Badania przesiewowe przeciwciał przeciwjądrowych przy użyciu komórek HEp-2

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zastosowanie pośredniego testu immunofluorescencyjnego do badań przesiewowych na obecność przeciwciał przeciwjądrowych. Osiąga się to poprzez inkubację surowicy pacjenta z dwoma szkiełkami substratowymi hep. Niezwiązana surowica pacjenta jest zmywana ze związanych automatycznych przeciwciał, a następnie inkubuje się ze specyficznym koniugatem znakowanym fluoresceiną, a niezwiązany odczynnik jest zmywany.

Oglądane przez mikroskop fluorescencyjny, próbki z dodatnim wynikiem autoprzeciwciał będą wykazywać fluorescencję w kolorze zielonego jabłka odpowiadającą obszarom komórki lub jąder, w których autoprzeciwciało związało się we wzorze fluorescencji wskazującym na obecność antygenu. Ostatecznie obecność arny może być wykorzystana do pomocy w diagnostyce chorób tkanki łącznej. Główną zaletą metody immunofluorescencji pośredniej w porównaniu z innymi metodami, takimi jak Eliza w fazie stałej, jest to, że substrat dwukomórkowy Hep zawiera ponad 100 antygenów wyrażonych w ich natywnej konfiguracji.

Pozwala to na identyfikację prawie wszystkich klinicznie istotnych przeciwciał O, co nie jest możliwe w przypadku technik litej twarzy, ponieważ metoda immunofluorescencji pośredniej jest bardzo specjalistyczną techniką. Osoby, które dopiero zaczynają przygodę z tą metodą, potrzebują czasu i praktyki, aby osiągnąć biegłość w procedurze obróbki preparatów. Interpretacja obrazów mikroskopowych i nauka rozpoznawania odpowiednich wzorców to również umiejętność, której opanowanie wymaga czasu.

Dzięki odpowiednim odczynnikom i narzędziom wyniki są bardziej spójne i łatwiejsze do interpretacji. Procedurę zademonstruje Cassandra Bryant, technolog z Immunofluorescent Asay Development Laboratory. Wyjmij odczynniki z opakowania i pozwól, aby każdy przedmiot osiągnął temperaturę pokojową, przygotuj odczynniki i rozcieńcz surowicę pacjenta zgodnie z kierunkiem, w którym szkiełka są oznaczone kodami kreskowymi i można je łatwo zintegrować z automatycznymi systemami.

Ta procedura ilustruje ręczne przetwarzanie slajdów. Laboratoria o wysokiej przepustowości mogą jednak zdecydować się na zautomatyzowane urządzenia do obróbki preparatów z możliwością skanowania kodów kreskowych. Urządzenia Inova są połączone za pomocą scentralizowanej, inteligentnej sieci, która zapewnia kontrolę nad wynikami przepływu pracy i raportowaniem.

Dla IFA. Skutkuje to pozytywną identyfikacją pacjenta na podstawie przetwarzania i eliminacją błędów transkrypcji i związanych z tym błędów. Dozować jedną kroplę kontroli dodatniej i jedną kroplę kontroli ujemnej na odpowiednie szkiełko.

Studnie odpipetować od 20 do 25 mikrolitrów rozcieńczonej surowicy pacjenta do pozostałych studzienek. Przetwarzaj jeden slajd na raz. Umieść szkiełko w pojemniku do barwienia z wilgotnym ręcznikiem papierowym na dnie, przykryj pojemnik i inkubuj szkiełko przez 30 minut.

Wilgotne warunki zapobiegną wysychaniu podłoża, co może spowodować sztuczne zabarwienie. Podczas tego okresu inkubacji przeciwciała przeciwjądrowe w surowicy pacjenta będą wiązać się z antygenami komórek, które są przymocowane do każdej studzienki. Po okresie inkubacji spłukać serum delikatnym strumieniem buforu do płukania, aby uniknąć uszkodzenia podłoża.

Lekko pochylić szkiełko, aby strumień nie był skierowany bezpośrednio na podłoże. Taka orientacja szkiełek pomoże również zapobiec krzyżowaniu się próbek między studzienkami. Odczep nadmiar buforu do płukania i umieść szkiełko w słoiku Copeland zawierającym bufor do płukania.

Czas inkubacji dla etapu mycia powinien wynosić około pięciu minut. Wyjmij szkiełka z bufora do mycia i delikatnie postukaj. Aby usunąć nadmiar buforu do płukania, nałóż jedną kroplę koniugatu fluorescencyjnego na każdą studzienkę.

Do badania NA zaleca się stosowanie koniugatu swoistego dla IgG FC. Inkubuj szkiełka przez 30 minut w nawilżonym pojemniku i pamiętaj o założeniu pokrywy barwiącej. Koniugat jest światłoczuły, a okładka ochroni szkiełka przed nasłonecznieniem.

Podczas tego okresu inkubacji koniugat zwiąże się z przeciwciałami przeciwjądrowymi pacjenta, które związały się z antygenami komórkowymi. To sprzężone wiązanie powoduje obecność fluorescencji w studzienkach po inkubacji. Umyj szkiełko buforem do mycia.

Tak jak poprzednio, umieść szkiełko nakrywkowe na ręczniku papierowym i nałóż medium mocujące w linii ciągłej na dolną krawędź szkiełka nakrywkowego. Wyjmij każdy szkiełko z bufora myjącego i delikatnie postukaj w szkiełko. Aby usunąć nadmiar bufora do płukania, przyłóż dolną krawędź szkiełka do krawędzi szkiełka nakrywkowego.

Delikatnie opuścić szkiełko na szkiełko nakrywkowe w taki sposób, aby medium mocujące na szkiełku nakrywkowym spływało do górnej krawędzi szkiełka bez ślizgania się pokrywy pęcherzyków powietrza, w tym optymalna ilość medium montażowego to technika, która wymaga praktyki, aby uzyskać doskonały widok. Preparaty z mikroskopem fluorescencyjnym umieszczonym w ciemnym pomieszczeniu, skanowanie całej studni powinno być wykonane obiektywem 20x lub 25x. Aby ocenić rozmieszczenie komórek i jednorodność fluorescencji, przełącz się na obiektyw 40x.

Aby dokonać ostatecznej interpretacji dotyczącej pozytywności i wzorca, spójrz na pozytywne i negatywne kontrole. Kontrola ujemna może nie wydawać się całkowicie ciemna, ale często wykazuje niski poziom niespecyficznej fluorescencji. Kontrola pozytywna będzie wykazywać jasnozieloną fluorescencję jabłka w jądrze.

Pozytywność można ocenić za pomocą skali oceny reaktywności od jednego plus do czterech plus. Oprócz ręcznej interpretacji, preparaty mogą być ładowane i skanowane przez automatyczny mikroskop fluorescencyjny. Nie jest konieczna ciemna sala.

Po utworzeniu projektu poprzez wybór odpowiedniego typu szkiełka, urządzenie pozyskuje i przechowuje cyfrowe obrazy komórek w każdej studzience w wysokiej rozdzielczości. Dodatkowo Nova view mierzy natężenie światła fluorescencyjnego i kategoryzuje wyniki jako pozytywne lub negatywne oraz zapewnia rozpoznawanie wzorców dla próbek dodatnich. Obrazy są oglądane przez operatora na monitorze komputerowym o wysokiej rozdzielczości, co pozwala na ostateczną interpretację, korektę i potwierdzenie Nova View.

Raporty z wynikami mogą być generowane na podstawie potwierdzonych wyników. Wiązanie się przeciwciał z tworzącymi się strukturami białkowymi w jądrze skutkuje pięcioma głównymi wzorcami jądrowymi, w tym jednorodnym, nakrapianym centromerem, jądrem i kropką jądrową. Aby zidentyfikować jednorodny wzór, jak pokazano tutaj, zidentyfikuj komórki mitotyczne lub dzielące się.

Komórki mitotyczne wykazują stałą jednolitą fluorescencję, która jest często bardziej wyraźna niż w komórkach spoczynkowych. Spoczynkowe jądra komórkowe powinny być jednolite z rozproszonym barwieniem. Ten charakterystyczny wzór jest najprawdopodobniej wynikiem działania autoprzeciwciał przeciwko dwuniciowemu DNA.

Kluczową cechą nakrapianego wzoru jest wygląd szczeliny monety komórek mitotycznych metafazy. Region chromosomalny tych komórek jest ujemny. Komórki w stanie spoczynku wykazują wzór plamek w jądrach.

Nakrapianie można określić jako grube lub drobne. Nakrapianie kursu jest wynikiem działania autoprzeciwciał przeciwko SM i RNP. Drobne plamki mogą być spowodowane automatycznymi przeciwciałami przeciwko S-S-A-S-S-B, a także polimerazie RNA.

Wzór DFS jest określany jako gęsty, drobno nakrapiany i wskazuje na automatyczne przeciwciała przeciwko DFS 70. Komórki mitotyczne wykazują plamiste barwienie, podczas gdy komórki w stanie spoczynku mają równomiernie rozmieszczone drobne plamki w całym jądrze. W takich przypadkach należy wykonać testy potwierdzające, ponieważ autoprzeciwciała DFS 70 są powszechne u zdrowych osób w porównaniu z pacjentami z chorobą tkanki łącznej.

Aby zidentyfikować wzór centromerów, zeskanuj studzienki i zidentyfikuj komórki mitotyczne lub dzielące się. Dzielące się komórki mają liczne dyskretne plamki w ścisłym powiązaniu ze sobą, często nazywane paskiem metafazy. Komórki w stanie spoczynku wykazują około 40 do 60 dyskretnych plamek rozmieszczonych w całym jądrze.

Wzór centromerów jest związany z autoprzeciwciałami przeciwko białkom centromerowym o wzorze jąderkowym. Barwienie regionu chromosomalnego w komórkach mitotycznych jest zmienne. Wzór jąderkowy jest związany z jednorodnym lub nakrapianym barwieniem jąder, wraz ze słabym, nakrapianym lub jednorodnym barwieniem nukleoplazmy pozostających w stanie spoczynku jąder komórkowych.

Ten wzór jest związany z autoprzeciwciałami przeciwko polimerazie RNA, trz fibrylinie i przeciwciałom PM SCL. Wzór kropek jądrowych jest związany z ujemną metafazą, komórkami mitozy i kilkoma dyskretnymi kropkami w jądrach komórkowych w stanie spoczynku. Ten charakterystyczny wzór jest często wynikiem autoprzeciwciał przeciwko SP 100 PML lub P 80 colan.

Przeciwciała te są związane z pierwotną marskością żółciową wątroby i autoimmunologicznym zapaleniem wątroby. Na pokazanym obrazie wzór kropki jądrowej wykazuje barwienie cytoplazmatyczne spowodowane autoprzeciwciałami przeciwko antygenom mitochondrialnym. Wykrywanie przeciwciał przeciwjądrowych i rozpoznawanie wzorców służy jako ważne narzędzie wspomagające diagnozę pacjenta.

Zrozumienie znaczenia różnych wzorców umożliwia klinicystom i personelowi laboratoryjnemu przeprowadzenie odpowiednich badań kontrolnych. Najważniejszymi czynnikami pozwalającymi na prawidłową identyfikację wzorców przeciwciał przeciwjądrowych są wybór wysokiej jakości substratu komórkowego i przetwarzanie szkiełek przy użyciu konsekwentnej, dobrej techniki. Czytanie szkiełek jest tradycyjnie wykonywane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w ciemnych pomieszczeniach i jest wykonywane przez wyszkolonych technologów, którzy są zaznajomieni z różnymi wzorcami w kontekście cyklu komórkowego i morfologii komórki.

W ciągu ostatnich kilku lat opracowano cyfrowe systemy obrazowania do automatycznego odczytu slajdów, takie instrumenty zautomatyzowały przepływ pracy i zwiększyły spójność odczytu i interpretacji. Co więcej, dzięki zastosowaniu szkiełek z kodami kreskowymi, identyfikowalność próbki w całym procesie eliminuje potencjalne błędy przy przepisywaniu oraz zwiększa integralność danych i bezpieczeństwo pacjenta. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać każdy etap procedury immunofluorescencji pośredniej i jak zidentyfikować klinicznie istotne wzorce przeciwciał przeciwjądrowych.