Obrazowanie kolców dendrytycznych pierwotnych neuronów hipokampa szczura za pomocą mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Ogólnym celem tej procedury jest zobrazowanie kolców dendrytycznych w super rozdzielczości. Osiąga się to, najpierw przygotowując pierwotny hipokamp szczura, drugim krokiem jest wizualizacja kolców dendrytycznych za pomocą transfekcji i barwienia GFP. Następnie akwizycja kolców dendrytycznych oznaczonych GFP odbywa się w super rozdzielczości za pomocą mikroskopu SIM.

Ostatnim krokiem jest rekonstrukcja surowych danych obrazu do 3D gotowych do późniejszej analizy obrazu. Ostatecznie GFP wyrażający pierwotne neurony hipokampa zobrazowane w super rozdzielczości jest wykorzystywany do pokazania subtelnych zmian w morfologii kolców dendrytycznych. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak konwencjonalna mikroskopia konfokalna, jest to, że pozwala ona na bardziej szczegółowe badanie morfologii kolców dendrytycznych.

Metoda ta może pomóc w zbadaniu kluczowych bieżących pytań w neurobiologii, takich jak molekularne i farmakologiczne zmiany zależne w kształcie kolców dendrytycznych. Mikroskopia eliminacji strukturalnej opiera się na rzutowaniu wzorów liniowych na próbkę, a to daje dodatkowe informacje, które można wyodrębnić za pomocą programu komputerowego i daje bardzo ostre obrazy, a także pozwala spojrzeć na mitochondria MI i inne małe struktury w komórce. Wizualna demonstracja tej metody jest ważna, aby uzyskać prawidłową rekonstrukcję obrazu karty SIM, ważne jest, aby przejść przez kroki, które zapewniają dobrą jakość surowych danych.

Ważnym etapem przygotowawczym jest powlekanie szkiełek nakrywkowych, praca w sterylnym kapturze laminarnym. Użyj małych sterylnych kleszczyków, aby umieścić poszczególne szkiełka nakrywkowe w pojedynczych dołkach płytki 12-dołkowej. Następnie dodaj 500 mikrolitrów roztworu polilizyny do każdej studzienki, aby zanurzyć szkiełka nakrywkowe.

Po umyciu studzienek dodać jeden mililitr podłoża galwanicznego i pozostawić szkiełka przykrywkowe w inkubatorze do hodowli tkankowych do 24 godzin przed posiewem komórek. Procedura zostanie zademonstrowana przez HU is SH, doktoranta w naszej grupie. Po wyizolowaniu zarodka szczura użyj cienkich kleszczy, aby usunąć i wyrzucić móżdżek z mózgu.

Oddziel dwie półkule, wykonując strzałkowe cięcie wzdłuż linii środkowej pod mikroskopem preparacyjnym, użyj jednej pary małych kleszczy, aby delikatnie przytrzymać śródmózgowie i usunąć śródmózgowie. Za pomocą kolejnej pary kleszczy pozostaw nienaruszoną pozostałą część półkuli zawierającą korę i hipokamp. Następnie ostrożnie usuń opony mózgowe, zmień orientację tkanki tak, aby hipokamp był skierowany do góry.

Hipokamp można rozpoznać po charakterystycznej strukturze w kształcie CS. Za pomocą cienkich kleszczy wypreparuj hipokamp i umieść go w nowym 30-milimetrowym naczyniu zawierającym świeży zimny X-H-B-S-S. Po usunięciu hipopotama campi ze wszystkich zarodków, policz całkowitą liczbę hippo campi, a następnie pokrój je na małe kawałki.

Zbierz kawałki w 15-mililitrowej probówce wirówkowej zawierającej trzy mililitry jednego X-H-B-S-S. Po odwirowaniu i usunięciu supernatantu dodaj sześć mikrolitrów trypsyny na hipokamp. Po inkubacji i umyciu fragmentów hipokampa zgodnie z opisem w protokole tekstowym, powoli tnij fragmenty 30 razy za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety pastora, aż wszystkie kawałki tkanki zostaną jednorodnie rozproszone w pojedynczych komórkach.

Uważaj, aby nie dopuścić do bulgotania. Następnie dodaj pięć mililitrów podłoża galwanicznego, wstępnie ostrzeżonego do 37 stopni Celsjusza. Po zliczeniu komórek za pomocą trianowego niebieskiego nasiona barwiącego żywotne, 50 000 komórek na dołek 12, płytki dołkowej w jednym mililitrze podłoża galwanowego, co daje całkowitą objętość dwóch mililitrów.

Po rozkołysaniu płytki w celu równomiernego rozprowadzenia komórek, inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla. Po dwóch do trzech dniach zastąp 0,5 mililitra pożywki galwanicznej pożywką hodowlaną zawierającą 10 mikromolowych FUDR. Aby przetransfekować, neurony dodają lipektomię.

Wymieszaj kroplami do mieszanki DNA A i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. W kapturze z przepływem laminarnym, 10 minut przed końcem 30-minutowej mieszaniny lipektomii DNA, inkubacji, pipetować kondycjonowaną pożywkę z pierwotnej lub pierwszej płytki hodowlanej do drugiej 12. Dobrze utrzymuj płytkę i przechowuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla na pierwszej płytce hodowlanej.

Szybko zamieniono kondycjonowaną pożywkę na jeden mililitr wstępnie podgrzanej pożywki inkubacyjnej, aby zapobiec wysychaniu komórek. Umieść obie płytki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla. Pod koniec 30-minutowej inkubacji lipektomii DNA mieszanina lipektomii DNA jest gotowa do dodania do komórek.

Delikatnie dodaj kroplami 200 mikrolitrów mieszanki lipektomii DNA do każdej studzienki i inkubuj przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla. Po 45-minutowej inkubacji użyj małych kleszczy, aby podnieść szkiełka nakrywkowe przytrzymujące neurony. Opłucz je, zanurzając je w trzycentymetrowym naczyniu zawierającym świeże, ciepłe podłoże neuropodstawowe i umieść w studzience.

W drugiej 12-studzienkowej płytce zawierającej kondycjonowane podłoże. Następnie inkubuj transfekowane neurony w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez 48 godzin. Aby przygotować się do barwienia immunologicznego, należy delikatnie zassać podłoże z dołków zawierających szkiełka nakrywkowe.

Następnie ostrożnie dodaj 500 mikrolitrów ciepłego 4% PFA, aby zapobiec uszkodzeniu dendrytów. Po inkubacji i umyciu bloku komórek 1% roztworem T-B-S-B-S-A w temperaturze pokojowej przez 30 minut po ponownym umyciu, dodać przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w inkubacji, wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając.

Następnego ranka usuń przeciwciało pierwszorzędowe i ponownie umyj od tego miejsca, chroń szkiełka nakrywkowe przed światłem. Następnie dodaj drugorzędowe fluorescencyjne sprzężone przeciwciało rozcieńczone w inkubacji. Wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.

Następnie usuń przeciwciało wtórne i umyj komórki za pomocą cienkiej pęsety. Usuń szkiełka pokrywy ze studzienek i osusz nadmiar TBS chusteczką. Na koniec zamontuj szkiełka nakrywkowe za pomocą medium montażowego i uszczelnij lakierem do paznokci.

Aby rozpocząć obrazowanie karty SIM, włącz laser 488 nanometrów, lampę rtęciową, kontroler stage, kontroler pizo i lampę halogenową dla światła przechodzącego. Uruchom oprogramowanie SIM w trybie i lub dla nsim. Po nałożeniu kropli olejku immersyjnego na obiektyw sprawdź, czy w kropli oleju nie ma pęcherzyków powietrza.

Umieść szkiełko nakrywkowe z neuronami hipokampa na stoliku mikroskopu. Przesuń obiektyw do góry, aż olej dotknie próbki. Pamiętaj, aby podczas procedury akwizycji założyć osłonę na stolik, aby chronić próbkę przed światłem otoczenia i maksymalnie przyciemnić światło w pomieszczeniu.

W oprogramowaniu SIM wybierz konfigurację optyczną IFI i wybierz pusty blok filtra między jednym do kontroli wizualnej z ustawieniem światła białego ostrości próbki. Następnie wyłącz białe światło i włącz lampę rtęciową. Otwórz migawkę i wybierz zielony filtr, aby wyszukać wystarczająco jasny dendryt.

Po napotkaniu wystarczająco jasnego dendrytu zainteresowania i wyśrodkowaniu interesującego segmentu w polu widzenia, zamknij migawkę. Ustaw oprogramowanie na konfigurację optyczną 3D SIM 4 88, a ustawienia aparatu w następujący sposób. Ustaw tryb odczytu na em.

Zyskaj jeden megaherc 16 bitów. Ustaw czas ekspozycji na 100 milisekund. Ustaw moc lasera na 5%Ustaw wzmocnienie EM na 200.

Po ustawieniu bardzo precyzyjnej szybkości ustawiania ostrości ustaw ostrość na interesującym Cię obiekcie. Szybko dostosuj ustawienia aparatu w następujący sposób. Aby uzyskać wartość intensywności z zakresu 30 040 5 000, ustaw moc lasera na 0% do 20%Ustaw czas ekspozycji na 50 milisekund do dwóch sekund.

Ustaw tryb odczytu na em. Zyskaj jeden megaherc 16 bitów. Ustaw wzmocnienie EM na zero do 300.

Ustaw wzmocnienie konwersji na jeden x na 5,1 x. Ustaw format dla live na brak Benninga. Ustaw format przechwytywania na brak Benninga.

Następnie skonfiguruj ustawienia stosu trzech DZ w panelu sekwencji ND w następujący sposób, ustaw zakres na dwa mikrony. Ustaw rozmiar kroku na 120 nanometrów i kliknij pozycję początkową. Następnie wybierz konfigurację optyczną, 3D SIM 4 88 w sekcji lambda.

Po wybraniu 3D SIM jako trybu akwizycji, uruchom akwizycję sekwencji ND i zapisz surowe dane, które dendryty i kolce dendrytyczne obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej i sim są pokazane tutaj. Akwizycje zrekonstruowano na podstawie obrazów konfokalnych i SIM. Dendryty zostały prześledzone, a kolce zostały sklasyfikowane automatycznie za pomocą oprogramowania po dostosowaniu głównych parametrów, takich jak długość szyi, średnica szyi i średnica głowy.

Obszary ramkowe pokazują pojedynczy kręgosłup dendrytyczny zobrazowany za pomocą mikroskopii konfokalnej i mikroskopii sim oraz zrekonstruowany z odpowiadających im stosów Z, przedstawiając różnice w rozdzielczości i dokładności powstałych rekonstrukcji 3D. Zgodnie z SIM, wyższa rozdzielczość, analiza ilościowa zarówno średnicy głowy, jak i szyi wykazała, że mikroskopia SIM mierzy znacznie mniejsze wymiary niż mikroskopia konfokalna dla tych samych kolców dendrytycznych, co wskazuje, że SIM jest w stanie wykryć mniejsze zmiany w morfologii kolców dendrytycznych. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o pozyskaniu surowych obrazów o wysokiej jakości, aby uzyskać bardziej wiarygodną późniejszą rekonstrukcję tego samego obrazu.

Mikroskopia oświetlenia strukturalnego może być również skuteczna w obrazowaniu żywych komórek, umożliwiając badanie dynamiki komórek, takich jak komórki hela, neurony lub bakterie E. coli. Po obejrzeniu tego filmu należy dobrze zrozumieć, jak przygotować, zwizualizować i obrazować standardowe wyjaśnienia z pierwotnych neuronów hipokampa w super rozdzielczości.