Name: Cytotoksyczna skuteczność terapii fotodynamicznej w komórkach kostniakomięsaka in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Poznaj skuteczność fotodynamicznej terapii przeciwnowotworowej w komórkach kostniakomięsaka in vitro. Metoda obejmuje pomiar wchłaniania fotouczulacza M-T-H-P-C i ocenę cytotoksyczności za pomocą testu WST-1.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować firmie biolitec Research GmbH (Jena, Niemcy) za uprzejme dostarczenie nam liposomalnego preparatu mTHPC, ze specjalnymi podziękowaniami dla Susanny Gräfe i Arno Wiehe za ich pomoc i wiedzę techniczną. Chcielibyśmy również podziękować Kerstin Reidy, która wygenerowała dużą część wyników i była współodpowiedzialna za ich publikację11.
Ta praca była wspierana przez granty od Schweizerischer Verein Balgrist, Uniwersytetu w Zurychu, Krebsliga Zurych, a także przez grant od Fundacji Waltera L. i Johanny Wolf, Zurych, Szwajcaria oraz grant od EuroNanoMed ERA-NET ⁄SNF Swiss National Science Foundation 31NM30-131004 ⁄ 1. Prace te były również wspierane przez program HSM (Medycyna Wysoce Specjalistyczna) dla Onkologii Układu Mięśniowo-Szkieletowego Kantonu w Zurychu.

1. Porównanie wychwytu mTHPC w odpowiednich liniach komórkowych HOS i 143B OS o niskim i wysokim poziomie przerzutów
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych zawierającą DMEM, szynkę F12 i podgrzać inaktywowaną płodową surowicę cielęcą w stosunku 4,5:4,5:1, 
	nuta: Liposomalny preparat PS mTHPC rozpuszczono w wodzie w końcowym stężeniu 1,5 mg/ml mTHPC.</li>
	<li>Płytka 0,2 x 106 komórek HOS i 143B / studzienka na płytkach 6-dołkowych (trzykrotnie dla każdego warunku) i pozwól komórkom przylegać przez noc. 
	Uwaga: liczba musi być dostosowana do poszczególnych linii komórek. Zbieg 80-90% jest najbardziej odpowiedni w czasie eksperymentu.</li>
	<li>Następnego dnia należy inkubować komórki ze stałym stężeniem mTHPC przez różne okresy czasu (wychwyt zależny od czasu) lub ze wzrostem stężenia mTHPC w ustalonym okresie czasu (wychwyt zależny od dawki).</li>
	<li>Inkubować komórki z mTHPC dla określonych punktów czasowych lub stężeń mTHPC. 
	Uwaga: W tym badaniu zarówno linie komórkowe HOS, jak i 143B inkubowano z 0,6 μg/ml mTHPC przez 0, 2,5, 5 lub 10 godzin lub z 0, 0,6, 2,5 i 10 μg/ml mTHPC przez 5 godzin. Stosowane okresy i dawki mogą się różnić w zależności od używanej linii komórkowej.</li>
	<li>Pamiętaj, aby zawsze pracować w ciemności lub w przyciemnionych warunkach oświetleniowych, aby zapobiec bezpośredniemu narażeniu ogniw na światło.</li>
	<li>Po inkubacji komórek we wskazanych warunkach należy odessać pożywkę i trzykrotnie przemyć komórki PBS. Następnie odłącz komórki za pomocą 0,5 ml trypsyny/EDTA i policz komórki.</li>
	<li>Po odłączeniu odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut, odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w PBS do końcowej gęstości 200 000 komórek/ml.</li>
	<li>Pobrać pipetę 100 μl otrzymanej zawiesiny komórek (tj. 20 000 komórek) na płytkę 96-dołkową i zmierzyć fluorescencję tych komórek w spektrofotometrze fluorescencyjnym. Ustawienia dla pomiarów fluorescencji mTHPC to: 417 nm dla wzbudzenia i 652 nm dla emisji.</li>
	<li>Aby obliczyć ilość zinternalizowanego mTHPC na komórkę, znormalizuj względną jednostkę fluorescencji (RFU) dla liczby komórek i objętości komórek w następujący sposób:</li>
	<li>Przygotować krzywą wzorcową, stosując różne stężenia mTHPC w PBS od 0 do 4 μg/ml (użyć trzykrotnych pomiarów). Odpipetować 100 μl każdego rozcieńczenia na płytce 96-dołkowej i zmierzyć fluorescencję studzienek, stosując ustawienia opisane w kroku 1.6.</li>
	<li>Podziel RFU (uzyskane dla 20 000 komórek) przez nachylenie liniowej krzywej wzorcowej mTHPC, co daje stężenie mTHPC (w μg/ml) w studzience.</li>
	<li>Podziel to stężenie mTHPC przez 10, aby uzyskać całkowitą ilość mTHPC w jednym dołku (w μg, co odpowiada 100 μl zawiesiny komórek) i podziel tę wartość przez objętość 20 000 komórek.</li>
	<li>Oblicz objętość za pomocą wzoru na kulę: (4/3 x π) x r3. Uzyskaj promień r, mierząc średnicę 20 trypsynizowanych komórek pod mikroskopem i dzieląc tę wartość przez 2.</li>
	<li>Na koniec znormalizuj wszystkie wartości do tych uzyskanych dla komórek HOS po 10 godzinach inkubacji (wychwyt zależny od dawki) lub potraktowany 10 μg/ml mTHPC (wychwyt zależny od czasu), które ustawiono na 100%.</li>
</ol>
2. Pomiar fototoksyczności PS In Vitro
<ol>
	<li>Wysiewaj 3,000 komórek/studzienkę na 96-dołkowej płytce (trzykrotnie na każde stężenie użytego mTHPC) i pozwól im przylegać przez noc. Podobnie przygotuj dodatkową 96-dołkową płytkę i potraktuj komórki zgodnie z opisem poniżej, ale następnie odłóż je na bok do obrazowania z kontrastem fazowym. 
	Uwaga: liczba musi być dostosowana dla każdej pojedynczej linii komórek. Idealnie nadaje się zbieg 50-60% w czasie eksperymentu.
	<ol>
		<li>Należy pamiętać, aby dodać odpowiednią kontrolę ciemnej toksyczności komórek dla każdego ze stężeń mTHPC. Są to komórki, które będą inkubowane przy braku lub obecności wybranych stężeń mTHPC, ale nie będą oświetlane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnego dnia inkubuj komórki o różnych stężeniach mTHPC (0, 0,0001, 0,001, 0,01, 0,03, 0,075, 0,15, 0,3, 0,6, 1,25, 2,5, 5 i 10 μg/ml) w zależności od linii komórkowych i trzymaj je w ciemności przez 5 godzin.
	<ol>
		<li>Patrz sekcja 1.3.2 
		Uwaga: Czas inkubacji przed oświetleniem zależy od linii komórkowej i użytego PS, dlatego zaleca się testowanie różnych stężeń i różnych punktów czasowych w oddzielnych eksperymentach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po inkubacji przez wskazany okres czasu, przemyć komórki dwukrotnie PBS i dodać nową świeżą pożywkę bez mTHPC.</li>
	<li>Oświetlić ogniwa laserem diodowym o długości fali 652 nm, specyficznym dla widma absorpcji mTHPC (patrz rysunek 1).
	<ol>
		<li>Ustaw laser na moc 21,88 mW/cm2 na wysokości 13,5 cm odległości od ogniw, w celu uzyskania dawki energii 5 J/cm2. Oświetlaj ogniwa przez 230 sekund. Nie oświetlać ciemnych komórek kontroli toksyczności (z mTHPC i bez). 
		nuta: Zawsze noś okulary, aby chronić oczy przed światłem laserowym używanym do wzbudzania PS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po naświetleniu utrzymuj ogniwa w ciemności w temperaturze 37 ºC przez 24 godziny. Następnie dodać rozpuszczalny w wodzie odczynnik tetrazolowy (WST-1) (10 μl/100 μl pożywki).</li>
	<li>Trzy godziny po dodaniu odczynnika WST-1 zmierzyć absorbancję poszczególnych studzienek płytki 96-dołkowej przy długości fali 415 nm.</li>
	<li>Aby obliczyć odsetek komórek, które przeżyły, należy ustawić średnią wartości uzyskanych dla komórek nietraktowanych mTHPC dla każdego stanu na 100% (tj. oświetlone, bez mTHPC i nieoświetlone, bez mTHPC).</li>
</ol>
3. Szacowanie numeru komórki na podstawie zliczania komórek
<ol>
	<li>Wysiej 20 000 komórek/studzienkę na 24-dołkowej płytce i pozwól im przylegać przez noc.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 5 godzin z mTHPC (0,001, 0,003, 0,15, 0,6 i 1,25 μg/ml) i oświetlać je zgodnie z powyższym opisem.</li>
	<li>Zebrać pożywkę, przemyć komórki raz PBS, trypsynizować je i zbierać przez odwirowanie przy 400 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Po odwirowaniu odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 200 μl świeżej pożywki.</li>
	<li>Policz komórki w komorze Neubauera.</li>
</ol>

<ol><li>Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+of+cancer.+Basic+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Transl.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications.</a> Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).</li>
<li>Agostinis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+of+cancer%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy of cancer: an update.</a> CA Cancer. 61, 250-281 (2011).</li>
<li>D'Adamo, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appraising+the+current+role+of+chemotherapy+for+the+treatment+of+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Appraising the current role of chemotherapy for the treatment of sarcoma.</a> Semin. Oncol. 38 Suppl 3, 19-29 (2011).</li>
<li>Allison, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+meta-analysis+of+osteosarcoma+outcomes+in+the+modern+medical+era%5BTitle%5D)+AND+%22Sarcoma%22%5BJournal%5D)">A meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era.</a> Sarcoma. , (2012).</li>
<li>Anninga, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapeutic+adjuvant+treatment+for+osteosarcoma%3A+where+do+we+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chemotherapeutic adjuvant treatment for osteosarcoma: where do we stand.</a> Eur. J. Cancer. 47, 2431-2445 (2011).</li>
<li>Bacci, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+relapse+in+patients+with+osteosarcoma+of+the+extremities+treated+with+neoadjuvant+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pattern of relapse in patients with osteosarcoma of the extremities treated with neoadjuvant chemotherapy.</a> Eur. J. Cancer. 37, 32-38 (2001).</li>
<li>Briccoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resection+of+recurrent+pulmonary+metastases+in+patients+with+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Resection of recurrent pulmonary metastases in patients with osteosarcoma.</a> Cancer. 104, 1721-1725 (2005).</li>
<li>Milla Sanabria, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+photodynamic+therapy+effects+on+the+cellular+and+molecular+components+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect photodynamic therapy effects on the cellular and molecular components of the tumor microenvironment.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1835, 36-45 (2013).</li>
<li>Mitra, S., Foster, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photophysical+parameters%2C+photosensitizer+retention+and+tissue+optical+properties+completely+account+for+the+higher+photodynamic+efficacy+of+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin+vs+Photofrin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin.</a> Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).</li>
<li>Ma, L., Moan, J., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+new+photosensitizer%2C+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin%2C+for+use+in+photodynamic+therapy%3A+a+comparison+of+its+photobiological+properties+with+those+of+two+other+photosensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers.</a> Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).</li>
<li>Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTHPC-mediated+photodynamic+therapy+is+effective+in+the+metastatic+human+143B+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells.</a> Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).</li>
<li>Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+sensitivity+of+microvascular+endothelial+cells%2C+fibroblasts+and+tumor+cells+after+in+vitro+photodynamic+therapy+with+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin.</a> Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).</li>
<li>Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Oncologist%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy in oncology.</a> Oncologist. 11, 1034-1044 (2006).</li>
<li>Burch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+canine+osseous+tumors+with+photodynamic+therapy%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych lub konfliktów interesów.

Aby osiągnąć optymalną cytotoksyczność w odpowiedzi na PDT, kluczowe znaczenie ma wybór odpowiednich ustawień światła laserowego i czasu inkubacji. Opisane tutaj procedury są spójne i skuteczne w określaniu wychwytu PS i ilościowym określaniu cytotoksyczności indukowanej PDT in vitro. Korzystając ze specyficznych długości fal absorpcyjnych PS mTHPC, wychwyt komórkowy PS można określić w sposób bezpośredni, a PS można aktywować w celu wytworzenia cytotoksycznych reaktywnych form tlenu.
<p class="jove_content"...

Dzisiejsze najnowocześniejsze leczenie kostniakomięsaka (OS), pierwotnego guza kości, obejmuje połączenie neoterapii uzupełniającej i chirurgii. Ten schemat leczenia wykazał wzrost przeżywalności pacjentów z chorobą zlokalizowaną z około 20% przed zastosowaniem chemioterapii do obecnie między 60-70%3,4. Jednak w ciągu ostatnich dwóch dekad całkowite przeżycie pacjentów z OS z chorobą miejscową ustabilizowało się na poziomie 4,5. Co więcej, u 30-40% tych pacjentów dochodzi do nawrotu choroby w ciągu 3 lat od rozpoznania, a pacjenci z chorobą przerzutową nadal mają słabe przeżycie wynoszące 20-30%4,6,7. Aby poprawić wyniki leczenia tych pacjentów, należy opracować nowe strategie terapeutyczne.
Terapia Fotodynamiczna (PDT), dość nowatorska terapia przeciwnowotworowa, wykorzystuje światło o określonej długości fali do wzbudzenia fotosensybilizatora (PS), który gromadzi się w komórkach nowotworowych po wstrzyknięciu do krwiobiegu. Wzbudzenie światłem laserowym PS generuje rodniki tlenowe w obecności tlenu, które indukują reakcję cytotoksyczną w komórkach nowotworowych i śmierć komórki. Oprócz tego podstawowego mechanizmu, dwa dodatkowe procesy biologiczne wywołane PDT przyczyniają się do zmniejszenia wzrostu guza: PDT powoduje zwężenie naczyń krwionośnych i tworzenie się skrzepliny w mikrokrążeniu guza, a w konsekwencji miejscowe niedotlenienie i niedotlenienie wewnątrz guza, co prowadzi do zawału guza. Wreszcie, uszkodzone i umierające komórki nowotworowe PDT wywołują miejscową odpowiedź immunologiczną, co jest dość unikalną cechą PDT. Wiąże się to z układem dopełniacza i aktywacją komórek dendrytycznychprezentujących antygen 8. W ten sposób tworzone są warunki do prezentacji antygenów nowotworowych z późniejszą aktywacją komórek limfatycznych, co prowadzi do odporności swoistej dla nowotworu.
Do tej pory PDT było stosowane w leczeniu kilku typów guzów tkanek miękkich i hiperplazji, takich jak rogowacenie słoneczne, przełyk Barretta, guzy wewnątrzoskrzelowe, rak pęcherza moczowego, rak podstawnokomórkowy oraz paliatywne leczenie raka głowy i szyi2. Wiadomo, że leczenie wywołuje miejscową martwicę na dużą skalę z niewielkimi skutkami ubocznymi, a zatem ma potencjał do selektywnego eliminowania tkanki nowotworowej. Pomimo tych zalet zastosowanie PDT pozostaje technicznie bardziej wymagające niż podawanie leków chemioterapeutycznych. Aby osiągnąć maksymalną skuteczność, należy zoptymalizować stężenie PS, czas ekspozycji na światło i całkowity transfer energii świetlnej. Można to zrobić w eksperymentach in vivo, ale ze względu na stosunkowo dużą liczbę parametrów, które należy zoptymalizować, bardziej efektywne jest wstępne określenie optymalnych warunków in vitro.
W eksperymentach opisanych poniżej, testowaliśmy skuteczność in vitro PDT przy użyciu PS 5,10,15,20-tetrakis(meta-hydroksyfenylo)chloriny, w skrócie mTHPC (Rysunek 1A). mTHPC jest substancją czynną produktu leczniczego Foscan, który jest obecnie stosowany w klinice do paliatywnego leczenia raka głowy i szyi. Jest to jeden z najsilniejszych PS, wywołujący masywne uszkodzenia komórek już przy niskich stężeniach i wykazano, że jest lepszy od innych PS pod względem penetracji tkanek 9,10. Jego widmo absorpcji światła (ryc. 1B) pokazuje dwa wyraźne piki, jeden przy 417 nm, a drugi przy 652 nm, które są wykorzystywane odpowiednio do lokalizacji tkankowej akumulującego się PS i do indukcji PDT.
Obecnie trwają prace nad liposomalnym preparatem dla mTHPC. W tym miejscu opisujemy procedury ilościowego określania wchłaniania tego preparatu liposomalnego oraz wykonywania PDT w dwóch ludzkich liniach komórkowych OS ; nisko przerzutowe HOS i wysokoprzerzutowe komórki 143B. Niektóre z przedstawionych tu danych zostały zgłoszone wcześniej11. Opisane tutaj podejście umożliwia nam zbadanie wpływu fenotypu przerzutowego na skuteczność PDT. Limfocyty 143B, wstrzykiwane ortotopowo do tylnych kończyn myszy z SCID z niedoborem odporności, powodują pierwotne guzy z przerzutami do kości piszczelowej, model ściśle naśladujący ludzką chorobę przerzutową. W związku z tym proponowane eksperymenty in vitro doskonale nadają się do oceny optymalnych ustawień PDT, które mają być później wykorzystane w eksperymentach in vivo.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>PAA GmbH, Fryburg, Niemcy</td><td>E15-883</td><td></td></tr><tr><td>HAM F12</td><td>PAA GmbH, Fryburg, Niemcy</td><td>E15-817</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie surowica cielęca</td><td>płodu GIBCO, Bazylea, Szwajcaria</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>mTHPC</td><td>biolitec Research GmbH, Jena, Niemcy</td><td></td><td>Ponieważ ten preparat liposomalny pochodzi z R& D w chwili obecnej nie jest dostępny numer katalogowy. Zapas: 1,5 mg/ml; dostarczany w mieszaninie 9:1 dipalmitoilofosfatydylocholiny (DPPC) i dipalmitoilofosfatydyloglicerolu (DPPG; >czystość 99%)</td></tr><tr><td>Czytnik płytek Spectramax Gemini XS</td><td>Urządzenia molekularne, Sunnyvale, CA</td><td>ID# 861</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Zeiss Observer.Z1</td><td>Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ceralas PDT 652 nm Laser</td><td>biolitec AG, Jena, Niemcy</td><td>LD652nm2W400u</td><td></td></tr><tr><td>Rozpuszczalny w wodzie odczynnik tetrazolowy (WST)</td><td>Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Szwajcaria</td><td>1644807</td><td></td></tr></tbody></table>

cytotoksyczna skuteczność terapii fotodynamicznej w komórkach kostniakomięsaka in vitro

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

W ostatnich latach pojawiły się trudności ze znalezieniem bardziej skutecznych terapii przeciwko rakowi z mniej ogólnoustrojowymi skutkami ubocznymi. Dlatego terapia fotodynamiczna jest nowatorskim podejściem do bardziej selektywnego leczenia nowotworu.
Terapia fotodynamiczna (PDT) wykorzystująca nietoksyczny fotosensybilizator (PS), który po aktywacji światłem o określonej długości fali w obecności tlenu generuje rodniki tlenowe, które wywołują reakcję cytotoksyczną1. Pomimo zatwierdzenia przez FDA prawie dwadzieścia lat temu, PDT jest obecnie stosowana tylko w leczeniu ograniczonej liczby rodzajów raka (skóra, pęcherz moczowy) i chorób nieonkologicznych (łuszczyca, rogowacenie słoneczne)2.
Główną zaletą stosowania PDT jest możliwość przeprowadzenia miejscowego leczenia, co zapobiega ogólnoustrojowym skutkom ubocznym. Ponadto pozwala na leczenie nowotworów w delikatnych miejscach (np. wokół nerwów czy naczyń krwionośnych). W tym przypadku rozważa się śródoperacyjne zastosowanie PDT w kostniakomięsaku (OS), guzie kości, w celu celowania w pierwotne satelity guza pozostawione w tkance otaczającej guz po chirurgicznej resekcji guza. Leczenie ma na celu zmniejszenie liczby nawrotów oraz zmniejszenie ryzyka przerzutów (pooperacyjnych).
W obecnym badaniu prezentujemy procedury PDT in vitro, aby ustalić optymalne ustawienia PDT dla skutecznego leczenia powszechnie stosowanych linii komórkowych OS, które są używane do rozmnażania ludzkiej choroby w dobrze znanych mysich modelach OS piszczelowych. Wychwyt PS mTHPC badano za pomocą spektrofotometru, a fototoksyczność prowokowano za pomocą wzbudzenia mTHPC światłem laserowym przy długości fali 652 nm w celu wywołania śmierci komórki ocenianej za pomocą testu WST-1 i zliczania komórek, które przeżyły. Sprawdzone techniki pozwalają nam określić optymalne ustawienia PDT dla przyszłych badań na modelach zwierzęcych. Są one łatwym i szybkim narzędziem do oceny skuteczności PDT in vitro przed zastosowaniem in vivo.

Zastosowanie opisanych tutaj technik pozwoliło nam zbadać PDT opartą na mTHPC w ludzkich komórkach OS. W pierwszej kolejności zbadano zależne od czasu i dawki pobieranie mTHPC w liniach komórkowych OS: słabo metastatycznej HOS oraz silnie metastatycznej 143B. Pobieranie mTHPC można ocenić poprzez pomiar fluorescencji mTHPC za pomocą spektrofotometru fluorescencyjnego (Rycina 2, powielona za zgodą Reidy et al.11). Rycina 2A przedstawia pobieranie mTHPC w sposób zależny...

Opisany tutaj protokół pozwala na ocenę skuteczności terapii fotodynamicznej (PDT) w liniach komórkowych i optymalizację ustawień PDT przed zastosowaniem terapii na modelach zwierzęcych.

Cytotoksyczna skuteczność terapii fotodynamicznej w komórkach kostniakomięsaka in vitro

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykazanie cytotoksycznej skuteczności terapii fotodynamicznej w komórkach kostniakomięsaka. Osiąga się to, najpierw mierząc wewnątrzkomórkowy wychwyt fotosensybilizatora M-T-H-P-C przez komórki kostniakomięsaka. W drugim etapie światło lasera jest nakładane na komórki w celu aktywacji M-T-H-P-C i wytworzenia cytotoksycznych rodników tlenowych.Wreszcie, metabolizm komórek i liczbę komórek mierzy się za pomocą rozpuszczalnego w wodzie testu tetra oleum one lub WST one. Ostatecznie test WST one, jak również bezpośrednie zliczanie komórek, mogą być wykorzystane do pomiaru cytotoksyczności terapii fotodynamicznej na komórkach kostniakomięsaka. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii kostniakomięsaka, ponieważ umożliwia ona pomiar skuteczności terapii fotodynamicznej in vitro i przypomina technikę stosowaną obecnie u pacjentów.Aby porównać wychwyt M-T-H-P-C między liniami komórkowymi kostniakomięsaka, zacznij od posiewu 0,2 razy 10 do szóstego Hossa i 143 limfocytów B na studzienkę. W trzech egzemplarzach na płytkach sześciodołkowych pozwól komórkom przylegać przez noc do 80 do 90% płynności CO, a następnie następnego dnia inkubuj komórki ze stałym stężeniem M-T-H-P-C przez różne okresy czasu w ciemności, aby ocenić zależny od czasu wychwyt fotosensybilizatora przez komórki. Po inkubacjach odessać pożywkę i trzykrotnie przemyć komórki PBS, a następnie odłączyć komórki z 0,5 mililitra tripyny EDTA i policzyć je.Następnie wiruj komórki przez pięć minut w temperaturze 400 razy G i temperaturze pokojowej. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad w PBS do końcowej gęstości dwa razy 10 do piątych komórek na mililitr. Odpipetować 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki 96.Dobrze płytkować i mierzyć fluorescencję komórek w spektrofotometrze fluorescencyjnym ustawionym na wzbudzenie 417 nanometrów i emisję 652 nanometrów. Następnie przygotuj krzywą wzorcową, posiewając 100 mikrolitrów od zera do czterech miligramów na mililitr stężeń M-T-H-P-C w trzech egzemplarzach. Na 96-dołkowej płytce i zmierz fluorescencję, jak właśnie pokazano, aby wygenerować standardową krzywą do obliczenia względnej jednostki fluorescencji każdej komórki zawierającej studzienkę z poprzednio zmierzonej płytki.Aby zmierzyć fototoksyczność fotouczulacza, najpierw wysiewaj 3000 komórek na studzienkę w trzech egzemplarzach na każde stężenie M-T-H-P-C na 96-dołkowej płytce, w tym ciemne komórki kontrolne toksyczności dla każdego stężenia FOTOSENSYBILIZATORA. Pozwól komórkom przylegać przez noc do 50 do 60% płynności co następnego dnia. Inkubować komórki o różnych stężeniach M-T-H-P-C w ciemności przez pięć godzin po inkubacji.Odessać pożywkę i dwukrotnie umyć komórki PBS i dodać świeżą pożywkę bez M-T-H-P-C, a następnie specyficzną dla spektrum absorpcji M-T-H-P-C, stosując odpowiednią ochronę oczu. Ustaw laser diodowy o długości fali 652 nm na moc 21,88 miliwatów na centymetr kwadratowy na wysokości 13,5 centymetra. Odległość od komórek, aby uzyskać dawkę energii wynoszącą pięć dżuli na centymetr kwadratowy.Następnie oświetl komórki, z wyjątkiem ciemnych komórek kontroli toksyczności, przez 230 sekund po oświetleniu. Trzymaj komórki w ciemności w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnie dodaj 10 mikrolitrów wst, jeden odczynnik na 100 mikrolitrów pożywki trzy godziny po dodaniu wst jeden odczynnik zmierz absorbancję poszczególnych studzienek przy 415 nanometrach.Na koniec oblicz liczbę komórek, które przeżyły, oprócz jednego testu WST. Bezpośrednie liczenie komórek jest drugą metodą pomiaru toksyczności komórek. Aby obliczyć procent żywotnych komórek, wysiewaj dwa razy od 10 do czwartego komórki na studzienkę w 2 24-dołkowych płytkach i pozwól im przylegać przez noc.Następnego dnia inkubuj komórki przez pięć godzin w ciemności za pomocą M-T-H-P-C i oświetl je, jak właśnie pokazano. Utrzymuj ciemne komórki kontrolne w ciemności po 24 godzinach, zbierz supernatant, umyj komórki raz PBS i trypsyną, oczy, w końcu odwiruj komórki i ponownie zawieś osad w 200 mikrolitrach świeżej pożywki do liczenia. Wyniki zilustrowane na tym wykresie pokazują w górnym panelu wychwyt M-T-H-P-C w sposób zależny od czasu z intensywnością fluorescencji zawiesiny komórkowej reprezentującą wewnątrzkomórkowe poziomy M-T-H-P-C.W dolnym panelu. Zależny od dawki wychwyt M-T-H-P-C można ocenić, mierząc fluorescencję M-T-H-P-C za pomocą spektrofotometru fluorescencyjnego. Wykres ten ilustruje wychwyt ustalonego stężenia M-T-H-P-C w sposób zależny od czasu z intensywnością fluorescencji zawiesiny komórkowej reprezentującej wewnątrzkomórkowe poziomy M-T-H-P-C.Na tym wykresie pokazano zależny od dawki wychwyt M-T-H-P-C w komórkach Haassa i 143 limfocytach B po pięciogodzinnej inkubacji. Wychwyt w linii komórek macierzystych 143 B o wysokim przerzutach był znacznie wyższy niż w linii komórek macierzystych gospodarza o niskim przerzutach. Wykazano zależną od dawki ciemną toksyczność komórek kostniakomięsaka.143 limfocyty B potraktowano różnymi dawkami M-T-H-P-C i porównano z komórkami nieleczonymi i zaobserwowano zależny od dawki spadek aktywności metabolicznej i liczby komórek mierzony za pomocą jednego testu. Zmniejszoną żywotność komórek stwierdzono przy stężeniu M-T-H-P-C równym i wyższym niż 2,5 mikrograma na mililitr. Na dolnym wykresie zilustrowano toksyczność M-T-H-P-C zależną od dawki.Komórki traktowano różnymi dawkami M-T-H-P-C, a następnie naświetlano je w tempie pięciu dżuli na centymetr kwadratowy. W konsekwencji zaobserwowano spadek aktywności metabolicznej komórek, a także spadek liczby komórek. Opracowanie tej techniki utorowało drogę naukowcom zajmującym się biologią nowotworów do zastosowania tej metody w modelach kostniakomięsaka in vivo, a także w innych badaniach przedklinicznych.

cytotoxic-efficacy-photodynamic-therapy-osteosarcoma-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Skuteczność cytotoksyczna terapii fotodynamicznej w komórkach osteosarcoma in vitro

Terapia fotodynamiczna (PDT) jest nieinwazyjną i niechirurgiczną metodą leczenia raka płuc. Fotouczulacze selektywnie kumulują się w tkance nowotworowej i prowadzą do śmierci komórek nowotworowych w obecności tlenu i odpowiedniej długości fali światła. W tym filmie z protokołem metoda oparta na PDT jest stosowana do oceny potencjału fototoksycznego potencjalnego fotosensybilizatora w komórkach raka płuc.

Test fototoksyczności in vitro: metoda oparta na PDT do oceny potencjału fototoksycznego fotosensybilizatora w komórkach raka płuc

Terapia fotodynamiczna (PDT) jest nieinwazyjną i niechirurgiczną metodą leczenia raka płuc. Fotouczulacze selektywnie kumulują się w tkance nowotworowej i prowadzą do śmierci komórek nowotworowych w obecności tlenu i odpowiedniej długości fali światła. Ten film opisuje analizę skuteczności przeciwnowotworowej in vivo przy użyciu fotouczulacza zawierającego nanocząstki u myszy z nowotworem, w celu określenia potencjału fototoksycznego fotouczulacza.

Analiza skuteczności przeciwnowotworowej PDT in vivo: technika określania potencjału fototoksycznego fotouczulacza u myszy z nowotworem

Tutaj, monitorowanie metabolizmu komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym, w połączeniu z modelem przerzutów in vivo błony kosmówkowo-omocznikowej (CAM) zarodka kurczaka, są wykorzystywane do oceny nowych celów/środków przeciwnowotworowych pod kątem ich zdolności do uwrażliwiania komórek nowotworowych na chemoterapeutyki uszkadzające DNA.

Ocena skuteczności uczulenia na leki przeciwnowotworowe in vitro i in vivo

Terapia fotodynamiczna (PDT) jest alternatywnym wyborem w leczeniu raka płuc. Aby zwiększyć efekt terapeutyczny PDT, opracowano nanocząstki ukierunkowane na raka płuc w połączeniu z chemioterapią. Oceniano zarówno skuteczność przeciwnowotworową PDT in vitro, jak i in vivo z przygotowanymi nanocząstkami.

Skuteczność przeciwnowotworowa terapii fotodynamicznej nanocząstkami ukierunkowanymi na raka płuc

Bezpośrednie wstrzykiwanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzenia rakowego (EV) prowadzi do przeprogramowania szpiku kostnego, co wspomaga postęp nowotworu; jednak nie jest jasne, które komórki pośredniczą w tym efekcie. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół badania interakcji nowotworowo-mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) za pośrednictwem EV in vivo, ujawniając kluczową rolę MSC edukowanych przez EV w przerzutach.

Przedkliniczny mysi model kostniakomięsaka w celu zdefiniowania komunikacji za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych między guzem a mezenchymalnymi komórkami macierzystymi

Terapia fotodynamiczna (PDT) to procedura medyczna, która polega na inkubacji egzogennie zastosowanego fotouczulacza (PS), a następnie fotoaktywacji światłem widzialnym w celu wywołania apoptozy. Przedstawiamy protokół PDT in vitro przeznaczony do symulacji PDT, który może być wykorzystany do badania różnic w inkubacji PS i parametrach leczenia światłem.

Podejście in vitro do terapii fotodynamicznej

Obecny protokół opisuje wstrzykiwanie komórek do kostniakomięsaka kości piszczelowej w celu wygenerowania modeli myszy z ortotopowym kostniakomięsakiem i przerzutami do płuc.

Wstrzyknięcie komórek kostniakomięsaka piszczelowego w celu wygenerowania ortotopowego kostniakomięsaka i mysich modeli przerzutów do płuc

Tutaj opisujemy nowatorskie, proste i tanie urządzenie do skutecznego przeprowadzania testów terapii fotodynamicznej in vitro (PDT) przy użyciu dwuwymiarowej hodowli komórek HeLa i werteporfiny jako fotosensybilizatora.

Zbudowane przez nas urządzenie do terapii fotodynamicznej oparte na diodach elektroluminescencyjnych do zwiększania cytotoksyczności werteporfiny w modelu hodowli komórkowej 2D

Ten protokół przedstawia zestaw eksperymentów przyjętych do oceny fotoprzełączalnych peptydów przeciwnowotworowych, które mogą być użyte w przedklinicznych badaniach przesiewowych takich związków. Obejmuje to ocenę cytotoksyczności w hodowlach komórkowych 2D i 3D, ocenę skuteczności fotoizomeryzacji ex vivo (tkanki modelowej) oraz skuteczności in vivo.

Ocena in vitro i in vivo fotokontrolowanych związków biologicznie czynnych - potencjalni kandydaci na leki w fotofarmakologii nowotworów

Obecny protokół opisuje metodę tworzenia mysiego modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX) przy użyciu ludzkiej tkanki kostniakomięsaka.

Opracowanie mysiego modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta z tkankami ludzkiego kostniakomięsaka

Poznaj skuteczność fotodynamicznej terapii przeciwnowotworowej w komórkach kostniakomięsaka in vitro. Metoda obejmuje pomiar wchłaniania fotouczulacza M-T-H-P-C i ocenę cytotoksyczności za pomocą testu WST-1.

Cytotoksyczna skuteczność terapii fotodynamicznej w komórkach kostniakomięsaka in vitro

Przeglądaj więcej filmów