Demonstracja wielolekoopornej mikromacierzy amplifikacyjnej Mycobacterium tuberculosis
25 kwietnia 2014
Mikromacierz amplifikacyjna łączy asymetryczną amplifikację PCR i hybrydyzację mikromacierzy w jednej komorze, co znacznie usprawnia pracę z mikromacierzą dla użytkownika końcowego. Uproszczenie przepływu pracy z mikromacierzami jest niezbędnym pierwszym krokiem do stworzenia diagnostyki opartej na mikromacierzach, która może być rutynowo używana w środowiskach o niższych zasobach.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest genotyp wielolekoopornej gruźlicy drobnoustrojowej przy użyciu mikromacierzy amplifikacyjnej. Osiąga się to poprzez wykonanie multipleksowej asymetrycznej reakcji PCR na wierzchu mikromacierzy w pojedynczej mikroprzepływowej komorze reakcyjnej. Tam próbka jest jednocześnie amplifikowana, oznaczana rozmiarem wybieranym, jednoniciowa i hybrydyzowana do mikromacierzy.
Następnie, po umyciu mikromacierzy, czytnik pokazuje, czy mikrobakteria gruźlicy jest obecna i czy zawiera mutację DNA, o której wiadomo, że nadaje oporność na ryfampicynę iso, niazi ethambutol lub streptomycynę. Zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi metodami hybrydyzacji mikromacierzy lub hybrydyzacji kwasów nukleinowych jest to, że mikromacierz amplifikacyjna znacznie upraszcza interakcję użytkownika z testem. Mimo to, zapewniając czułość analityczną PCR i zdolność multipleksowania mikromacierzy W przypadku tej procedury należy przetrzeć czystą przestrzeń roboczą roztworem odkażającym i mieć kwasy nukleinowe wystarczająco czyste do multipleksowego PCR.
Po rozmrożeniu i wymieszaniu wszystkich roztworów podstawowych złóż mieszankę wzorcową PCR. Przygotowując tę mieszankę, przygotuj co najmniej jedną dodatkową objętość mieszanki do testu TB pokazanego tutaj. Dodaj również dodatkową polimerazę T do mieszanki głównej.
Oprócz ilości przyczepności dostarczonej z odczynnikami podstawowymi, należy wymieszać jeden mikrolitr podwielokrotności próbki DNA z 49 mikrolitrami mieszanki wzorcowej. Ostrożnie dodaj 48 mikrolitrów każdej mieszaniny reakcyjnej do środka odpowiedniej mikromacierzy. Nie dotykaj samej mikromacierzy.
Następnie ostrożnie przykryj i uszczelnij mikromacierz w niewłaściwy sposób. Nakładanie szkiełka nakrywkowego może wprowadzić pęcherzyki, które mogą prowadzić do artefaktów, parowania, słabej amplifikacji lub niejednorodnej hybrydyzacji. Każdy z tych warunków może prowadzić do błędnego wyniku.
Następnie załaduj mikroszybkość do termocyklera. Gdy podłoża przylegają do bloku grzewczego, opcja podgrzewanej pokrywy musi być wyłączona. W przypadku laboratoriów, które stosują uniwersalne środki ostrożności PCR, bardziej efektywne jest włączenie kilku mikromacierzy amplifikacyjnych na szkiełko i jednoczesne przetwarzanie wielu testów.
Teraz uruchom odpowiedni program cykli termicznych. Ten program ma 50 cykli amplifikacji, które mogą wydawać się wysokie, ale potrzebne ze względu na głównie jednoniciową populację amplikonów utworzoną w wyniku reakcji. Po zakończeniu reakcji usuń mikromacierze i wyłącz termocykler.
Ostrożnie otwórz komorę mikromacierzy za pomocą płaska i kleszczowa. Usuń poślizg, pokrywę i uszczelkę. Na tym etapie mikromacierz może zostać uszkodzona, więc należy zachować ostrożność w niewłaściwy sposób.
Usunięcie zespołu uszczelki może prowadzić do fizycznego uszkodzenia mikroukładu. Uważaj, aby nie zginać ani nie zginać szkiełka nakrywkowego i zachowaj szczególną ostrożność, aby nie zarysować powierzchni mikromacierzy kleszczami, Teraz przenieś podłoża mikromacierzy do uchwytu na szkiełko histologiczne. Zanurzyć podłoża w buforze do płukania przez 10 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem, a następnie zanurzyć w roztworze płuczącym jeszcze dwa lub trzy płukania, wszystkie w wodzie dejonizowanej.
Wysuszyć mikromacierze przed przystąpieniem do obrazowania. W tym celu można użyć delikatnego strumienia sprężonego powietrza, którego parametry są specyficzne dla testu MDR TB i przenośnego imagera terenowego Econ DX 2100. Niebieska lampka na wywoływarce wskazuje, że jest gotowy.
Włącz komputer. Otwórz oprogramowanie systemowe dostarczone przez komputer i poczekaj, aż oprogramowanie ogłosi, że nawiązało połączenie z kamerą. Następnie włóż wysuszoną mikromacierz do imagera.
Z mikromatrycą skierowaną w stronę obiektywu, a z dala od użytkownika. Oprogramowanie zapewni teraz podgląd obrazu z menu rozwijanego. Wybierz skrypt analizy MDR TB.
Wprowadź czas naświetlania z zakresu od 100 do 500 milisekund. Prześwietlone piksele zostaną odczytane. Dostosuj ekspozycję, aby je zminimalizować.
Gdy nasycenie jest ustawione tak, aby zminimalizować nadmierną ekspozycję, rozpocznij analizę. Oprogramowanie umieszcza siatkę MDRT TB na wynikach obrazu, próbkach i intensywności tła, a następnie raportuje wyniki oporności na leki i genotypowania. Po zakończeniu i zapisaniu analizy wyjmij chip z imagera i rozpocznij nową sesję analizy, aby przeanalizować następną matrycę.
Kontynuować analizę dla każdej z przetworzonych mikromacierzy. Zapisywanie danych za każdym razem. Jakościowa analiza obrazu może zapewnić wgląd w źródła eksperymentalnego szumu lub zmienności, które są trudne do zidentyfikowania w tabelach danych generowanych przez oprogramowanie do automatycznej analizy obrazu.
Widać tutaj tablicę wysokiej jakości pozbawioną artefaktów. Kilka artefaktów może prowadzić do wprowadzenia bąbelków, które tworzą aureole. Pomimo artefaktów tablicy, oprogramowanie nadal będzie pobierać wartości ze skanowania.
Algorytm raportowania diagnostycznego, pomimo uzyskania wartości, rozpoznałby tę tablicę jako nieprawidłową. Serię rozcieńczeń genomowego DNA dzikiego typu H 37 RA zastosowano na matrycy PCR z mikromacierzą w pikogramach 6,25, co odpowiada 1 250 komórkom. Wszystkie sondy zostały wykryte.
Wartość SNR powyżej trzech jest wynikiem dodatnim, a zarejestrowane wartości były znacznie wyższe. Następnie genotypowano referencyjne izolaty Światowej Organizacji Zdrowia. Polimorfizmy pojedynczych nukleotydów obecne w macierzy wykryto jako odpowiadającą im mutację w genomie MDR TB.
Ewidentnych było również kilka przykładów wykrywania mutacji u bliskich sąsiadów. Dyskusja znajduje się w protokole tekstowym. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu około trzech i pół do sześciu i pół godziny, w zależności od stężenia DNA, specyficznego testu, wydajności i jednorodności termocyklera oraz pożądanej czułości i swoistości analitycznej lub klinicznej.
Ponadto liczbę cykli amplifikacji i czasy hybrydyzacji po amplifikacji można łatwo skrócić lub wydłużyć, aby uzyskać pożądane cechy wydajności.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nowatorską metodę mikromacierzy amplifikacyjnej do genotypowania wielolekoopornych szczepów microbacterium tuberculosis. Dzięki zintegrowaniu asymetrycznej amplifikacji PCR i hybrydyzacji na mikromacierzy w jednej komorze, cały proces został znacząco uproszczony, co czyni go odpowiednim dla środowisk o ograniczonych zasobach.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Genetyka
- Diagnostyka
Wstęp
- Wielolekooporna prątka gruźlicy (*Mycobacterium tuberculosis*) stanowi istotne wyzwanie dla zdrowia publicznego.
- Tradycyjne metody detekcji mogą być złożone i zasobożerne.
- Istnieje zapotrzebowanie na uproszczone metody diagnostyczne w warunkach ograniczonego dostępu do zasobów.
- Niniejsze badanie analizuje nowe podejście z wykorzystaniem mikromacierzy amplifikacyjnych.
Cel badania
- Opracowanie metody genotypowania wielolekoopornych szczepów microbacterium tuberculosis.
- Uproszczenie interakcji użytkownika z testem diagnostycznym.
- Połączenie procesów amplifikacji i hybrydyzacji w jednej reakcji mikroprzepływowej.
Zastosowane metody
- Multiplexowa asymetryczna reakcja PCR przeprowadzona na matrycy mikroarray.
- Jednoczesna amplifikacja, znakowanie, selekcja wielkości i hybrydyzacja.
- Przemywanie matrycy mikroarray po hybrydyzacji.
- Użycie czytnika w celu wykrycia obecności microbacterium tuberculosis oraz powiązanych mutacji.
Główne wyniki
- Metoda mikrotablicy amplifikacyjnej upraszcza proces diagnostyczny.
- Zachowuje ona czułość analityczną charakterystyczną dla PCR.
- Umożliwia ona zastosowanie multipleksowania o możliwościach zbliżonych do tradycyjnych mikrotablic.
- Wyniki wskazują na skuteczną detekcję mutacji oporności na leki.
Wnioski
- Mikromacierze amplifikacyjne stanowią obiecujące narzędzie w diagnostyce gruźlicy.
- Metoda ta mogłaby zwiększyć możliwości testowania w warunkach ograniczonych zasobów.
- Do powszechnego zastosowania niezbędna jest dalsza walidacja i optymalizacja.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta metoda mikroarrayu amplifikacyjnego usprawnia genotypowanie MDR-TB poprzez integrację asymetrycznej PCR, znakowania i hybrydyzacji w jednej komorze mikroprzepływowej, co redukuje liczbę etapów manualnych i umożliwia wdrożenie w warunkach ograniczonych zasobów. Podejście to zachowuje czułość na poziomie PCR, jednocześnie wspierając multipleksową detekcję mutacji nadających oporność, co wyznacza kierunek ku uproszczonej, skalowalnej diagnostyce w nadzorze nad chorobami zakaźnymi. Poprzez minimalizację interakcji z użytkownikiem i czasu przetwarzania, metoda ta wypełnia krytyczne luki w translacyjnych przepływach pracy w mikrobiologii, gdzie szybkość, powtarzalność i niska zależność od infrastruktury są niezbędne dla wczesnej walidacji celów i opracowywania testów.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie celów genetycznych związanych z mechanizmami lekooporności u Mycobacterium tuberculosis.
- Wartość operacyjna: Wspiera weryfikację hipotez poprzez multipleksową detekcję SNP w jednej reakcji, co zmniejsza zmienność wynikającą z podziału próbek.
- Wartość translacyjna: Zapewnia system istotny dla przebiegu choroby do oceny mutacji nadających oporność, pomagając w ograniczaniu ryzyka mechanistycznego w programach celowania w leki przeciwinfekcyjne.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe sygnały hybrydyzacji, które korelują z wariantami allelicznymi, umożliwiając dyskryminację specyficzną dla allelu.
- Wartość operacyjna: Łączy amplifikację i detekcję w zamkniętym systemie, co minimalizuje ryzyko kontaminacji i poprawia powtarzalność między partiami.
- Gotowość testu: Wykorzystuje 9-pleksową asymetryczną mieszaninę master mix kompatybilną z macierzami o niskiej gęstości, wykazując skalowalną multipleksację dla paneli genotypowania patogenów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie kliniczne: Bezpośrednie genotypowanie szczepów MDR-TB z wykorzystaniem izolatów referencyjnych WHO, co zapewnia istotność kliniczną wykrytych mutacji.
- Pewność predykcyjna: Osiągnięcie poziomu SNR >3 jako progu dodatniego wyniku, co stanowi ilościowy punkt odniesienia dla oceny wydajności testu.
- Ciągłość procesu: Wyniki genotypowania są kompatybilne z algorytmami interpretacji oporności w dalszych etapach analizy, co wspiera dostosowanie translacyjnych biomarkerów.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w przepływy pracy od wczesnego etapu odkrywania do badań przedklinicznych, zapewniając szybki odczyt genotypowania w systemie zamkniętym, który wspiera decyzje dotyczące walidacji celu oraz optymalizacji wiodących związków w programach przeciwinfekcyjnych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia badanie mechanizmów oporności na poziomie szlaków poprzez wykrywanie wielu mutacji w genach takich jak rpoB, katG oraz embB.
- Screening: Umożliwia wysokoprzepustowe profilowanie szczepów przy minimalnym nakładzie pracy manualnej, wspierając analizę izolatów klinicznych lub bibliotek zmutagenizowanych.
- Analityka: Zapewnia multipleksowe odczyty fluorescencyjne ilościowo określające wydajność hybrydyzacji, co pozwala na porównanie liczebności alleli mutantów w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Wykorzystuje klinicznie istotne ilości wejściowe DNA (nawet do poziomu 1 000 ekwiwalentów komórek), łącząc testowanie próbek syntetycznych i pochodzących od pacjentów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Format mikrofluidycznego macierzy amplifikacyjnych jest dostosowywalny do innych paneli patogenów, co sprzyja ponownemu wykorzystaniu platformy w badaniach nad różnymi celami w chorobach zakaźnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w genotypowaniu oporności poprzez zapewnienie jednoczesnego, multipleksowego wykrywania mutacji.
- Wartość operacyjna: Eliminuje oddzielne etapy amplifikacji i hybrydyzacji, co zmniejsza czas pracy manualnej oraz zmienność techniczną.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji go/no-go w walidacji celu poprzez dostarczenie profili oporności w ciągu 6,5 hours.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację związków skierowanych przeciwko szczepom opornym z uwzględnieniem ryzyka dzięki wiarygodnemu genotypowaniu izolatów przedklinicznych.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obsłudze mikrofluidyki oraz optymalizacji asymetrycznej reakcji PCR w celu zachowania jednorodności amplifikacji.
- Zależność od termocyklerów z regulowanymi ustawieniami pokrywy oraz kompatybilnych obrazowników fluorescencji do detekcji końcowej.
- Konieczność stosowania znormalizowanych protokołów płukania, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej między seriami w trybach przetwarzania wsadowego.
- Należy uwzględnić ograniczenia kompatybilności starterów w multipleksowych mieszaninach master mix, ponieważ zakres multipleksowania jest ograniczony kompatybilnością par starterów, a nie gęstością sond.
- Wydajność jest wrażliwa na jakość i stężenie wejściowego DNA, co wymaga kontroli jakości materiału genomowego przed amplifikacją.
