Cytotoksyczna skuteczność terapii fotodynamicznej w komórkach kostniakomięsaka in vitro

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykazanie cytotoksycznej skuteczności terapii fotodynamicznej w komórkach kostniakomięsaka. Osiąga się to, najpierw mierząc wewnątrzkomórkowy wychwyt fotosensybilizatora M-T-H-P-C przez komórki kostniakomięsaka. W drugim etapie światło lasera jest nakładane na komórki w celu aktywacji M-T-H-P-C i wytworzenia cytotoksycznych rodników tlenowych.

Wreszcie, metabolizm komórek i liczbę komórek mierzy się za pomocą rozpuszczalnego w wodzie testu tetra oleum one lub WST one. Ostatecznie test WST one, jak również bezpośrednie zliczanie komórek, mogą być wykorzystane do pomiaru cytotoksyczności terapii fotodynamicznej na komórkach kostniakomięsaka. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii kostniakomięsaka, ponieważ umożliwia ona pomiar skuteczności terapii fotodynamicznej in vitro i przypomina technikę stosowaną obecnie u pacjentów.

Aby porównać wychwyt M-T-H-P-C między liniami komórkowymi kostniakomięsaka, zacznij od posiewu 0,2 razy 10 do szóstego Hossa i 143 limfocytów B na studzienkę. W trzech egzemplarzach na płytkach sześciodołkowych pozwól komórkom przylegać przez noc do 80 do 90% płynności CO, a następnie następnego dnia inkubuj komórki ze stałym stężeniem M-T-H-P-C przez różne okresy czasu w ciemności, aby ocenić zależny od czasu wychwyt fotosensybilizatora przez komórki. Po inkubacjach odessać pożywkę i trzykrotnie przemyć komórki PBS, a następnie odłączyć komórki z 0,5 mililitra tripyny EDTA i policzyć je.

Następnie wiruj komórki przez pięć minut w temperaturze 400 razy G i temperaturze pokojowej. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad w PBS do końcowej gęstości dwa razy 10 do piątych komórek na mililitr. Odpipetować 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki 96.

Dobrze płytkować i mierzyć fluorescencję komórek w spektrofotometrze fluorescencyjnym ustawionym na wzbudzenie 417 nanometrów i emisję 652 nanometrów. Następnie przygotuj krzywą wzorcową, posiewając 100 mikrolitrów od zera do czterech miligramów na mililitr stężeń M-T-H-P-C w trzech egzemplarzach. Na 96-dołkowej płytce i zmierz fluorescencję, jak właśnie pokazano, aby wygenerować standardową krzywą do obliczenia względnej jednostki fluorescencji każdej komórki zawierającej studzienkę z poprzednio zmierzonej płytki.

Aby zmierzyć fototoksyczność fotouczulacza, najpierw wysiewaj 3000 komórek na studzienkę w trzech egzemplarzach na każde stężenie M-T-H-P-C na 96-dołkowej płytce, w tym ciemne komórki kontrolne toksyczności dla każdego stężenia FOTOSENSYBILIZATORA. Pozwól komórkom przylegać przez noc do 50 do 60% płynności co następnego dnia. Inkubować komórki o różnych stężeniach M-T-H-P-C w ciemności przez pięć godzin po inkubacji.

Odessać pożywkę i dwukrotnie umyć komórki PBS i dodać świeżą pożywkę bez M-T-H-P-C, a następnie specyficzną dla spektrum absorpcji M-T-H-P-C, stosując odpowiednią ochronę oczu. Ustaw laser diodowy o długości fali 652 nm na moc 21,88 miliwatów na centymetr kwadratowy na wysokości 13,5 centymetra. Odległość od komórek, aby uzyskać dawkę energii wynoszącą pięć dżuli na centymetr kwadratowy.

Następnie oświetl komórki, z wyjątkiem ciemnych komórek kontroli toksyczności, przez 230 sekund po oświetleniu. Trzymaj komórki w ciemności w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnie dodaj 10 mikrolitrów wst, jeden odczynnik na 100 mikrolitrów pożywki trzy godziny po dodaniu wst jeden odczynnik zmierz absorbancję poszczególnych studzienek przy 415 nanometrach.

Na koniec oblicz liczbę komórek, które przeżyły, oprócz jednego testu WST. Bezpośrednie liczenie komórek jest drugą metodą pomiaru toksyczności komórek. Aby obliczyć procent żywotnych komórek, wysiewaj dwa razy od 10 do czwartego komórki na studzienkę w 2 24-dołkowych płytkach i pozwól im przylegać przez noc.

Następnego dnia inkubuj komórki przez pięć godzin w ciemności za pomocą M-T-H-P-C i oświetl je, jak właśnie pokazano. Utrzymuj ciemne komórki kontrolne w ciemności po 24 godzinach, zbierz supernatant, umyj komórki raz PBS i trypsyną, oczy, w końcu odwiruj komórki i ponownie zawieś osad w 200 mikrolitrach świeżej pożywki do liczenia. Wyniki zilustrowane na tym wykresie pokazują w górnym panelu wychwyt M-T-H-P-C w sposób zależny od czasu z intensywnością fluorescencji zawiesiny komórkowej reprezentującą wewnątrzkomórkowe poziomy M-T-H-P-C.

W dolnym panelu. Zależny od dawki wychwyt M-T-H-P-C można ocenić, mierząc fluorescencję M-T-H-P-C za pomocą spektrofotometru fluorescencyjnego. Wykres ten ilustruje wychwyt ustalonego stężenia M-T-H-P-C w sposób zależny od czasu z intensywnością fluorescencji zawiesiny komórkowej reprezentującej wewnątrzkomórkowe poziomy M-T-H-P-C.

Na tym wykresie pokazano zależny od dawki wychwyt M-T-H-P-C w komórkach Haassa i 143 limfocytach B po pięciogodzinnej inkubacji. Wychwyt w linii komórek macierzystych 143 B o wysokim przerzutach był znacznie wyższy niż w linii komórek macierzystych gospodarza o niskim przerzutach. Wykazano zależną od dawki ciemną toksyczność komórek kostniakomięsaka.

143 limfocyty B potraktowano różnymi dawkami M-T-H-P-C i porównano z komórkami nieleczonymi i zaobserwowano zależny od dawki spadek aktywności metabolicznej i liczby komórek mierzony za pomocą jednego testu. Zmniejszoną żywotność komórek stwierdzono przy stężeniu M-T-H-P-C równym i wyższym niż 2,5 mikrograma na mililitr. Na dolnym wykresie zilustrowano toksyczność M-T-H-P-C zależną od dawki.

Komórki traktowano różnymi dawkami M-T-H-P-C, a następnie naświetlano je w tempie pięciu dżuli na centymetr kwadratowy. W konsekwencji zaobserwowano spadek aktywności metabolicznej komórek, a także spadek liczby komórek. Opracowanie tej techniki utorowało drogę naukowcom zajmującym się biologią nowotworów do zastosowania tej metody w modelach kostniakomięsaka in vivo, a także w innych badaniach przedklinicznych.