Metoda ekspansji stosowana do cGMP dla agregatów ludzkich nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych lub tkanki mózgowej płodu
15 czerwca 2014
Ten protokół opisuje nowatorską metodę mechanicznego siekania, która pozwala na ekspansję sferycznych agregatów nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych bez dysocjacji do zawieszenia pojedynczej komórki. Utrzymanie kontaktu komórka/komórka pozwala na szybki i stabilny wzrost przez ponad 40 przejść.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest efektywne przejście neurosfer tak, aby kontakt między komórkami był utrzymywany przez cały okres życia hodowanych komórek. Technika ta stwarza warunki ekspansji wymagane dla ludzkich nerwowych komórek progenitorowych. Osiąga się to poprzez połączenie do dwóch kolb T 1 75 tych samych komórek i przeniesienie do stożkowej rurki, co pozwala na przeniesienie kulek na szalkę Petriego jako drugi krok skondensowanych do zawieszonych neurosfer w łatwą do opanowania masę na szalce Petriego, co pozwala ostrzu pociąć NPC H na małe skupiska.
Następnie pasażowane lub rozdrobnione neurosfery są ponownie zawieszane w celu usunięcia komórek z szalki Petriego i wsadzenia do nowych kolb. Uzyskano wyniki, które pokazują, że technika siekania zapewnia długoterminową strategię wzrostu opartą na krzywych ekspansji, wykazując długoterminowe logarytmiczne tempo wzrostu w porównaniu z komórkami pasażowanymi za pomocą standardowego podejścia enzymatycznego. Wizualna demonstracja tej techniki ma kluczowe znaczenie jako sfera.
Etapy kondensacji są trudne do opisania na piśmie. Istnieje również kilka sztuczek, które mogą pomóc w tym procesie. Jeśli nadmiar pożywki nie zostanie całkowicie usunięty z szalki Petriego, kule zostaną po prostu przepchnięte w pożywce, zamiast podzielić się na mniejsze skupiska.
Rozpocznij tę procedurę od zwrócenia uwagi na kolor pożywki kolby H. Przeskanuj kolbę pod mikroskopem, aby obserwować komórki. Jeśli to możliwe, użyj rodnika, aby zbadać rozmiar kilku kul.
Jeśli wiele kulek ma średnicę 300 mikrometrów lub większą, kontynuuj proces siekania i siekaj komórki co siedem do 10 dni. Następnie umieść kolbę z powrotem w inkubatorze i ustaw rozdrabniacz. Włącz wyłącznik zasilania helikoptera.
W BSC ustaw grubość cięcia na 200 mikrometrów, a siłę ostrza na 180 stopni lub pozycję godziny dziewiątej. Następnie upewnij się, że pokrętło automatycznej prędkości jest obrócone tak daleko, jak to możliwe w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Następnie przesuń pokrętło zwalniające stół jak najdalej w prawo i upewnij się, że uchwyt talerza jest stabilny.
Obróć manipulator ramienia ręcznego zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby podnieść ramię do maksymalnego poziomu. Następnie w asepcie przenieś sterylne obosieczne ostrze do siekania na ramienia rozdrabniacza. Za pomocą kleszczy umieść zapięcie na ostrzu za pomocą kleszczy.
Zakrzywiona część zapięcia musi znajdować się nad górną krawędzią ramienia. Następnie przytrzymaj zapięcie na ramieniu i przymocuj nakrętkę do. Ze sterylnym kluczem do nakrętek, pozostawiając nakrętkę luźną o ćwierć obrotu.
W tej procedurze należy przenieść sugerowaną ilość pożywki konserwacyjnej do nowej kolby. Następnie w asepcie przenieś komórki z inkubatora do BSC. Oprzyj kolbę na stojaku na probówki i pozwól, aby kulki osiadły w kolbie.
Jeden się ustatkował. Aspirowany do 12 mililitrów supernatantu. Za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej spłukać wszystkie luźno przylegające kulki z powierzchni kolby.
Powtórz w razie potrzeby i pozwól kulom osiąść między Renami. Następnie przenieść sugerowaną objętość kondycjonowanego podłoża do nowej kolby. Następnie przenieś wszystkie pozostałe kondycjonowane media i kulki do nowej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.
Pozwolić, aby kulki opadły i wyrzucić zużytą kolbę. Następnie powoli przenieś komórki z 15-mililitrowej stożkowej rurki na 60-milimetrową szalkę Petriego lub krążek podkładkowy w najmniejszej możliwej objętości. Zachowaj pozostałą kondycjonowaną pożywkę, ponieważ zostanie ona użyta do wypłukania komórek z naczynia po posiekaniu .
Staraj się zminimalizować powierzchnię pokrytą przez media i kulki na naczyniu. Następnie rozpocznij kondensację puli kul, przenosząc super natin z powrotem do 15-mililitrowej stożkowej rurki. Usuń jak najwięcej pożywki z górnej części puli komórek pożywki za pomocą mikropipetera z barierą aerozolową.
Dopóki nie będzie można usunąć mediów bez kulek, rozłóż pulę. Używając boku końcówki pipety, aby zwiększyć powierzchnię, lekko przechyl szalkę Petriego i użyj boku końcówki pipety, aby delikatnie przesunąć wszystkie kulki na jedną stronę basenu. Po przeniesieniu wszystkich komórek powoli przechyl szalkę Petriego w przeciwnym kierunku, aby umożliwić pożywce oddzielenie się od kulek.
Następnie przenieś oczyszczone media z powrotem do 15-mililitrowej stożkowej rurki. Użyj boku końcówki pipety, aby delikatnie przesunąć wszystkie kulki z powrotem do środka szalki Petriego. Tak więc basen ma średnicę od 0,5 do 2,4 centymetra.
Ważne jest, aby głębokość basenu kulowego była płytka. Jeśli basen jest zbyt głęboki, kule zostaną zepchnięte na bok podczas siekania. Teraz przenieś szalkę Petriego na uchwyt talerza i zabezpiecz go pod haczykami uchwytu talerza.
Użyj pokrętła zwalniającego stół, aby przesunąć uchwyt płyty w lewo, tak aby ostrze znalazło się z dala od kulek i zostało zablokowane w biegu. Następnie opuść ramię rozdrabniacza, obracając pokrętło manipulatora ręcznego zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż ostrze zatrzaśnie się płasko na szalce Petriego. Naciśnij uchwyt ramienia podczas dokręcania nakrętki.
Następnie naciśnij przycisk resetowania. Raz ustabilizowaj szalkę Petriego jedną ręką, obracając pokrętło manipulatora ramienia automatycznego zgodnie z ruchem wskazówek zegara do pozycji 90 stopni lub godziny 12 i rozpocznij siekanie, gdy wszystkie kulki zostaną posiekane. Obróć uchwyt płyty o 90 stopni.
Następnie poluzuj, opuść ramię i ponownie dokręć nakrętkę. Powtórz procedurę siekania. Następnie w asepcie przenieść szalkę Petriego z uchwytu płytki do przestrzeni roboczej w BSC.
Przenieś jeden mililitr kondycjonowanego podłoża na posiekane kulki. Następnie delikatnie ponownie zawieś i przenieś posiekane kulki do nowej 15-mililitrowej stożkowej tuby. Staraj się unikać tworzenia bąbelków i powtarzaj tyle razy, ile to konieczne, aby zebrać posiekane kulki.
Zmierz objętość kondycjonowanych pożywek i posiekanych kulek. Dodać odpowiednią ilość pożywki konserwacyjnej, aby osiągnąć sugerowaną objętość w tabeli drugiej kolumny E. Następnie Eloqua zawiesinę kulki do każdej nowej kolby przenosi zawiesinę kulki tylko do jednej kolby na raz i ponownie zawiesza kulki między transferami. Końcowa objętość w każdej kolbie powinna być równa sugerowanej objętości w tabeli drugiej kolumna F. Umieść posiekane h NPC w inkubatorze.
Rysunek ten przedstawia przewidywaną liczbę komórek H NPC zamrożonych w pasażu 19, a następnie rozmrożonych i rozdwojonych jako przylegająca monowarstwa przy użyciu dysocjacji enzymatycznej w porównaniu z neurosferami pasażowanymi metodą siekania. Oto reprezentatywne obrazy wstępnie posiekanych i posiekanych kul w powiększeniu 10x. Ten obraz pokazuje NPC 29 H w pasażu rozmrażania, które były posiewane przez jeden dzień i barwione w celu gniazdowania i ekspresji, podczas gdy ten obraz pokazuje NPC 29 H w przejściu rozmrażania, które były posiewane przez siedem dni przy braku czynników wzrostu i barwione na GFAP i beta trzy tubuliny.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać techniki automatycznego siekania do pasażowania HBC, która utrzymuje kontakt między komórkami przez całe życie komórek i hodowli. Procedura ta może być dostosowana do wielu typów komórek, takich jak neurokomórki macierzyste pochodzące z komórek pluripotencjalnych lub sfery sercowo-naczyniowe.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje nową metodę mechanicznego siekania, która umożliwia ekspansję sferycznych agregatów neuralnych komórek macierzystych i progenitorowych bez konieczności dysocjacji do zawiesiny pojedynczych komórek. Zachowanie kontaktu międzykomórkowego pozwala na szybki i stabilny wzrost przez ponad 40 pasażowań.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Badania nad komórkami macierzystymi
Wstęp
- Efektywne pasażowanie neurosfer jest kluczowe dla utrzymania żywotności komórek.
- Tradycyjne metody często zakłócają kontakty międzykomórkowe.
- Niniejsze badanie analizuje technikę mechanicznego siekania w celu przyspieszenia wzrostu.
- Strategie długoterminowej hodowli są niezbędne w przypadku ludzkich komórek progenitorowych neuronów.
Cel badania
- Opracowanie metody pozwalającej na zachowanie kontaktu międzykomórkowego podczas pasażowania.
- Porównanie tempa wzrostu posiekanych neurosfer w stosunku do standardowych metod enzymatycznych.
- Przedstawienie wizualnej demonstracji techniki siekania.
Zastosowane metody
- Łączenie do dwóch kolb T 1 75 zawierających te same komórki.
- Przenoszenie komórek do probówki stożkowej w celu dalszej obróbki.
- Rozdrabnianie agregatów na małe klastry za pomocą ostrza.
- Resuspensja posiekanych neurosfer w celu przeniesienia ich do nowych kolb.
Główne wyniki
- Technika siekania sprzyja utrzymaniu długoterminowych logarytmicznych tempo wzrostu.
- Wyniki wskazują na poprawę wzrostu w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Demonstracje wizualne podkreślają skuteczność tej techniki.
- Posiekane neurosfery wykazały lepszą przeżywalność komórek w czasie.
Wnioski
- Metoda mechanicznego siekania jest skuteczna w namnażaniu komórek progenitorowych neuronów.
- Zachowanie kontaktu międzykomórkowego jest kluczowe dla optymalnego wzrostu.
- Technika ta stanowi obiecującą alternatywę dla pasażowania enzymatycznego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta mechaniczna metoda siekania umożliwia skalowalną ekspansję agregatów ludzkich neuralnych komórek macierzystych i progenitorowych przy jednoczesnym zachowaniu krytycznych kontaktów międzykomórkowych, co rozwiązuje kluczowy problem wąskiego gardła w produkcji komórek macierzystych zarówno do celów badawczych, jak i klinicznych. Dzięki uniknięciu dysocjacji enzymatycznej technika ta zmniejsza presję na różnicowanie oraz ryzyko starzenia się komórek, wspierając spójną produkcję klinicznie istotnych produktów neuralnych w warunkach cGMP. Pozycjonuje to tę metodę jako wartościowe narzędzie do ograniczania ryzyka we wczesnej fazie walidacji celów neuralnych oraz umożliwia generowanie powtarzalnych modeli przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na zachowanie fizjologicznych oddziaływań międzykomórkowych w kulturach progenitorów neuronalnych, co wspiera badania nad angażowaniem celów o większej relewancji biologicznej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia długoterminową ekspansję przez ponad 40 pasaży, zapewniając stałą podaż komórek dla iteracyjnych kampanii walidacji celów.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na otrzymanie jednorodnych kultur sferoidów, odpowiednich do standaryzowanych formatów testów wymagających 3D architektury komórkowej.
- Wartość operacyjna: Generuje wysoką wydajność (>50 milionów komórek na kolbę T175) w porównaniu z kulturami adherentnymi, co zwiększa przepustowość screeningu i efektywność wykorzystania odczynników.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie istotne dla chorób poprzez ekspansję komórek pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych lub tkanki płodowej bez dryfu fenotypowego.
- Wartość operacyjna: Zgodność z zasadami cGMP, co ułatwia płynne przejście z etapu odkryć do produkcji w skali klinicznej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda siekania wpisuje się w kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając niezawodną ekspansję neuralnych komórek progenitorowych w celu walidacji celu, opracowania testów oraz redukcji ryzyka mechanistycznego przed identyfikacją związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez długotrwałą hodowlę fizjologicznie istotnych agregatów neuronalnych.
- Screening: Zapewnia powtarzalne wyniki przy wysokiej liczbie komórek, co jest niezbędne do standaryzacji testów i kampanii screeningu związków.
- Analityka: Umożliwia kwantyfikację kinetyki ekspansji i wskaźników żywotności w celu podjęcia decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań.
- Badania translacyjne: Zachowuje wierność komórkową od etapu odkryć po walidację przedkliniczną, redukując zmienność biologiczną.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Tworzy skalowalną, zautomatyzowaną platformę pasażowania, którą można zastosować dla wielu źródeł neuronalnych komórek macierzystych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Pewność predykcyjna dzięki zachowaniu naturalnych kontaktów międzykomórkowych i ograniczeniu artefaktów indukowanych hodowlą.
- Wartość operacyjna: Standaryzowane, mechaniczne pasażowanie minimalizuje zmienność zależną od użytkownika i wspiera skalowalne, powtarzalne procesy.
- Wartość strategiczna: Redukcja ryzyka biologicznego w programach celowanych w tkankę nerwową poprzez zapewnienie spójnej jakości komórek w kolejnych pasażach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia podejmowanie decyzji o rozwoju skorygowanych o ryzyko dzięki niezawodnym dostawom komórek zgodnym z cGMP do badań przedklinicznych i klinicznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga przeszkolenia w zakresie technik aseptycznych oraz obsługi mechanicznej siekarki.
- Zależy od dostępu do sterylnych ostrzy, probówek stożkowych, szalek Petriego i inkubatorów.
- Wymaga ustandaryzowanych etapów kondensacji i resuspensji w celu zapewnienia spójnego rozkładu wielkości sfer.
- Adaptacja w różnych systemach modelowych może wymagać optymalizacji grubości siekania i siły nacisku ostrza.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność ręcznego usuwania pożywki podczas kondensacji, co może wpływać na wydajność, jeśli nie zostanie zoptymalizowane.
