Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku chemicznych inhibitorów wirusów RNA o szerokim spektrum działania

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie leków przeciwwirusowych o szerokim spektrum działania z bibliotek chemicznych przy użyciu kombinacji testów komórkowych in vitro. Osiąga się to poprzez selekcję związków, które hamują replikację in vitro rekombinowanego szczepu wirusa odry, który koduje lucyfery jako reporter. Równolegle toksyczność związku szacuje się za pomocą testu żywotności opartego na lucyferazy.

Połączone dane fenotypowe z obu testów są wykorzystywane do izolowania cząsteczek HIIT. Ostatnim krokiem jest ponowne przetestowanie związków HIIT pod kątem replikacji odpowiedzi na dawkę, hamowania odry i wirusa guna kurczaka oraz dokładniejszego pomiaru toksyczności in vitro. Ostatecznie związki przeciwwirusowe o szerokim spektrum działania są identyfikowane i weryfikowane przez badania przesiewowe.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak standardowe testy replikacji wirusa oparte na efektach cytopatycznych, jest to, że wykorzystuje luminescencję jako odczyt i łączy się z wysoce rozbieżnymi wirusami eksprymującymi lucyferazy jako reportera. Procedurę zademonstrują Olivier Ellan, technik z zespołu El Niemans oraz Marianne Luca Ori, inżynier współpracująca ze mną w jednostce badawczej Fredrika JI Rozpocznij od podgrzania do temperatury pokojowej. 96-dołkowe płytki macierzyste zawierające 10 milimolowych roztworów podstawowych związków chemicznych w DMSO.

Przenieś pięć mikrolitrów każdego związku do nowych 96-dołkowych płytek już z 20 mikrolitrami DMSO w każdym dołku, tworząc w ten sposób pośrednie płytki rozcieńczające. Teraz wlej jeden mikrolitr tych płytek rozcieńczających do suchych studzienek z białą kulturą tkankową z kodem kreskowym. Płytki 96-dołkowe.

Są to płytki D one i służą do oceny toksyczności związków o stężeniu 20 mikromolów. Przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Teraz uformuj nowe płytki z pośrednich płytek rozcieńczających, które są dalej rozcieńczane 10 razy.

Weź cztery mikrolitry każdego rozcieńczonego związku i wymieszaj je w studzienkach z 36 mikrolitrami DMSO. Z tych płytek przenieś jeden mikrolitr na próbkę do suchych studzienek z białą kulturą tkankową z płaskim dnem z kodem kreskowym. Płytki 96-dołkowe.

Są to dwie płytki D i służą do oceny hamowania replikacji MV. Przechowuj je również w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Hoduj limfocyty T HEK 2 93 w uzupełnionym DMM ze stabilizowaną L-glutaminą co cztery do pięciu dni, przepuszczaj komórki przez trypsynę i wykonaj jedno dziesiąte rozcieńczenie do świeżych kolb.

Podczas ich logarytmicznej fazy wzrostu zbierz i policz komórki do eksperymentu. Zawieś ogniwa na poziomie 300 000 komórek na mililitr. 12,5 mililitra komórek w tym rozcieńczeniu jest potrzebne na każdą płytkę, która będzie przesiewana.

Teraz przygotuj płytki i nabij jeden zestaw studzienek kontrolnych jednym mikrolitrem DMSO. Nabij drugi zestaw studzienek kontrolnych jednym mikrolitrem DMSO i 2,5 mikrolitra 0,5% roztworu ipolu, aby zabić komórki. Przenieś zawiesinę komórek do koryta i dozuj 100 mikrolitrów do każdej studzienki z płytek D-jeden.

Zawiesinę należy regularnie mieszać, aby uniknąć sedymentacji. Następnie inkubuj przygotowane płytki przez 24 godziny. Przygotuj komórki na płytki, jak to opisano w poprzednim rozdziale.

Pożywkę hodowlaną można uzupełnić urydyną w celu odfiltrowania cząsteczek przeciwwirusowych, które są ukierunkowane na wczesne etapy biosyntezy pirymidyny, ponieważ są one dość powszechne. Zachowaj jedną dziesiątą zawiesiny komórek do studzienek kontrolnych z niezainfekowanymi komórkami i zainfekuj pozostałą objętość. Odmrozić wystarczająco.

RMV dwa luksusowe roztwór podstawowy do infekowania kultury 0,1 zakaźnymi cząstkami na komórkę docelową dla 0,1 wielokrotności infekcji. Dodaj obliczoną objętość wirusa do zawiesiny komórkowej i delikatnie wymieszaj. Przenieś zainfekowane komórki do koryta i dozuj 100 mikrolitrów zainfekowanych komórek na dwie płytki D.

Kolumny docelowe od drugiej do jedenastej, które zawierają wzbogacone związki chemiczne i studzienki kontroli dodatniej w kolumnach pierwszej i 12. Delikatnie wymieszaj komórki w korycie w naprzemiennych rzędach kolumn pierwszej i 12, dozuj 100 mikrolitrów niezainfekowanych komórek. Teraz inkubuj płytki przez 24 godziny.

Po czasie inkubacji określić żywotność komórek z jedną płytką D. Wymieszaj 50 mikrolitrów odczynnika żywotności na bazie lucyferazy z każdym dołkiem i odczekaj 10 minut. Następnie odczytaj płytki za pomocą luminometru.

Ustaw czas integracji na 100 milisekund na studzienkę. Następnie określ replikację MV na dwóch płytkach D, mieszając 50 mikrolitrów substratu świetlika Lucyfera do każdej studzienki i czekając sześć minut w temperaturze pokojowej. Następnie należy zapoznać się ze współczynnikiem Z dla każdej płytki D jeden i D dwie płytki testu toksyczności.

Kontynuuj, obliczając zahamowanie replikacji wirusa. Związki Hi to te, które redukują replikację wirusa poniżej zastosowanej wartości odcięcia i nie są toksyczne dla każdego związku HI. Wykonuj seryjne rozcieńczenia w DMSO, zaczynając od 500 mikrotrzonowców i przesuwając się o pół kroku w dół do czterech mikrotrzonowców wzdłuż jednej kolumny płytki 96-dołkowej, dodaj jeden mikrolitr z płytki rozcieńczającej związek do białej płytki do hodowli tkankowej z kodem kreskowym.

Powtórz ten proces dwukrotnie, aby utworzyć potrójny zestaw płytek testowych. Następnie napełnij płytki do hodowli tkankowych 50 mikrolitrami pożywki hodowlanej. Teraz przygotuj 37,5 mililitra limfocytów T HEK 2 93, zawieszonych w uzupełnionym DM EM w ilości 600 000 komórek na mililitr.

Załaduj dwie 15-mililitrowe rurki 12,5 mililitra zawiesiny ogniw. Każdy z nich infekuje jedną probówkę komórek RMV dwa Luke'a przy wielokrotności infekcji 0,1. Zainfekuj drugą probówkę komórek rekombinowanym szczypiorkiem wyrażającym lucyfery wanilii.

Użyj wielokrotności infekcji wynoszącej 0,2. Wymieszaj obie probówki z komórkami zakażonymi wirusem za pomocą inwersji. Powinno to być przeprowadzone w laboratorium trzeciego poziomu bezpieczeństwa biologicznego, ponieważ ze względu na patogenność szczypiorku, teraz ładuje się niezakażone komórki i zestawy zakażonych komórek do własnego zestawu płytek ze związkiem HIIT.

Dozować 50 mikrolitrów komórek na studzienkę i inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia dodaj 50 mikrolitrów lucyferazy świetlików do każdej studzienki RMV dwóch komórek zainfekowanych Luke'iem. Podobnie, dodaj 50 mikrolitrów substratu Lucyfera waniliowego do komórek zakażonych Chick V Ren do niezainfekowanych komórek kontrolnych, dodaj 50 mikrolitrów żywotności zasady krzyżowej.

Odczynnik należy określić stężenia związków hi, które hamują replikację MV i Chick V o 50%Ponadto należy pominąć związki wykazujące toksyczność komórkową. Ten proces przesiewowy opiera się na wyborze związków, które nie wykazują żadnej znaczącej toksyczności komórkowej i hamują replikację zarówno MV, jak i Chick V, jak określono odpowiednio w pierwszorzędowych i wtórnych badaniach przesiewowych, wykorzystuje rekombinowane wirusy eksprymujące świetliki lub lucyfery waniliowe. Jako reporter.

Toksyczność związków ocenia się za pomocą komercyjnego testu opartego na lucyferach, w którym luminescencja koreluje z żywymi komórkami na tej płytce. 21 związków oceniono jako toksyczne na podstawie progu ustalonego przez studzienki kontroli pozytywnej. Aktywność przeciwwirusową po raz pierwszy zmierzono za pomocą RMV dwa.

Luminescencja Łukasza została porównana do limitu ustalonego przez studnie kontrolne. W tym przypadku stwierdzono, że cztery związki są w stanie hamować replikację wirusa o ponad 75% w drugim teście. Dwa z nich okazały się toksyczne dla wszystkich związków HIIT.

Połowę maksymalnego stężenia hamującego oznaczono zarówno dla wirusów VRNA MV, jak i Chick wykazujących ekspresję lucyferazy. Te dwa wirusy nie są ze sobą powiązane, dzięki czemu ekran jest bardziej wytrzymały. Równolegle w eksperymencie dawka-odpowiedź potwierdzono brak toksyczności komórkowej wybranych związków.

W sumie zidentyfikowano 13 nietoksycznych związków z biblioteki chemicznej liczącej 10 000 cząsteczek. Związki te były nowatorskie zarówno pod względem budowy chemicznej, jak i aktywności biologicznej. Opierając się na podobieństwach strukturalnych, związki te podzieliły się na trzy rodziny chemiczne.

Dla porównania, połowę maksymalnych stężeń hamujących uzyskano dla substancji o silnym działaniu przeciwwirusowym. Patrząc na te wartości, cząsteczka referencyjna była o mniej niż rząd wielkości oddzielona od najbardziej aktywnych trafień zidentyfikowanych przez ekran. Świadczy to o stosunkowo silnej aktywności przeciwwirusowej wybranych związków raz opanowanych.

Technika ta może być stosowana do badań przesiewowych dużych bibliotek chemicznych w warunkach wysokiej przepustowości oraz selekcji zestawów małych cząsteczek i sięgania po leki przeciwwirusowe o szerokim spektrum działania.