Przejściowa ekspresja genów w tytoniu przy użyciu zespołu Gibsona i pistoletu genowego

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest obserwacja przejściowej ekspresji genu reporterowego z tagiem GFP w komórkach epidermy liścia tytoniu. Jest to realizowane poprzez zaprojektowanie konstruktu DNA, który będzie ulegał ekspresji w chloroplastach i peroksysomach. Następnie konstrukt jest budowany przy użyciu amplifikacji PCR oraz metody Gibson assembly.

Następnie do wprowadzenia konstruktu do komórek epidermy liścia tytoniu wykorzystuje się armatkę genową. Ostatecznie obrazowanie liścia tytoniu za pomocą mikroskopii konfokalnej ujawnia ekspresję GFP w chloroplastach i peroksysomach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak klasyczne klonowanie, jest to, że nie wymaga ona użycia enzymów restrykcyjnych, a zatem każdą sekwencję, którą można namnożyć metodą PCR, można sklonować.

Dzięki elastyczności projektu genetycznego zastosowania tych technik można rozszerzyć na większą skalę. Inżynieria genetyczna roślin uprawnych. Rozpocznij ten protokół od określenia miejsc w komórce roślinnej, w których ma nastąpić końcowa ekspresja białka. W niniejszej pracy celem jest skierowanie ekspresji do chloroplastu, peroksysomu i cytozolu.

Następnie należy zaprojektować konstrukt ekspresyjny. Konstrukt musi zawierać promotor, gen wykrywalny oraz terminator w obrębie jednego plazmidu. W tym przypadku konstytutywny promotor P end cup two steruje ekspresją GFP, po której następuje terminator Nolene Synthe lub nos t.

Należy zauważyć, że w tym doświadczeniu będziemy testować serię znaczników trit, jeden, dwa i trzy, ekspresyjne na końcu terminalnym GFP w celu ekspresji w chloroplastach i peroksysomach. Metoda Gibson assembly opiera się na działaniu kilku enzymów w gotowej mieszaninie, które częściowo trawią końce dwuniciowego DNA i ułatwiają hybrydyzację komplementarnych par zasad sąsiednich sekwencji DNA. Końcowy konstrukt składa się z trzech części, które muszą zostać namnożone w czterech reakcjach PCR przed przeprowadzeniem Gibson assembly.

Pierwsza i druga reakcja amplifikują wektor plazmidowy PORE o długości 8 000 par zasad, który zawiera GFP NOS T oraz marker oporności na kanamycynę. Marker oporności jest odpowiednim miejscem do podziału tego dużego fragmentu DNA na dwa mniejsze matryce, które są łatwiejsze do amplifikacji metodą PCR. Trzecia reakcja amplifikuje promotor P end cup two, a czwarta reakcja amplifikuje triag one, przy czym projektowanie in silico z wykorzystaniem oprogramowania takiego jak ape design pozwala na opracowanie konstrukcji w sposób zapewniający 50 par zasad nakładania się między poszczególnymi fragmentami.

Zamawiając startery do PCR, można wykorzystać 50 par zasad zakładki, przyjmując po 25 par zasad starterów w każdym kierunku. Po przeprowadzeniu reakcji PCR w celu amplifikacji każdego komponentu, należy oddzielnie oczyścić produkty PCR, a następnie rozcieńczyć je w destylowanej wodzie dejonizowanej. Jeśli matrycą PCR był mini prep z E. coli, traktowanie enzymem restrykcyjnym DpnI usunie zanieczyszczającą matrycę DNA. Następnie należy zmierzyć stężenia poszczególnych fragmentów DNA.

Dostosuj stężenie wektora do około 150 nanogramów na mikrolitr dla każdego konstruktu przeznaczonego do złożenia, w tym dla kontroli, a następnie wyjmij z zamrażarki aliquot 15 mikrolitrów mieszaniny do Gibson Assembly i odmroź go na lodzie. Korzystając z otwartoźródłowego narzędzia online @gibbon. org, wyznacz objętości dla ekvimolarnych ilości każdego z fragmentów.

Dodaj obliczoną objętość każdego z fragmentów do 15 µL mieszaniny Gibsona. Przygotuj również kontrolę zawierającą sam DNA wektora. Całkowita objętość każdej reakcji powinna wynosić 20 µL.

W razie potrzeby użyj wody do dostosowania objętości. Inkubuj probówki w temperaturze od 50 do 55 °C przez 30 do 60 minut. Po inkubacji umieść probówki z powrotem w lodzie.

Wyjmij z zamrażarki w temperaturze -80 °C probówkę do mikrocentryfugi zawierającą komercyjny preparat 200 µL kompetentnych komórek e coli w chlorku wapnia i lekko ogrzej ją w dłoni. Następnie dodaj całe 20 µL reakcji do e coli. Inkubuj kultury na lodzie przez 30 minut, a następnie przenieś je do kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C i poddaj szokowi termicznemu przez 60 sekund.

Nie należy używać komórek elektrokompetentnych. Stosunkowo wysokie stężenie soli i niskie stężenie DNA mogą spowodować przeskoki iskier w komórkach. Po transformacji należy umieścić kultury w lodzie na dwie minuty, a następnie dodać 750 µL pożywki SOC lub LB i pozostawić je do regeneracji na 30 minut w temperaturze 37 °C.

Następnie mieszaninę wysiewamy na płytki LB z kanamycyną lub innym odpowiednim antybiotykiem i inkubujemy w temperaturze 37 °C przez noc, po czym przesiewamy 10 kolonii za pomocą sekwencjonowania. Należy pamiętać, że metoda ta może prowadzić do wyższego tła i większej liczby zdarzeń rekombinacji poza celem niż tradycyjne klonowanie oparte na ligacji. Biotyczna transfekcja tytoniu za pomocą armatki genowej została wcześniej opisana w JoVE.

W niniejszym rozdziale przeanalizowano kluczowe etapy oraz różnice w stosunku do poprzednich protokołów. Po amplifikacji i izolacji konstruktów należy przygotować mikrocząsteczki do armatki genowej zgodnie z opisem w artykule JoVE autorstwa woods i zeto, a następnie załadować je do armatki genowej w celu transfekcji tkanki epidermalnej liścia tytoniu Nico Tania Benham Miana. Należy wybrać duży liść znajdujący się blisko podstawy rośliny w wieku od trzech do pięciu miesięcy.

Używając odpowiednich środków ochrony oczu i uszu, ostrożnie umieść liść stroną spodnią do góry na mokrych ręcznikach papierowych w 15 centymetrowej płytce Petriego. Ustaw ciśnienie helu w pistolecie genowym na 200 do 250 PSI. Ostrożnie skieruj pistolet genowy pomiędzy nerwy na spodniej stronie liścia, w odległości około trzech do pięciu centymetrów nad nim. Zwolnij blokadę bezpieczeństwa i wprowadź cząsteczki do liścia.

Każdą kulkę zastosuj dwukrotnie w tym samym miejscu na liściu. Jeśli liść pęknie, przejdź do innego miejsca i powtórz proces; w przeciwnym razie wyrzuć go i użyj nowego liścia. Wytrzymałość liścia może się różnić w zależności od warunków wzrostu, takich jak wiek, wilgotność itp.

Po wykonaniu wszystkich iniekcji, przykryj liść i przechowuj go przez dwa do trzech dni w słabym świetle na blacie laboratoryjnym. Zbadaj liść pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w fluorescencję UV i wyszukaj pojedyncze komórki wykazujące ekspresję GFP. Po znalezieniu komórek wykazujących ekspresję GFP, użyj nożyczek sekcyjnych, aby ostrożnie wyciąć fragmenty liścia o długości od 5 do 10 mm.

Należy natychmiast zanurzyć każdy fragment liścia w studni głębokiego szkiełka przedmiotowego zawierającej około 200 µL 0,1% Triton X 100. Detergent zapobiega powstawaniu pęcherzyków powietrza na powierzchni, a głębokie szkiełko przedmiotowe umożliwia obrazowanie większego obszaru tkanki; komórki obrazowano za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w odpowiednie filtry i obiektyw imersyjny wodny 40 x. W niniejszym badaniu trzy różne konstrukty GFP kierowane do organelli porównano z nieznakowanym GFP oraz rubis.Coag.

Do wykrycia fluorescencji GFP w przejściowo transformowanych pojedynczych komórkach w eksperymentach kontrolnych, w których eksprymowano nieznakowane GFP, wykorzystano mikroskopię konfokalną GFP. Fluorescencję obserwuje się wyłącznie w jądrze komórkowym i cytozolu, ale nie w chloroplastach, które są identyfikowane na podstawie czerwonej autofluorescencji chlorofilu, co widać na tym przykładzie komórki transfektowanej wyłącznie chloroplastowym Rubis Oag. Konstrukt GFP został wyeksprymowany w dużych organellach.

Komórka jest obrysowana na biało. Kolor żółty wskazuje obszary kolokalizacji konstruktu z chlorofilem, co świadczy o tym, że konstrukt jest kierowany do chloroplastu, jak pokazano na tym obrazie pojedynczej komórki przetransfekowanej triag one; ekspresja GFP jest widoczna w chloroplastach, na peryferiach, w cytosolu oraz w małych punktowych organellach, które prawdopodobnie są peroksysomami. Podobnie, komórki przetransfekowane triag two również wykazują ekspresję GFP w chloroplastach, cytosolu i peroksysomach; triag three, który składa się z sygnału peroksysomalnego osadzonego w regionie o niskiej złożoności sekwencji chloroplastowej, lokalizuje się wyłącznie w chloroplastach i peroksysomach.

Należy zauważyć, że komórka ta znajduje się w innej warstwie liścia. Rycina ta podsumowuje ekspresję zaobserwowaną w przedziałach typowej komórki epidermy liścia tytoniu. Przedstawiono względne wielkości i położenie elementów w obrębie komórki oraz poziomy względnej ekspresji zaobserwowane za pomocą transfekcji metodą armatki genowej i mikroskopii konfokalnej.

Należy zauważyć, że nieoznakowany GFP lokalizuje się w cytosolu i jądrze, kontrola PIMT two GFP lokalizuje się w chloroplastach, natomiast triag one GFP, triag two GFP oraz Triag 3G FP zlokalizowały się w chloroplastach i peroksysomach, zgodnie z przewidywaniami. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak skonstruować plazmid za pomocą metody Gibson assembly, dostarczyć go balistycznie do liści tytoniu i zaobserwować ekspresję GFP w ciągu trzech dni. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby do reakcji Gibson assembly użyć 150 ng/µL DNA wektora, a do przygotowania mikropocisków do armatki genowej 1500 ng/µL finalnego konstruktu DNA. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak transfekcja za pośrednictwem Agrobacterium, aby uzyskać stabilną, a nie przejściową ekspresję genów.