Badania przesiewowe przeciwciał przeciwjądrowych przy użyciu komórek HEp-2

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wykorzystanie pośredniej metody immunofluorescencji do przesiewowego wykrywania przeciwciał przeciwjądrowych. Osiąga się to poprzez inkubację surowicy pacjenta z preparatami na szkiełkach zawierającymi substrat HEp-2. Niezwiązana surowica pacjenta zostaje wypłukana, a następnie związane autoprzeciała inkubuje się ze specyficznym koniugatem znakowanym fluoresceiną, po czym niezwiązany odczynnik zostaje wypłukany.

Podczas obserwacji pod mikroskopem fluorescencyjnym próbki dodatnie pod kątem autoprzeciwciał będą wykazywać jabłkowo-zieloną fluorescencję, odpowiadającą obszarom komórek lub jąder, w których autoprzeciwciała związały się w wzorcu fluorescencji wskazującym na obecność antygenu. Ostatecznie obecność ANA może wspomóc diagnostykę chorób tkanki łącznej. Główną zaletą pośredniej metody immunofluorescencyjnej w stosunku do innych metod, takich jak ELISA w fazie stałej, jest fakt, że substrat komórkowy Hep-2 zawiera ponad 100 antygenów wykazanych w ich natywnej konfiguracji.

Umożliwia to identyfikację prawie wszystkich klinicznie istotnych przeciwciał O, co nie jest możliwe przy zastosowaniu technik z powierzchnią stałą, ponieważ metoda pośredniej immunofluorescencji jest techniką bardzo specjalistyczną. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą potrzebują czasu i praktyki, aby opanować procedurę przygotowania preparatów. Interpretacja obrazów mikroskopowych oraz nauka rozpoznawania odpowiednich wzorów to również umiejętności, których opanowanie wymaga czasu.

Dzięki zastosowaniu odpowiednich odczynników i narzędzi wyniki są bardziej spójne i łatwiejsze do interpretacji. Procedurę zaprezentuje Cassandra Bryant, technolog z Laboratorium Rozwoju Testów Immunofluorescencyjnych. Należy wyjąć odczynniki z opakowań i pozwolić każdemu elementowi osiągnąć temperaturę pokojową, przygotować odczynniki oraz rozcieńczyć surowicę pacjenta zgodnie z ulotką; slajdy posiadają kody kreskowe i mogą zostać łatwo zintegrowane z systemami zautomatyzowanymi.

Niniejsza procedura przedstawia manualne przygotowanie preparatów na szkiełkach. Laboratoria o wysokiej przepustowości mogą jednak zdecydować się na zastosowanie zautomatyzowanego sprzętu do przetwarzania szkiełek z funkcją skanowania kodów kreskowych. Instrumenty Inova są połączone poprzez scentralizowaną inteligentną sieć, która zapewnia kontrolę nad wynikami procesów i raportowaniem.

Do metody IFA. Zapewnia to pozytywną identyfikację pacjenta podczas przetwarzania oraz eliminuje błędy transkrypcyjne i pokrewne. Nanieś jedną kroplę kontroli pozytywnej i jedną kroplę kontroli negatywnej na odpowiedni preparat.

Do pozostałych dołków pipetujemy od 20 do 25 µL rozcieńczonej surowicy pacjenta. Każdy preparat na szkiełku przetwarzamy pojedynczo. Szkiełko umieszczamy w pojemniku do barwienia z wilgotnym ręcznikiem papierowym na dnie, zamykamy pojemnik i inkubujemy preparat przez 30 minut.

Warunki wysokiej wilgotności zapobiegną wysychaniu podłoża, co mogłoby doprowadzić do powstania artefaktów barwienia. Podczas tego okresu inkubacji przeciwciała przeciwjądrowe w surowicy pacjenta zwiążą się z antygenami komórek unieruchomionych w każdej studzience. Po zakończeniu inkubacji należy wypłukać surowicę, używając łagodnego strumienia buforu myjącego, aby uniknąć uszkodzenia podłoża.

Ustaw slajd pod lekkim kątem, tak aby strumień nie był skierowany bezpośrednio na podłoże. Taka orientacja slajdów pomoże również zapobiec przenoszeniu się próbek między dołkami. Odlej nadmiar buforu płuczącego i umieść slajd w naczyniu Copelanda zawierającym bufor płuczący.

Czas inkubacji dla etapu płukania powinien wynosić około pięciu minut. Wyjąć preparaty z buforu płuczącego i delikatnie nimi stuknąć. Aby usunąć nadmiar buforu płuczącego, nanieść jedną kroplę koniugatu fluorescencyjnego do każdej dołki.

Do testów NA zaleca się stosowanie koniugatu specyficznego dla fragmentu FC IgG. Inkubować preparaty przez 30 minut w nawilżonym pojemniku, pamiętając o ponownym założeniu pokrywy do barwienia. Koniugat jest światłoczuły, a pokrywa chroni preparaty przed ekspozycją na światło.

W czasie tego okresu inkubacji koniugat zwiąże się z przeciwciałami przeciwjądrowymi pacjenta, które związały się z antygenami komórkowymi. Wiązanie koniugatu prowadzi do wystąpienia fluorescencji w dołkach po inkubacji. Przemyj preparat buforem do mycia.

Podobnie jak poprzednio, należy położyć szkiełko nakrywkowe na ręczniku papierowym i nanieść medium montażowe w ciągłej linii wzdłuż dolnej krawędzi nakrywki. Wyjmij każdy preparat z buforu płuczącego i delikatnie nim stuknij. Aby usunąć nadmiar buforu płuczącego, dotknij dolnej krawędzi preparatu do krawędzi szkiełka nakrykowego.

Ostrożnie opuść szkiełko na szkiełko nakrywkowe w taki sposób, aby medium montażowe na szkiełku nakrywkowym rozprzestrzeniło się do górnej krawędzi szkiełka bez powstawania pęcherzyków powietrza; uzyskanie optymalnej ilości medium montażowego jest techniką, która wymaga wprawy w celu osiągnięcia idealnego efektu. Szkiełka należy oglądać za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego znajdującego się w ciemni, a skanowanie całego dołka powinno być wykonane przy użyciu obiektywu 20 x lub 25 x. Aby ocenić rozkład komórek i jednorodność fluorescencji, należy przełączyć na obiektyw 40 x.

Aby dokonać ostatecznej interpretacji w zakresie pozytywności i wzorca, należy przeanalizować kontrole pozytywne i negatywne. Kontrola negatywna może nie być całkowicie ciemna, ale często wykazuje niespecyficzną fluorescencję o niskim natężeniu. Kontrola pozytywna wykaże jasną, jabłkowo-zieloną fluorescencję w jądrze komórkowym.

Poziom pozytywności można ocenić, stosując skalę reaktywności od jeden plus do czterech plus. Oprócz interpretacji manualnej, preparaty mogą zostać wczytane i przeskanowane przez zautomatyzowany mikroskop fluorescencyjny. Nie jest wymagana ciemnia.

Po utworzeniu projektu poprzez wybór odpowiedniego typu slajdu, urządzenie pozyskuje i przechowuje cyfrowe obrazy komórek w każdej studzience w wysokiej rozdzielczości. Dodatkowo Nova view mierzy intensywność światła fluorescencyjnego, klasyfikuje wyniki jako pozytywne lub negatywne oraz zapewnia rozpoznawanie wzorców dla próbek pozytywnych. Obrazy są przeglądane przez operatora na monitorze komputerowym o wysokiej rozdzielczości, co umożliwia ostateczną interpretację, korektę i potwierdzenie wyników Nova View.

Raporty z wyników mogą być generowane na podstawie potwierdzonych rezultatów. Wiązanie autoprzeciwciał z białkowymi strukturami w obrębie jądra prowadzi do powstania pięciu głównych wzorców jądrowych, w tym jednorodnego, drobnoziarnistego, centromerycznego, jąderkowego oraz punktowego. Aby zidentyfikować wzorzec jednorodny, taki jak przedstawiono tutaj, należy zidentyfikować komórki w fazie mitozy lub komórki dzielące się.

Komórki w stanie mitozy wykazują jednorodną, intensywną fluorescencję, która często jest bardziej wyraźna niż w komórkach spoczywających. Jądra komórek spoczywających powinny być jednorodne z rozproszonym barwieniem. Ten charakterystyczny wzór jest najprawdopodobniej wynikiem obecności autoprzeciwciał przeciwko dwuniciowemu DNA.

Kluczową cechą wzoru cętkowanego jest wygląd komórek mitotycznych w metafazie przypominający szczelinę w monecie. Region chromosomalny tych komórek jest ujemny. Komórki spoczynkowe wykazują wzór cętkowania w całym obrębie jąder.

Kropkowanie może być zdefiniowane jako gruboziarniste lub drobnoziarniste. Kropkowanie gruboziarniste jest wynikiem obecności autoprzeciwciał przeciwko SM i RNP. Kropkowanie drobnoziarniste może wynikać z obecności autoprzeciwciał przeciwko S-S-A-S-S-B, a także polimerazie RNA.

Wzorzec DFS określany jest jako gęsty, drobnoziarnisty (dense, fine speckled) i wskazuje na obecność autoprzeciwciał przeciwko DFS 70. Komórki w fazie mitozy wykazują barwienie ziarniste, natomiast komórki w fazie spoczynku prezentują równomiernie rozmieszczone drobne ziarna w całym jądrze komórkowym. W takich przypadkach należy przeprowadzić testy potwierdzające, ponieważ autoprzeciwciała DFS 70 występują powszechnie u osób zdrowych w porównaniu z pacjentami z chorobami tkanki łącznej.

Aby zidentyfikować wzór centromerów, należy przeskanować dołki i odnaleźć komórki w fazie mitozy lub komórki dzielące się. Komórki dzielące się posiadają liczne, oddzielne punkty położone blisko siebie, często określane jako pręt metafazowy. Komórki w stanie spoczynku wykazują od około 40 do 60 oddzielnych punktów rozmieszczonych w całej objętości jądra.

Wzór centromerowy wiąże się z autoprzeciwciałami przeciwko białkom centromerów, podobnie jak wzór nukleolarny. Barwienie regionu chromosomowego w komórkach mitotycznych jest zmienne. Wzór nukleolarny wiąże się z jednorodnym lub ziarnistym barwieniem jąder, wraz ze słabym, ziarnistym lub jednorodnym barwieniem nukleoplazmy jąder komórek w stanie spoczynku.

Wzorzec ten wiąże się z autoprzeciwciałami przeciwko polimerazie RNA III, fibrylinie oraz przeciwciałami PM-SCL. Wzorzec kropkowy jądrowy wiąże się z ujemnym wynikiem w komórkach w metafazie i mitozie oraz niewielką liczbą pojedynczych kropek w jądrach komórek w stanie spoczynku. Ten charakterystyczny wzorzec jest często wynikiem obecności autoprzeciwciał przeciwko SP 100, PML lub P 80 colan.

Przeciwciała te są związane z pierwotną marskością żółciową oraz autoimmunologicznym zapaleniem wątroby. Na przedstawionym obrazie kropkowaty wzór jądrowy wykazuje barwienie cytoplazmatyczne wynikające z obecności autoprzeciwciał przeciwko antygenom mitochondrialnym. Wykrywanie przeciwciał przeciwjądrowych oraz rozpoznawanie ich wzorów stanowi istotne narzędzie wspomagające diagnostykę pacjentów.

Zrozumienie znaczenia poszczególnych obrazów pozwala klinicystom i personelowi laboratoryjnemu na przeprowadzenie odpowiednich badań kontrolnych. Najważniejszymi czynnikami dla prawidłowej identyfikacji obrazów przeciwciał przeciwjądrowych są wybór wysokiej jakości podłoża komórkowego oraz przygotowanie preparatów przy zastosowaniu spójnej, prawidłowej techniki. Odczyt preparatów jest tradycyjnie wykonywany za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w ciemnych pomieszczeniach i przeprowadzany przez przeszkolonych technologów, którzy znają różnorodne obrazy w kontekście cyklu komórkowego i morfologii komórek.

W ciągu ostatnich kilku lat opracowano systemy obrazowania cyfrowego do zautomatyzowanego odczytu preparatów; instrumenty te automatyzują przepływ pracy oraz zwiększają spójność odczytu i interpretacji. Ponadto, dzięki zastosowaniu preparatów z kodami kreskowymi, możliwość śledzenia próbek w całym procesie eliminuje potencjalne błędy transkrypcyjne i zwiększa integralność danych oraz bezpieczeństwo pacjentów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wykonać każdy etap procedury pośredniej immunofluorescencji oraz jak identyfikować klinicznie istotne wzory przeciwciał przeciwjądrowych.