Name: Przejściowa ekspresja genów w tytoniu przy użyciu zespołu Gibsona i pistoletu genowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-18T18:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Naucz się metody przejściowej ekspresji genów w komórkach epidermy liścia tytoniu przy użyciu zespołu Gibsona i pistoletu genowego. Technika umożliwia wizualizację GFP w chloroplastach i peroksysomach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Jen Sheen z Massachusetts General Hospital za hojną darowiznę sadzonek Nicotiana benthamiana. Jen Bush bardzo nam pomogła w doradztwie w zakresie uprawy roślin i założenia komory wzrostu. Tom Ferrante z Instytutu Wyss zaoferował kluczową pomoc w mikroskopii konfokalnej. Autorzy chcieliby szczególnie podziękować Donowi Ingberowi ze Szpitala Dziecięcego w Bostonie i Wyss Institute za hojną darowiznę w postaci pistoletu Gene Gun i związanych z nim materiałów. Finansowanie tego projektu zostało zapewnione na podstawie umowy o współpracy z Agencją Zaawansowanych Projektów Badawczych Departamentu Energii (ARPA-E Award # DE-000079) dla PAN, JCW i MdM oraz za pośrednictwem Chimerion Biotechnology, Inc. dla MJV.

1. Projektowanie alternatywnie połączonych sekwencji do celowania w wiele organelli
<ol>
	<li>Określ miejsca końcowej ekspresji białka. W tej pracy zainteresowanie skupia się na chloroplastach, peroksysomach i cytozolu.</li>
	<li>Skorzystaj z literatury, aby zidentyfikować sekwencje białek i DNA, o których wiadomo, że kierują białka do interesujących organelli. W tym przypadku oznaczono sekwencję celującą w chloroplast z metylotransferazy L-izoasparaginianu Arabidopsis thaliana 6,15 oraz sekwencję celującą w peroksysomy z transtyretynopodobnej syntazy S-alantoiny Arabidopsis thaliana 16,17.</li>
	<li>Zidentyfikuj alternatywny schemat splicingu, który powinien być ukierunkowany na interesujące białka do odpowiednich organelli. W tej pracy należy przeprowadzić badania w miejscach splicingu, jak zaobserwowano w naturalnym systemie Arabidopsis 6. Sekwencja mRNA została przeprojektowana, pozostawiając naturalne miejsca splicingu, ale sekwencje umieszczono kodujące znaczniki ukierunkowane na chloroplasty lub peroksysomy w alternatywnie splicowanych intronach (Figura 1).</li>
</ol>
2. Montaż części DNA Gibsona
Zobacz także Rysunek 2.
Metoda składania Gibsona polega na działaniu kilku enzymów w gotowym mieszance, aby 1) częściowo trawić końce dwuniciowego DNA, aby utworzyć pojedyncze nici i 2) wyżarzać uzupełniające się pary zasad sąsiednich części DNA. Pozwala to na klonowanie fragmentów DNA bez ograniczeń związanych z miejscami restrykcyjnymi.
<ol>
	<li>Wybierz kolejność pierwiastków w konstrukcie plazmidu DNA. Na przykład TriTag-1 zawiera elementy: a) wektora plazmidowego (pORE, zawierającego konstrukt GFP, o którym wiadomo, że działa w roślinach, marker oporności na kanamycynę i pochodzenie replikacji dla gospodarzy E. coli i Agrobacterium tumefaciens), b) sekwencję promotorową (PENTCUP2, która okazała się konstytutywna dla roślin), c) sekwencję ukierunkowaną na chloroplasty (CTS), c) sekwencję ukierunkowaną na peroksysomy (PTS), oraz d) szereg miejsc łączenia, jak opisano wcześniej6.</li>
	<li>Zaprojektuj konstrukcję baza po podstawie za pomocą oprogramowania do projektowania in silico. ApE to darmowy pakiet open source przydatny do tej pracy. 
	Uwaga: TriTag-1, ma kolejność: wektor plazmidu, promotor, ATG, miejsce donorowe splicingu, sekwencja docelowa chloroplastów, miejsce donorowe splicingu, miejsce neutralne, miejsce akceptora splicingu, sekwencja docelowa peroksysomów, miejsce akceptora splicingu, GFP zawarta w wektorze plazmidowym.
	<ol>
		<li>Zaprojektuj konstrukcję DNA in silico w taki sposób, aby przy zamawianiu starterów do PCR występowało 50-pz zachodzenia na siebie między każdym kawałkiem. Możliwe jest użycie zakładki 50 pz jako starterów: po 25 pz w każdym kierunku.
		<ol>
			<li>Pamiętaj, aby śledzić pochodzenie każdego z elementów sekwencji. Czy jest jako: plazmid do wyhodowania i miniprzygotowania; sekwencję liniową, która może być wykorzystana jako matryca do PCR; A może sekwencja, która będzie musiała zostać zsyntetyzowana komercyjnie? Kilka firm oferuje tanie usługi syntezy DNA dla fragmentów <500 pz. W tym przypadku sam TriTag ma 437 pz, więc korzystne było zamówienie go komercyjnie.</li>
			<li>Najlepsze wyniki uzyskamy, jeśli wszystkie fragmenty zostaną amplifikowane metodą PCR i oczyszczone z ich matrycowego DNA. Marker oporności jest dobrym miejscem do podzielenia tego dużego DNA na dwie mniejsze matryce, które są łatwiejsze do amplifikacji PCR.</li>
			<li>Enzym restrykcyjny DpnI tnie metylowane DNA. Jeśli matryca PCR była minipreparem z E. coli, leczenie DpnI usunie zanieczyszczający matrycowy DNA.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść wszystkie sekwencje DNA oddzielnie i eluuj w wodzie, TE lub buforze EB.
	<ol>
		<li>Wektor pORE część 1, ~3,000 pz (zielone strzałki). PCR amplifikowany i traktowany DpnI.</li>
		<li>Wektor PORE, część 2, ~3,000 bp (czarne strzałki). PCR amplifikowany i traktowany DpnI.</li>
		<li>Wkładka TriTag, 437 bp (niebieskie strzałki). Zamawiane komercyjnie. Ponowne zawieszenie w ddH2O.</li>
		<li>Ppromotor ENTCUP, ~750 pz (pomarańczowe strzałki). Amplifikowany PCR i leczony DpnI.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz stężenie każdego z fragmentów DNA. Celuj w 150 ng/μl kawałków wektora.</li>
	<li>Wyjmij porcję mieszanki montażowej Gibsona z zamrażarki i rozmroź na lodzie. Jest to dostępne na rynku, ale także łatwe do wykonania w laboratorium12–14.
	<ol>
		<li>Receptura składa się z dwóch etapów: lepkiej mieszanki wzorcowej 5x i 15 μl wielkości reakcji 1,33x podwielokrotności. 5x master mix zawiera: 3 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5, 300 μl 1 M MgCl2, 600 μl 10 mM każdego dNTP, 300 μl 1 M DTT, 1,5 g PEG-8000, 20 mg NAD i ddH2O do 6 ml. Przygotować 320 μl podwielokrotności (18) i zamrozić wszystkie porcje oprócz jednej w temperaturze -20 °C. Roztwór będzie dość lepki. Oznacz je jako "bufor izotermiczny 5X"</li>
		<li>Do pozostałej (320 μl) dodać 1,2 μl egzonukleazy T5, 20 μl polimerazy DNA wysokiej wierności Phusion, 160 μl ligazy DNA Taq i 700 μl ddH2O. Przygotować 15 μl podwielokrotności (~80) na lodzie w probówkach do PCR i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ objętości dla równomolowych ilości każdego z fragmentów. Istnieje kilka kalkulatorów online, w tym Gibthon.org. Powinno być w sumie 5 μl wszystkich fragmentów DNA. Dodać je do 15 μl podwielokrotności Gibson Mix. Jeśli wymaga to objętości zbyt małej do pipetowania, należy rozcieńczyć fragmenty DNA i/lub użyć więcej niż jednej podwielokrotności.
	<ol>
		<li>Nie należy zapominać o przygotowaniu kontroli samego DNA wektora (np. części DNA zawierającej marker oporności na antybiotyki) i uzupełnieniu objętości wodą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować probówki w termocyklerze w temperaturze 50-55 °C przez 30-60 minut. Zamień na lodzie i przekształć się w E. coli za pomocą chemicznie kompetentnych komórek szoku cieplnego. Nie używaj ogniw elektrokompetentnych. Wysokie stężenie soli i stosunkowo niskie stężenie DNA mogą powodować wygięcie komórek w łuk.
	<ol>
		<li>Zastosować wszystkie 20 μl do komercyjnego preparatu zawierającego 200 μl chlorku wapnia E. coli. 
		Inkubować na lodzie 30 minut i szokować cieplnie 60 sekund w temperaturze 42 °C</li>
		<li>Wrócić do lodu po 2 minutach, nałożyć 750 μl SOC lub LB pożywki i odzyskać wstrząsy w probówce do mikrowirówki przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Mieszaninę i odpowiednie rozcieńczyć na płytce LB+Kan (lub innym odpowiednim antybiotyku). Może to skutkować wyższym tłem (i większą liczbą zdarzeń rekombinacji niedocelowych) niż tradycyjne klonowanie oparte na ligacji, ale warto przeprowadzić badania przesiewowe około 10 kolonii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdzić klonowanie za pomocą sekwencji i przechowywać podwielokrotność w temperaturze -80 °C</li>
</ol>
3. Biolistyczna transfekcja tytoniu za pomocą pistoletu genowego
To jest technika, która została opisana w JoVE18,19. Kluczowe kroki i różnice opisano poniżej.
<ol>
	<li>Wyhoduj 50-100 ml E. coli lub 200 ml Agrobacterium. Przygotuj kulturę na maksimum. Do kontynuacji wymagane jest stężenie około 1 500 ng/μl.</li>
	<li>Przygotuj pociski do pistoletów genowych, jak opisano wcześniej. Załaduj je do Gene Guna.</li>
	<li>Do transfekcji tkanki naskórka liści tytoniu Nicotiana benthamiana wybierz duży liść blisko podstawy 3-miesięcznej rośliny. Ostrożnie pokrój go i połóż dnem do góry na mokrych ręcznikach papierowych na szalce Petriego o średnicy 15 cm.</li>
	<li>Ustaw ciśnienie He w Gene Gun na 200-250 psi.</li>
	<li>Ostrożnie wyceluj Gene Gun między żebra na spodniej stronie liścia, około 3-5 cm nad nim. Zwolnij zabezpieczenie i dostarcz cząstki do liścia. Każdy pocisk może być użyty dwukrotnie w tym samym miejscu na liściu. Jeśli liść eksploduje, wyrzuć go i rozpocznij nowy liść - istnieje pewna różnica w wytrzymałości liści ze względu na warunki wzrostu, takie jak wiek, wilgotność itp. W przypadku liścia o średnicy 12 cm spodziewaj się, że zmieści się około 6 strzałów.</li>
	<li>Przechowuj liść przykryty wierzchem szalki Petriego przez 2-3 dni w słabym świetle na ławce.</li>
	<li>Zbadaj liść w mikroskopie preparacyjnym wyposażonym we fluorescencję UV i poszukaj pojedynczych komórek wykazujących ekspresję GFP. Rozetnij 5-10 mm odcinki liścia.</li>
	<li>Zanurz liść w szkiełku mikroskopowym ze studnią głębinową pod ~200 μl 0,1% Triton X-100. Detergent pomaga zapobiegać tworzeniu się pęcherzyków powietrza na powierzchni, a szkiełko mikroskopowe z głęboką studnią pozwala na większy obszar obrazowania tkanek.</li>
</ol>
4. Mikroskopia konfokalna transfekowanej tkanki
Te instrukcje różnią się dla każdego instrumentu, dlatego ważne jest, aby odpowiednio się przeszkolić.
<ol>
	<li>W przypadku eksperymentów z detekcją fluorescencji ustaw laser wzbudzający na 489 nm, a detektory fotopowielaczy na 500-569 nm dla fluorescencji GFP i 630-700 nm dla autofluorescencji chlorofilu. Obrazuj komórki za pomocą obiektywu z 40-krotnym zanurzeniem w wodzie.</li>
</ol>

<ol><li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trait+stacking+in+transgenic+crops%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22GM+crops%22%5BJournal%5D)">Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities.</a> GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).</li>
<li>Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+plant+splicing+code%3A+experimental+and+computational+approaches+for+predicting+alternative+splicing+and+splicing+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).</li>
<li>Hickey, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgene+regulation+in+plants+by+alternative+splicing+of+a+suicide+exon%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon.</a> Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).</li>
<li>Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+in+plants+-+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing in plants - coming of age.</a> Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).</li>
<li>Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+alternative+pre-messenger+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing.</a> Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).</li>
<li>Dinkins, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+transcriptional+initiation+sites+and+alternative+5%27-+and+3%27-splice+site+selection+of+the+first+intron+deploys+Arabidopsis+protein+isoaspartyl+methyltransferase2+variants+to+different+subcellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%3A+for+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Changing transcriptional initiation sites and alternative 5'- and 3'-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).</li>
<li>Kebeish, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplastic+photorespiratory+bypass+increases+photosynthesis+and+biomass+production+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).</li>
<li>Maier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Introduction+of+a+Glycolate+Oxidative+Cycle+into+A.+thaliana+Chloroplasts+Leads+to+Growth+Improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+the+isoprenoid+pathway+in+tobacco+by+expressing+the+cytoplasmic+mevalonate+pathway+in+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts.</a> Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).</li>
<li>Sapir-Mir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomal+localization+of+Arabidopsis+isopentenyl+diphosphate+isomerases+suggests+that+part+of+the+plant+isoprenoid+mevalonic+acid+pathway+is+compartmentalized+to+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes.</a> Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).</li>
<li>Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+heterologous+protein+to+multiple+plant+organelles+via+rationally+designed+5%27+mRNA+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5' mRNA tags.</a> Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).</li>
<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Lowenson, J. D., Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+D-aspartyl+residues+in+polypeptides+by+the+erythrocyte+L-isoaspartyl%2FD-aspartyl+protein+methyltransferase.+Implications+for+the+repair+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).</li>
<li>Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+a+camel+through+the+eye+of+a+needle%3A+the+import+of+folded+proteins+by+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell+%2F+under+the+auspices+of+the+European+Cell+Biology+Organization%22%5BJournal%5D)">Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).</li>
<li>Reumann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+Arabidopsis+leaf+peroxisomes+reveals+novel+targeting+peptides%2C+metabolic+pathways%2C+and+defense+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms.</a> The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li>
<li>Hollender, C. A., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+Fluorescence+Complementation+%28BiFC%29+Assay+for+Protein-Protein+Interaction+in+Onion+Cells+Using+the+Helios+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene.</a> (40), (2010).</li>
<li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu opisano proste strategie lokalizacji pojedynczego białka transgenicznego w wielu przedziałach komórkowych w roślinach. Celem było zaprojektowanie konstruktu, który wykazywałby ekspresję pojedynczego genu w więcej niż jednej organelli u Nicotiana benthamiana. Strategie obejmują racjonalne projektowanie konstruktów DNA opartych na GFP, montaż Gibsona, dostarczanie plazmidów do komórek liści za pomocą Gene Gun oraz obserwację wyników za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Zapro...

Ta praca to projekt inżynierii metabolicznej / biologii syntetycznej, w którym komórki roślinne są modyfikowane tak, aby wyrażały białko reporterowe w wielu organellach, ale tylko za pomocą jednego konstruktu DNA.
Jednym z podejść do kierowania białek do więcej niż jednego miejsca jest klonowanie wielu kopii genetycznych, z których każda zawiera inny peptyd lokalizacyjny. Każda kopia musi być wprowadzona przez kolejne przekształcenia lub alternatywnie przez krzyżowanie wsteczne pojedynczych transformacji1. Wiąże się to z dodatkowym klonowaniem i jest ograniczone przez jeden znacznik lokalizacji na końcówkę.
Innym sposobem na zlokalizowanie białka w wielu miejscach jest alternatywny splicing2–5. RNA jest transkrybowane z jednego genu, ale różne kopie transkryptu są przetwarzane w różny sposób, często na więcej niż jeden sposób na komórkę. Może to spowodować, że w komórce pojawi się więcej niż jeden informacyjny RNA transkrybowany z jednego genu. Te różne informacyjne RNA mogą kodować różne izoformy tego samego białka lub, w przypadku przesunięcia ramki ramki odczytu, zupełnie inne białko. Chociaż alternatywny splicing jest opisywany w literaturze od wielu lat, mechanizmy działania i zachowane miejsca splicingu dawcy i receptora są wyjaśniane dopiero od niedawna6. Ponieważ miejsca te są lepiej opisywane, otwierają one możliwości dla inżynierii.
Inżynierowie metabolizmu roślin stają przed wyzwaniem podczas wyrażania białka w wielu organellach. W przypadku białka, które ma być zlokalizowane w więcej niż jednej organelli, inżynier musi sklonować ten sam gen wiele razy, z których każdy ma oddzielną sekwencję sygnałową kierującą go do organelli będącej przedmiotem zainteresowania. W przypadku pojedynczego genu w trzech organellach są to po prostu trzy geny. Ale w przypadku sześciogenowego szlaku metabolicznego rozszerza się on do 18 genów, co stanowi znaczący wysiłek związany z klonowaniem. Połączenie wielu sekwencji lokalizacyjnych w jeden, alternatywnie splicingowany gen znacznie zmniejsza ten wysiłek. Na przykład reinżynieria fotooddychania7,8 i syntezy izoprenoidów9,10 obejmuje zarówno chloroplasty, jak i peroksysomy. W naszym przypadku wykorzystaliśmy miejsca splicingu, które zaobserwowano w naturalnym systemie Arabidopsis thaliana opisanym wcześniej6. Racjonalnie przeprojektowaliśmy sekwencję mRNA, pozostawiając naturalne miejsca splicingu w spokoju, ale umieściliśmy sekwencje, które kodowałyby znaczniki ukierunkowane na chloroplasty lub peroksysomy w alternatywnie splicingowanych intronach (Figura 1). Wyrażone białko może, ale nie musi mieć znacznika, w zależności od tego, czy pre-mRNA, które je koduje, zostało wycięte jako intron (ryc. 1g i 1h). Więcej informacji na temat konstrukcji przedstawionych w tej pracy można znaleźć w artykuletowarzyszącym 11.
Ponieważ jest to nadal znaczący wysiłek związany z klonowaniem, w budownictwie stosuje się montaż Gibsona, nową metodę klonowania konstruktów DNA. Metoda Gibsona może być stosowana do dowolnej sekwencji, niezależnie od miejsc restrykcyjnych (Rysunek 2)12–14. Specyficzna mieszanka enzymów pozwala na jednoetapowy, izotermiczny montaż. W tej metodzie kilka dwuniciowych liniowych części DNA jest zaprojektowanych w taki sposób, że mają nakładające się sekwencje ~50 pz. Mieszanka enzymów montażowych Gibsona częściowo trawi liniowe części DNA, odsłaniając pojedyncze nici sekwencji homologicznych. Te częściowe sekwencje jednoniciowe są ponownie wyżarzane w mieszaninie reakcyjnej, co daje szybką, jednoetapową, niezależną od sekwencji, wolną od ligacji reakcję podklonowania.
Ta praca opisuje 1) racjonalne projektowanie alternatywnie splicowanych konstruktów do ekspresji w roślinnych chloroplastach, peroksysomach i cytozolach, 2) ich klonowanie przy użyciu nowej metody montażu Gibsona bez ligacji, 3) ich dostarczanie do komórek liści tytoniu za pomocą Gene Gun, oraz 4) wyniki pokazujące celowanie w organelle, jak zaobserwowano za pomocą GFP i mikroskopii konfokalnej.

<table><tbody><tr><td>Startery oligonukleotydowe</td><td>IDT</td> <td>(niestandardowe)</td><td>Zaprojektowane specjalnie do budowy</td></tr><tr><td>GeneBlocks</td><td>IDT</td> <td>(niestandardowe)</td> <td>500 bp oligonukleotydy</td></tr><tr><td>ApE oprogramowanie</td><td>U Utah</td> <td>(pobierz)</td> <td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td></tr> <tr><td>zestaw MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Służy do oczyszczania produktów PCR</td></tr><tr><td>QIAprep spin miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Służy do przygotowania odpowiednich do klonowania ilości plazmidu</td></tr><tr><td>Phusion Master Mix z buforem GC</td><td>NEB</td><td>M0532S</td><td>Służy do amplifikacji genu PCR będącego przedmiotem zainteresowania</td></tr><tr><td>Mieszanina reakcyjna montażu Gibsona</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>Główna mieszanka następujących 9 składników</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH7,5</td><td>Teknova</td><td>T1075</td><td>Gibson mieszanka montażowa</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>G Biosiences</td><td>82023-086</td><td>Mieszanka montażowa Gibson</td></tr><tr><td>Mieszanka dNTP</td><td>Fermentas</td><td>R0192</td><td>Mieszanka montażowa Gibson</td></tr><tr><td>1 M DTT</td><td>Fermentas</td><td>R0861</td><td>Mieszanka montażowa Gibson</td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Affymetrix</td><td>19966</td><td>Mieszanka montażowa Gibson</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Applichem</td><td>A1124,0005</td><td>Mieszanka montażowa Gibson</td></tr><tr><td>Egzonukleaza T5</td><td>Epicentrum</td><td>T5E4111K</td><td>Miks montażowy Gibsona</td></tr><tr><td>Polimeraza Phusion</td><td>NEB</td><td>F530S</td><td>Mieszanka montażowa Gibsona</td></tr><tr><td>Ligaza DNA Taq NEB</td><td></td><td>M0208L</td><td>Mieszanka montażowa Gibsona</td></tr><tr><td>Gibthon.org</td><td></td><td></td><td>Strona internetowa upraszczająca obliczenia</td></tr><tr><td>Zestaw Plasmid PLUS</td><td>Maxi Qiagen</td><td>12963</td><td>Służy do przygotowania DNA do pocisków do pistoletów genowych</td></tr><tr><td>System Gene Gun BioRad</td><td></td><td>165-2451</td><td>Zawiera wszystkie niezbędne części</td></tr><tr><td>Nicotania benthamiana</td><td>(n/a)</td><td>(n/a)Prezent</td> <td>od Jen Sheen, MGH</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>SP5 X MP</td><td>Obrazowanie powstałych komórek</td></tr><tr><td>Szkiełka głębinowe Mikroskopia</td><td>elektronowa Nauki</td><td>71561-01</td><td>Używany do obrazowania konfokalnego</td></tr><tr><td>Edytor plazmidu (ApE) </td><td>University of Utah </td><td></td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape</td></tr><tr><td>Gibthon:Kalkulator</td><td></td><td></td> podwiązania <td>http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/</td></tr></tbody></table>

przejściowa ekspresja genów w tytoniu przy użyciu zespołu gibsona i pistoletu genowego

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Aby skierować pojedyncze białko do wielu organelli subkomórkowych, rośliny zazwyczaj duplikują odpowiednie geny i wyrażają każdy gen oddzielnie za pomocą złożonych strategii regulacyjnych, w tym różnych promotorów i/lub sekwencji sygnałowych. Inżynierowie metaboliczni i biolodzy syntetyczni zainteresowani ukierunkowaniem enzymów na określone organelle stoją przed wyzwaniem: aby białko, które ma być zlokalizowane w więcej niż jednej organelli, inżynier musi sklonować ten sam gen wiele razy. Niniejsza praca przedstawia rozwiązanie tej strategii: wykorzystanie alternatywnego splicingu mRNA. Technologia ta wykorzystuje ustalone sekwencje celowania w chloroplasty i peroksysomy i łączy je w pojedyncze mRNA, które jest alternatywnie splicjonowane. Niektóre warianty splicingu są wysyłane do chloroplastu, niektóre do peroksysomu, a niektóre do cytozolu. W tym przypadku system jest przeznaczony do celowania w wiele organelli z alternatywnym splicingiem. W tej pracy oczekiwano, że GFP będzie wyrażany w chloroplastach, cytozolu i peroksysomach przez serię racjonalnie zaprojektowanych znaczników 5' mRNA. Znaczniki te mogą potencjalnie zmniejszyć ilość klonowania wymaganego, gdy heterologiczne geny muszą być wyrażane w wielu organellach subkomórkowych. Konstrukty zostały zaprojektowane w poprzedniej pracy11 i zostały sklonowane przy użyciu montażu Gibsona, metody klonowania niezależnej od ligacji, która nie wymaga enzymów restrykcyjnych. Powstałe plazmidy wprowadzono do komórek naskórka liści Nicotiana benthamiana za pomocą zmodyfikowanego protokołu Gene Gun. Na koniec zaobserwowano przekształcone liście za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Proces projektowania był wynikiem szczegółowego planowania. Nowością w tym projekcie jest wykorzystanie alternatywnego splicingowania w celu stworzenia pre-mRNA, który jest tłumaczony na białka o zróżnicowanej ekspresji. Białka te są eksponowane w różnych organellach, w tym przypadku w chloroplastach, peroksysomach i/lub cytosolu. Zaadaptowaliśmy naturalny gen Arabidopsis, który ulega alternatywnemu splicingowi6, i umieściliśmy znane sekwencje kierujące do chloroplastów6 oraz peroksysomów<s...

Ta praca opisuje nowatorską metodę selektywnego celowania w organelle subkomórkowe u roślin, testowaną za pomocą BioRad Gene Gun.

Przejściowa ekspresja genów w tytoniu przy użyciu zespołu Gibsona i pistoletu genowego

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest obserwacja przejściowej ekspresji genu reporterowego z tagiem GFP w komórkach epidermy liścia tytoniu. Jest to realizowane poprzez zaprojektowanie konstruktu DNA, który będzie ulegał ekspresji w chloroplastach i peroksysomach. Następnie konstrukt jest budowany przy użyciu amplifikacji PCR oraz metody Gibson assembly.Następnie do wprowadzenia konstruktu do komórek epidermy liścia tytoniu wykorzystuje się armatkę genową. Ostatecznie obrazowanie liścia tytoniu za pomocą mikroskopii konfokalnej ujawnia ekspresję GFP w chloroplastach i peroksysomach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak klasyczne klonowanie, jest to, że nie wymaga ona użycia enzymów restrykcyjnych, a zatem każdą sekwencję, którą można namnożyć metodą PCR, można sklonować.Dzięki elastyczności projektu genetycznego zastosowania tych technik można rozszerzyć na większą skalę. Inżynieria genetyczna roślin uprawnych. Rozpocznij ten protokół od określenia miejsc w komórce roślinnej, w których ma nastąpić końcowa ekspresja białka. W niniejszej pracy celem jest skierowanie ekspresji do chloroplastu, peroksysomu i cytozolu.Następnie należy zaprojek

transient-gene-expression-tobacco-using-gibson-assembly-gene

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Tymczasowa ekspresja genów w tytoniu z wykorzystaniem montażu Gibsona i pistoletu genowego

Opis metody wyciszania genów indukowanego wirusem (VIGS) w celu obniżenia ekspresji genów u Nicotiana benthamiana oraz pomidora.

Wyciszanie genów indukowane wirusem (VIGS) u Nicotiana benthamiana i pomidora

Przedstawiamy szczegółowy protokół badania wyciszania genów indukowanego wirusem (VIGS) za pośrednictwem Agrobacterium w bawełnie. Do indukowania wyciszania RNA genu GrCLA1 (Cloroplastos alterados 1) bawełny wykorzystano wektory VIGS pochodzące z wirusa TRV (tobacco rattle virus). Albino fenotyp wywołany wyciszeniem GrCLA1 zaobserwowano w stadium siewki w ciągu 2 tygodni po inokulacji.

Analiza wyciszania genów indukowanego wirusem za pośrednictwem Agrobacterium w bawełnie

Rośliny oferują nowatorski system do produkcji białek farmaceutycznych na skalę komercyjną, który jest bardziej skalowalny, opłacalny i bezpieczny niż obecne paradygmaty ekspresji. W tym badaniu przedstawiamy proste i wygodne, a jednocześnie skalowalne podejście do wprowadzenia genu docelowego zawierającego Agrobacterium tumefaciens do roślin w celu przejściowej ekspresji białka.

Efektywna agroinfiltracja roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie

Wyciszanie genów wywołane przez wirusa jest użytecznym narzędziem do identyfikacji genów zaangażowanych w odporność roślin na brak gospodarza. Pokazujemy zastosowanie patogenów bakteryjnych eksprymujących GFPuv w identyfikacji roślin wyciszonych genowo podatnych na patogeny niebędące gospodarzem. Takie podejście jest łatwe, szybkie i ułatwia badania przesiewowe na dużą skalę, a podobny protokół można zastosować do badania różnych innych interakcji roślina-mikroorganizm.

Badania przesiewowe genetyki za pośrednictwem VIGS w celu identyfikacji genów zaangażowanych w oporność na zwierzęta inne niż gospodarz

Produkcja białka przejściowego w roślinach Nicotiana oparta na infiltracji próżniowej za pomocą agrobakterii przenoszących wektory startowe (oparte na wirusie mozaiki tytoniu) jest szybkim i ekonomicznym podejściem do produkcji antygenów szczepionkowych i białek terapeutycznych. Uprościliśmy procedurę i poprawiliśmy akumulację celu, optymalizując warunki hodowli bakterii, dobierając gatunki gospodarzy i współwprowadzając supresory wyciszające RNA.

Optymalizacja i wykorzystanie produkcji białek przejściowych za pośrednictwem Agrobacterium w Nicotiana

Opisujemy podejście do projektowania eksperymentów, które może być użyte do określenia i modelowania wpływu elementów regulatorowych transgenu, parametrów wzrostu i rozwoju roślin oraz warunków inkubacji na przejściową ekspresję przeciwciał monoklonalnych i białek reporterowych w roślinach.

Charakterystyka układów złożonych z wykorzystaniem podejścia Design of Experiments: przejściowa ekspresja białek w tytoniu jako studium przypadku

Rośliny tytoniu zostały użyte do produkcji celulazy grzybowej, TrCel5A, za pomocą systemu ekspresji przejściowej. Ekspresję można było monitorować za pomocą fluorescencyjnego białka fuzyjnego, a aktywność białka scharakteryzowano po ekspresji.

Ekspresja rekombinowanej celulazy Cel5A z Trichoderma reesei w roślinach tytoniu

Synteza niestandardowych plazmidów jest pracochłonna i czasochłonna. Protokół ten opisuje zastosowanie klonowania zespołu Gibsona w celu zmniejszenia pracy i czasu trwania niestandardowej procedury klonowania DNA. Opisany protokół pozwala również na uzyskanie wiarygodnych znakowanych konstruktów białkowych do ekspresji ssaków przy podobnych kosztach jak w przypadku tradycyjnego klonowania DNA metodą "wytnij i wklej".

Generowanie wektorów plazmidowych eksprymujących białka znakowane FLAG pod regulacją promotora ludzkiego czynnika wydłużenia-1α przy użyciu zespołu Gibsona

W tym badaniu porównano ekspresję docelowego ludzkiego białka rekombinowanego na różnych platformach produkcyjnych. Skupiliśmy się na tradycyjnych kulturach fermentorowych i roślinach, opisując konfigurację każdego systemu i podkreślając, na podstawie zgłoszonych wyników, nieodłączne ograniczenia i zalety każdej platformy.

Analiza porównawcza ekspresji białek rekombinowanych w różnych biofabrykach: bakteriach, komórkach owadów i systemach roślinnych

Na poziomie subkomórkowym, zdarzenia sygnalizacyjne są dynamicznie modulowane przez sygnały rozwojowe i środowiskowe. W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje system przejściowej ekspresji tytoniu do monitorowania dynamicznej interakcji białko-białko i ujawniania przestrzennej organizacji transdukcji sygnału w komórkach roślinnych.

Obrazowanie przestrzennej reorganizacji szlaku sygnałowego MAPK przy użyciu systemu przejściowej ekspresji tytoniu

Przejściowa heterologiczna ekspresja enzymów biosyntetycznych w liściach Nicotiana benthamiana może przekierować endogenne dostawy 2,3-oksydoskwalenu na produkcję nowych produktów triterpenowych o wysokiej wartości. W niniejszym dokumencie opisano szczegółowy protokół szybkiej (5 dni) produkcji triterpenów i analogów na skalę preparatywną z wykorzystaniem tej potężnej platformy roślinnej.

Przejściowa ekspresja w liściach Nicotiana benthamiana do produkcji triterpenów w skali preparatywnej

Naucz się metody przejściowej ekspresji genów w komórkach epidermy liścia tytoniu przy użyciu zespołu Gibsona i pistoletu genowego. Technika umożliwia wizualizację GFP w chloroplastach i peroksysomach.

Przejściowa ekspresja genów w tytoniu przy użyciu zespołu Gibsona i pistoletu genowego

Przeglądaj więcej filmów