Name: Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-11T21:00:00.000+00:00
Duration: 24 min 2 s
Description: Poznaj metodę ChroP łączącą ChIP ze spektrometrią mas do analizy proteomicznej architektury chromatyny. Ta technika umożliwia badanie modyfikacji histonów i białek niehistonowych w specyficznych domenach chromatynowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te zostały pierwotnie opublikowane w Mol Cell Proteomics. Soldi M. i Bonaldi T. Badanie proteomiczne domen funkcjonalnych chromatyny ujawnia nowe synergizmy między różnymi składnikami heterochromatyny MCP. 2013; 12: 64-80. © Amerykańskie Towarzystwo Biochemii i Biologii Molekularnej. Dziękujemy Roberze Noberini (Włoski Instytut Technologii i IEO, Włochy) za krytyczną lekturę manuskryptu. Prace nad gruźlicą są wspierane przez granty z Programu Rozwoju Kariery Fundacji Giovanniego Armenise-Harvarda, Włoskiego Stowarzyszenia Badań nad Rakiem oraz włoskiego Ministerstwa Zdrowia. Prace nad stwardnieniem rozsianym były wspierane przez stypendium FIRC.

<ol><li>Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure%3A+a+repeating+unit+of+histones+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA.</a> Science. 184, 868-871 (1974).</li>
<li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Res. 21, 381-395 (2011).</li>
<li>Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+chromatin-binding+modules+interpret+histone+modifications%3A+lessons+from+professional+pocket+pickers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
<li>Spotswood, H. T., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+increasingly+complex+code%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">An increasingly complex code.</a> J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).</li>
<li>Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics+for+the+analysis+of+chromatin+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics.</a> Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).</li>
<li>Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+in+chromatin+biology+and+epigenetics%3A+Elucidation+of+post-translational+modifications+of+histone+proteins+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry.</a> J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).</li>
<li>Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+histone+code+with+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry.</a> Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).</li>
<li>Taverna, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+combinatorial+linkage+between+methylation+and+acetylation+on+histone+H3+N+termini%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).</li>
<li>Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+histones+and+their+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry.</a> Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).</li>
<li>Villar-Garea, A., Imhof, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The analysis of histone modifications.</a> Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).</li>
<li>Plazas-Mayorca, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-pot+shotgun+quantitative+mass+spectrometry+characterization+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones.</a> J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).</li>
<li>Ohta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+composition+of+mitotic+chromosomes+determined+using+multiclassifier+combinatorial+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics.</a> Cell. 142, 810-821 (2010).</li>
<li>Vermeulen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+anchoring+of+TFIID+to+nucleosomes+by+trimethylation+of+histone+H3+lysine+4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4.</a> Cell. 131, 58-69 (2007).</li>
<li>Vermeulen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+interaction+proteomics+and+genome-wide+profiling+of+epigenetic+histone+marks+and+their+readers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers.</a> Cell. 142, 967-980 (2010).</li>
<li>Bartke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome-interacting+proteins+regulated+by+DNA+and+histone+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation.</a> Cell. 143, 470-484 (2010).</li>
<li>Dejardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+proteins+associated+with+specific+genomic+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification of proteins associated with specific genomic Loci.</a> Cell. 136, 175-186 (2009).</li>
<li>Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+proteomics+approach+for+the+discovery+of+chromatin-associated+protein+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks.</a> Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).</li>
<li>Soldi, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteomic+investigation+of+chromatin+functional+domains+reveals+novel+synergisms+among+distinct+heterochromatin+components%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components.</a> Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).</li>
<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).</li>
<li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal Chem. 68, 850-858 (1996).</li>
<li>Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications.</a> Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).</li>
<li>Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SILAC-based+proteomic+analysis+to+dissect+the+%26%2334%3Bhistone+modification+signature%26%2334%3B+of+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">SILAC-based proteomic analysis to dissect the &#34;histone modification signature&#34; of human breast cancer cells.</a> Amino Acids. 41, 387-399 (2011).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).</li>
<li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization%2C+nanoelectrospray%2C+and+LC%2FMS+sample+pretreatment+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal Chem. 75, 663-670 (2003).</li>
<li>Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).</li>
<li>Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometry+of+histones+H3.2+and+H3.3+in+Suz12-deficient+mouse+embryonic+stem+cells+reveals+distinct%2C+dynamic+post-translational+modifications+at+Lys-27+and+Lys-36%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andromeda%3A+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).</li>
<li>Lachner, M., O'Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+histone+H3+lysine+9+creates+a+binding+site+for+HP1+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins.</a> Nature. 410, 116-120 (2001).</li>
<li>Bannister, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+recognition+of+methylated+lysine+9+on+histone+H3+by+the+HP1+chromo+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain.</a> Nature. 410, 120-124 (2001).</li>
<li>Ram, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+patterning+of+chromatin+regulators+uncovered+by+genome-wide+location+analysis+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells.</a> Cell. 147, 1628-1639 (2011).</li>
<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129, 823-837 (2007).</li>
<li>Beck, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+in+epigenetic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry in epigenetic research.</a> Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).</li>
<li>Ernst, J., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+characterization+of+chromatin+states+for+systematic+annotation+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome.</a> Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).</li>
<li>Tipton, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+intact+protein+isoforms+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry.</a> J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).</li>
<li>Young, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+characterization+of+combinatorial+histone+codes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High throughput characterization of combinatorial histone codes.</a> Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).</li>
<li>Boyne, M. T. 2nd, Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+characterization+of+human+histones+in+the+H2A+gene+family+by+top+down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Niedawno opisaliśmy ChroP, ilościową strategię charakterystyki na dużą skalę składników białkowych chromatyny. ChroP łączy w sobie dwa uzupełniające się podejścia stosowane w dziedzinie epigenetyki, ChIP i MS, wykorzystując ich mocne strony i pokonując odpowiednie ograniczenia. ChIP sprzężony z głębokim sekwencjonowaniem (ChIP-Seq) umożliwia mapowanie modyfikacji histonów w całym genomie z rozdzielczością kilku nukleosomów35. Chociaż korzystne ze względu na ich czułość, testy oparte na przeciwciałach mają ogra...

Chromatyna to wysoce dynamiczny kompleks nukleoproteinowy, który jest używany jako główny szablon dla wszystkich procesów zachodzących za pośrednictwem DNA. Nukleosom jest podstawową powtarzaną jednostką chromatyny i składa się z białkowego rdzenia oktamerycznego zawierającego dwie cząsteczki każdego kanonicznego histonu H2A, H2B, H3 i H4, wokół których owinięte jest1,2 pz DNA. Wszystkie histony rdzenia są zbudowane jako domena kulista i elastyczny N-końcowy "ogon", który wystaje na zewnątrz nukleosomu. Jednym z głównych mechanizmów regulacji struktury i dynamiki chromatyny jest oparcie na kowalencyjnych modyfikacjach potranslacyjnych (PTM), które zachodzą głównie na N-końcach histonów3,4. Modyfikacje histonów mogą funkcjonować albo poprzez zmianę struktury chromatyny wyższego rzędu, poprzez zmianę kontaktów między histonami-DNA lub między nukleosomami, a tym samym kontrolowanie dostępności białek wiążących DNA (mechanizmy cis), albo poprzez działanie jako miejsca dokowania dla białek regulatorowych, albo jako pojedyncze jednostki, albo osadzone w kompleksach multimerycznych. Takie białka regulacyjne mogą pełnić swoją funkcję na różne sposoby: poprzez bezpośrednią modulację ekspresji genów (tj. białka TAF) lub poprzez zmianę położenia nukleosomów (tj. kompleksy remodelujące chromatynę) lub poprzez modyfikację innych reszt histonów (tj. białek o aktywności metylotransferazy lub acetylotransferazy) (mechanizmy trans)5. Obserwacja, że różne wzorce PTM grupują się w określonych loci chromatyny, doprowadziła do opracowania hipotezy, że różne modyfikacje w różnych miejscach mogą działać synergicznie, aby wygenerować kod molekularny pośredniczący w stanie funkcjonalnym leżącego u podstaw DNA. "Hipoteza kodu histonowego" zyskała na przestrzeni lat duży konsensus, ale jej eksperymentalna weryfikacja została opóźniona przez ograniczenia techniczne6,7.
Proteomika oparta na spektrometrii mas (MS) stała się potężnym narzędziem do mapowania wzorców modyfikacji histonów i charakteryzowania białek wiążących chromatynę8. MS wykrywa modyfikację jako właściwą masę Δ między eksperymentalną a teoretyczną masą peptydu. Na poziomie pojedynczych histonów MS zapewnia bezstronną i kompleksową metodę mapowania PTM, pozwalającą na wykrycie nowych modyfikacji i ujawnienie wzajemnych zależności między nimi9-14.
W ostatnich latach opracowano szereg strategii analizowania składu proteomicznego chromatyny, w tym charakterystykę nienaruszonych chromosomów mitotycznych15, identyfikację rozpuszczalnych białek wiążących hPTM16-18 oraz izolację i analizę specyficznych regionów chromatyny (tj. telomerów)19,20. Jednak badanie specyficznych dla locus synergii między histonowymi PTM, wariantami i białkami związanymi z chromatyną jest nadal niekompletne. W tym miejscu opisujemy nowe podejście, nazwane ChroP (Chromatin Proteomics)21, które opracowaliśmy w celu skutecznego scharakteryzowania funkcjonalnie odrębnych domen chromatyny. Podejście to adaptuje immunoprecypitację chromatyny (ChIP), dobrze znany protokół stosowany w badaniach epigenetycznych, do wydajnej analizy proteomicznej wzbogaconej próbki opartej na stwardnieniu rozsianym. Opracowaliśmy dwa różne protokoły, w zależności od rodzaju chromatyny użytej jako dane wejściowe i pytania, na które zwraca uwagę MS; w szczególności: 1) ChIP nieutrwalonej natywnej chromatyny trawionej MNazą jest stosowany do oczyszczania mononukleosomów i do preparacji współasocjujących hPTM (N-ChroP); 2) ChIP usieciowanej chromatyny rozdrobnionej przez sonikację stosuje się w połączeniu ze strategią interaktomiki opartą na SILAC w celu scharakteryzowania wszystkich współwzbogacających białek wiążących chromatynę (X-ChroP). Ilustrujemy tutaj kombinację N- i X-ChroP do wzbogacania i badania heterochromatyny, używając H3K9me3 jako przynęty dla etapów immunoprecypitacji. Zastosowanie ChroP można rozszerzyć o badanie odrębnych regionów chromatyny lub zmian w składzie chromatyny w tym samym regionie podczas przejścia do innego stanu funkcjonalnego, torując w ten sposób drogę do różnych zastosowań w epigenetyce.

<table><tbody><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>SILAC DMEM</td><td>M-Medical</td><td>FA30E15086</td><td></td></tr><tr><td>Dializowany FBS</td><td>Invitrogen</td><td>26400-044</td><td></td></tr><tr><td>Lizyna 0 (12C6 14N2 L-lizyna)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8662</td><td></td></tr><tr><td>Arginina 0 (12C6 14N4 L-arginina)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6969</td><td></td></tr><tr><td>Lizyna 8 (13C6 15N2 L-lizyna)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>68041</td><td></td></tr><tr><td>Arginina 10 (13C6 15N4 L-arginina)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaza mikrokokkowa</td><td>Roche</td><td>10 107 921 001</td><td></td></tr><tr><td>Kompletne, wolne od EDTA tabletki koktajlowe z inhibitorem proteazy</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>Rurka do dializy Spectra/Por 3, 3,5K MWCO, płaska szerokość 18 mm, długość</td> <td>50 stópSpectrumlabs</td><td>132720</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histone H3 tri-metylowany K9-ChIP klasy</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>Peptyd histonowy H3 trimetylo-metylowy K9&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab1773</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Białko G</td><td>Invitrogen</td><td>100.04D</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12%&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Żel Bis-Tris&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia na kolor koloidalny w kolorze niebieskim</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>LDS Bufor do próbek</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Formaldheyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik acetyczny-d6</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175641-1G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94318-50ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid &ge; 99% (HPLC), krystaliczna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana trypsyna klasy sekwencjonowania, mrożona 100 &mu; g (5 & razy; 20 &mu; g)</td> <td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>Nanospray OD 360&mu; m x ID 75&mu; m, końcówki ID 8 i mu; m niepowlekany Pk 5</td><td>Mikrokolumna Srl</td><td>FS360-75-8-N-5-C15</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 &mikro; m&nbsp; &nbsp; 15% C</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r13.aq.</td><td></td></tr><tr><td>Węglowa tarcza ekstrakcyjna, 47 mm</td><td>Agilent Technologies</td><td>12145040</td><td></td></tr><tr><td>Tarcza do ekstrakcji kationów</td><td>Agilent Technologies</td><td>66889-U</td><td></td></tr></tbody></table>

podejście chrop łączy chip i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatyna to wysoce dynamiczny kompleks nukleoproteinowy zbudowany z DNA i białek, który kontroluje różne procesy zależne od DNA. Struktura i funkcja chromatyny w określonych regionach jest regulowana przez lokalne wzbogacenie modyfikacji potranslacyjnych histonów (hPTM) i wariantów, białek wiążących chromatynę, w tym czynników transkrypcyjnych, oraz metylacji DNA. Proteomiczna charakterystyka składu chromatyny w różnych regionach funkcjonalnych była do tej pory utrudniona przez brak skutecznych protokołów wzbogacania takich domen w odpowiedniej czystości i ilości do późniejszej dogłębnej analizy za pomocą spektrometrii mas (MS). Opisujemy tutaj nowo zaprojektowaną strategię proteomiki chromatyny, nazwaną ChroP (Chromatin Proteomics), w której preparatywna immunoprecypitacja chromatyny jest stosowana do izolowania odrębnych regionów chromatyny, których cechy, pod względem hPTM, wariantów i współzwiązanych białek niehistonicznych, są analizowane przez MS. Ilustrujemy tutaj ustawienie ChroP do wzbogacania i analizy niemających transkrypcji regionów heterochromatycznych, oznaczonych obecnością trimetylacji lizyny 9 na histonie H3. Uzyskane wyniki pokazują potencjał ChroP w dokładnym charakterystyce proteomu heterochromatyny i udowadniają, że jest to potężna strategia analityczna pozwalająca zrozumieć, w jaki sposób różne białkowe determinanty chromatyny oddziałują i synergizują się w celu ustalenia specyficznych dla locus konfiguracji strukturalnych i funkcjonalnych.

Immunoprecypitacja chromatyny jest potężną techniką stosowaną do profilowania lokalizacji białka lub modyfikacji histonów w obrębie genomu. W odpowiedniku proteomicznym po ChIP następuje analiza proteomiczna oparta na MS, aby jakościowo i ilościowo zidentyfikować hPTM, warianty histonów oraz białka wiążące chromatynę, które zostały immunoprecypitowane wraz z modyfikacją lub białkiem docelowym, pełniącym rolę „przynęty”. W podejściu N-ChroP, przedstawionym na Rysunku 1A, natywny ChIP, w którym chromatyna ...

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest charakterystyka składu proteomicznego funkcjonalnie odrębnych domen chromatyny, aby zrozumieć, w jaki sposób różne elementy synergizują w celu określenia stanu transkrypcyjnego. Osiąga się to poprzez wstępne przygotowanie jąder z hodowlanych komórek i trawienie chromatyny do fragmentów o optymalnej długości za pomocą metod enzymatycznych lub mechanicznych. Drugim krokiem jest oczyszczenie konkretnej domeny funkcjonalnej z całej chromatyny poprzez immunoprecypitację z użyciem przeciwciał przynęty przeciwko modyfikacji potranslacyjnej histonów lub białku znanemu z tego, że specyficznie znakuje interesujący region.Następnie immunoczyszczone białka chromatyny są rozdzielane za pomocą elektroforezy SDS-PAGE, a następnie poddawane trawieniu w żelu przed analizą spektrometrią mas. Kolejnym krokiem jest analiza chromatografią cieczową sprzężoną ze spektrometrią mas na urządzeniu o wysokiej rozdzielczości. Ostatecznie surowe dane ze spektrometrii mas są analizowane za pomocą specjalistycznego oprogramowania, po czym następuje manualna inspekcja widm w celu identyfikacji i kwantyfikacji modyfikacji histonów oraz białek współwzbogaconych, opierając się odpowiednio na obliczeniu względnej zawartości w materiale immunoprecypitowanym w stosunku do materiału wejściowego lub na stosunku SLAC i eksperymentach konkurencji z użyciem rozpuszczalnego peptydu jako konkurenta dla przynęty. Dzięki temu możemy uzyskać wgląd w oddziaływania między wzorcem modyfikacji histonów a ich wariancją oraz w konkretne regiony chromatyny i rekrutowane przez nie oddziaływania jądrowe, które wszystkie działają w sposób skoordynowany.Aby zdefiniować specyficzny krajobraz chromatyny o działaniu regulacyjnym na ekspresję genów, główną zaletą metody crop w stosunku do istniejących metod opartych na przesiewaniu in vitro w celu poszukiwania rozpuszczalnych interaktorów lub modyfikacji histonów, takich jak pull down, jest możliwość zbadania locus-specyficznego składu chromatyny w warunkach bardziej natywnych i mniej sztucznych, dzięki zastosowaniu peptydów histonowych lub zrekonstytuowanych matryc chromatyny. Zastosowanie metody crop można również rozszerzyć na inne systemy modelowe lub badania zależne od czasu.Na przykład możemy zastosować crop w linii komórkowej, która reaguje na określone zaburzenie wywołujące globalną odpowiedź transkrypcyjną. Procedurę tę zaprezentuje Monica Sodi. Postdoc w moim laboratorium przygotuje jądra do procedury N chip z nieznakowanych komórek.W eksperymentach z użyciem komórek He A S3 stosuje się od 1 do 2 × 10⁸ komórek. Aby zebrać komórki, należy przygotować cztery aliquoty po 5 × 10⁷ komórek w probówkach o pojemności 50 ml i odwirować je z prędkością 340 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Komórki należy przemyć lodowatym PBS, odrzucić nadsącz i resuspenderować.Każdy osad komórkowy zawiesić w 8 mL buforu lizującego i przenieść do probówek o pojemności 15 mL. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4°C na rotatorze. Następnie ostrożnie nalać każdy lizat komórkowy na poduszkę sacharozową i wirować w rotorze kątowym z prędkością 3 270 ×g przez 20 minut w temperaturze 4°C w celu oddzielenia jąder od cytoplazmy.Odrzuć nadsącz i przemyj pellety jąder dwa razy w zimnym PBS w temperaturze 4°C. Po odrzuceniu nadsączu z drugiego przemycia, połącz jądra w jednej probówce o pojemności 50 ml.Resuspender pellet jądra komórkowego w jednym mililitrze buforu do trawienia. Podzielić każdą próbkę na dwie alikwoty po 500 µL i przechowywać na lodzie. Do każdej alikwoty dodać pięć µL MNA, co odpowiada końcowemu stężeniu 0,005 jednostek enzymu na µL jąder.Delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut. Dodać 1 mM EDTA, aby zatrzymać reakcję, i przechowywać na lodzie. Odwirować trawione jądra komórkowe w temperaturze 4 °C przy 7 800 ×g przez 10 minut w celu uzyskania osadu.Przenieś nadsącz do dwóch probówek i przechowuj w temperaturze 4°C. Jest to frakcja S1, która zawiera pierwszą rozpuszczalną frakcję chromatyny składającą się z mononukleosomów. Ostrożnie resuspenduj osady w 1 ml buforu do dializy i dializuj przez noc w temperaturze 4°C w 3 litrach buforu do dializy przy stałym, łagodnym mieszaniu. Następnego dnia zbierz zdializowany materiał i odwiruj przy 7 800 ×g przez 10 minut w temperaturze 4°C.Przenieś supernatant do nowej probówki typu Eppendorf. Jest to frakcja S2, która zawiera nukleosomy w zależności od stopnia trawienia przez MNazy. Przechowuj w temperaturze 4 °C przed immunoprecypitacją.Należy sprawdzić jakość oraz stopień trawienia MN a za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i wizualnej inspekcji drabinki nukleosomowej, jak przedstawiono na tym przykładzie; frakcja S one jest silnie wzbogacona w mononukleosomy, podczas gdy frakcja S two zawiera głównie nukleosomy do immunoprecypitacji chromatyny. Najpierw należy dodać jedną objętość buforu do rozcieńczania chip do frakcji S one. Następnie należy dodać przeciwciało przeciwko modyfikacji potranslacyjnej histonów lub białku zainteresowania i inkubować przez noc na rotatorze w temperaturze 4 °C, a następnie kontynuować procedurę następnego dnia.Wyizolować chromatynę przy użyciu magnetycznych kulek sprzężonych z białkiem G. Dodać 100 µL zablokowanych kulek do próbki chromatyny S1 i inkubować na wirówce rotacyjnej w temperaturze 4 °C przez trzy godziny. Po trzech godzinach.Wiruj z prędkością 340 ×g przez jedną minutę. Umieść probówki einor w statywie magnetycznym, aby odwirować kuleczki. Zabezpiecz nadsącz, który stanowi przefiltrowany roztwór zawierający nieprzypisane nukleosomy.Dodać bufor do płukania do kulek i inkubować przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze przed wirowaniem. W ten sposób przemyć kulki łącznie cztery razy, zwiększając stężenie soli. Wykonać dwa płukania w roztworze 75 millimolar sodium chloride, a następnie jedno płukanie w roztworze 125 millimolar oraz kolejne w 175 millimolar sodium chloride w celu elucji.Chromatynę wytrąconą aminowo. Inkubować koraliki w 30 µL buforu do próbek LDS uzupełnionego o 50 mM ditiotreitolu (DTT) przez pięć minut w temperaturze 70 °C.Aby rozpocząć tę procedurę, należy przeprowadzić sieciowanie komórek za pomocą formaldehydu, a następnie rozdzielić wspomniane białka metodą SDS-PAGE. Do komórek znakowanych metodą SLAC dodać 0,75% formaldehydu. Krótko wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Zneutralizuj formaldehyd, dodając 125 mM glicyny i inkubując przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie podziel komórki na dwie do czterech alikwotów, po około 5 × 10⁷ komórek na alikwot. Po ostatnim przemyciu opłucz komórki trzykrotnie lodowatym PBS.Odrzuć supernatranty i zachowaj osady; każdy osad komórkowy resuspender w 10 mililitrach buforu do lizy. Inkubuj przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy ciągłym mieszaniu obrotowym, a następnie wirowarkuj przy 430 ×g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzuć supernatranty i zachowaj osady jądrowe.Po przemyciu osadów jąder buforem do przemywania Resus, zawiesić każdy osad jądrowy w trzech mililitrach buforu do inkubacji ChIP i przechowywać w lodzie do fragmentacji chromatyny za pomocą sonikacji w schłodzonym urządzeniu Bio Rupture przy mocy 200 W. Odjąć 2% sonikowanej chromatyny i odwrócić sieciowanie poprzez inkubację w temperaturze 65 °C przez minimum jedną godzinę w buforze do inkubacji ChIP.Jest to materiał wejściowy. Następnie DNA jest ekstrahowane przy użyciu zestawu do oczyszczania produktów PCR, a fragmentację chromatyny ocenia się za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym w celu immunoprecypitacji sieciowanej chromatyny. Do sonikowanej chromatyny znakowanej lekko i ciężko należy dodać wybrane przeciwciało.W kanale lekkim, do każdej z trzech probówek do mikrocentryfugi dodaj nadmiar rozpuszczalnego peptydu oraz alikwot przeciwciała dla próbek lekkich i ciężkich, a następnie inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C na wirówce rotacyjnej. Następnego dnia do każdej próbki chromatyny dodaj 100 µL zablokowanych magnetycznych kulek sprzężonych z białkiem G i inkubuj na wirówce rotacyjnej przez trzy godziny w temperaturze 4 °C. Wiruj przy 340 ×g przez jedną minutę. Umieść probówki w statywie magnetycznym, aby odwirować kuleczki.Nadsącz stanowi frakcję przepływową zawierającą niezmwiązane nukleosomy, którą należy zachować do późniejszych kontroli. Przemyć kuleczki czterokrotnie w buforze do płukania z rosnącym stężeniem soli. Wykonać dwa płukania w 150 millimolar sodium chloride, a następnie dwa płukania w 300 millimolar sodium chloride.Inkubuj kuleczki przez 25 minut w temperaturze 95 °C z dodatkiem 30 µL buforu do prób w elektroforezie SDS-PAGE, aby eluować i odkrzyżować immunoprecypitowane białka. Na koniec połącz EIT i rozdziel białka za pomocą SDS-PAGE przed analizą spektrometrią mas.W celu rozpoczęcia tej procedury poddaje się trawieniu histony wyizolowane z NIP. Wycina się fragmenty żelu odpowiadające prążkom histonów rdzeniowych z gradientowego żelu akrylamidowego 4-12% BIS CITRIS barwionego koloidalnym kumasi, a następnie odbarwia się je w 50% acetonitrylu i dejonizowanej wodzie destylowanej, naprzemiennie z 100% acetonitrylem w celu obkurczenia żelu, aż do całkowitego odbarwienia fragmentów żelu. Następnie należy je wysuszyć w wirówce próżniowej.Do fragmentów żelu dodać bezwodnik octowy w stosunku objętościowym od 1:9 do 1:1 w 1 M wodorowęglanie amonu oraz 3 µL octanu sodu jako katalizatora. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C przy silnym mieszaniu. Fragmenty żelu skurczyć w 100% acetonitrylu, a następnie odwodnić przez około pięć minut w wirówce próżniowej; następnie ponownie nawodnić fragmenty żelu w lodowatej wodzie.Roztwór trypsyny o stężeniu 100 ng/µL w 50 mM wodorowęglanie amonu przez noc w temperaturze 37 °C. Połączenie modyfikacji chemicznej lizyn przy użyciu deuterowanego bezwodnika octowego i trawienia trypsyną generuje wzór trawienia w żelu typu RC. Rozpuszczalne strawione peptydy zebrać do nowej probówki typu Eppendorf i suszyć peptydy przez około jedną godzinę. Liofilizowane peptydy zawiesić w 0,5% kwasie octowym i 0,1% kwasie trifluorooctowym, a następnie odsolić i zagęścić peptydy na kolumnie C18 w fazie odwróconej oraz przeprowadzić chromatografię wymiany jonowej na mikrokolumnach wykonanych ręcznie.Nanieś 50% peptydów na końcówkę z węglem C 18 i 50% na końcówkę SCX. Eluuj peptydy z końcówek SCX przy użyciu 5% wodorotlenku amonu i 30% metanolu, a z końcówek z węglem C 18 przy użyciu 80% acetonitrylu i 0,5% kwasu octowego. Na koniec liofilizuj eluaty peptydowe i resuspenduj je w 0,1% kwasie mrówkowym w natywnej metodzie immunoprecypitacji chromatyny i wycinania (ChIP-crop). W pierwszym kroku chromatynę trawiono MNase, aby oczyścić konkretną domenę funkcjonalną z całej chromatyny.Panel po lewej stronie przedstawia test MNA w małej skali, w którym DNA jest rozdzielane w żelu agarozowym 1% po trawieniu chromatyny przez MNA w różnych odstępach czasu. Po prawej stronie pokazano trawienie MNA w dużej skali. DNA jest rozdzielane w żelu agarozowym 1% po 60 minutach trawienia chromatyny przez MNA oraz po oddzieleniu frakcji S1 zawierającej mononukleosomy od frakcji S2 zawierającej polinukleosomy.Strawiona chromatyna, bogata w mononukleosomy, jest inkubowana z przeciwciałem rozpoznającym specyficzną modyfikację potranslacyjną histonów. Przykładem jest trimetylacja lizyny dziewiątej histonu H3 (H3K9me3), będąca markerem chromatyny wyciszonej. Immunopuryfikowane białka oraz wejściowa chromatyna są następnie rozdzielane metodą SDS-PAGE; barwienie koloidalnym Coomassie wykazuje obecność histonów rdzeniowych H3, H4, H2A i H2B w okolicach i poniżej prążka 17 kDa, przy czym H3 i H2B migrują wspólnie. Porównanie ilości trimetylowanej lizyny dziewiątej w H3 obecnej w cieczy przepływowej i w materiale wejściowym wskazuje, że immunopuryfikowano około 50% regionu zainteresowania, co wyklucza ryzyko błędu wynikającego z wzbogacenia mniejszej subpopulacji chromatyny.Ten histogram przedstawia średnią plus minus SEM z trzech niezależnych eksperymentów dla każdej modyfikacji; następnie zastosowano spektrometrię mas MS w celu scharakteryzowania modyfikacji potranslacyjnych współwystępujących w wzbogaconych nukleosomach. Wszystkie potranslacyjne modyfikacje histonów zostały zweryfikowane poprzez manualną inspekcję odpowiadających im widm ms ms na tym reprezentatywnym widmie Ms m Ms z wykorzystaniem fragmentacji CID. Serie jonów B i jonów Y pozwalają na określenie sekwencji peptydu H3 9-17 oraz lokalizację trimetylacji na reszcie lizyny 9; kwantyfikacja bez użycia markerów (label-free) została osiągnięta poprzez uprzednie sporządzenie chromatogramu jonów wyekstrahowanych lub XIC dla każdego zmodyfikowanego peptydu na podstawie wartości masy do ładunku oraz obliczenie pola pod krzywą lub AUC dla każdego piku.Następnie szacuje się względną obfitość różnych stopni metylacji lizyny dziewiątej w peptydzie H3 9-17, dzieląc AUC każdego zmodyfikowanego peptydu przez sumę pól odpowiadających wszystkim zaobserwowanym formom niezmodyfikowanym i zmodyfikowanym tego peptydu. Po trzecie, względne wzbogacenie każdej modyfikacji w materiale ChIP wyraża się jako stosunek log2 między względną obfitością każdej metylacji w peptydzie ChIP a próbką wejściową (input). Analiza peptydu H3 9-17 wykazuje wzbogacenie dimetylowanej i trimetylowanej lizyny dziewiątej przy jednoczesnym zmniejszeniu ilości form niezmodyfikowanych i monometylowanych.Przyjmując te wyniki jako kontrolę pozytywną dla swoistości przeciwciał, można ocenić współwystępowanie lub brak innych modyfikacji zarówno na poziomie wewnątrzcząsteczkowym w obrębie tej samej histony H3, jak i na poziomie międzycząsteczkowym w odniesieniu do innych wzbogaconych histonem w obrębie tego samego nukleosomu. Ta reprezentatywna mapa ciepła podsumowuje wzbogacenie wszystkich współwystępujących modyfikacji potranslacyjnych (PTM) histonów zidentyfikowanych w histonach H3, H4 i H2A. Każdy wiersz odpowiada innej modyfikacji, a skrót ND oznacza modyfikacji niewykrytych podczas przesiewania wszystkich białek. Współwystępowanie w obrębie heterochromatyny w badaniu ChIP sieciowanej chromatyny fragmentowanej metodą sonikacji jest stosowane w połączeniu z techniką znakowania stabilnymi izotopami aminokwasów w hodowlach komórkowych (SILAC).W pierwszej kolejności ocenia się wydajność znakowania poprzez obliczenie stopnia wbudowania ciężkiej lizyny i ciężkiej argininy w białka. Dla dokładnej kwantyfikacji białek wymagane jest wbudowanie obu ciężkich aminokwasów powyżej 95%, co zaobserwowano w tym przypadku – mediana rozkładu gęstości peptydów lizyny i argininy wynosi odpowiednio 0,974 i 0,964. Po drugie, należy zoptymalizować stosunek rozpuszczalnego peptydu do przeciwciała.Rysunek ten przedstawia powiększone widma masowe dla odpowiadającej wartości stosunku masy do ładunku dla trimetylowanej lizyny w pozycji dziewięć K9me3 z ładunkiem 2+ w peptydzie H3 9-17, zarówno dla formy lekkiej, jak i ciężkiej w próbce wejściowej (input) oraz w próbce ChIP-octr. O ile w próbce wejściowej intensywności peptydów ciężkiego i lekkiego są zbliżone do jedności, o tyle w próbce forward SLAC chip intensywność peptydy lekkiego jest znacznie niższa niż jego ciężkiego odpowiednika, co wskazuje na efektywną konkurencję.Przedstawiono reprezentatywny wynik elektroforezy SDS-PAGE dla wejściowej chromatyny oraz materiału wyprecypitowanego metodą ChIP, znakowanych odpowiednio lekko (L) i ciężko (H). Ścieżka odpowiadająca materiałowi z ChIP została pocięta na 10 fragmentów, podczas gdy przeanalizowano tylko dwa fragmenty próbki wejściowej. W analizie testu wbudowania eksperymenty konkurencji SLAC są zazwyczaj przeprowadzane w dubletach, w tzw. formatach bezpośrednim i odwrotnym, w których konkurencja z nadmiarem rozpuszczalnego peptydu jest zamieniana między próbkami chromatyny ciężkiej (H) a lekkiej (L).To reprezentatywne pełne widmo przedstawia pary SLAC odpowiadające peptydom z białek HP one oraz macro two A, gdzie stosunek białka ciężkiego do lekkiego jest większy niż jeden. W eksperymencie bezpośrednim, odzwierciedlonym przez stosunek mniejszy niż jeden w replice odwróconej, wykazano specyficzne wzbogacenie tych białek w białkach heterochromatyny, których intensywność w formach ciężkich i lekkich jest podobna zarówno w eksperymentach bezpośrednich, jak i odwróconych, co daje stały stosunek bliski jedności i pozwala zaklasyfikować je jako tło. Przecięcie eksperymentów X-chipp bezpośredniego i odwróconego doprowadziło do zidentyfikowania 635 białek obecnych w obu eksperymentach i skwantyfikowanych za pomocą co najmniej dwóch pomiarów stosunku.Wykres logarytmiczny (log 2) stosunków ciężkich do lekkich reprezentuje tzw. chromosom heterologiczny. Czerwone linie przerywane na tym wykresie rozrzutu reprezentują najwyższe 40% oraz 30% stosunków białek. Jak wskazano, rzeczywiste interaktory trimetylowanej lizyny 9 są jednoznacznie zidentyfikowane jako białka znajdujące się w górnych 40% rozkładów stosunków białek.Tutaj rozkłady proporcji białek z eksperymentów wejściowych, forward oraz reverse X crop przedstawiono odpowiednio w kolorze czarnym, niebieskim i pomarańczowym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować chromatynę do E i end crop, aby przetworzyć białka monoprecypitowane przed analizą spektrometrią mas, jak identyfikować i kwantyfikować modyfikacje histonów w widmach mas oraz jak definiować konkretne oddziaływania na podstawie ich proporcji białkowych.

the-chrop-approach-combines-chip-mass-spectrometry-to-dissect-locus

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię masową do analizy charakterystyki proteomicznej chromatyny w określonych lokusa

Analiza oddziaływań chromatyny za pomocą sekwencjonowania parowanych końców (ChIA-PET) jest metodą detekcji oddziaływań chromatyny de novo, służącą lepszemu zrozumieniu kontroli transkrypcyjnej.

Analiza oddziaływań chromatyny z sekwencjonowaniem parowanych końców (ChIA-PET) w celu mapowania oddziaływań chromatyny i zrozumienia regulacji transkrypcji

Postępy w spektrometrii mas umożliwiły wysokoprzepustową analizę ekspresji i modyfikacji białek w wielu tkankach. W połączeniu z frakcjonowaniem subkomórkowym i modelami chorób, ilościowa spektrometria mas oraz bioinformatyka mogą ujawnić nowe właściwości systemów biologicznych. Metoda opisana w niniejszym opracowaniu analizuje białka związane z chromatyną w kontekście chorób serca i jest łatwo stosowalna w innych modelach in vivo chorób ludzkich.

Ilościowa analiza proteomów chromatyny w chorobach

Identyfikacja cząsteczek związanych z konkretnymi regionami genomu będącymi przedmiotem zainteresowania jest konieczna, aby zrozumieć mechanizmy regulacji funkcji tych regionów. Protokół ten opisuje procedury przeprowadzania imunoprecipitacji chromatyny za pośrednictwem cząsteczki wiążącej DNA (enChIP) w celu identyfikacji białek i RNA związanych z określonym regionem genomu.

Izolacja określonych regionów genomu i identyfikacja powiązanych cząsteczek za pomocą enChIP

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół sekwencjonowania ChIP o wysokiej przepustowości oraz potok analiz obliczeniowych do określania wzorców stanu chromatyny w całym genomie z zamrożonych tkanek nowotworowych i linii komórkowych.

Zintegrowana platforma do mapowania stanów chromatyny w całym genomie przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania ChIP w tkankach nowotworowych

To jest metoda identyfikacji nowych białek oddziałujących z DNA w określonych docelowych loci, polegająca na specyficznym dla sekwencji wychwytywaniu usieciowanej chromatyny do kolejnych analiz proteomicznych. Nie jest wymagana żadna wcześniejsza wiedza na temat potencjalnych białek wiążących ani modyfikacji komórek. Początkowo opracowana dla drożdży, technologia została obecnie zaadaptowana do komórek ssaków.

Adaptacja wychwytywania hybrydyzacji białek związanych z chromatyną do proteomiki komórek ssaków

Opisujemy krok po kroku protokół sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny tandemowej (tChIP-Seq), który umożliwia analizę specyficznej dla typu komórki modyfikacji histonów w całym genomie.

TChIP-Seq: Profilowanie epigenomu specyficzne dla typu komórki

CUT&amp;RUN i jego warianty mogą być używane do określania obecności białek na chromatynie. Protokół ten opisuje, w jaki sposób określić lokalizację białka na chromatynie za pomocą jednokomórkowego uliCUT&amp;RUN.

Lokalizacja czynnika jednokomórkowego na chromatynie przy użyciu ultra-niskiego rozszczepienia wejściowego pod celami i uwalniania za pomocą nukleazy

Ten protokół opisuje metodę Capture Hi-C używaną do charakteryzowania organizacji 3D docelowych regionów genomowych o rozmiarach mega w wysokiej rozdzielczości, w tym granic topologicznie asojacujących domen (TADs) i interakcji chromatyny dalekiego zasięgu między regulatorowymi i innymi elementami sekwencji DNA.

Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C

Ekspresja genów jest regulowana przez interakcje promotorów genów z dystalnymi elementami regulatorowymi. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób niski poziom wejściowy Capture Hi-C (liCHi-C) pozwala na identyfikację tych interakcji w rzadkich typach komórek, które wcześniej były niemierzalne.

Zintegrowany proces pracy do badania architektury genomu czasoprzestrzennego skoncentrowanej na promotorze w rzadkich populacjach komórek

Przedstawiamy trójkolorowy protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej chromatyny (SMLM), który umożliwia powtarzalne mapowanie euchromatyny, heterochromatyny i RNAP II do analizy przestrzennej. Protokół ten umożliwia efektywne wielokolorowe oznakowanie w gęstych środowiskach jądrowych, w tym na celach związanych z chromatyną, co pozwala na niezawodne jednoczesne wykrywanie.

Protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki wieloznaczny do badania chromatyny w gęstym środowisku jądrowym

Poznaj metodę ChroP łączącą ChIP ze spektrometrią mas do analizy proteomicznej architektury chromatyny. Ta technika umożliwia badanie modyfikacji histonów i białek niehistonowych w specyficznych domenach chromatynowych.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Przeglądaj więcej filmów