Name: Metoda ekspansji stosowana do cGMP dla agregatów ludzkich nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych lub tkanki mózgowej płodu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Naucz się metody mechanicznego siekania do ekspansji sfer nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych człowieka przy zachowaniu kontaktu międzykomórkowego. Technika ta umożliwia stabilny wzrost przez ponad 40 pasowań.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Soshanie Svendsen za krytyczną recenzję i redakcję tego raportu. Do tej pracy przyczynili się NIH/NINDS 1U24NS078370-01 i CIRM DR2A-05320.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

<img alt="Schemat procesu hodowli neuralnych komórek macierzystych; izolacja kory płodowej, grupowanie, etapy pasażowania mediów." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51219/51219fig6highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Schemat siekania. Namnażanie sferoidalnych komórek macierzystych/progenitorowych w hodowli z wykorzystaniem mechanicznej metody siekania.
Kluczowe etapy
...

A correction was made to <a href="/video/51219">A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue</a>. The corresponding author was changed from:
Brandon C. Shelley 
to:
Clive Svendsen

A correction was made to <a href="/video/51219">A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue</a>. The corresponding author was changed.

Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

Istnieje długa historia ekspansji nerwowych komórek macierzystych gryzoni w hodowli jako monowarstwa1-3 lub zagregowane neurosfery4-7. Ponadto ludzkie neuronalne komórki progenitorowe (hNPC) wyizolowane z różnych regionów rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego8-17 zostały namnażone in vitro. Komórki te są bipotencjalne, zdolne do różnicowania się zarówno w astrocyty, jak i neurony, i są bardzo przydatnym narzędziem w badaniu rozwoju neuronalnego18,19 i mechanizmu choroby20,21. hNPC zostały również przeszczepione do wielu różnych modeli zwierzęcych choroby ośrodkowego układu nerwowego o różnym poziomie integracji, przeżycia i efektów funkcjonalnych22-24.
Tradycyjnie, NPC pochodzące od gryzoni lub ludzkich płodów są narażone na czynniki wzrostu - często naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) i/lub czynnik wzrostu fibroblastów-2 (FGF-2)25-28 - i zarówno przylegające29, jak i trójwymiarowe systemy sferoidalne są zazwyczaj pasażowane za pomocą dysocjacji enzymatycznej do zawiesiny jednokomórkowej30-34. Standardową metodą namnażania komórek do celów badawczych lub klinicznych jest adherentna monowarstwa ze względu na łatwą manipulację. Wykazaliśmy jednak, że pasażowanie jednowarstwowych i neurosferycznych hNPC z roztworami enzymatycznymi lub chemicznymi powodowało wczesne starzenie się35. Ponadto dysocjacja enzymatyczna może powodować zwiększony poziom różnicowania i nieprawidłowości kariotypowe na podstawie danych wykazanych na embrionalnych komórkach macierzystych36-38. Chociaż standardowa metoda pasażowania hNPC pozwoliła na opracowanie aktualnych produktów klasy dobrej praktyki wytwarzania (cGMP), które przeszły do badań klinicznych fazy 1 (Stem Cells Inc., Neuralstem Inc.), metoda ta pozwoliła tylko na kilka rund amplifikacji komórek, co ograniczyło potencjał bankowania.
Oczywiście, duże eksperymenty badawcze i przyszłe próby kliniczne mogłyby skorzystać z możliwości masowego rozmnażania komórek i opóźnionego starzenia, co pozwoliłoby na wzrost na dużą skalę i bankowanie komórek. Aby odpowiedzieć na tę potrzebę, opracowaliśmy nowatorski i zautomatyzowany sposób mechanicznego przechodzenia nienaruszonych neurosfer poprzez "krojenie" ich na małe skupiska w celu utrzymania kontaktu między komórkami. Metoda ta znacznie wydłużyła ich żywotność39 , a hodowla zawiesinowa pozwala na bardziej efektywne wykorzystanie przestrzeni inkubatora w porównaniu z kulturami jednowarstwowymi, co widać w przypadku alternatywnej metody hodowli w bioreaktorze3D 40. Dostarczony protokół siekania pozwala na produkcję dużych banków z jednej próbki płodu większej niż pasaż 10, co jest mało prawdopodobnym wyczynem przy użyciu standardowych metod pasażowania. Chociaż ta metoda pasażowania hNPC jest niekonwencjonalna, zyskuje na popularności i została niedawno opublikowana z innymi typami komórek, takimi jak nerwowe komórki macierzyste pochodzące z ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, umożliwiając ekspansję na dużą skalę do różnych zastosowań, w tym modelowania chorób in vitro 41-46. Co ważne, przy użyciu metody siekania stworzono już bank komórek hNPC klasy cGMP, co pokazuje, że technika ta może być stosowana w przyszłych zastosowaniach klinicznych.

<table><tbody><tr><td>Zlewka, 50 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-100-50</td><td>wielu producentów/dostawców</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego, klasa II</td><td>Baker</td><td>SG-603A</td><td>Model 4 stopy lub 6 stóp.&nbsp; Zalecany model 6 stóp; wielu producentów/dostawców</td></tr><tr><td>Ostrza, Przygotowanie dwukrawędziowe</td><td>Personna</td><td>74-0002</td><td>wielu producentów / dostawców.&nbsp; UWAGA: Sharp</td></tr><tr><td>Cell Freezing Media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6295-50ML</td><td>DMSO, wirówka bez surowicy</td></tr><tr><td>, wiadro wahadłowe z wkładkami 15 ml</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>wielu producentów/dostawców</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe, 15 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>S50712</td><td>wielu producentów / dostawców</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe, 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352074</td><td>wielu producentów/ dostawcy</td></tr><tr><td>Strugarka</td><td>do zamrażarek o kontrolowanej szybkości</td><td>Kryo 750</td><td>wielu producentów/dostawców</td></tr><tr><td>Kriowiale 2 ml</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>wielu producentów/dostawców</td></tr><tr><td>Kolba hodowlana, wentylowana, T12.5</td><td>BD Falcon</td><td>353107</td><td>wielu producentów/dostawców</td></tr><tr><td>Kolba hodowlana, wentylowana, T25</td><td>BD Falcon</td><td>353081</td><td>wielu producentów/dostawców</td></tr><tr><td>Kolba hodowlana, wentylowana, T175</td><td>BD Falcon</td><td>353045</td><td>wielu producentów/dostawców</td></tr><tr><td>Kolba hodowlana, wentylowana, T75&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353110</td><td>wielu producentów/dostawców</td></tr><tr><td>Filtr, 0,22 i mikro; m, dołączony kubek, 1 L</td><td>Millipore</td><td>SCGPU11RE</td><td>wielu producentów/dostawców</td></tr><tr><td>Filtr, 0,22 i mikro; m, dołączony kubek, 150 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGVU01RE</td><td>wielu producentów/dostawców</td></tr><tr><td>Filtr, 0,22 i mikro; m, dołączony kubek, 500 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>wielu producentów/dostawców</td></tr><tr><td>Filtr, 0,22 i mikro; m, dołączony kubek, 50 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>wielu producentów/dostawców</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna, koła 8,5 cm</td> Kleszcze <td>Whatman/GE</td><td>1001-085</td><td></td></tr><tr><td>, wzór standardowy - ząbkowane/zakrzywione/18 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11001-18</td><td></td></tr><tr><td>Komora zamrażania, alkohol izopropylowy</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>"Mr. Frosty"</td></tr><tr><td>Inkubator, 37 & C/5% CO2</td><td>Forma</td><td>370 series</td><td>wielu producentów/dostawców</td></tr><tr><td>Hemacytometr, faza</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td>wielu producentów/dostawców</td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Lafayette Instruments</td><td>TC752-PD&</td><td>nbsp; Wymagana modyfikacja szalki Petriego.&nbsp; &nbsp; UWAGA:&nbsp; Ruchome, ostre ostrze.</td></tr><tr><td>Mikropipettor, 1-10 &mu; l</td><td>Gilson</td><td>F144562</td><td>wielu producentów / dostawców</td></tr><tr><td>Mikropipettor, 100-1,000 &mu; l (zestaw startowy)</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>wielu producentów / dostawców</td></tr><tr><td>Mikropipettor, 2-20 i mu; l (zestaw startowy)</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>wielu producentów / dostawców</td></tr><tr><td>Mikropipettor, 20-200 &mu; l (zestaw startowy)</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>wielu producentów / dostawców</td></tr><tr><td>Kluczokręt, autoklawowalny, 5/16"</td><td>Steritool</td><td>10302</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipety, zaślepione bawełną</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-8B</td><td>wielu producentów / dostawców</td></tr><tr><td>szalka Petriego, szkło, autoklawowalne</td><td>Corning</td><td>3160-100</td><td></td></tr><tr><td>Pomoc do pipet</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td>wielu producentów/dostawców</td></tr><tr><td>Podkładka regulacyjna</td><td>McMaster-Carr</td><td>VARIABLE</td><td>wielu producentów/dostawców</td></tr><tr><td>Sterylne końcówki do pipet barierowych, 10 &mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV10R-H</td><td>wielu producentów / dostawców</td></tr><tr><td>Sterylne końcówki do pipet barierowych, 1,000 &mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV1000</td><td>wielu producentów / dostawców</td></tr><tr><td>Sterylne końcówki do pipet barierowych, 20 i mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV20-H</td><td>wielu producentów / dostawców</td></tr><tr><td>Sterylne końcówki do pipet barierowych, 200 i mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV200-H</td><td>wielu producentów/dostawców</td></tr><tr><td>Sterylne pipety jednorazowe, folia w całości z tworzywa sztucznego, 10 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10J</td><td>wielu producentów/dostawców</td></tr><tr><td>Sterylne pipety jednorazowe, folia w całości z tworzywa sztucznego, 2 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-675-3C</td><td>wielu producentów/dostawców</td></tr><tr><td>Sterylne pipety jednorazowe, folia w całości z tworzywa sztucznego, 25 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10K</td><td>wielu producentów/dostawców</td></tr><tr><td>Sterylne Pipety jednorazowe, folia w całości z tworzywa sztucznego, 5 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10H</td><td>wielu producentów / dostawców</td></tr><tr><td>Woreczki do sterylizacji, 19 x 33 cm</td><td>Crosstex</td><td>SCL</td><td>wielu producentów/dostawców</td></tr><tr><td>Sitko, 40 i mikro; m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli tkankowych, 60 mm</td><td>Stojaki</td> na probówki BD Falcon <td>351007</td><td></td></tr><tr><td>, blokujące czterokierunkowe</td><td>Fisherbrand</td><td>03-448-17</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Fisherbrand</td><td>S52602Q</td><td>wielu producentów / dostawców</td></tr><tr><td>Progenitor neuronalny Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td>do przetwarzania specyficzne dla komórek</tr><tr><td>Nerwowe komórki macierzyste Podłoże ekspandacyjne (Stemline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3194-500ML</td><td>Ważne jest, aby używać marki Stemline</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>Millipore</td><td>GF316</td><td>wielu producentów / dostawców</td></tr><tr><td>Rekombinowany czynnik hamujący białaczkę ludzką (LIF)</td><td>Millipore</td><td>LIF1010</td><td>wielu producentów / dostawców</td></tr><tr><td>Błękit trypanowy (0,4%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-100ML</td><td>wielu producentów / dostawców</td></tr><tr><td>TrypLE Select (1x)</td> <td>Life Technologies</td><td>12563-011</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda ekspansji stosowana do cgmp dla agregatów ludzkich nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych lub tkanki mózgowej płodu

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

Technika ekspansji komórek w celu zgromadzenia dużej liczby komórek z pojedynczej próbki do eksperymentów badawczych i prób klinicznych byłaby bardzo korzystna dla społeczności komórek macierzystych. Wiele obecnych metod ekspansji jest pracochłonnych i kosztownych, a te obejmujące całkowitą dysocjację mogą powodować różnicowanie lub wczesne starzenie się kilku typów komórek macierzystych i progenitorowych. Aby przezwyciężyć te problemy, opracowaliśmy zautomatyzowaną metodę mechanicznego pasażowania, zwaną "siekaniem", która jest prosta i niedroga. Technika ta pozwala uniknąć chemicznej lub enzymatycznej dysocjacji na pojedyncze komórki, a zamiast tego pozwala na ekspansję na dużą skalę zawieszonych, sferoidalnych kultur, które utrzymują stały kontakt komórka/komórka. Metoda siekania była stosowana głównie w przypadku płodowych nerwowych komórek progenitorowych lub neurosfer pochodzących z mózgu, a ostatnio została opublikowana do stosowania z nerwowymi komórkami macierzystymi pochodzącymi z embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Procedura polega na wysiewie neurosfer na szalce Petriego w kulturze tkankowej, a następnie przepuszczeniu ostrego, sterylnego ostrza przez komórki, skutecznie automatyzując żmudny proces ręcznej mechanicznej dysocjacji każdej kuli. Zawieszenie komórek w hodowli zapewnia korzystny stosunek powierzchni do objętości; ponieważ ponad 500 000 komórek może być hodowanych w jednej neurosferze o średnicy mniejszej niż 0,5 mm. W jednej kolbie T175 ponad 50 milionów komórek może rosnąć w kulturach zawiesinowych, w porównaniu do zaledwie 15 milionów w kulturach przylegających. Co ważne, procedura rozdrabniania została zastosowana zgodnie z obecną dobrą praktyką produkcyjną (cGMP), co pozwala na masową produkcję produktów komórkowych klasy klinicznej.

<img alt="Porównanie metod wzrostu komórek; wykres, mikroskopia morfologii komórek przed i po rozdrabnianiu; fluorescencja." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51219/51219fig5highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Reprezentatywne dane. A) Przewidywana liczba komórek hNPC zamrożonych w p19, a następnie rozmrożonych i namnożonych jako adherentna monowarstwa z wykorzystaniem dysocjacji en...

Ten protokół opisuje nowatorską metodę mechanicznego siekania, która pozwala na ekspansję sferycznych agregatów nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych bez dysocjacji do zawieszenia pojedynczej komórki. Utrzymanie kontaktu komórka/komórka pozwala na szybki i stabilny wzrost przez ponad 40 przejść.

Metoda ekspansji stosowana do cGMP dla agregatów ludzkich nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych lub tkanki mózgowej płodu

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest efektywne pasażowanie neurosfer w sposób zapewniający utrzymanie kontaktu międzykomórkowego przez cały okres życia hodowanych komórek. Technika ta tworzy warunki ekspansji niezbędne dla ludzkich neuralnych komórek progenitorowych. Osiąga się to poprzez połączenie zawartości do dwóch kolb T 1 75 zawierających te same komórki i przeniesienie ich do probówki stożkowej, co umożliwia w drugim kroku przeniesienie sfer na szalkę Petriego w celu zagęszczenia zawiesiny neurosfer w zarządzalną masę, co pozwala na pocięcie hNPCs na małe klastry za pomocą ostrza.Następnie pasażowane lub posiekane neurosfery są resuspenderowane, aby usunąć komórki z szalki Petriego i przenieść je do nowych kolb. Uzyskane wyniki wykazują, że technika siekania zapewnia długoterminową strategię wzrostu, co potwierdzają krzywe ekspansji wykazujące długotrwałe logarytmiczne tempo wzrostu w porównaniu z komórkami pasażowanymi standardową metodą enzymatyczną. Wizualna demonstracja tej techniki jest kluczowa w przypadku sfer.Etapy kondensacji są trudne do opisania w formie pisemnej. Istnieje również kilka sposobów, które ułatwiają ten proces. Jeśli nadmiar pożywki nie zostanie całkowicie usunięty z czareski Petriego, sferoidy będą po prostu przemieszczać się w pożywce, zamiast rozdzielić na mniejsze skupiska.Rozpocznij tę procedurę od oceny koloru medium w kolbie z H NPCs. Przeskanuj zawartość kolby pod mikroskopem, aby zaobserwować komórki. Jeśli to możliwe, użyj radikału, aby zbadać rozmiar kilku sfer.Jeśli wiele sfer ma średnicę 300 µm lub większą, należy przystąpić do procesu rozdrabniania i rozdrabniać komórki co siedem do 10 dni. Następnie umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze i przygotować rozdrabniacz. Włączyć wyłącznik zasilania rozdrabniacza.W BSC ustaw grubość cięcia na 200 micrometers, a siłę ostrza na 180 stopni lub pozycję godziny dziewiątej. Następnie upewnij się, że pokrętło prędkości automatycznej jest obrócone maksymalnie w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Następnie przesuń pokrętło zwalniające stół maksymalnie w prawo i potwierdź, że uchwyt płyty jest stabilny.Obróć ręczne ramię manipulatora zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby podnieść je na maksymalną wysokość. Następnie w warunkach aseptycznych przenieś sterylną obustronną głowicę tnącą na śrubę ramienia rozdrabniacza. Za pomocą pęsety nałóż zacisk na głowicę.Zakrzywiona część zacisku musi znajdować się nad górną krawędzią ramienia. Następnie przytrzymaj zacisk na ramieniu i zamocuj nakrętkę na śrubie. Za pomocą sterylnego klucza do nakrętek pozostaw nakrętkę poluzowaną o ćwierć obrotu.W ramach tej procedury przenieś zalecaną ilość pożywki utrzymującej do nowej kolby. Następnie w warunkach aseptycznych przenieś komórki z inkubatora do komory z laminarnym przepływem powietrza (BSC). Oprzyj kolbę o statyw na probówki i pozwól sferoidom osiąść na dnie kolby.Po sedymentacji odessano do 12 mililitrów supernatantu. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 mililitrów spłukano wszystkie słabo przylegające sferoidy z powierzchni kolby.Powtarzać w razie potrzeby, pozwalając sferoidom opaść pomiędzy płukaniami. Następnie przenieść zalecaną objętość pożywki kondycjonowanej do nowej kolby. Następnie przenieść całą pozostałą pożywkę kondycjonowaną oraz sferoidy do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 mililitrów.Pozostaw sferoidy do osadzenia i wyrzuć zużytą kolbę. Następnie powoli przenieś komórki z probówki stożkowej o pojemności 15 mililitrów na szalkę Petriego o średnicy 60 milimetrów lub dysk shim, używając najmniejszej możliwej objętości. Zachowaj pozostałą pożywkę kondycjonowaną, ponieważ zostanie ona wykorzystana do wypłukania komórek z szalki po posiekaniu.Należy dążyć do zminimalizowania powierzchni zajmowanej przez pożywkę i sfery na szalce. Następnie należy rozpocząć zagęszczanie puli sfer, przenosząc supernatant z powrotem do probówki stożkowej o pojemności 15 mililitrów. Za pomocą mikropipety z końcówkami z filtrem należy usunąć jak największą ilość pożywki z górnej części puli komórek w pożywce.Dopóki nie będzie możliwe usunięcie medium bez sfer, należy rozłożyć pulę. Przechylając lekko szalkę Petriego i wykorzystując bok końcówki pipety w celu zwiększenia powierzchni kontaktu, delikatnie przesuń wszystkie sfery na jedną stronę puli. Po przeniesieniu wszystkich komórek powoli przechyl szalkę Petriego w przeciwnym kierunku, aby umożliwić oddzielenie medium od sfer.Następnie przenieś oczyszczone medium z powrotem do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Używając boku końcówki pipety, delikatnie przesuń wszystkie sfery z powrotem na środek szalki Petriego, tak aby powstała plamka o średnicy od 0,5 do 2,4 cm.Ważne jest, aby głębokość warstwy kulek w naczyniu pozostała niewielka. Jeśli warstwa będzie zbyt głęboka, kulki zostaną odsunięte podczas siekania. Teraz przenieś szalkę Petriego na uchwyt do płytek i zabezpiecz ją pod haczykami uchwytu.Użyj pokrętła zwalniającego stół, aby przesunąć uchwyt płytki w lewo, tak aby ostrze nie stykało się z sferami i zostało zablokowane w mechanizmie. Następnie opuść ramię siekarki, obracając ręcznym pokrętłem manipulatora zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż ostrze dociśnie się płasko do szalki Petriego. Naciśnij mocowanie ramienia, dokręcając nakrętkę.Następnie naciśnij przycisk resetu. Stabilizując jedną ręką szalkę Petriego, przekręć pokrętło manipulatora ramienia automatycznego zgodnie z ruchem wskazówek zegara do pozycji 90 stopni lub godziny 12:00 i rozpocznij siekanie; proces kończy się, gdy wszystkie sfery zostaną posiekane. Obróć uchwyt płytki o 90 stopni.Następnie poluzuj śrubę, opuść ramię i ponownie dokręć nakrętkę. Powtórz procedurę siekania. Po tym czasie, w sposób aseptyczny, przenieś szalkę Petriego z uchwytu na obszar roboczy w BSC.Przenieś jeden mililitr medium warunkującego na posiekane sferoidy. Następnie delikatnie resuspenduj i przenieś posiekane sferoidy do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 mililitrów. Staraj się unikać tworzenia pęcherzyków powietrza i powtarzaj czynność tyle razy, ile jest to konieczne, aby zebrać wszystkie posiekane sferoidy.Zmierzyć objętość medium kondycjonowanego oraz posiekanych sfer. Dodać odpowiednią ilość medium utrzymującego, aby osiągnąć objętość sugerowaną w tabeli 2, kolumna E. Następnie przelać zawiesinę sfer do każdej z nowych kolb, przenosząc zawiesinę sfer do jednej kolby na raz i resuspendując sfery pomiędzy kolejnymi przeniesieniami. Końcowa objętość w każdej kolbie powinna być równa objętości sugerowanej w tabeli 2, kolumna F. Umieścić posiekane hNPC w inkubatorze.Rysunek ten przedstawia prognozowaną liczbę komórek H NPC zamrożonych w pasażu 19, a następnie rozmrożonych i namnożonych jako adherentna monowarstwa z zastosowaniem dysocjacji enzymatycznej, w porównaniu do neurosfer pasażowanych metodą siekania. Przedstawiono tutaj reprezentatywne obrazy sfer przed i po siekaniu przy 10-krotnym powiększeniu. Ten obraz pokazuje rozmrożone H NPC z pasażu 29, które były wysiane przez jeden dzień i barwione pod kątem nest i ekspresji, natomiast ten obraz przedstawia rozmrożone H NPC z pasażu 29, które były wysiane przez siedem dni bez czynników wzrostu i barwione pod kątem GFAP oraz beta three tubulin.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak wykorzystać zautomatyzowaną technikę siekania do pasażowania HBC, co pozwala na zachowanie kontaktu międzykomórkowego przez cały czas życia komórek i hodowli. Procedura ta może zostać dostosowana do wielu typów komórek, takich jak neurogeniczne komórki macierzyste pochodzące z komórek pluripotencjalnych lub kardiosfery.

a-cgmp-applicable-expansion-method-for-aggregates-human-neural-stem

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Metoda ekspansji z zastosowaniem cGMP dla agregatów ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych nerwowo-glejkowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych lub tkanki mózgu płodowego

Zdolność do manipulowania ludzkimi komórkami macierzystymi/prekursorowymi neuronów (hNSPCs) in vitro pozwala badać ich przydatność jako przeszczepów komórkowych do celów terapeutycznych oraz zgłębiać proces rozwoju ludzkiego układu nerwowego. Niniejszy protokół przedstawia metodę hodowli i pasażowania hNSPCs w celu zwiększenia powtarzalności badań nad ludzkimi komórkami macierzystymi.

Pasażowanie ludzkich neuralnych komórek macierzystych

Opisano prostą i niezawodną metodę izolacji oraz hodowli neuralnych komórek macierzystych z odrzuconej ludzkiej tkanki kory płodowej. Hodowle pochodzące z rozpoznanych neurologicznych schorzeń człowieka mogą być wykorzystywane do charakteryzacji patologicznych procesów komórkowych i molekularnych, a także stanowić platformę do oceny skuteczności farmakologicznej.

Generowanie komórek macierzystych neuronów z odrzuconej ludzkiej tkanki korowej płodu

Protokoły różnicowania neuronalnego pluripotencjalnych ludzkich komórek macierzystych (hPSCs) są często czasochłonne i wymagają zaawansowanych umiejętności w hodowli komórkowej. W niniejszej pracy dostosowaliśmy procedurę różnicowania opartą na małych cząsteczkach do formatu płytek wielodobojowych, co umożliwia prostą, szybką i wydajną generację ludzkich neuronów w sposób kontrolowany.

Szybka i wydajna generacja neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płyt wielodołkowych

Ten film pokazuje generowanie nerwowych komórek progenitorowych z nietransgenicznych i transgenicznych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). hPSC są różnicowane w neuronalne komórki progenitorowe za pomocą neuronalnej pożywki różnicującej. Podczas gdy różnicowanie jest indukowane w komórkach nietransgenicznych za pomocą małych cząsteczek, transgeniczne hPSC są różnicowane przez dodanie antybiotyku, który indukuje promotor dla czynnika transkrypcyjnego specyficznego dla...

Różnicowanie nietransgenicznych i transgenicznych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w neuronalne komórki progenitorowe

Ta procedura prowadzi do powstania neuronów kresomózgowiowych poprzez przejście przez punkty kontrolne, które są podobne do tych obserwowanych podczas rozwoju człowieka. Komórki mogą się spontanicznie różnicować, są wystawione na działanie czynników, które popychają je w kierunku linii neuronalnej, są izolowane i są powlekane na szkiełkach nakrywkowych, aby umożliwić końcowe różnicowanie i dojrzewanie.

Specyfikacja neuronów glutaminergicznego kresomózgowia z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Organoidy mózgowe reprezentują nowy system modelowy do badania wczesnego rozwoju ludzkiego mózgu in vitro. Niniejszy artykuł zawiera szczegółową metodologię wydajnego generowania jednorodnych organoidów typu grzbietowego przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, w tym krytyczne etapy charakterystyki i walidacji.

Generowanie standaryzowanych i powtarzalnych organoidów mózgowych typu przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy metodę dla ludzkiego modelu in vitro uszkodzenia rozciągającego w formacie 96-dołkowym w skali czasowej istotnej dla traumy uderzeniowej. Obejmuje to metody wytwarzania rozciągliwych płytek, ilościowego określania mechanicznej zniewagi, hodowli i uszkadzania komórek, obrazowania i analizy wysokiej zawartości w celu ilościowego określenia urazu.

Metoda szybkiego rozciągania indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych w formacie 96-dołkowym

W tym protokole staramy się opisać powtarzalną metodę łączenia zdysocjowanych ludzkich neuronów i astrocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w kokultury sfer 3D, utrzymywania tych sfer w warunkach swobodnego pływania, a następnie mierzenia aktywności obwodów synaptycznych kul za pomocą immunoanalizy i zapisów z matrycy wieloelektrodowej.

Modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3D astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje dynamiczny system hodowli do produkcji kontrolowanych agregatów ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i dalszego stymulowania różnicowania w organoidach móżdżku w chemicznie zdefiniowanych warunkach i bez karmienia za pomocą jednorazowego bioreaktora.

Skalowalne generowanie dojrzałych organoidów móżdżku z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i charakterystyka za pomocą barwienia immunologicznego

Ten artykuł opisuje protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych w laboratoryjnym bioreaktorze zawiesinowym 3D.

Produkcja ludzkich neuronów indukowanych neurogeniną 2 w trójwymiarowym bioreaktorze zawiesinowym

Naucz się metody mechanicznego siekania do ekspansji sfer nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych człowieka przy zachowaniu kontaktu międzykomórkowego. Technika ta umożliwia stabilny wzrost przez ponad 40 pasowań.

Metoda ekspansji stosowana do cGMP dla agregatów ludzkich nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych lub tkanki mózgowej płodu (Wideo) | JoVE Journal

Metoda ekspansji stosowana do cGMP dla agregatów ludzkich nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych lub tkanki mózgowej płodu

Przeglądaj więcej filmów