Biotynylacja wycinków mózgu: podejście ex vivo do pomiaru specyficznego dla regionu transportu białek błony plazmatycznej w dorosłych neuronach

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie ostrych zmian w białkach powierzchniowych neuronów. W preparatach ex vivo z wycinkami mózgu osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw żywotnych ostrych wycinków mózgu. Następnie plastry są traktowane interesującymi lekami.

Następnie białka powierzchniowe komórki są znakowane za pomocą odczynników tonacji imperialnej błony. Na koniec biotynylowane białka powierzchniowe izoluje się za pomocą chromatografii paciorkowca i chromatografii powinowactwa. Ostatecznie wykresy immunologiczne są wykorzystywane do ilościowego określania zmian w ekspresji powierzchni białek po leczeniu farmakologicznym.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak terapia komórkowa, jest to, że transport białek neuronalnych jest badany in situ, a nie w heterologicznych systemach ekspresji lub pierwotnych kulturach neuronalnych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z przygotowaniem opłacalnych plasterków marki. Porządku. Aby przygotować plastry mózgu, zacznij od zrobienia świeżego x sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy lub A płyn mózgowo-rdzeniowy i sacharoza uzupełnione A CSF lub S-A-C-S-F zgodnie z protokołem tekstowym, schłoń.

S-A-C-S-F na ICE wykorzystuje 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla do nasycenia tlenem poprzez bulgotanie przez 20 minut na lodzie. Po poświęceniu P 30 do 38 myszy przez zwichnięcie szyjki macicy i dekapitację oraz szybkim usunięciu mózgów, umieść je we wstępnie schłodzonym, natlenionym S-A-C-S-F za pomocą wibrującego mikrotomu. Wykonaj 300-mikronowe sekcje mózgu w obszarze zainteresowania i, jeśli chcesz, oddziel prawą i lewą półkulę, aby użyć ich odpowiednio jako plasterków kontrolnych i eksperymentalnych.

Za pomocą wypolerowanej na gorąco pipety pastierowej przenieś plastry do siatkowych dolnych komór trzymających zawierających natleniony płyn mózgowo-rdzeniowy A. Pozostaw plastry do odbudowania na 40 minut w temperaturze 31 stopni Celsjusza, ciągle delikatnie bulgocząc. Po inkubacji przenieś plastry do poszczególnych komór siatkowych.

W 24-dołkowych płytkach i umyj plastry trzy razy w rozgrzanym natlenionym płynie mózgowo-rdzeniowym A z ciągłym bulgotaniem. W przypadku testowania związków należy dodać jedną dziesiątą objętości 10-krotnego stężenia leku i wymieszać, delikatnie odwracając po delikatnym potrząśnięciu płytkami w łaźni wodnej w żądanej temperaturze. Użyj lodowatego płynu mózgowo-rdzeniowego, aby szybko schłodzić plastry, myjąc je trzykrotnie, aby kupić białka powierzchniowe.

Przygotuj świeżą biotynę 1,0 miligrama na mililitr sulfonamidu N-H-S-S-S w lodowatym zimnym płynie mózgowo-rdzeniowym Dodaj 0,75 mililitra roztworu do plastrów i inkubuj na lodzie przez 45 minut. Po użyciu lodowatego płynu mózgowo-rdzeniowego A do szybkiego trzykrotnego umycia plastrów, inkubuj je przez 10 minut w lodowatym lodowate miejsce CSF na lodzie, a następnie użyj lodowatego bufora do hartowania plastrów, aby trzykrotnie umyć plastry i inkubować je z 0,75 mililitra plastra, schłodzić bufor dwa razy po 25 minut na lodzie, aby ugasić wolną biotynę suo N-H-SS-S-S w celu przygotowania lizatów tkankowych. Umyj plastry trzy razy w lodowatym płynie mózgowo-rdzeniowym przed użyciem wypolerowanej ogniowo pipety do makaronu, aby przenieść każdą kromkę do mikroprobówki wirówkowej.

Delikatnie granulować plastry przez centryfuzję w temperaturze 200 GS przez jedną minutę i ostrożnie zasysać pozostały płyn mózgowo-rdzeniowy. Następnie dodaj 400 mikrolitrów lodowatego lodu, rozerwij liczbę pi i użyj pipety P 200, aby rozbić tkankę, pipetując raz w górę iw dół, aby zakończyć lizę. Przenieść zdysocjowaną tkankę do świeżej probówki i inkubować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą wirówki obrotowej w temperaturze 18 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Aby osadzać szczątki komórkowe, wyizoluj biotynylowane białka i przeanalizuj je za pomocą immuno blot. Zgodnie z protokołem tekstowym, neuronalny transporter dopaminy jest internalizowany w odpowiedzi na aktywację PKC w liniach komórkowych. Pomimo wielu doniesień wykazujących indukowaną przez PKC utratę dopaminy, aktywnego transportera lub powierzchni długu w różnych liniach komórkowych i systemach ekspresji, wyzwaniem było potwierdzenie tego odkrycia w hodowanych neuronach dopaminergicznych, użyliśmy mysich wycinków stri AAL, aby bezpośrednio sprawdzić, czy dat internalizuje się w odpowiedzi na aktywację PKC w dorosłych neuronach dopaminergicznych, jak widać.

Tutaj wykryliśmy silną ekspresję powierzchni DA w prążkowiu myszy w warunkach traktowania bazylii lub nośnika z 81,4 plus minus 5,8% całkowitego długu na powierzchni komórki aktywacji PKC za pomocą czterech kulek 12. Octan Myra State 13 znacznie zmniejszył ekspresję powierzchniową dat do 60,8 plus minus 5,2% całkowitego długu, co odpowiada około 30% utracie długu z błony plazmatycznej. W przeciwieństwie do tego, tylko 1,6 plus minus 0,4% całkowitej hydroksylazy tyrozynowej było biotynylowane zgodnie z jej lokalizacją wewnątrzkomórkową i potwierdzające, że odczynnik tonacyjny został wykluczony z wnętrza komórki neuronów dopaminergicznych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć zmiany w ekspresji białka błonowego w nienaruszonych zakończeniach neuronalnych.