Name: Obrazowanie kolców dendrytycznych pierwotnych neuronów hipokampa szczura za pomocą mikroskopii oświetlenia strukturalnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 11 s
Description: Poznaj technikę obrazowania kolców dendrytycznych neuronów hipokampa szczura za pomocą mikroskopii SIM. Ta superrozdzielcza metoda umożliwia szczegółową analizę morfologii synaptycznej w neurobiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantu VIDI numer H64.09.016 od Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO) dla CPF. CPF jest wdzięczny dr Silvinie A. Fratantoni za jej krytyczne uwagi i poprawki do ostatecznej wersji rękopisu. GMRDL/EMMM są wspierane przez Holenderską Fundację Technologiczną STW (projekt 12151 i 11350), która jest częścią NWO i która jest częściowo finansowana przez Ministerstwo Gospodarki. Dziękujemy Catherine Kitts i Peterowi Drentowi z firmy Nikon Instruments Europe BV za pomoc i wsparcie. HX był wspierany przez Królewską Holenderską Akademię Sztuk i Nauk (grant 11CDP10), a WT był wspierany przez grant Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (grant 820.02.006).

<ol><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J Microsc. 198, 82-87 (2000).</li>
<li>Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+formation+and+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine formation and stabilization.</a> Curr Opin Neurobiol. 19, 146-153 (2009).</li>
<li>Dailey, M. E., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+dendritic+structure+in+developing+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dynamics of dendritic structure in developing hippocampal slices.</a> J Neurosci. 16, 2983-2994 (1996).</li>
<li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).</li>
<li>Jaworski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+microtubules+regulate+dendritic+spine+morphology+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity.</a> Neuron. 61, 85-100 (2009).</li>
<li>Abbe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beitr%C3%A4ge+zur+Theorie+des+Mikroskops+und+der+mikroskopischen+Wahrnehmung%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+f%C3%BCr+mikroskopische+Anatomie%22%5BJournal%5D)">Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung.</a> Archiv für mikroskopische Anatomie. 9, 413-418 Forthcoming.</li>
<li>Gustafsson, M. G., Agard, D. A., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I5M%3A+3D+widefield+light+microscopy+with+better+than+100+nm+axial+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">I5M: 3D widefield light microscopy with better than 100 nm axial resolution.</a> J Microsc. 195, 10-16 (1999).</li>
<li>Heintzmann, R., Cremer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laterally+modulated+excitation+microscopy%3A+improvement+of+resolution+by+using+a+diffraction+grating%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+SPIE+3568+Optical+Biopsies+and+Microscopic+Techniques+III%22%5BJournal%5D)">Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating.</a> Proc. SPIE 3568 Optical Biopsies and Microscopic Techniques III. , 185-196 (1999).</li>
<li>Karadagliƒá, D., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+formation+in+structured+illumination+wide-field+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Image formation in structured illumination wide-field fluorescence microscopy.</a> Micron. 39, 808-818 (2008).</li>
<li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320, 1332-1336 (2008).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+structured-illumination+microscopy%3A+wide-field+fluorescence+imaging+with+theoretically+unlimited+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13081-13086 (2005).</li>
<li>Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+dendritic+spines+by+STED+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 18982-18987 (2008).</li>
<li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat Methods. 6, 339-342 (2009).</li>
<li>James, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligned+microcontact+printing+of+micrometer-scale+poly-L-lysine+structures+for+controlled+growth+of+cultured+neurons+on+planar+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Aligned microcontact printing of micrometer-scale poly-L-lysine structures for controlled growth of cultured neurons on planar microelectrode arrays.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 47, 17-21 (2000).</li>
<li>Dumitriu, D., Rodriguez, A., Morrison, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput%2C+detailed%2C+cell-specific+neuroanatomy+of+dendritic+spines+using+microinjection+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-throughput, detailed, cell-specific neuroanatomy of dendritic spines using microinjection and confocal microscopy.</a> Nat Protoc. 6, 1391-1411 (2011).</li>
<li>Fitzsimons, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+the+glucocorticoid+receptor+alters+functional+integration+of+newborn+neurons+in+the+adult+hippocampus+and+impairs+fear-motivated+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Knockdown of the glucocorticoid receptor alters functional integration of newborn neurons in the adult hippocampus and impairs fear-motivated behavior.</a> Mol Psychiatry. , (2012).</li>
<li>van Hooijdonk, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-mediated+transgene+delivery+to+the+hippocampus+reveals+sub-field+specific+differences+in+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-mediated transgene delivery to the hippocampus reveals sub-field specific differences in expression.</a> BMC Neurosci. , (2009).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal%2C+a+new+serum-free+medium+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).</li>
<li>Izeddin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+dynamic+imaging+of+dendritic+spines+using+a+low-affinity+photoconvertible+actin+probe%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Super-resolution dynamic imaging of dendritic spines using a low-affinity photoconvertible actin probe.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule opisano działający protokół obrazowania kolców dendrytycznych z pierwotnych neuronów hipokampa szczurów hodowanych in vitro przy użyciu karty SIM. Pierwotna metoda hodowli neuronów hipokampa jest adaptacją oryginalnej metody opisanej przez Kaecha i Bankera 18. Główne różnice to użycie pożywki hodowlanej Neurobasal/B27, która eliminuje wymóg hodowli astrogleju, oraz dodanie inhibitora mitotycznego FUDR w dniu 3, który wspomaga przeżycie neuronów przy jednoczesnym hamowaniu proliferacji gleju...

Kolce dendrytyczne to małe wybrzuszenie błony neuronalnej. Ta charakterystyczna struktura jest wyspecjalizowana w odbieraniu danych wejściowych z pojedynczej synapsy i reprezentuje obszar kontaktu fizycznego między dwoma neuronami. Najbardziej funkcjonalnie dojrzałe kolce dendrytyczne składają się z kulistej końcówki, zwanej głową, i cienkiej szyjki, która łączy głowę z trzonem dendrytycznym. Jednak kolce nie są statyczne i aktywnie się poruszają i zmieniają swoją morfologię w sposób ciągły, nawet w dorosłym mózgu 2. W ciągu 2 tygodni pierwotne hodowle neuronów hipokampa szczurów pochodzące z późnego okresu embrionalnego lub wczesnego okresu pourodzeniowego rozwijają złożone altany dendrytyczne z licznymi wypukłościami błony, które ewoluują od wczesnych filipodiów do struktur przypominających kręgosłup 3. Na podstawie tego dynamicznego zachowania i innych cech uważa się, że kolce dendrytyczne stanowią anatomiczny substrat do przechowywania pamięci i transmisji synaptycznej 4,5.
Biorąc pod uwagę kluczową rolę, jaką rozmiar i kształt kolców dendrytycznych odgrywają w funkcji synaptycznej, ważne jest, aby dokładnie zmierzyć ich wymiary. Kolce mają długość od około 200 do 2000 nanometrów i można je łatwo zidentyfikować za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii fluorescencyjnej. Jednak wymiary kręgosłupa inne niż długość są zwykle niższe od rozdzielczości konwencjonalnych układów optycznych, teoretycznie ustalanej przez dyfrakcję około 200 nanometrów 6. Te zdolności rozdzielcze są niewystarczające do obrazowania drobniejszych szczegółów, takich jak szerokość kręgosłupa, szyi i głowy. Poświęcono wiele pracy w celu rozwiązania tego problemu, a wiele stosunkowo nowych technik mikroskopii superrozdzielczej zapewniło znaczny postęp. W szczególności możliwe jest osiągnięcie rozdzielczości wykraczającej poza klasyczną granicę bez odrzucenia światła emisyjnego dzięki zastosowaniu mikroskopii oświetlenia o strukturze bocznej (SIM) w szerokokątnym, niekonfokalnym mikroskopie 7-10. Stosując tę technikę w połączeniu z technikami mikroskopii nieliniowej, teoretycznie możliwe jest poprawienie rozdzielczości bocznej mikroskopu optycznego o nieograniczony współczynnik 11. Jednak w większości przypadków eksperymentalnych SIM pozwala na dwukrotne przekroczenie limitu rozdzielczości. Inne techniki mikroskopii optycznej o wysokiej rozdzielczości, takie jak mikroskopia wymuszonego zubożenia emisji (STED) 12 i mikroskopia lokalizacji fotoaktywacji (PALM) 12, zostały zastosowane do obrazowania kolców dendrytycznych. Metody oparte na lokalizacji, takie jak PALM, wymagają bardzo dużej liczby obrazów RAW w celu uzyskania superrozdzielczości i dlatego mają ograniczoną prędkość. Z drugiej strony, STED może osiągać wysoką prędkość obrazowania, choć przy stosunkowo niskiej liczbie fotonów i małych polach widzenia, co może nie mieć miejsca w przypadku SIM 13.
W tym artykule celem jest dostarczenie działającego protokołu do obrazowania kolców dendrytycznych z pierwotnych neuronów hipokampa szczurów hodowanych in vitro za pomocą SIM. Protokół składa się z dwóch wyróżniających się faz: początkowej polegającej na ustanowieniu, rozwoju, transfekcji i immunohistochemii pierwotnych kultur neuronów hipokampa szczurów oraz fazy późnej poświęconej obrazowaniu próbek.

<table><tbody><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>drobne Duże kleszcze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duże nożyczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>szpatułka Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>preparacyjny z oświetleniem Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>świetlny</tr><tr><td>37 & Stopniach; C Kąpiel</td><td></td><td></td><td></td>wodna</tr><tr>Kaptur <td></td><td></td><td></td>do<td>hodowli komórkowych z przepływem laminarnym</td></tr><tr><td>Wysokotemperaturowy suchy piec</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Palnik</td><td></td><td></td><td></td>Bunsena</tr><tr><td>Inkubator do hodowli komórkowych (5% CO2, 37 & deg; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Wytrząsarka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr> <tr>orbitalna <td></td><td></td><td></td><td>do mikrowirówek</td></tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>Konfiguracja mikroskopu oświetlenia strukturalnego firmy Nikon składająca się z:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop badawczy Nikon Eclipse Ti z systemem</td><td></td><td></td><td></td>Perfect Focus</tr><tr><td>Nikon CFI Apo TIRF 100x soczewka obiektywu olejowego (nie dotyczy. 1.49)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>4 koherentne lasery szafirowe (długość fali wyjściowej 458, 488, 514 i 561 nm)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Oświetlacz</td><td></td><td></td><td></td>SIM</tr><tr><td>Kontroler stolika Nikon Kontroler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>piezoelektryczny <td></td><td></td><td></td><td>MCL Nano-Drive</td></tr><tr><td>Lampa rtęciowa Nikon Intensilight C-HGFIE Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SIM Regulacja</td><td></td><td></td><td></td>temperatury obudowy</tr><tr><td>Kamera iXon DU897 iXon DU897</td><td></td><td></td><td></td></tr> z <tr><td>systemem Microsoft Windows 7 Home Edition Nikon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>' s Pakiet</td><td></td><td></td><td></td>oprogramowania SIM NiS Elements 6.14</tr><tr><td>Olejek</td><td></td><td></td><td></td> immersyjny Nikon typu A</tr></tbody></table>

obrazowanie kolców dendrytycznych pierwotnych neuronów hipokampa szczura za pomocą mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Kolce dendrytyczne są wypukłościami wyłaniającymi się z dendrytu neuronu i reprezentują główne postsynaptyczne cele bodźców pobudzających w mózgu. Postęp technologiczny pozwolił zidentyfikować te struktury jako kluczowe elementy łączności neuronów i plastyczności synaptycznej. Ilościowa analiza morfologii kręgosłupa przy użyciu mikroskopii świetlnej pozostaje istotnym problemem ze względu na ograniczenia techniczne związane z wewnętrzną granicą załamania światła. Kolce dendrytyczne można łatwo zidentyfikować za pomocą konfokalnej laserowej skaningowej mikroskopii fluorescencyjnej. Jednak pomiar subtelnych zmian w kształcie i rozmiarze kolców jest trudny, ponieważ wymiary kręgosłupa inne niż długość są zwykle mniejsze niż konwencjonalna rozdzielczość optyczna ustalona przez teoretyczny limit rozdzielczości mikroskopii świetlnej wynoszący 200 nm.
Kilka ostatnio opracowanych technik super rozdzielczości zostało wykorzystanych do obrazowania struktur komórkowych mniejszych niż 200 nm, w tym kolców dendrytycznych. Techniki te opierają się na klasycznych operacjach w dalekim terenie, a zatem pozwalają na wykorzystanie istniejących metod przygotowania próbki i obrazowanie poza powierzchnią próbki. Opisano tutaj działający protokół zastosowania mikroskopii oświetlenia strukturalnego o wysokiej rozdzielczości (SIM) do obrazowania kolców dendrytycznych w pierwotnych kulturach neuronów hipokampa. Możliwe zastosowania SIM pokrywają się z zastosowaniami mikroskopii konfokalnej. Jednak te dwie techniki mają różne zastosowania. SIM oferuje wyższą efektywną rozdzielczość boczną, podczas gdy mikroskopia konfokalna, dzięki zastosowaniu fizycznego otworu otworkowego, osiąga poprawę rozdzielczości kosztem usunięcia nieostrego światła. W tym protokole neurony pierwotne są hodowane na szklanych szkiełkach nakrywkowych przy użyciu standardowego protokołu, transfekowane plazmidami DNA kodującymi białka fluorescencyjne i obrazowane za pomocą SIM. Cały opisany tu protokół trwa około 2 tygodni, ponieważ kolce dendrytyczne obrazuje się po 16-17 dniach in vitro, kiedy rozwój dendrytyczny jest optymalny. Po zakończeniu działania protokołu, kolce dendrytyczne mogą być rekonstruowane w 3D z serii stosów obrazów SIM za pomocą specjalistycznego oprogramowania.

W niniejszym opracowaniu przedstawiono zestandaryzowany protokół roboczy obrazowania kolców dendrytycznych w pierwotnych neuronach hipokampa szczura in vitro z wykorzystaniem techniki SIM. Schemat protokołu oraz jego kluczowe etapy przedstawiono na Rysunku 1. Całość procedury zajmuje około 2 tygodni pracy eksperymentalnej, podzielonej na pierwszą fazę przygotowania próbek, obejmującą hodowlę, rozwój i transfekcję pierwotnych neuronów hipokampa szczura oraz immunohistochemię, oraz drugą fazę obra...

Ten artykuł opisuje działający protokół obrazowania kolców dendrytycznych z neuronów hipokampa in vitro za pomocą Mikroskopii Iluminacji Strukturalnej (SIM). Mikroskopia superrozdzielcza wykorzystująca SIM zapewnia rozdzielczość obrazu znacznie wykraczającą poza granicę dyfrakcji światła we wszystkich trzech wymiarach przestrzennych, umożliwiając obrazowanie pojedynczych kolców dendrytycznych z większą szczegółowością.

Obrazowanie kolców dendrytycznych pierwotnych neuronów hipokampa szczura za pomocą mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Ogólnym celem tej procedury jest obrazowanie kolców dendrytycznych w superrozdzielczości. Jest to realizowane poprzez przygotowanie w pierwszej kolejności pierwotnej hodowli neuronów hipokampa szczura, a w drugim kroku wizualizację kolców dendrytycznych za pomocą transfekcji GFP i barwienia. Następnie przeprowadzana jest akwizycja obrazów kolców dendrytycznych znakowanych GFP w superrozdzielczości przy użyciu mikroskopu SIM.Ostatnim krokiem jest rekonstrukcja surowych danych obrazowych w formacie 3D, gotowym do dalszej analizy obrazu. Ostatecznie wykorzystano pierwotne neurony hipokampa wykazujące ekspresję GFP, obrazowane w superrozdzielczości, aby wykazać subtelne zmiany w morfologii kolców dendrytycznych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak konwencjonalna mikroskopia konfokalna, jest możliwość bardziej szczegółowego badania morfologii kolców dendrytycznych.Metoda ta może pomóc w badaniu kluczowych, aktualnych zagadnień w neuronauce, takich jak molekularne i farmakologiczne zmiany w kształcie kolców dendrytycznych. Strukturalna mikroskopia emisyjna opiera się na rzutowaniu wzorów liniowych na próbkę, co dostarcza dodatkowych informacji, które mogą zostać wyekstrahowane przez program komputerowy, zapewniając wyjątkowo ostre obrazy i umożliwiając obserwację mitochondriów oraz innych małych struktur w komórce. Wizualna demonstracja tej metody jest istotna, ponieważ w celu uzyskania prawidłowej rekonstrukcji obrazu SIM kluczowe jest przejście przez etapy pozwalające na uzyskanie wysokiej jakości danych surowych.Ważnym krokiem przygotowawczym jest powlekanie szkiełek podstawowych, wykonywane w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza. Za pomocą małej sterylnej pęsety należy umieścić poszczególne szkiełka w pojedynczych studzienkach płytki 12-dołkowej. Następnie do każdej studzienki należy dodać 500 µL roztworu polizyny, aby zanurzyć szkiełka.Po przemyciu dołków należy dodać jeden mililitr medium do wysiewu i pozostawić szkiełka nakrywkowe w inkubatorze do hodowli tkankowej do 24 godzin przed wysiewaniem komórek. Procedura zostanie zademonstrowana przez HU is SH, doktoranta w naszej grupie. Po wyizolowaniu embrionu szczura należy za pomocą precyzyjnej pincety usunąć i odrzucić móżdżek z mózgu.Oddziel dwie półkule, wykonując cięcie strzałkowe wzdłuż linii środkowej pod mikroskopem dissectingowym; za pomocą jednej pary małych pęset delikatnie przytrzymaj śródmózowie, a następnie je usuń. Inną pęsetą pozostaw nienaruszoną pozostałą część półkuli zawierającą korę oraz hipokamp. Następnie ostrożnie usuń opony mózgowe i zorientuj tkankę tak, aby hipokamp był skierowany ku górze.Hipokamp można zidentyfikować po jego charakterystycznej strukturze w kształcie litery C. Za pomocą precyzyjnych pincet wypreparować hipokamp i umieścić go w nowej szalce o średnicy 30 milimetrów zawierającej świeże, schłodzone 1X-H-B-S-S. Po usunięciu hipokampów ze wszystkich embrionów, należy policzyć całkowitą liczbę hipokampów, a następnie pociąć je na małe kawałki.Zebrać fragmenty do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml 1X HBSS. Po odwirowaniu i usunięciu supernatantu dodać 6 µL trypsyny na jeden hipokamp. Po inkubacji i przemyciu fragmentów hipokampa zgodnie z opisem w protokole tekstowym, powoli potrząsać fragmentami 30 razy za pomocą wypalanej pipety Pasteura, aż wszystkie kawałki tkanki zostaną homogenicznie rozproszone do postaci pojedynczych komórek.Należy uważać, aby nie doprowadzić do powstania pęcherzyków powietrza. Następnie należy dodać 5 mL podłoża do wysiewu, uprzednio ogrzanego do 37 °C. Po policzeniu komórek przy użyciu barwienia żywotności trypanem niebieskim, należy wysiać 50 000 komórek na każdą studzienkę płytki 12-studzienkowej w 1 mL podłoża do wysiewu, aby uzyskać objętość całkowitą 2 mL.Po delikatnym potrząśnięciu płytki w celu równomiernego rozłożenia komórek, inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% carbon dioxide. Po dwóch lub trzech dniach zastąp 0,5 mL pożywki do wysiewu pożywką hodowlaną zawierającą 10 µM FUDR. Aby przeprowadzić transfekcję neuronów, dodaj lipektomię.Dodaj kroplami do mieszaniny DNA i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. W komorze z laminarnym przepływem powietrza, na 10 minut przed zakończeniem 30-minutowej inkubacji mieszaniny do lipektomii DNA, przenieś pipetą warunkowaną pożywkę z oryginalnej lub pierwszej płytki hodowlanej do drugiej płytki 12-dołkowej i przechowuj tę płytkę w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% carbon dioxide w pierwszej płytce hodowlanej.Szybko zastąpiono medium warunkujące jednym mililitrem podgrzanego medium inkubacyjnego, aby zapobiec wysychaniu komórek. Obie płytki umieszczono ponownie w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. Po zakończeniu 30-minutowej inkubacji mieszaniny do lipektomii DNA, mieszanina ta jest gotowa do dodania do komórek.Powoli dodaj kroplami 200 µL mieszaniny do lipectomii DNA do każdej studzienki i inkubuj przez 45 minut w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO2. Po 45-minutowej inkubacji użyj małej pęsety, aby podnieść szkiełka podstawowe z neuronami. Przepłucz je, zanurzając w naczyniu o średnicy 3 cm zawierającym świeżą, ciepłą pożywkę neurobasal, a następnie umieść je w studzience.Do drugiej płytki 12-dołkowej zawierającej pożywkę warunkującą. Następnie inkubować transfekowane neurony w temperaturze 37°C, przy 5% carbon dioxide przez 48 godzin. W celu przygotowania do immunobarwienia ostrożnie odessać pożywkę z dołków zawierających szkiełka podstawowe.Następnie ostrożnie dodaj 500 µL ciepłego 4% PFA, aby zapobiec uszkodzeniu dendrytów. Po inkubacji i przemyciu komórek przeprowadź blokowanie w 1% roztworze T-B-S-B-S-A w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po ponownym przemyciu dodaj przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w buforze inkubacyjnym, wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Następnie inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C przy delikatnym wstrząsaniu.Następnego ranka usunąć przeciwciało pierwszorzędowe i ponownie przemyć; od tego momentu chronić szkiełka podstawowe przed światłem. Następnie dodać wtórne przeciwciało znakowane fluorescencyjnie, rozcieńczone w buforze do inkubacji. Wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.Następnie usuń przeciwciało wtórne i przemyj komórki za pomocą precyzyjnej pęsety. Wyjmij szkiełka nakrywowe z dołków i osusz nadmiar TBS za pomocą chusteczki. Na koniec zamocuj szkiełka nakrywowe, używając medium montażowego, i zabezpiecz lakierem do paznokci.Aby rozpocząć obrazowanie SIM, włącz laser o długości fali 488 nanometrów, lampę rtęciową, sterownik stolika, sterownik piezoelektryczny oraz lampę halogenową do światła przechodzącego. Uruchom oprogramowanie SIM w trybie nsim. Po nałożeniu kropli oleju imersyjnego na obiektyw upewnij się, że w kropli oleju nie ma pęcherzyków powietrza.Umieść szkiełko przykrywowe z neuronami hipokampa na stoliku mikroskopu. Przesuwaj obiektyw w górę, aż olej dotknie próbki. Pamiętaj, aby podczas procedury akwizycji przykryć stolik, aby chronić próbkę przed światłem zewnętrznym, oraz maksymalnie przyciemnić światło w pomieszczeniu.W oprogramowaniu SIM wybierz konfigurację optyczną IFI, a następnie wybierz pusty blok filtrów inter w celu wizualnej inspekcji z ustawieniem światła białego i ustawieniem ostrości próbki. Następnie wyłącz światło białe i włącz lampę rtęciową. Otwórz migawkę i wybierz zielony filtr, aby odnaleźć wystarczająco jasny dendryt.Po znalezieniu wystarczająco jasnego, interesującego dendrytu i wycentrowaniu wybranego segmentu w polu widzenia, należy zamknąć migawkę. W oprogramowaniu ustaw konfigurację optyczną na 3D SIM 4 88, a ustawienia kamery w następujący sposób. Ustaw tryb odczytu na em.Ustaw wzmocnienie na 1 MHz 16 bit. Ustaw czas ekspozycji na 100 ms. Ustaw moc lasera na 5%. Ustaw wzmocnienie EM na 200.Ustawiając prędkość ostrzenia na poziom bardzo precyzyjny, ustaw ostrość na badanym obiekcie. Szybko dostosuj ustawienia kamery w następujący sposób. Aby uzyskać wartość intensywności między 30 040 a 5 000, ustaw moc lasera w zakresie od 0% do 20%. Ustaw czas ekspozycji od 50 milisekund do dwóch sekund.Ustaw tryb odczytu na em. Wzmocnienie jeden megahertz 16 bit. Ustaw wzmocnienie EM w zakresie od zero do 300.Ustaw wzmocnienie konwersji (conversion gain) w zakresie od 1x do 5,1x. Ustaw format obrazu na żywo na „no binning”. Ustaw format przechwytywania obrazu na „no binning”.Następnie w panelu sekwencji ND skonfiguruj ustawienia trzech stosów DZ w następujący sposób: ustaw zakres na 2 µm. Ustaw wielkość kroku na 120 nm i kliknij pozycję początkową (home position). Następnie w sekcji lambda wybierz konfigurację optyczną 3D SIM 4 88.Po wybraniu 3D SIM jako trybu akwizycji, przeprowadź akwizycję sekwencji ND i zapisz surowe dane. Przedstawione są tutaj dendryty i kolce dendrytyczne obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej i SIM. Akwizycje zostały zrekonstruowane z obrazów konfokalnych i SIM. Dendryty zostały obrysowane, a kolce sklasyfikowane automatycznie za pomocą oprogramowania po dostrojeniu głównych parametrów, takich jak długość szyjki, średnica szyjki i średnica główki.Obszary w ramkach przedstawiają pojedynczą kolbę dendrytyczną obrazowaną za pomocą mikroskopii konfokalnej i mikroskopii SIM oraz zrekonstruowaną z odpowiadających im stosów Z, co obrazuje różnice w rozdzielczości i dokładności wynikających rekonstrukcji 3D. Dzięki wyższej rozdzielczości SIM, analiza ilościowa średnic główki i szyjki wykazała, że mikroskopia SIM mierzy znacznie mniejsze wymiary niż mikroskopia konfokalna dla tych samych kolb dendrytycznych, co wskazuje, że SIM jest w stanie wykryć mniejsze zmiany w morfologii kolb dendrytycznych. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest pamiętanie o pozyskiwaniu surowych obrazów wysokiej jakości, aby uzyskać bardziej wiarygodną późniejszą rekonstrukcję tego samego obrazu.Mikroskopia z ustrukturyzowanym oświetleniem może być również skuteczna w obrazowaniu żywych komórek, umożliwiając badanie dynamiki takich komórek jak komórki HeLa, neurony czy bakterie E. coli. Po obejrzeniu tego filmu widz powinien dobrze zrozumieć, jak przygotować, wizualizować i obrazować standardowe preparaty z pierwotnych neuronów hipokampa w superrozdzielczości.

imaging-dendritic-spines-rat-primary-hippocampal-neurons-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Obrazowanie kolców dendrytycznych pierwotnych neuronów hipokampa szczura za pomocą mikroskopii z oświetleniem strukturalnym

Liczne niedawne badania zidentyfikowały mutacje w białkach synaptycznych powiązanych z patologiami mózgu. Pierwotne hodowle neuronów korowych zapewniają dużą elastyczność w badaniu wpływu tych białek związanych z chorobami na morfologię i ruchliwość kolców dendrytycznych.

Analiza morfologii kolców dendrytycznych w hodowlanych neuronach OUN

Źródło: Pekarek, B. T., et. al., Obrazowanie i kwantyfikacja nienaruszonych dendrytów neuronalnych za pomocą oczyszczania tkanek CLARITY. J. Vis. Exp. (2021)W tym filmie pokazujemy przygotowanie, obrazowanie i analizę oczyszczonego mózgu myszy w celu zbadania dendrytycznych altan dendrytycznych, morfologii kręgosłupa i rozmieszczenia neuronów przy użyciu mikroskopii konfokalnej i technik rekonstrukcji 3D.

Obrazowanie mikroskopem konfokalnym nienaruszonych altan dendrytycznych i morfologii kręgosłupa w oczyszczonym mózgu myszy

Źródło: Gouder, et. al. Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2015).Ten film przedstawia obrazowanie i analizę kolców dendrytycznych w transdukowanych, znakowanych immunologicznie neuronach piramidowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Szum tła jest redukowany, a dendryty są śledzone, szacując ich średnicę i długość. Automatyczna segmentacja kręgosłupa polega na...

Kwantyfikacja kolców dendrytycznych za pomocą obrazowania w mikroskopii konfokalnej

Obrazowanie poklatkowe u żywego zwierzęcia dostarcza cennych informacji na temat reorganizacji strukturalnej w nienaruszonym mózgu. Tutaj wprowadzamy preparat z rozcieńczoną czaszką, który umożliwia przezczaszkowe obrazowanie znakowanych fluorescencyjnie struktur synaptycznych w żywej korze myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo kolców dendrytycznych w korze myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką

Opisujemy dwie metody wizualizacji i kwantyfikacji arboryzacji dendrytycznej w hipokampie modeli mysich: obrazowanie w czasie rzeczywistym i rozszerzoną głębię ostrości. Podczas gdy pierwsza metoda pozwala na zaawansowane śledzenie topograficzne i ilościowe określenie zakresu rozgałęzień, druga pozwala na szybką wizualizację drzewa dendrytycznego.

Ocena arboryzacji dendrytycznej w zakręcie zębatym okolicy hipokampa u myszy

Dendrytyczne kolce neuronów piramidowych są miejscami najbardziej pobudzających synaps w korze mózgowej ssaków. Metoda ta opisuje ilościową analizę 3D morfologii kręgosłupa w ludzkich korowych piramidowych neuronach glutaminergicznym pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ta metoda opisuje chroniczne przygotowanie, które umożliwia optyczny dostęp do hipokampa żywych myszy. Preparat ten może być stosowany do wykonywania podłużnego obrazowania optycznego plastyczności strukturalnej neuronów i plastyczności komórkowej wywołanej aktywnością przez okres kilku tygodni.

Podłużne obrazowanie dwufotonowe grzbietowego hipokampa CA1 u żywych myszy

Ten protokół pokazuje, jak wykorzystać mikroskopię superrozdzielczą do badania kolokalizacji białek w pierwotnych kulturach neuronalnych.

Obrazowanie superrozdzielcze w celu zbadania kolokalizacji białek i markerów synaptycznych w neuronach pierwotnych

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa (SBEM) jest stosowana do obrazowania i analizy kolców dendrytycznych w mysim hipokampie.

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa typu block-face (SBEM) do badania kolców dendrytycznych

Obecny protokół opisuje metodę wizualizacji i pomiaru pierścieni aktynowych i innych składników okresowego szkieletu błony początkowego segmentu aksonu przy użyciu hodowanych neuronów hipokampa szczura i mikroskopii iluminacyjnej o strukturze 3D (3D-SIM).

Pomiar właściwości okresowego szkieletu błonowego początkowego segmentu aksonu przy użyciu mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (3D-SIM)

Protokół opisuje modyfikację szybkiej metody Golgiego, która może być dostosowana do dowolnej części układu nerwowego, do barwienia neuronów w hipokampie i przyśrodkowej korze przedczołowej szczura.

Szybkie barwienie Golgiego do wizualizacji dendrytycznego kręgosłupa w hipokampie i korze przedczołowej

Poznaj technikę obrazowania kolców dendrytycznych neuronów hipokampa szczura za pomocą mikroskopii SIM. Ta superrozdzielcza metoda umożliwia szczegółową analizę morfologii synaptycznej w neurobiologii.

Obrazowanie kolców dendrytycznych pierwotnych neuronów hipokampa szczura za pomocą mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Przeglądaj więcej filmów