Name: Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku chemicznych inhibitorów wirusów RNA o szerokim spektrum działania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-05T16:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Poznaj wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku inhibitorów wirusów RNA o szerokim spektrum działania. Metoda wykorzystuje rekombinowane wirusy odry i chikungunya z lucyferazą do identyfikacji związków przeciwwirusowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Yves L. Janin za jego owocne komentarze i sugestie. Chcielibyśmy podziękować J.H. za CHIK/Ren i C. Combredet za wsparcie techniczne. Prace te były wspierane przez Instytut Pasteura, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale (INSERM), Institut Carnot - Pasteur Maladies Infectieuses (Program STING do P.O.V i H.M.-L), Agence Nationale pour la Recherche (ANR-RPIB, Program STING 2.0 do P.O.V), oraz "Conseil Régional d'Ile-de-France" (Projekt Biblioteki Chemicznej, dotacje nr I 06-222/R i I 09-1739/R dla H.M.-L.). Prace nad CHIKV/Ren były wspierane przez projekt ArbOAS (grant ANR 2010-INTB-1601-02).

1. Przygotowanie 96-dołkowych płytek potomnych ze związkami
<ol>
	<li>Przenieść 96-dołkowe płytki macierzyste zawierające 10 mM roztwory podstawowe związków chemicznych w DMSO z -20 °C do temperatury pokojowej. Rozcieńczyć związki 5x w DMSO, aby otrzymać pośrednie 96-dołkowe płytki rozcieńczające w 2 mM. Rozcieńczenie uzyskuje się przez pipetowanie 5 μl do 20 μl DMSO i mieszanie.</li>
	<li>Odpipetować 1 μl z płytek rozcieńczających do suchych studzienek z białymi, 96-dołkowymi płytkami z kulturą tkankową oznaczoną kodem kreskowym. Pierwszy zestaw płytek pochodnych (D1) zostanie wykorzystany do oceny toksyczności związków przy końcowym stężeniu 20 μM. Płytki pochodne należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Rozcieńczyć związki ponownie w stosunku 1:10, pipetując 4 μl z płytek rozcieńczających do 36 μl DMSO i mieszając. Odpipetować 1 μl do suchych studzienek z białymi, płaskodennymi, 96-dołkowymi płytkami z kulturą tkankową z kodem kreskowym. Ten drugi zestaw płytek pochodnych (D2) zostanie wykorzystany do oceny zahamowania replikacji MV przez związki o końcowym stężeniu 2 μM. Płytki potomne należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kultur komórkowych w celu określenia toksyczności związków
<ol>
	<li>Hoduj komórki HEK-293T w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco ze stabilizowaną L-glutaminą i uzupełnioną 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), streptomycyną (100 μg / ml) i penicyliną (100 IU / ml). Komórki są pasażowane przez trypsynizację co 4-5 dni i rozcieńczane w stosunku 1:10 do świeżej kolby. Komórki powinny znajdować się w fazie logarytmicznej do eksperymentów.</li>
	<li>W dniu eksperymentu odzyskaj komórki przez trypsynizację i przeprowadź liczenie komórek. Osadzać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić je w stężeniu 3 x 105 komórek/ml w pożywce hodowlanej. Należy wziąć pod uwagę, że na każdą płytkę przesiewową wymagane jest 12,5 ml zawiesiny komórek.</li>
	<li>Przenieś komórki do koryta i dozuj 100 μl zawiesiny komórek w płytkach D1 zawierających wzbogacone związki chemiczne. Zawiesina komórkowa w korycie jest regularnie mieszana, aby uniknąć sedymentacji.</li>
	<li>Studzienki kontrolne A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 i G12 z 1 μl DMSO. Odpowiednie studzienki zostaną wykorzystane jako odniesienie dla żywych komórek (brak toksyczności). Studzienki kontrolne B1, D1, F1, H1, B12, D12, F12 i H12 z 1 μl DMSO i 2,5 μl 0,5% roztworu IGEPAL do zabijania komórek. Odpowiednie studzienki zostaną wykorzystane jako odniesienie dla martwych komórek (wysoka toksyczność).</li>
	<li>Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
3. Przygotowanie kultur komórkowych zakażonych przez rMV2/Luc
<ol>
	<li>Hodować i odzyskiwać komórki zgodnie z opisem w 2.1 i 2.2. Ponownie zawieś komórki w stężeniu 3 x 105 komórek/ml w pożywce hodowlanej. Należy wziąć pod uwagę, że na każdą płytkę przesiewową wymagane jest 12,5 ml zawiesiny komórek.</li>
	<li>Opcjonalnie: uzupełnić pożywkę hodowlaną urydyną w ilości 20 μg/ml. 
	Uwaga: Podczas badań przesiewowych bibliotek chemicznych pod kątem inhibitorów replikacji wirusa wydaje się, że związki ukierunkowane na wczesne etapy szlaku biosyntezy pirymidyny są często izolowane13,16,27,28. Dodanie urydyny do pożywki hodowlanej służy do odfiltrowania takich cząsteczek przeciwwirusowych. Rzeczywiście, skutecznie przywraca to replikację wirusa, gdy enzymy poprzedzające szlak biosyntezy pirymidyny są zablokowane.</li>
	<li>Zaoszczędź 1:10 zawiesiny komórek na studzienki kontrolne z niezainfekowanymi komórkami i przystąp do infekcji pozostałą objętością.</li>
	<li>Rozmrozić odpowiednią objętość roztworu podstawowego rMV2/Luc. Roztwory podstawowe MV mają zwykle 106-10 8 zakaźnych cząstek na ml. Hodowla musi być zakażona 0,1 zakaźnymi cząstkami rMV2/Luc na komórkę docelową, co odpowiada 0,1 wielokrotności infekcji (MOI). Uwaga: rMV2/Luc pochodzi ze szczepionki MV (szczep Schwarz) i jest manipulowany w środowisku BSL2.</li>
	<li>Dodaj wirusa do zawiesiny komórkowej i delikatnie wymieszaj. Przenieść zakażone komórki do koryta i dozować 100 μl zawiesiny zakażonych komórek w kolumnach od 2 do 11 płytek D2 zawierających wzbogacone związki chemiczne. Zawiesina komórkowa w korycie jest regularnie delikatnie mieszana.</li>
	<li>W kolumnach 1 i 12 dozować 100 μl niezakażonych komórek na dwa. Zainfekowane komórki są dozowane w pozostałych studzienkach.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
4. Pomiary aktywności lucyferazy i analiza danych
<ol>
	<li>Wyjąć płytki D1 z inkubatora i określić żywotność komórkową, dodając 50 μl odczynnika żywotności na bazie lucyferazy bezpośrednio do dołków hodowlanych. Mieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Czytaj tabliczki za pomocą luminometru. Czas integracji jest ustawiony na 100 ms na studzienkę.</li>
	<li>Wyjmij płytki D2 z inkubatora i określ aktywność lucyferazy, dodając 50 μl substratu lucyferazy bezpośrednio do dołków hodowlanych. Inkubować przez 6 minut w temperaturze pokojowej i czytać płytki za pomocą luminometru, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Obliczyć współczynnik Z' dla każdej płytki D1 testu toksyczności, aby zagwarantować jakość badania przesiewowego29. Z' = 1-3*(σ+ + σ-)/(μ+ - μ-), gdzie μ+ i σ+ odpowiadają średnim wskaźnikom luminescencji, a odchylenia standardowe dla komórek HEK-293T z samym DMSO (brak toksyczności), a μ- i σ- są średnimi luminescencji i odchyleń standardowych dla studzienek hodowlanych poddanych działaniu IGEPAL w celu zabicia komórek. Oczekuje się, że Z' będzie powyżej 0,5 lub odpowiednia tabliczka zostanie odrzucona.</li>
	<li>Ustaw próg toksyczności na μ+/2. Odrzuć związki o wartościach luminescencji poniżej tej granicy odcięcia (rysunek 3A).</li>
	<li>Obliczyć współczynnik Z' dla każdej płytki D2 testu przeciwwirusowego. Tutaj μ+ i σ+ odpowiadają średnim wskaźnikom luminescencji i odchyleniom standardowym dla zakażonych komórek hodowanych za pomocą samego DMSO, a μ- i σ- są średnimi luminescencji i odchyleń standardowych dla komórek niezakażonych. Również w tym przypadku płytki z wartościami Z' poniżej 0,5 są odrzucane.</li>
	<li>Oblicz zahamowanie replikacji wirusa w następujący sposób: procent zahamowania = (μ+ - aktywność lucyferazy dla związku X)/(μ+ - μ-)*100. Ustaw próg inhibicji na poziomie 75% i wybierz związki, które zarówno zmniejszają wartości luminescencji poniżej tego punktu odcięcia (rysunek 3B), jak i nie są toksyczne zgodnie z kryteriami opisanymi w 4.4.</li>
</ol>
5. Wtórne badanie przesiewowe pod kątem toksyczności i szerokiego spektrum działania przeciwwirusowego
<ol>
	<li>Wykonać seryjne rozcieńczenia 1:2 dla każdego trafionego związku w DMSO, zaczynając od 500 μM do 4 μM (8 rozcieńczeń). Białe płytki do hodowli tkankowych z kodem kreskowym należy wypełnić 50 μl pożywki hodowlanej. Dodać 1 μl każdego rozcieńczenia związku do studzienek hodowlanych. Powtórz dwukrotnie, aby uzyskać 3 płytki hodowlane z podwójnymi seryjnymi rozcieńczeniami dla każdego trafionego związku.</li>
	<li>Przygotować 37,5 ml zawiesiny komórek HEK-293T w stężeniu 6 x 105 komórek/ml w pożywce hodowlanej, jak opisano powyżej (w ppkt 2.1 i 2.2). Dozować 2x 12,5 ml w probówkach sokoła i zainfekować komórki rMV2/Luc przy MOI = 0,1 lub rekombinowanym CHIKV z ekspresją lucyferazy Renilla (CHIKV/Ren) przy MOI = 0,2. Mieszać przez odwrócenie. 
	Uwaga: CHIKV/Ren pochodzi od dzikiego szczepu CHIKV i dlatego powinien być manipulowany w środowisku BSL3. Płytki można przenieść z BSL3 do BSL1 po dodaniu substratu Renilla do dołków hodowlanych (patrz poniżej).</li>
	<li>Dozować 50 μl komórek niezakażonych, zakażonych rMV2/Luc lub zakażonych CHIKV/Ren na płytkach hodowlanych zawierających seryjne rozcieńczenia związków trafionych. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 50 μl substratu lucyferazy świetlika, aby określić aktywność lucyferazy świetlika w studzienkach zakażonych rMV2/Luc. Dodać 50 μl substratu lucyferazy Renilla, aby określić aktywność lucyferazy Renilla w studzienkach zakażonych CHIKV/Ren. Na koniec dodaj 50 μl odczynnika do oznaczania żywotności na bazie lucyferazy do niezakażonych komórek, aby określić żywotność komórkową.</li>
	<li>Wykreślić dane (rysunek 4) i określić stężenia związków trafionych, które hamują replikację MV i CHIKV o 50%. Zignoruj związek wykazujący pewną toksyczność w tym teście.</li>
</ol>

<ol><li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+drugs+in+current+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">Antiviral drugs in current clinical use.</a> J Clin Virol. 30, 115-133 (2004).</li>
<li>Debing, Y., Jochmans, D., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervention+strategies+for+emerging+viruses%3A+use+of+antivirals%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Virol%22%5BJournal%5D)">Intervention strategies for emerging viruses: use of antivirals.</a> Curr Opin Virol. , (2013).</li>
<li>Leyssen, P., De Clercq, E., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+strategies+to+inhibit+the+replication+of+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular strategies to inhibit the replication of RNA viruses.</a> Antiviral Res. 78, 9-25 (2008).</li>
<li>Leyssen, P., Balzarini, J., De Clercq, E., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+predominant+mechanism+by+which+ribavirin+exerts+its+antiviral+activity+in+vitro+against+flaviviruses+and+paramyxoviruses+is+mediated+by+inhibition+of+IMP+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The predominant mechanism by which ribavirin exerts its antiviral activity in vitro against flaviviruses and paramyxoviruses is mediated by inhibition of IMP dehydrogenase.</a> J Virol. 79, 1943-1947 (2005).</li>
<li>Wang, B. X., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin+and+yang+of+viruses+and+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The yin and yang of viruses and interferons.</a> Trends Immunol. 33, 190-197 (2012).</li>
<li>Empey, K. M., Peebles, R. S., Kolls, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+advances+in+the+treatment+and+prevention+of+respiratory+syncytial+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic advances in the treatment and prevention of respiratory syncytial virus.</a> Clin Infect Dis. 50, 1258-1267 (2010).</li>
<li>Tan, S. L., Ganji, G., Paeper, B., Proll, S., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+and+the+host+response+to+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systems biology and the host response to viral infection.</a> Nat Biotechnol. 25, 1383-1389 (2007).</li>
<li>Prussia, A., Thepchatri, P., Snyder, J. P., Plemper, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Approaches+towards+the+Development+of+Host-Directed+Antiviral+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Systematic Approaches towards the Development of Host-Directed Antiviral Therapeutics.</a> Int J Mol Sci. 12, 4027-4052 (2011).</li>
<li>Connolly, D. J., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+Toll-like+receptor+targeted+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">New developments in Toll-like receptor targeted therapeutics.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2012).</li>
<li>Thakur, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+activators+of+RNase+L+with+broad-spectrum+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Small-molecule activators of RNase L with broad-spectrum antiviral activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9585-9590 (2007).</li>
<li>Shoji-Kawata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+candidate+therapeutic+autophagy-inducing+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of a candidate therapeutic autophagy-inducing peptide.</a> Nature. 494, 201-206 (2013).</li>
<li>Hoffman, E. S., Smith, R. E., Renaud, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+analyst%27s+couch%3A+TLR-targeted+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">From the analyst's couch: TLR-targeted therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 4, 879-880 (2005).</li>
<li>Bonavia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+broad-spectrum+antiviral+compounds+and+assessment+of+the+druggability+of+their+target+for+efficacy+against+respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of broad-spectrum antiviral compounds and assessment of the druggability of their target for efficacy against respiratory syncytial virus (RSV).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6739-6744 (2011).</li>
<li>Rider, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+antiviral+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum antiviral therapeutics.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Krumm, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+host-directed+small-molecule+inhibitors+of+myxovirus+RNA-dependent+RNA-polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Potent host-directed small-molecule inhibitors of myxovirus RNA-dependent RNA-polymerases.</a> PLoS One. , (2011).</li>
<li>Hoffmann, H. H., Kunz, A., Simon, V. A., Palese, P., Shaw, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+antiviral+that+interferes+with+de+novo+pyrimidine+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum antiviral that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5777-5782 (2011).</li>
<li>Harvey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSK983%3A+a+novel+compound+with+broad-spectrum+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">GSK983: a novel compound with broad-spectrum antiviral activity.</a> Antiviral Res. 82, 1-11 (2009).</li>
<li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+were+new+medicines+discovered%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">How were new medicines discovered.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 507-519 (2011).</li>
<li>Jochmans, D., Leyssen, P., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+high-throughput+screening+to+quantify+antiviral+activity+against+viruses+that+induce+limited+CPE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for high-throughput screening to quantify antiviral activity against viruses that induce limited CPE.</a> J Virol Methods. 183, 176-179 (2012).</li>
<li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+assays+using+a+luciferase-expressing+replicon%2C+virus-like+particles%2C+and+full-length+virus+for+West+Nile+virus+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49, 4980-4988 (2005).</li>
<li>Panchal, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+high-content+imaging+assays+for+lethal+viral+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Development of high-content imaging assays for lethal viral pathogens.</a> J Biomol Screen. 15, 755-765 (2010).</li>
<li>Pohjala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+alphavirus+entry+and+replication+identified+with+a+stable+Chikungunya+replicon+cell+line+and+virus-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of alphavirus entry and replication identified with a stable Chikungunya replicon cell line and virus-based assays.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+stable+luciferase+dengue+virus+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening.</a> Antiviral Res. 91, 11-19 (2011).</li>
<li>Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+insights+into+firefly+luciferase+and+other+bioluminescent+reporters+used+in+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology.</a> Chem Biol. 17, 646-657 (2010).</li>
<li>Komarova, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+virus-host+interactions+in+an+infectious+context+using+recombinant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of virus-host interactions in an infectious context using recombinant viruses.</a> Mol Cell Proteomics. , (2011).</li>
<li>Henrik Gad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+E2-E166K+substitution+restores+Chikungunya+virus+growth+in+OAS3+expressing+cells+by+acting+on+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The E2-E166K substitution restores Chikungunya virus growth in OAS3 expressing cells by acting on viral entry.</a> Virology. 434, 27-37 (2012).</li>
<li>Wang, Q. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+dengue+virus+through+suppression+of+host+pyrimidine+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of dengue virus through suppression of host pyrimidine biosynthesis.</a> J Virol. 85, 6548-6556 (2011).</li>
<li>Smee, D. F., Hurst, B. L., Day, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D282%2C+a+non-nucleoside+inhibitor+of+influenza+virus+infection+that+interferes+with+de+novo+pyrimidine+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Antivir+Chem+Chemother%22%5BJournal%5D)">D282, a non-nucleoside inhibitor of influenza virus infection that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis.</a> Antivir Chem Chemother. 22, 263-272 (2012).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Qing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+dengue+virus+resistance+to+brequinar+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Characterization of dengue virus resistance to brequinar in cell culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54, 3686-3695 (2010).</li>
<li>Munier-Lehmann, H., Vidalain, P. O., Tangy, F., Janin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+dihydroorotate+dehydrogenases+and+their+inhibitors+and+uses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">On dihydroorotate dehydrogenases and their inhibitors and uses.</a> J Med Chem. 56, 3148-3167 (2013).</li>
<li>Yoon, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening-based+identification+of+paramyxovirus+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening-based identification of paramyxovirus inhibitors.</a> J Biomol Screen. 13, 591-608 (2008).</li>
<li>Maréchal, E., Roy, S., Lafanechère, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMar%C3%A9chal%2C+E+%22Chemogenomics+and+Chemical+Genetics%3A+A+User%27s+Introduction+for+Biologists%2C+Chemists+and+Informaticians%22">Chemogenomics and Chemical Genetics: A User's Introduction for Biologists, Chemists and Informaticians</a>. , Springer. (2011).</li>
<li>Gentzsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+complete+life+cycle+screen+for+identification+of+small+molecules+with+pro-+or+antiviral+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus complete life cycle screen for identification of small molecules with pro- or antiviral activity.</a> Antiviral Res. 89, 136-148 (2011).</li>
<li>Caignard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V+protein+of+Tioman+virus+is+incapable+of+blocking+type+I+interferon+signaling+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The V protein of Tioman virus is incapable of blocking type I interferon signaling in human cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisana tu procedura badań przesiewowych ma na celu wyselekcjonowanie związków o odpowiednim profilu jako inhibitory wirusów RNA o szerokim spektrum działania. Gdy za pomocą tego protokołu przebadano bibliotekę 10 000 związków i zastosowano wyżej wymienione kryteria filtrowania, tj. hamowanie replikacji MV powyżej 75%, 40 związków (0,4%) uzyskało wynik pozytywny. Poza tym około połowa z nich wykazała pewną toksyczność w teście żywotności opartym na lucyferazie i z tego powodu została zignorowana. Na koniec ponow...

Wirusy RNA są odpowiedzialne za wiele różnych infekcji u ludzi i mają ogromny wpływ na populacje na całym świecie, zarówno pod względem zdrowia publicznego, jak i kosztów ekonomicznych. Opracowano skuteczne szczepionki przeciwko kilku ludzkim wirusom RNA i są one szeroko stosowane w leczeniu profilaktycznym. Jednak nadal istnieje krytyczny brak leków terapeutycznych przeciwko infekcjom wirusem RNA. Rzeczywiście, nie są dostępne skuteczne szczepionki przeciwko głównym patogenom u ludzi, takim jak wirus dengi, wirus zapalenia wątroby typu C lub ludzki syncytialny wirus oddechowy (hRSV). Poza tym wirusy RNA są odpowiedzialne za większość pojawiających się chorób, których częstotliwość wzrosła ze względu na globalną wymianę i wpływ człowieka na systemy ekologiczne. Wobec tego zagrożenia, jakim są wirusy RNA, nasz arsenał terapeutyczny jest niezwykle ograniczony i stosunkowo mało skuteczny1-3. Obecne terapie opierają się zasadniczo na rekombinowanych interferonach typu I (IFN-α/β) w celu stymulacji odporności wrodzonej lub podawaniu rybawiryny. Chociaż sposób działania tego analogu rybonukleozydu jest kontrowersyjny i prawdopodobnie opiera się na różnych mechanizmach, hamowanie komórkowego IMPDH (dehydrogenazy monofosforanu inozyny), która wyczerpuje wewnątrzkomórkowe pule GTP, jest wyraźnie niezbędne4. Rybawiryna, w skojarzeniu z pegylowanym IFN-α, jest głównym lekiem przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C. Jednak leczenie IFN-α/β i rybawiryną ma stosunkowo niską skuteczność in vivo przeciwko większości wirusów RNA, ponieważ skutecznie tępią sygnalizację IFN-α/β poprzez ekspresję czynników wirulencji5 i często uciekają rybawiryny3. Przyczyniło się to do faktu, że leczenie rybawiryną rodzi poważne problemy związane z toksycznością, chociaż niedawno została zatwierdzona przeciwko ciężkiej chorobie hRSV z kontrowersyjnymi korzyściami6. Ostatnio wprowadzono na rynek niektóre terapie specyficzne dla wirusa, w szczególności przeciwko wirusowi grypy wraz z opracowaniem inhibitorów neuraminidazy3. Jednak duża różnorodność i trwałe pojawianie się wirusów RNA uniemożliwia opracowanie specyficznych metod leczenia każdego z nich w stosunkowo bliskiej przyszłości. Ogólnie rzecz biorąc, podkreśla to potrzebę opracowania skutecznych strategii identyfikacji i rozwoju silnych cząsteczek przeciwwirusowych w najbliższej przyszłości.
Trywialne jest stwierdzenie, że inhibitor o szerokim spektrum działania przeciwko dużej liczbie wirusów RNA rozwiązałby ten problem. Chociaż taka cząsteczka jest nadal marzeniem wirusologa, nasze lepsze zrozumienie mechanizmów obrony komórkowej i wrodzonego układu odpornościowego sugeruje, że istnieją pewne możliwości7,8. Kilka laboratoriów akademickich i przemysłowych poszukuje obecnie cząsteczek, które stymulują określone aspekty komórkowych mechanizmów obronnych lub szlaków metabolicznych w celu osłabienia replikacji wirusa. Chociaż takie związki prawdopodobnie będą wykazywać znaczące skutki uboczne, leczenie ostrych infekcji wirusowych będzie stosowane przez stosunkowo krótki czas, co czyni je akceptowalnymi pomimo pewnej potencjalnej toksyczności w dłuższej perspektywie. Opracowano różne strategie identyfikacji takich cząsteczek przeciwwirusowych o szerokim spektrum działania. Niektóre programy badawcze mają na celu znalezienie cząsteczek, które są ukierunkowane na określone szlaki obronne lub metaboliczne. Obejmuje to na przykład receptory rozpoznające patogeny w celu wywołania ekspresji genów przeciwwirusowych9 i aktywacji czynników przeciwwirusowych, takich jak RNaza10, maszyneria autofagii sprzyjająca degradacji wirusa11, szlaki syntezy nukleozydów12,13 lub kaskady apoptotyczne w celu przyspieszenia śmierci komórek zakażonych wirusem14. Inne grupy opracowały fenotypowe badania przesiewowe, które nie są oparte na celu13,15-17. W takim przypadku cząsteczki przeciwwirusowe są po prostu identyfikowane na podstawie ich zdolności do blokowania replikacji wirusa w danym systemie komórkowym. Ogólne założenie jest takie, że związek hamujący 2-3 niespokrewnione wirusy RNA miałby odpowiedni profil dla cząsteczki przeciwwirusowej o szerokim spektrum działania. Sposób działania związków trafionych wybranych przy takim podejściu empirycznym jest określany dopiero po raz drugi i ostatecznie może doprowadzić do identyfikacji nowych celów komórkowych dla leków przeciwwirusowych. Co ciekawe, retrospektywna analiza nowych leków zatwierdzonych przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków w latach 1999-2008 wykazała, że ogólnie rzecz biorąc, takie fenotypowe badania przesiewowe zwykle osiągają lepsze wyniki niż podejścia celowe w celu odkrycia pierwszych w swojej klasie leków małocząsteczkowych18.
Replikacja wirusa w wysokoprzepustowych testach komórkowych jest zwykle określana na podstawie efektów cytopatycznych wirusa. Komórki są zakażone i hodowane na płytkach 96- lub 384-dołkowych w obecności badanych związków. Po kilku dniach warstwy komórkowe są utrwalone i zabarwione barwnikami, takimi jak fiolet krystaliczny. Na koniec absorbancję określa się za pomocą czytnika płytkowego, a związki hamujące replikację wirusa identyfikuje się na podstawie ich zdolności do ochrony warstw komórkowych przed efektem cytopatycznym wywołanym przez wirusa. Alternatywnie, efekty cytopatyczne za pośrednictwem wirusa ocenia się za pomocą standardowych testów żywotności, takich jak redukcja MTS. Takie testy są bardzo wykonalne i opłacalne, ale mają trzy główne ograniczenia. Po pierwsze, wymagają one kombinacji wirus-komórka, w której replikacja wirusa jest cytopatyczna w ciągu zaledwie kilku dni, ale nie zawsze jest to możliwe, co wymaga alternatywnych podejść19. Po drugie, są one słabo ilościowe, ponieważ opierają się na pośredniej mierze replikacji wirusa. Wreszcie, związki toksyczne mogą być oceniane jako trafienia dodatnie, a zatem muszą być eliminowane za pomocą ekranu licznika mierzącego żywotność komórek. Aby przezwyciężyć niektóre z tych przeszkód, rekombinowane wirusy lub replikony zostały zmodyfikowane za pomocą genetyki odwrotnej w celu ekspresji białek reporterowych, takich jak EGFP lub lucyferaza, z dodatkowej jednostki transkrypcyjnej lub w ramce z genami białka wirusowego (kilka przykładów to 20-23). Kiedy te wirusy się replikują, białka reporterowe są wytwarzane razem z samymi białkami wirusowymi. Zapewnia to bardzo ilościowy test do pomiaru replikacji wirusa i oceny aktywności hamującej cząsteczek kandydujących. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku rekombinowanych wirusów eksprymujących lucyferazy (lub inne enzymy zdolne do bioluminescencji), ponieważ ten system reporterowy wykazuje szeroki zakres dynamiki z wysoką czułością i praktycznie bez tła. Ponadto nie ma źródła światła wzbudzającego, co zapobiega interferencji z fluorescencją związków24.
Tutaj szczegółowo opisujemy protokół o wysokiej przepustowości do przeszukiwania bibliotek chemicznych pod kątem inhibitorów wirusów RNA o szerokim spektrum. Związki są najpierw testowane na komórkach ludzkich zakażonych rekombinowanym wirusem odry (MV) eksprymującym lucyferazy świetlika25 (rMV2 / Luc, ryc. 1, pierwotne badanie przesiewowe). MV należy do rzędu Mononegavirales i jest często uważany za prototypowego członka wirusów o ujemnej nici RNA. W związku z tym genom MV jest wykorzystywany jako matryca przez polimerazę wirusa do syntezy cząsteczek mRNA kodujących białka wirusowe. W rekombinowanym szczepie MV o nazwie rMV2 / Luc ekspresja lucyferazy ulega ekspresji z dodatkowej jednostki transkrypcyjnej wstawionej między geny P i M (Figura 2A). Równolegle związki są testowane pod kątem ich toksyczności na komórkach ludzkich przy użyciu komercyjnego odczynnika na bazie lucyferazy, który ocenia, poprzez kwantyfikację ATP, liczbę metabolicznie aktywnych komórek w hodowli (ryc. 1, podstawowe badanie przesiewowe). Za pomocą tych dwóch testów można łatwo przebadać całe biblioteki chemiczne w celu wybrania związków, które nie są toksyczne i skutecznie blokują replikację MV. Następnie trafienia są ponownie testowane pod kątem zahamowania replikacji MV dawka-odpowiedź, braku toksyczności, a także ich zdolności do upośledzenia replikacji wirusa chikungunya (CHIKV) (Figura 1, badanie wtórne). CHIKV należy do rodziny Togaviridae, a jego genom jest dodatnią jednoniciową cząsteczką RNA. W związku z tym jest całkowicie niezwiązany z odrą, a związki hamujące zarówno MV, jak i CHIKV mają wielką szansę na zahamowanie dużego panelu wirusów RNA. Białka niestrukturalne CHIKV są bezpośrednio translowane z genomu wirusa, podczas gdy białka strukturalne są kodowane przez transkrypcję i translację subgenomowej cząsteczki mRNA. Nasz test replikacji in vitro dla CHIKV opiera się na rekombinowanym szczepie o nazwie CHIKV / Ren, który wyraża enzym lucyferazy Renilla jako rozszczepioną część niestrukturalnej poliproteiny poprzez insercję genu reporterowego między sekwencjami nsP3 i nsP426 (Figura 2B). Pomiar aktywności lucyferazy Renilla pozwala na monitorowanie replikacji wirusa na wczesnym etapie cyklu życiowego CHIKV.
Ten protokół o wysokiej przepustowości został wykorzystany do szybkiej identyfikacji związków o odpowiednim profilu dla leków przeciwwirusowych o szerokim spektrum działania w komercyjnej bibliotece 10 000 cząsteczek wzbogaconych o różnorodność chemiczną. Związki były zasadniczo zgodne z regułą pięciu Lipińskiego, z masami cząsteczkowymi w zakresie od 250 do 600 daltonów i wartościami logarytmu D poniżej 5. Większość z tych cząsteczek to nowe jednostki chemiczne niedostępne w innych komercyjnych bibliotekach.

<table><tbody><tr><td>Platforma Freedom EVO</td><td>TECAN</td><td></td><td>Platforma robotyczna</td></tr><tr><td>96-dołkowe mikropłytki do hodowli komórek polistyrenowych, białe</td><td>Greiner Bio One</td><td>655083</td><td></td></tr><tr><td>Test żywotności komórek luminescencyjnych CellTiter-Glo</td> Test żywotności <td>na bazie lucyferazy</td><td>Promega</td><td>G7570</td></tr><tr><td>System oznaczania lucyferazy Bright-Glo Promega</td><td></td><td>E2610</td><td>Odczynnik zawierający lucyferazy świetlika substrat</td></tr><tr><td>System oznaczania lucyferazy Renilla-Glo</td><td>Promega</td><td>E2710</td><td>Odczynnik zawierający substrat lucyferazy Renilla</td></tr><tr><td>Britelite plus Reporter Gene Assay System</td><td>Perkin-Elmer</td><td>6016761</td><td>Odczynnik zawierający substrat lucyferazy świetlika. Może być stosowany jako alternatywa dla odczynnika Brigh-Glo do określania aktywności lucyferazy.</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku chemicznych inhibitorów wirusów rna o szerokim spektrum działania

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Wirusy RNA są odpowiedzialne za główne choroby ludzkie, takie jak grypa, zapalenie oskrzeli, denga, wirusowe zapalenie wątroby typu C czy odra. Stanowią one również nowe zagrożenie ze względu na wzmożoną wymianę na całym świecie i populacje ludzkie penetrujące coraz więcej naturalnych ekosystemów. Dobrym przykładem takiej wyłaniającej się sytuacji są epidemie wirusa chikungunya w latach 2005-2006 na Oceanie Indyjskim. Ostatnie postępy w naszym zrozumieniu szlaków komórkowych kontrolujących replikację wirusa sugerują, że związki ukierunkowane na funkcje komórek gospodarza, a nie sam wirus, mogą hamować duży panel wirusów RNA. Niektóre związki przeciwwirusowe o szerokim spektrum działania zostały zidentyfikowane za pomocą testów zorientowanych na cel gospodarza. Jednak pomiar zahamowania replikacji wirusa w hodowlach komórkowych przy użyciu redukcji efektów cytopatycznych jako odczytu nadal stanowi najważniejszą strategię badań przesiewowych. Takie funkcjonalne badania przesiewowe zostały znacznie ulepszone dzięki opracowaniu rekombinowanych wirusów wykazujących ekspresję enzymów reporterowych zdolnych do bioluminescencji, takich jak lucyferaza. W niniejszym raporcie szczegółowo opisujemy wysokoprzepustową linię badań przesiewowych, która łączy rekombinowane wirusy odry i chikungunya z testami żywotności komórek, w celu identyfikacji związków o profilu przeciwwirusowym o szerokim spektrum działania.

Ta ścieżka przesiewowa opiera się w pierwszej kolejności na wyborze związków, które hamują replikację MV i nie wykazują istotnej toksyczności komórkowej (Rysunek 1, przesiew pierwotny). Wykorzystuje ona testy oparte na lucyferazie do określania toksyczności komórkowej oraz stopnia zahamowania replikacji wirusa. Wszystkie etapy pipetowania i akwizycji danych mogą być realizowane w warunkach wysokoprzepustowych z wykorzystaniem platformy robotycznej.
Toksyczność komórkową związk...

Testy in vitro do pomiaru replikacji wirusa zostały znacznie ulepszone dzięki rozwojowi rekombinowanych wirusów RNA wyrażających lucyferazy lub inne enzymy zdolne do bioluminescencji. W tym miejscu szczegółowo opisujemy wysokoprzepustową linię badań przesiewowych, która łączy takie rekombinowane szczepy wirusów odry i chikungunya w celu wyizolowania leków przeciwwirusowych o szerokim spektrum działania z bibliotek chemicznych.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku chemicznych inhibitorów wirusów RNA o szerokim spektrum działania

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie szerokospektralnych leków przeciwwirusowych z bibliotek chemicznych przy użyciu kombinacji testów komórkowych in vitro. Osiąga się to poprzez wstępną selekcję związków hamujących replikację in vitro rekombinowanego szczepu wirusa odry, który koduje lucyferazę jako marker. Równolegle szacowana jest toksyczność związku za pomocą testu żywotności opartego na lucyferazie.Połączone dane fenotypowe z obu testów służą do wyizolowania cząsteczek HIT. Końcowe etapy polegają na ponownym przebadaniu związków HIT pod kątem powtarzalności odpowiedzi dawka-reakcja w inhibicji wirusa odry oraz wirusa chikungunya, a także na dokładniejszym pomiarze toksyczności in vitro. Ostatecznie za pomocą tego przesiewu identyfikowane i walidowane są szerokospektrowe związki przeciwwirusowe.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak standardowe testy replikacji wirusów opierające się na efektach cytopatycznych, jest wykorzystanie luminescencji jako odczytu oraz połączenie dwóch wysoce zróżnicowanych wirusów wykazujących ekspresję lucyferazy jako reportera. Procedurę zaprezentują Olivier Helynck, technik z zespołu Helene Munier-Lehmann, oraz Marianne Lucas-Hourani, inżynier współpracująca ze mną w jednostce badawczej Frédérica Tangy.Należy rozpocząć od ogrzania do temperatury pokojowej płytek macierzystych 96-dołkowych zawierających 10 mM roztwory zapasowe związków chemicznych w DMSO. Przenieś 5 µL każdego związku na nowe płytki 96-dołkowe, w których każdy dołek zawiera już 20 µL DMSO, tworząc w ten sposób płytki z rozcieńczeniami pośrednimi. Następnie pipetuj 1 µL z tych płytek z rozcieńczeniami do suchych dołków białych, kodowanych kreskowo płytek 96-dołkowych do hodowli tkankowej.Są to płytki D1, które służą do oceny toksyczności związków przy stężeniu 20 µM. Przechowywać je w temperaturze -20 °C. Następnie przygotować nowe płytki z płytek rozcieńczeń pośrednich, poddając je dalszemu 10-krotnemu rozcieńczeniu.Należy pobrać 4 µL każdego rozcieńczonego związku i wymieszać je w dołkach z 36 µL DMSO. Z tych płytek należy przenieść 1 µL każdej próbki do suchych dołków białych 96-dołkowych płytek do hodowli tkankowej z płaskim dnem i kodami kreskowymi.Są to płytki D2, które są wykorzystywane do oceny inhibicji replikacji MV. Należy je również przechowywać w temperaturze -20 °C.Hodować komórki HEK-293-T w suplementowanym medium DMEM ze stabilizowaną L-glutaminą. Co cztery do pięciu dni pasażować komórki przy użyciu trypsyny, wykonując rozcieńczenie 1:10 w nowych kolbach.W fazie wzrostu logarytmicznego należy zebrać i policzyć komórki do eksperymentu. Resuspenduj komórki do stężenia 300 000 komórek na mililitr. Do każdej płytki przeznaczonej do screeningu wymagane jest 12,5 mililitra komórek w tym rozcieńczeniu.Następnie należy przygotować płytki. Do jednego zestawu studni kontrolnych dodaje się 1 µL DMSO, a do drugiego zestawu studni kontrolnych 1 µL DMSO oraz 2,5 µL 0,5% roztworu IGEPAL w celu zabicia komórek. Zawiesinę komórkową przenosi się do korytka, a następnie do każdej studni płytek D-one nanosi po 100 µL.Regularnie mieszaj zawiesinę, aby zapobiec sedymentacji. Następnie inkubuj przygotowane płytki przez 24 godziny.Przygotuj komórki na płytki zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji. Pożywka hodowlana może zostać uzupełniona o urydynę, aby wyeliminować cząsteczki przeciwwirusowe celujące w wczesne etapy biosyntezy pyrymidyn, ponieważ są one dość powszechne. Odstaw jedną dziesiątą zawiesiny komórkowej dla studzienek kontrolnych z niezinfekowanymi komórkami, a pozostałą objętość zainfekuj. Rozmroź odpowiednią ilość roztworu zapasowego rMV2-luc, aby zainfekować hodowlę z dawki 0,1 cząsteczek zakaźnych na komórkę docelową, co odpowiada wielokrotności infekcji (MOI) 0,1. Dodaj obliczoną objętość wirusa do zawiesiny komórkowej i delikatnie wymieszaj. Przenieś zainfekowane komórki do korytka i nanieś po 100 µL zainfekowanych komórek na płytki D-two. Wypełnij kolumny od drugiej do jedenastej, które zawierają dodane związki chemiczne, oraz studzienki kontroli pozytywnej w kolumnach pierwszej i dwunastej. Regularnie i delikatnie mieszaj komórki w korytku. W naprzemiennych rzędach kolumn pierwszej i dwunastej nanieś po 100 µL niezinfekowanych komórek. Następnie inkubuj płytki przez 24 godziny.Po czasie inkubacji należy określić żywotność komórek na płytce D-one. Do każdego dołka należy dodać 50 µL odczynnika do oceny żywotności opartego na lucyferazie i odczekać 10 minut. Następnie płytki należy odczytać za pomocą luminometru. Czas całkowania należy ustawić na 100 ms na dołek.Następnie określ replikację MV na płytkach D-two, dodając 50 µL podłoża lucyferazy świetlika do każdej studni i odczekując sześć minut w temperaturze pokojowej. Następnie wyznacz czynnik Z dla każdej płytki D-one i D-two w teście toksyczności.Następnie należy obliczyć stopień zahamowania replikacji wirusa. Związkami HIT są te, które redukują replikację wirusa poniżej przyjętej wartości odcięcia i nie wykazują toksyczności.Dla każdego związku HIT przygotować rozcieńczenia szeregowe w DMSO, zaczynając od 500 µM i zmniejszając stężenie dwukrotnie, aż do 4 µM, wzdłuż jednej kolumny płytki 96-dołkowej. Przenieść 1 µL z płytki z rozcieńczeniami związku do białej, kodowanej płytki do hodowli tkankowej. Powtórzyć ten proces dwukrotnie, aby utworzyć zestaw trzech powtórzeń płytek testowych. Następnie wypełnić płytki do hodowli tkankowej 50 µL pożywki hodowlanej. Przygotować 37,5 mL komórek HEK-293T zawieszonych w suplementowanym DMEM w stężeniu 600 000 komórek/mL.Do dwóch probówek o pojemności 15 mililitrów wlej po 12,5 mililitrów zawiesiny komórkowej. Jedną probówkę z komórkami zainfekuj rMV2/luc z wielokrotnością infekcji (MOI) wynoszącą 0,1. Drugą probówkę z komórkami zainfekuj rekombinowanym wirusem chikV wykazującym ekspresję lucyferazy renilla, stosując wielokrotność infekcji 0,2. Obie probówki z zainfekowanymi komórkami wymieszaj metodą odwracania. Ze względu na patogenność chikV czynność tę należy przeprowadzić w laboratorium trzeciego stopnia bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3).Następnie nanieś niezinfekowane komórki oraz zestawy komórek zainfekowanych do oddzielnych zestawów płytek z hitowymi związkami.Do każdego dołka nanieś 50 µL zawiesiny komórek i inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Następnego dnia do każdego dołka z komórkami zainfekowanymi rMV2/luc dodaj 50 µL lucyferazy świetlika. Analogicznie, do komórek zainfekowanych ChikV-Ren dodaj 50 µL substratu lucyferazy Renilla. Do niezinfekowanych komórek kontrolnych dodaj 50 µL odczynnika do oceny żywotności opartego na lucyferazie.Następnie należy wyznaczyć stężenia związków HIT, które hamują replikację MV oraz ChikV o 50%. Dodatkowo należy odrzucić związki wykazujące toksyczność komórkową. Niniejszy schemat przesiewowy opiera się na wyborze związków, które nie wykazują istotnej toksyczności komórkowej i hamują replikację zarówno MV, jak i ChikV, co określono odpowiednio w badaniach przesiewowych pierwotnych i wtórnych. Wykorzystuje on wirusy rekombinowane wykazujące ekspresję lucyferazy świetlika lub renilla jako reportera.Toksyczność związków ocenia się za pomocą komercyjnego testu opartego na lucyferazie, w którym luminescencja koreluje z liczbą żywych komórek. Na tej płytce 21 związków uznano za toksyczne na podstawie progu ustalonego przez studzienki z kontrolą pozytywną.Aktywność przeciwwirusową zmierzono najpierw z użyciem rMV2/ luc. Luminescencję porównano z limitem ustalonym dla dołków kontrolnych. W tym badaniu stwierdzono, że cztery związki są w stanie zahamować replikację wirusa o ponad 75%. W drugim teście dwa z tych związków okazały się toksyczne. Dla wszystkich związków typu HIT wyznaczono połowową maksymalną stężenie hamujące (IC₅₀) zarówno dla wirusów RNA MV, jak i ChikV wykazujących ekspresję lucyferazy. Te dwa wirusy nie są ze sobą spokrewnione, co zwiększa wiarygodność przesiewu. Równolegle, w eksperymencie zależności od dawki, potwierdzono brak cytotoksyczności wybranych związków.Wszystkich 13 nietoksycznych związków zidentyfikowano z biblioteki chemicznej zawierającej 10 000 cząsteczek. Związki te były nowatorskie zarówno pod względem struktury chemicznej, jak i aktywności biologicznej. Na podstawie podobieństwa strukturalnego związki te podzielono na trzy rodziny chemiczne. Jako punkt odniesienia uzyskano wartości połowicznej maksymalnej stężenia hamującego dla Brequinaru, substancji o silnej aktywności przeciwwirusowej. Analiza tych wartości wykazała, że cząsteczkę referencyjną od większości najaktywniejszych związków (HITs) zidentyfikowanych podczas przesiewu oddziela mniej niż rząd wielkości. Świadczy to o stosunkowo silnej aktywności przeciwwirusowej wybranych związków. Po opanowaniu ta technika może być wykorzystana do przesiewania dużych bibliotek chemicznych w systemach wysokoprzepustowych oraz do wyboru zestawów małych cząsteczek wzbogaconych o leki przeciwwirusowe o szerokim spektrum działania.

high-throughput-screening-for-broad-spectrum-chemical-inhibitors-rna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przesiewowe badanie wysokoprężnościowe w poszukiwaniu szerokospektralnych chemicznych inhibitorów wirusów RNA

Nowe czynniki gospodarza zaangażowane w infekcje wirusowe można zidentyfikować za pomocą komórkowego przesiewu RNAi w celu utraty funkcji w skali całego genomu. Model hodowli komórkowej Drosophila jest szczególnie podatny na to podejście ze względu na łatwość i wydajność RNAi. W niniejszym materiale prezentujemy tę technikę, posługując się wirusem vaccinia jako przykładem.

Przesiew RNAi w poszukiwaniu czynników gospodarza zaangażowanych w infekcję wirusem Vaccinia z wykorzystaniem komórek Drosophila

Trzy testy, w tym test oparty na działaniu cytopatycznym (CPE), test dawka-odpowiedź i test czasu dodania (ToA) zostały opracowane, zoptymalizowane, zatwierdzone i wykorzystane do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka (BTV), a także do określenia możliwego mechanizmu działania (MoA) dla nowo zidentyfikowanych leków przeciwwirusowych.

Testy do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka

Tutaj opisujemy cytotoksyczność komórkową i testy zakaźności w pojedynczej rundzie, które pozwalają na szybkie i dokładne badanie przesiewowe związków w celu określenia ich cytotoksyczności komórkowej (CC50) i wartości IC50 przeciwko WT i lekoopornemu HIV-1.

Szybkie badania przesiewowe w kierunku inhibitorów odwrotnej transkryptazy i integrazy HIV

Tutaj prezentujemy protokół, który bada konkretne etapy wejścia wirusa w celu identyfikacji i oceny nowych środków przeciwwirusowych.

Testy wczesnego wnikania wirusa w celu identyfikacji i oceny związków przeciwwirusowych

Opisano metody oceny skuteczności i toksyczności cząsteczek RNA ukierunkowanych na etapy postintegracyjne cyklu replikacji HIV-1. Metody te są przydatne do badań przesiewowych nowych cząsteczek i optymalizacji formatu istniejących.

Ocena skuteczności i toksyczności RNA ukierunkowanych na produkcję HIV-1 do stosowania w terapii genowej lub lekowej

Tutaj opisujemy protokół do wykorzystania wysokoprzepustowego badania przesiewowego RNAi w celu odkrycia celów gospodarza, które mogą być manipulowane w celu wzmocnienia terapii wirusami onkolitycznymi, w szczególności terapii wirusem rabodu i krowianki, ale można go łatwo dostosować do innych platform wirusów onkolitycznych lub do odkrywania genów gospodarza, które ogólnie modulują replikację wirusa.

Badania przesiewowe RNAi całego genomu w celu identyfikacji czynników gospodarza, które modulują terapię wirusem onkolitycznym

Opisujemy test oparty na komórkach, który informuje o fuzji HIV-1 poprzez ekspresję białka zielonej fluorescencji wykrywalnego za pomocą cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej. Może być stosowany do testowania inhibitorów wnikania wirusa (szczególnie na etapie fuzji) w systemach infekcji bezkomórkowych i międzykomórkowych.

Wysokoprzepustowy test fuzji błony wirusowej aktywowanej Cre-Lox w celu identyfikacji inhibitorów fuzji błony wirusowej HIV-1

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji 1) kodowanych przez wirusa immunomodulatorów, które promują replikację arbowirusa i 2) eukariotycznych czynników gospodarza, które ograniczają replikację arbowirusa. Te metody oparte na fluorescencji i luminescencji pozwalają naukowcom szybko uzyskać ilościowe odczyty replikacji arbowirusa w uproszczonych testach o niskim stosunku sygnału do szumu.

Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza

W tej pracy opisujemy protokoły używane w testach opartych na replikonie i enzymach wirusowych do badań przesiewowych na obecność inhibitorów replikacji wirusa Zika w formacie wysokoprzepustowych.

Wysokoprzepustowe testy przeciwwirusowe do badań przesiewowych w kierunku inhibitorów replikacji wirusa Zika

Opisujemy jednokomórkowy test wysokoprzepustowy do pomiaru cytotoksyczności limfocytów T podczas inkubacji z komórkami docelowymi nowotworu. Metoda ta wykorzystuje gęsty, elastomerowy układ dołków sub-nanolitrowych (~ 100 000 dołków / tablicę) w celu przestrzennego ograniczenia limfocytów T i komórek docelowych w określonych proporcjach i jest sprzężona z mikroskopią fluorescencyjną w celu monitorowania koniugacji efektor-cel i późniejszej apoptozy.

Ilościowy, wysokoprzepustowy test cytotoksyczności pojedynczej komórki dla limfocytów T

Poznaj wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku inhibitorów wirusów RNA o szerokim spektrum działania. Metoda wykorzystuje rekombinowane wirusy odry i chikungunya z lucyferazą do identyfikacji związków przeciwwirusowych.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku chemicznych inhibitorów wirusów RNA o szerokim spektrum działania

Przeglądaj więcej filmów