoryjnemu na przeprowadzenie odpowiednich badań kontrolnych. Najważniejszymi czynnikami dla prawidłowej identyfikacji obrazów przeciwciał przeciwjądrowych są wybór wysokiej jakości podłoża komórkowego oraz przygotowanie preparatów przy zastosowaniu spójnej, prawidłowej techniki. Odczyt preparatów jest tradycyjnie wykonywany za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w ciemnych pomieszczeniach i przeprowadzany przez przeszkolonych technologów, którzy znają różnorodne obrazy w kontekście cyklu komórkowego i morfologii komórek.W ciągu ostatnich kilku lat opracowano systemy obrazowania cyfrowego do zautomatyzowanego odczytu preparatów; instrumenty te automatyzują przepływ pracy oraz zwiększają spójność odczytu i interpretacji. Ponadto, dzięki zastosowaniu preparatów z kodami kreskowymi, możliwość śledzenia próbek w całym procesie eliminuje potencjalne błędy transkrypcyjne i zwiększa integralność danych oraz bezpieczeństwo pacjentów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wykonać każdy etap procedury pośredniej immunofluorescencji oraz jak identyfikować klinicznie istotne wzory przeciwciał przeciwjądrowych.

anti-nuclear-antibody-screening-using-hep-2-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie przeciwciał przeciwjądrowych z wykorzystaniem komórek HEp-2

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Immunofluorescence Assay to Detect Hepatitis C Virus Replication Complexes in Infected Cells

Automatyczne przeciwciała DFS70 naśladują powszechne wzorce przeciwciał przeciwjądrowych związanych z chorobami, co utrudnia dokładną interpretację przy użyciu konwencjonalnych substratów HEp-2. Protokół opisuje zalety nowatorskiego zmodyfikowanego substratu HEp-2 w porównaniu z konwencjonalnym HEp-2 w badaniach przesiewowych ANA i rozróżnianiu wzorców DFS70 z dużą pewnością zarówno w monospecyficznych, jak i mieszanych przypadkach dodatnich ANA.

Jednoczesne rozróżnianie monospecyficznych i mieszanych wzorców DFS70 podczas badań przesiewowych ANA za pomocą nowatorskiego podłoża do nokautowania HEp-2 ELITE/DFS70

Tutaj prezentujemy metodę cytometrii przepływowej opartej na komórkach do wykrywania przeciwciał neutralizujących lub innych czynników, które zakłócają pobieranie przez komórkę enzymatycznych terapii zastępczych w ludzkiej matrycy, takich jak płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) lub ludzka surowica.

Wykrywanie przeciwciał, które neutralizują wychwyt komórkowy enzymatycznych terapii zastępczych za pomocą testu komórkowego

Celem tego protokołu jest dostarczenie przewodnika krok po kroku do przeprowadzenia eksperymentów 3-D z wirusem zapalenia wątroby typu B.

Hodowle "wątroby na chipie" pierwotnych hepatocytów i komórek Kupffera w leczeniu zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B

Metoda BSelex do identyfikacji i odzyskiwania pojedynczych przeciwciał specyficznych dla antygenu z komórek jednojądrzastych ludzkiej krwi obwodowej łączy cytometrię przepływową z PCR pojedynczych komórek i klonowaniem.

Metoda przesiewowa pojedynczych komórek w celu selekcji i odzyskiwania przeciwciał o pożądanej swoistości ze wzbogaconych populacji komórek B ludzkiej pamięci

Prezentujemy solidną, opłacalną i elastyczną metodę pomiaru zmian w liczbie hepatocytów i ploidalności jądrowej w stałych/kriokonserwowanych próbkach tkanek, która nie wymaga cytometrii przepływowej. Nasze podejście zapewnia potężną sygnaturę cytologii wątroby obejmującą całą próbkę, idealną do śledzenia postępu uszkodzenia wątroby i choroby.

Wysokoprzepustowa metoda in situ do szacowania ploidalności jądrowej hepatocytów u myszy

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół infekcji wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV) w nowych zmodyfikowanych komórkach 293T (293T-NE-3NRs, wyrażających ludzkie NTCP, HNF4α, RXRα i PPARα) oraz tradycyjnych komórkach wątroby (HepG2-NE, wyrażających ludzkie NTCP).

Modelowanie zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B w niewątrobowych komórkach 293T-NE-3NRs

Prezentujemy protokół do badania związków wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) ukierunkowanych na etapy cyklu życia przed i po wejściu wirusa, używając izotermicznej kalorymetrii miareczkowej do pomiaru powinowactwa wiązania (KD) z polipeptydem kotransportującym taurocholan sodu gospodarza. Skuteczność przeciwwirusową określono poprzez supresję markerów cyklu życia wirusa (tworzenie cccDNA, transkrypcja i składanie wirusa).

Kompetentny model hepatocytów badający wnikanie wirusa zapalenia wątroby typu B przez polipeptyd transportujący taurocholan sodu jako cel terapeutyczny

Ten protokół przedstawia zautomatyzowaną, opartą na obrazie technikę wysokoprzepustową do identyfikacji związków modulujących zabijanie komórek raka piersi za pośrednictwem komórek NK w obecności terapeutycznego przeciwciała anty-HER-2.

Test przesiewowy o wysokiej zawartości do identyfikacji zależnych od przeciwciał związków modyfikujących cytotoksyczność komórkową

Hepatocyty pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych mogą być oczyszczane poprzez sortowanie komórek, przy użyciu kombinacji barwienia mitochondriów i aktywowanej cząsteczki adhezyjnej komórek leukocytów (ALCAM, znanej również jako CD166).

Zastosowanie barwienia żywych mitochondriów w sortowaniu komórek w celu oczyszczenia hepatocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Nie ma standardowego testu neutralizacji wirusa dostępnego dla wirusa zapalenia wątroby typu E (HEV), niecytopatycznego wirusa RNA z dodatnią polaryzacją. Tutaj opisano test neutralizacji oparty na redukcji fluorescencji (FRNT) – oparty na ilościowym zważeniu białka kapsydu wirusa z oznaczeniem fluorescencyjnym do oceny skuteczności przeciwciał przeciwko HEV.

Test neutralizacji z redukcją fluorescencji wirusa zapalenia wątroby typu E do pomiaru tytułów przeciwciał neutralizujących

Poznaj metodę pośredniej immunofluorescencji do wykrywania przeciwciał przeciwjądrowych w surowicy pacjenta przy użyciu komórek HEp-2. Technika ta wspiera diagnostykę chorób tkanki łącznej.

Badania przesiewowe przeciwciał przeciwjądrowych przy użyciu komórek HEp-2

Przeglądaj więcej filmów