Ocena hiperalgezji wywołanej morfiną i tolerancji przeciwbólowej u myszy przy użyciu termicznych i mechanicznych modalności nocyceptywnych
29 lipca 2014
Opisujemy protokół do badania rozwoju hiperalgezji i tolerancji wywołanej opioidami u myszy. Opierając się na pomiarze termicznych i mechanicznych reakcji nocyceptywnych zwierząt nieleczonych morfiną i leczonych morfiną, pozwala na ilościowe określenie wzrostu wrażliwości na ból (hiperalgezja) i spadku analgezji (tolerancji) związanego z przewlekłym podawaniem opiatów.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest obserwacja rozwoju opioidowej hiperalgezji oraz tolerancji na analgetyki u myszy. Osiąga się to poprzez pomiar termicznych i mechanicznych reakcji nocyceptywnych u myszy naiwnych po podaniu morfiny w określonym przedziale czasowym w dniu zerowym jako drugi etap. Próg nocyceptywny jest mierzony codziennie przed podaniem morfiny aż do siódmego dnia.
Efekt przeciwbólowy morfiny jest ponownie mierzony w czasie, aby wykazać rozwój tolerancji na leki przeciwbólowe. Uzyskane wyniki wskazują na wzrost wrażliwości na ból oraz rozwój tolerancji przeciwbólowej po powtarzanym podawaniu morfiny.
Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat rozwoju nadwrażliwości na ból oraz tolerancji analgetycznej u myszy, po przewlekłym leczeniu opiatami można ją zastosować również w przypadku innych opiatów lub myszy zmodyfikowanych genetycznie. Procedurę zaprezentuje student studiów doktoranckich z mojego laboratorium. Aby zminimalizować analgezję indukowaną stresem, myszy są poddawane obchodowi przez pięć minut każdego dnia i habituowane do momentu, aż będą swobodnie wchodzić do ograniczacza.
Po habituacji należy rozpocząć test zanurzenia ogona, ustawiając termostat na 48 °C. Ostrożnie umieść mysz w restrainerze. Po prawidłowym unieruchomieniu zwierzęcia zanurz wystające dwie trzecie długości jego ogona w łaźni wodnej i uruchom chronometr.
Odróżnienie bodźca nocyceptywnego od reakcji nocyceptywnej jest kluczowym elementem tej procedury. Prawidłowa ocena i praktyka są niezbędne do osiągnięcia sukcesu. Monitoruj ruchy zwierzęcia i zatrzymaj chronometr.
Niezwłocznie po wycofaniu ogona myszy z gorącej wody należy zapisać czas latencji wycofania. Przenieść mysz z powrotem do klatki i przetestować kolejne zwierzę, zachowując tę samą kolejność aż do zakończenia serii. Pomiary odpowiedzi nocyceptywnej powtórzyć jeszcze dwukrotnie.
Opóźnienie reakcji nocyceptywnej w sekundach dla każdej myszy określa się jako wartość średnią z trzech kolejnych pomiarów. W przypadku testu nacisku na ogon, najpierw delikatnie umieść mysz w stabilizatorze i ustaw jej ogon pod stożkową końcówką anal JMeter. Po ustawieniu naciśnij przełącznik nożny, aby przyłożyć równomiernie zwiększający się nacisk na proksymalną część ogona.
Przy pierwszej oznace reakcji nocyceptywnej wycofaj końcówkę. Reakcje nocyceptywne mogą obejmować szamotanie się, piszczenie lub cofanie ogona. Zapisz aktualną wartość siły w gramach, która wywołała reakcję nocyceptywną.
Powtórz ten pomiar na środkowej i dystalnej części ogona tej samej myszy w odstępach 32-sekundowych, zwróć zwierzę do klatki i powtarzaj te kroki, aż wszystkie myszy zostaną przebadane. Najpierw wyznacz dwie grupy zwierząt o porównywalnych średnich wartościach nocyceptywnych. Następnie zmierz i zapisz masę ciała każdego zwierzęcia.
Po utworzeniu grup solowych i morfinowych, należy przygotować roztwór morfiny w soli fizjologicznej do podania podskórnie. Pomiar latencji reakcji nocyceptywnej należy przeprowadzić w testach zanurzenia ogona oraz nacisku na ogon, a uzyskane wyniki zapisać jako czas 0,0 dla każdej grupy. Następnie każdemu zwierzęciu należy podać wstrzyknięcie morfiny lub soli fizjologicznej, zależnie od przynależności do grupy.
Po 30 minutach należy rozpocząć rejestrację reakcji nocyceptywnych u każdego zwierzęcia. Należy zwrócić szczególną uwagę na wartości odcięcia, ponieważ myszy prawdopodobnie nie zareagują na bodźce szkodliwe w tak wczesnym punkcie czasowym. W przypadku braku reakcji nocyceptywnej stosuje się 25-sekundowy czas odcięcia, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek, zachowując tę samą kolejność testów.
Powtarzać pomiary nocyceptywne co 30 minut aż do 3,5 godziny po wstrzyknięciu w przypadku przewlekłego leczenia morfiną. Uzyskać wartości dla pierwszego dnia, mierząc reakcję nocyceptywną zwierząt w testach TIT i TPT zgodnie z wcześniejszą instrukcją. Przygotować świeży roztwór morfiny.
Wykonaj wstrzyknięcia morfiny lub soli fizjologicznej zgodnie z przydziałem do grup i pozostaw zwierzęta do odpoczynku do następnego dnia. Następnego dnia zmierz odpowiedzi nocyceptywne w testach TIT i TPT przed podaniem drugiej serii wstrzyknięć. Powtarzaj te kroki codziennie przez sześć dni.
Siódmego dnia należy ocenić analgezję wywołaną morfiną. Zgodnie z przebiegiem czasowym zaprezentowanym wcześniej w teście zanurzenia ogona, maksymalny efekt przeciwbólowy morfiny osiągnięto po 30 minutach. Jednak w teście ucisku ogona maksymalny efekt wystąpił po 60 minutach w porównaniu z grupą kontrolną, której wstrzyknięto sól fizjologiczną.
Wyniki te wskazują, że codzienne iniekcje morfiny w siedmiodniowym okresie leczenia wywołały istotne i postępujące obniżenie podstawowych wartości nocyceptywnych dla bodźców termicznych i mechanicznych. Po przewlekłym leczeniu podstawowa wartość nocyceptywna u myszy traktowanych morfiną była istotnie niższa niż u myszy kontrolnych otrzymujących sól fizjologiczną. Po podaniu ostrej dawki morfiny odpowiedź nocyceptywna w grupie traktowanej przewlekle morfiną istotnie wzrosła, jednak przekroczyła zaledwie nieznacznie podstawową wartość nocyceptywną grupy kontrolnej otrzymującej sól fizjologiczną.
Myszom mierzono próg nocyceptywny w testach TIT i TPT w 30. minucie oraz w teście TIT w 60. minucie; tutaj przedstawiono wartości progów nocyceptywnych zmierzonych 30 minut po wstrzyknięciu soli fizjologicznej lub morfiny dla dnia zerowego oraz siódmego dnia rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie badań nad bólem do zgłębiania efektów interwencji farmakologicznych lub genetycznych w rozwoju nadwrażliwości bólowej i tolerancji analgetycznej indukowanej przewlekłym podawaniem morfiny.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół służący do badania hiperalgezji indukowanej opioidami oraz tolerancji przeciwbólowej u myszy. Poprzez pomiar termicznych i mechanicznych odpowiedzi nocyceptywnych, protokół ten pozwala na ilościowe określenie zmian w czułości na ból i działaniu przeciwbólowym po przewlekłym podawaniu morfiny.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Farmakologia
- Nauki o zachowaniu
Wstęp
- Hiperalgezja indukowana opioidami to zjawisko, w którym pacjenci doświadczają zwiększonej wrażliwości na ból po leczeniu opioidami.
- Tolerancja analgetyczna występuje, gdy skuteczność opioidów z czasem maleje.
- Zrozumienie tych mechanizmów jest kluczowe dla usprawnienia strategii leczenia bólu.
- W niniejszym badaniu wykorzystano model mysi w celu zbadania tych efektów w kontrolowanym środowisku.
Cel badania
- Obserwacja rozwoju opioidowej hiperalgezji u myszy.
- Pomiar tolerancji przeciwbólowej wynikającej z przewlekłego podawania morfiny.
- Zrozumienie mechanizmów nadwrażliwości na ból.
Zastosowane metody
- Myszy otrzymywały morfinę, a ich reakcje nocyceptywne mierzono za pomocą testów zanurzenia ogona oraz nacisku na ogon.
- Pomiary wykonywano codziennie przez siedem dni w celu oceny zmian w wrażliwości na ból.
- Oceniano zarówno progi termiczne, jak i mechaniczne, aby określić stopień hiperalgezji i tolerancji.
- Wyniki porównywano pomiędzy grupą otrzymującą morfinę a grupą kontrolną otrzymującą sól fizjologiczną.
Główne wyniki
- Przewlekłe podawanie morfiny doprowadziło do znaczącego wzrostu wrażliwości na ból.
- Zaobserwowano tolerancję przeciwbólową, objawiającą się zmniejszeniem skuteczności morfiny w czasie.
- Pomiary wykazały stopniowe obniżanie się progów nocyceptywnych u myszy traktowanych morfiną.
- Wyniki potwierdzają hipotezę, że przewlekłe stosowanie opioidów prowadzi do hiperalgezji i tolerancji.
Wnioski
- Badanie dostarcza niezawodnej metody oceny opioidowej hiperalgezji i tolerancji u myszy.
- Wyniki podkreślają potrzebę ostrożnego prowadzenia terapii opioidowych, aby uniknąć zwiększonej wrażliwości na ból.
- Niniejszy protokół można dostosować do dalszych badań nad innymi opioidami lub modyfikacjami genetycznymi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Hiperalgezja indukowana opioidami oraz tolerancja analgetyczna stanowią krytyczne wyzwania w opracowywaniu leków przeciwbólowych, obniżając długoterminową skuteczność terapii opioidowych. Niniejszy protokół umożliwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez kwantyfikację zmian nocyceptywnych w odpowiedzi na bodźce termiczne i mechaniczne in vivo, co wspiera walidację celu oraz zwiększa pewność prognostyczną w badaniach kandydatów na leki analgetyczne. Podejście to zapewnia system istotny z punktu widzenia jednostki chorobowej do oceny genetycznych i farmakologicznych modyfikatorów odpowiedzi na opioidy, co pozwala na optymalizację portfolio i identyfikację związków wiodących w badaniach nad bólem.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju bioprzemysłu farmaceutycznego
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez pomiar dwukierunkowych zmian w termicznej i mechanicznej nocycepcji po przewlekłej ekspozycji na morfinę.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez kwantyfikację fenotypów hiperalgezji i tolerancji u myszy typu dzikiego oraz myszy modyfikowanych genetycznie.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność predykcyjną poprzez ustalenie zależności od dawki i czasu pomiędzy ekspozycją na opioidy a przesunięciami progu nocyceptywnego.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszego screeningu poprzez ustalenie bazowych profili odpowiedzi nocyceptywnej oraz profili zmienionych pod wpływem leków.
- Wyniki ilościowe: Generuje powtarzalne, ciągłe odczyty (czas utajenia wycofania w sekundach, siła w gramach), co umożliwia standaryzowaną ocenę związków w różnych badaniach.
- Skalowalność: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy do testowania kandydatów na leki przeciwbólowe, interwencji genetycznych lub terapii skojarzonych w spójnych ramach pomiaru nocycepcji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla patogenezy chorób: Modeluje hiperalgezję i tolerancję indukowaną opioidami, które stanowią kluczowe ograniczenia w klinicznej terapii opioidowej, zapewniając translacyjne dopasowanie biomarkerów nadwrażliwości na ból.
- Ciągłość przedkliniczna: Łączy etap odkrywania z badaniami za pomocą podłużnego monitorowania nocycepcji, co umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o ocenę ryzyka i trwałość działania analgetycznego.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Izoluje zmienne przyczyniające się do tolerancji analgetycznej w przeciwieństwie do hiperalgezji, co dostarcza informacji niezbędnych do wyboru celu terapeutycznego i strategii biomarkerowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkrywania leków przeciwbólowych, od wczesnej walidacji celu, przez optymalizację związku wiodącego, aż po przedkliniczne badania skuteczności, umożliwiając iteracyjną ocenę potencjału przeciwbólowego oraz indeksu terapeutycznego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących modulacji szlaków nocycepcyjnych oraz biologiczne ograniczanie ryzyka w przypadku celów opioidowych poprzez podłużne profilowanie wrażliwości.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do przeprowadzania testów dzięki zstandaryzowanym, ilościowym pomiarom nocycepcji termicznej i mechanicznej, odpowiednim do oceny bibliotek związków.
- Analityka: Dostarcza danych z przebiegu czasowego oraz porównań grupowych (morfina vs. sól fizjologiczna, ostra vs. chroniczna), które umożliwiają statystyczną ocenę rozwoju tolerancji na leki przeciwbólowe.
- Badania translacyjne: Wiąże się z walidacją przedkliniczną poprzez modelowanie istotnych klinicznie fenotypów hiperalgezji i tolerancji indukowanej opioidami u myszy.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do fenotypowania nocycepcyjnego, którą można zastosować w różnych klasach opioidów, modelach genetycznych i badaniach nad interwencjami terapeutycznymi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w zakresie opioidowej hiperalgezji i tolerancji dzięki bezpośrednim, podłużnym pomiarom nocyceptywnym.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność poprzez habituację, pomiary ślepe oraz uśrednianie latencji w trzech powtórzeniach dla modalności termicznych i mechanicznych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez wczesną identyfikację ryzyka związanego z działaniem przeciwbólowym, co redukuje liczbę niepowodzeń na późnych etapach wynikających z nieprzewidzianej hiperalgezji lub tolerancji.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na leki przeciwbólowe z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o trwałość efektu oraz odróżnienie go od sygnatur hiperalgetycznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z gryzoniami, przeprowadzaniu testów nocyceptywnych oraz odróżnianiu odruchowych od afektywnych reakcji bólowych w celu zapewnienia ważności danych.
- Zależne od skalibrowanej aparatury termicznej (łaźnia wodna 48°C) i mechanicznej (stopniowany stymulator ciśnienia) z możliwością precyzyjnego pomiaru latencji i siły.
- Wymaga standaryzacji protokołów habituacji, procedur iniekcji oraz czasu pomiarów pomiędzy zespołami badawczymi, aby zminimalizować zmienność międzyoperatorową.
- W przypadku rozszerzenia badań na modele szczurze lub gatunki niemysie, należy uwzględnić kwestie adaptacyjne ze względu na różnice w morfologii ogona i wrażliwości nocyceptywnej.
- Ograniczenia praktyczne obejmują możliwość wystąpienia analgezji indukowanej stresem w przypadku niewystarczającej habituacji oraz efekty pułapu w pomiarach nocyceptywnych przy ekstremalnych dawkach leków.
