Przejściowa ekspresja genów w tytoniu przy użyciu zespołu Gibsona i pistoletu genowego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest obserwacja przejściowej ekspresji genu reportera oznaczonego GFP w komórkach naskórka liści tytoniu. Osiąga się to poprzez zaprojektowanie najpierw konstruktu DNA, który będzie ulegał ekspresji w chloroplastach i peroksysomach. Konstrukcja jest następnie budowana przy użyciu amplifikacji PCR i montażu Gibsona.

Następnie pistolet genowy jest używany do dostarczania konstruktu do komórek naskórka liści tytoniu. Ostatecznie obrazowanie liścia tytoniu za pomocą mikroskopii konfokalnej ujawnia ekspresję GFP w chloroplastach i peroksysomach. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak klasyczne klonowanie, jest to, że nie wymaga enzymów restrykcyjnych, a zatem każda sekwencja, którą można amplifikować za pomocą PCR, może zostać sklonowana.

Ze względu na elastyczność projektu genetycznego, zastosowania tych technik rozciągają się na większą skalę. Inżynieria genetyczna roślin uprawnych Rozpocznij ten protokół od określenia miejsc w komórce roślinnej do końcowej ekspresji białka. Celem tej pracy jest ukierunkowanie ekspresji na chloroplast, peroksysom i cytozol

Następnie zaprojektuj konstrukcję wyrażenia. Konstrukt musi zawierać promotor, wykrywalny gen i terminator w pojedynczym plazmidzie. W tym przypadku konstytutywny promotor P końcowy miseczka dwa napędza ekspresję GFP, po której następuje syntezator nolenu, terminator lub nos t.

Zauważ, że w tym eksperymencie będziemy testować serię znaczników, znaczników trit, jednego, dwóch i trzech wyrażonych końcówek końcowych do GFP pod kątem ekspresji w chloroplastach i peroksysomach. Metoda składania Gibsona polega na działaniu kilku enzymów we wcześniej przygotowanej mieszance w celu częściowego trawienia końców dwuniciowego DNA i ułatwiania wyżarzania uzupełniających się par zasad sąsiednich sekwencji DNA. Ostateczny konstrukt składa się z trzech części, które muszą zostać amplifikowane w czterech reakcjach PCR przed montażem Gibsona.

Pierwsza i druga reakcja amplifikują wektor plazmidowy o parach zasad o długości 8 000 par zasad, PORE, który zawiera GFP NOS T i marker oporności cany. Marker oporności jest dobrym miejscem do podzielenia tego dużego DNA na dwie mniejsze matryce, które łatwiej poddają się amplifikacji PCR. Trzecia reakcja wzmacnia drugi kubek końcowy promotora P, a czwarta reakcja wzmacnia triag jeden za pomocą oprogramowania do projektowania in silico, takiego jak projektowanie małp, podstawy konstrukcji dla zasady, tak że między każdym kawałkiem nakłada się 50 par zasad.

Zamawiając startery do PCR, możliwe jest użycie 50 par zasad nakładających się na siebie, ponieważ startery 25 par zasad w każdym kierunku Po wykonaniu PCR w celu amplifikacji każdego składnika, należy oddzielnie oczyścić produkt PCR i rozcieńczyć go w destylowanej wodzie dejonizowanej. Jeśli matryca PCR była mini preparatem po leczeniu E. coli enzymem restrykcyjnym DPN, usunie się zanieczyszczający DNA matrycy. Następnie zmierz stężenie każdego z fragmentów DNA.

Dostosuj stężenie wektorowe do około 150 nanogramów na mikrolitr dla każdej konstrukcji, która ma być złożona, w tym kontrolę, wyjmij z zamrażarki 15 mikrolitrów porcji mieszanki Gibson Assembly i rozmroź ją na lodzie. Korzystanie z internetowego tool@gibbon open source. org, określ objętości dla równomolowych ilości każdego z fragmentów.

Dodaj obliczoną objętość każdego z fragmentów do 15-mikrolitrowej mieszanki Gibsona. Przygotuj również kontrolę samego wektora DNA. Całkowita objętość każdej reakcji powinna wynosić 20 mikrolitrów.

W razie potrzeby użyj wody, aby wyregulować głośność. Inkubować probówki w temperaturze od 50 do 55 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut. Po inkubacji umieść probówki z powrotem na lodzie.

Wyjmij probówkę z mikro fuge zawierającą komercyjny preparat zawierający 200 mikrolitrów chlorku wapnia właściwego dla e. coli z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i lekko ją podgrzej ręcznie. Następnie dodaj wszystkie 20 mikrolitrów reakcji do E coli. Inkubuj kultury na lodzie przez 30 minut, a następnie przenieś je do łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza i szoku cieplnego przez 60 sekund.

Nie używaj ogniw elektrokompetentnych. Stosunkowo wysokie stężenie soli i niskie stężenie DNA mogą powodować łuk komórek po transformacji. Umieść kultury z powrotem w ICE na dwie minuty, a następnie nałóż 750 mikrolitrów pożywki SOC lub LB i pozwól im dojść do siebie przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następna płytka, mieszanina na płytkach LB z cany lub innym odpowiednim antybiotykiem inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, przesiewać 10 kolonii przez sekwencjonowanie. Należy zauważyć, że ta metoda może skutkować wyższym tłem i większą liczbą zdarzeń rekombinacji niedocelowych niż tradycyjne klonowanie oparte na ligacji. Biotyczna transfekcja tytoniu za pomocą pistoletu genowego została już wcześniej opisana w JoVE.

W tym miejscu omówiono kluczowe kroki i różnice w stosunku do poprzednich protokołów. Po amplifikacji i wyizolowaniu konstruktów, przygotuj pociski do pistoletów genowych, jak opisano w artykule JoVE autorstwa woodsa i zeto, i załaduj je do pistoletu genowego w celu transfekcji tkanki naskórka liści tytoniu Nico Tania Benham Miana. Wybierz duży liść blisko podstawy rośliny w wieku od trzech do pięciu miesięcy.

Ostrożnie połóż go dolną stroną do góry na mokrych ręcznikach papierowych na 15-centymetrowej szalce Petriego, zachowując odpowiednią ochronę oczu i uszu. Ustaw ciśnienie helu w pistolecie genowym na 200 do 250 PS. Ostrożnie celuję pistoletem genowym między żebra na spodniej stronie liścia, około trzech do pięciu centymetrów nad nim. Zwolnij zabezpieczenie i dostarcz cząstki do liścia.

Użyj każdej kuli dwa razy w tym samym miejscu na liściu. Przenieś się w inne miejsce i powtórz proces, jeśli liść eksploduje, wyrzuć i rozpocznij nowy liść. Istnieje pewna różnica w wytrzymałości liści ze względu na warunki wzrostu, takie jak wiek, wilgotność i tak dalej.

Po dostarczeniu wszystkich zastrzyków przykryj liść i przechowuj go przez dwa do trzech dni w słabym świetle na ławce. Zbadaj liść w mikroskopie preparacyjnym wyposażonym w fluorescencję UV i poszukaj pojedynczych komórek wyrażających GFP. Kiedy zostaną znalezione komórki wyrażające GFP, użyj nożyczek preparacyjnych, aby ostrożnie usunąć od pięciu do 10 milimetrowych odcinków liścia.

Natychmiast zanurz każdy pojedynczy fragment liścia w studzience szkiełka mikroskopowego ze studni głębinowej zawierającego około 200 mikrolitrów 0,1% Triton X 100. Detergent pomaga zapobiegać tworzeniu się pęcherzyków powietrza na powierzchni, a szkiełko mikroskopowe z głęboką studnią pozwala na obrazowanie komórek w większym obszarze tkanek za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w odpowiednie filtry i obiektyw 40-krotnego zanurzenia w wodzie. W tym badaniu porównano trzy różne konstrukty ukierunkowane na organelle GFP w celu odznaczenia GFP i rubinu. Coag.

Mikroskopia konfokalna GFP została wykorzystana do wykrycia fluorescencji GFP w przejściowo przekształconych pojedynczych komórkach w eksperymentach kontrolnych, w których ekspresjonowano nieoznakowany GFP. Fluorescencję obserwuje się tylko w jądrze i cytozolu, ale nie w chloroplastach, które są identyfikowane przez czerwoną autofluorescencję chlorofilu, jak widać w tym przykładzie komórki transfekowanej tylko chloroplastem Rubis Oag. Konstrukt GFP GFP ulegał ekspresji w dużych organellach.

Komórka jest obrysowana na biało. Kolor żółty oznacza obszary kolokalizacji konstruktu z chlorofilem, co wskazuje, że konstrukt jest ukierunkowany na chloroplast, jak pokazano na tym obrazie triagu ekspresji GFP w jednej transfekowanej komórce, którą obserwuje się w chloroplastach, peryferiach, cytozolu i małych organellach punktowych, które uważa się za peroksysomy. Podobnie, triag dwie transfekowane komórki również wyrażają GFP w chloroplastowym cytozolu i peroksysomach triag trzy, który składa się z sygnału peroksysomu osadzonego w regionie o niskiej złożoności sekwencji chloroplastów, zlokalizowanym tylko w chloroplastach i peroksysomach.

Zauważ, że ta komórka znajduje się w innej warstwie liścia. Rysunek ten podsumowuje ekspresję obserwowaną w przedziałach typowej komórki naskórka liści tytoniu. Pokazano względne rozmiary i lokalizacje w komórce oraz względne poziomy ekspresji obserwowane za pomocą transfekcji pistoletu genowego i mikroskopii konfokalnej.

Zauważ, że odznacznik GFP lokalizuje się w cytozolu i jądrze, PIMT dwie kontrole GFP lokalizuje się w chloroplastach i triag jeden GFP, triag dwa GFP i Triag 3G FP zlokalizowane w chloroplastach i peroksysomie zgodnie z przewidywaniami, Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonstruować plazmę za pomocą montażu Gibsona, dostarczyć go do liści tytoniu i obserwować ekspresję GFP w ciągu trzech dni. Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać, aby użyć 150 nanogramów na mikrolitr wektorowego DNA do montażu Gibsona i 1500 nanogramów na mikrolitr końcowego konstruktu DNA, aby wytworzyć pociski do pistoletu genowego Zgodnie z tą procedurą, można wykonać inne metody, takie jak transfekcja agrobacterium, w celu uzyskania stabilnej ekspresji genów, a nie przejściowej.