Name: Tworzenie modelu in vitro bariery krew-mózg szczura (BBB): skupienie się na nieprzepuszczalności bariery krew-mózg i transporcie za pośrednictwem receptorów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 26 s
Description: Poznaj metodę tworzenia modelu in vitro bariery krew-mózg szczura z wykorzystaniem współkultury komórek śródbłonowych i astrocytów. Model ten charakteryzuje się wysoką rezystancją elektryczną i niską przepuszczalnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie finansowe dla VECT-HORUS jest potwierdzone przez Fonds Unique Interministériel (projekt FUI/ MEDUL) oraz dla VECT-HORUS i laboratorium UMR7259 przez Agence Nationale de la Recherche (wspólne projekty ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, ADHOC i PREVENTAD). Laboratorium UMR7259 dziękuje również za wsparcie finansowe ze strony CNRS i Uniwersytetu w Aix-Marsylii.

1. Produkcja astrocytów szczurów
Do każdego przygotowania użyj 10 nowonarodzonych szczurów rasy Wistar dowolnej płci.
<ol>
	<li>Złóż szczury w ofierze, obcinając głowy nożyczkami i natychmiast przenieś je na suchą szalkę Petriego pod kapturem z przepływem laminarnym. Usunąć mózgi z czaszki bez móżdżku i natychmiast przenieść je na szalkę Petriego zawierającą zimny bufor preparacyjny: HBSS uzupełniony 1% albuminą surowicy bydlęcej (niski poziom endotoksyny BSA), penicyliną 100 jednostek/ml i streptomycyną 100 μg/ml.</li>
	<li>Przetnij mózgi na pół, aby oddzielić 2 półkule mózgowe i przenieś je na czystą szalkę Petriego z buforem preparacyjnym na lodzie. Przeciąć nerw wzrokowy i usunąć opony mózgowe pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Dokładnie umyć kawałki kory mózgowej w 50 ml zimnego buforu do preparacji.</li>
	<li>Umieścić kawałki kory mózgowej z 3 mózgów w 15 ml probówce Falcon i rozdzielić przez kilkakrotne pipetowanie w górę i w dół za pomocą jednorazowej pipety o pojemności 10 ml wyposażonej w niebieską końcówkę do 6 ml trypsyny 0,05% - EDTA 0,02% przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 24 ml DMEM uzupełnionego 10% FBS i następującymi antybiotykami, penicyliną 100 jednostek/ml i streptomycyną 100 μg/ml, pożywkę zwaną pożywką dla komórek glejowych (GCM) i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w RT. Partie FBS zostały wybrane i zatwierdzone pod kątem wzrostu i przeżycia naskórków astrocytów.</li>
	<li>Zawiesić osad zawierający zdysocjowane komórki w 10 ml GCM i rozmieścić w kolbie T o średnicy 75cm2 (T75). Zmień pożywkę następnego dnia, aby usunąć resztki komórek i DNA. Wymieniaj pożywki hodowlane dwa razy w tygodniu.</li>
	<li>Po 1 tygodniu proliferacji delikatnie wstrząsnąć komórkami glejowymi wytrząsarką orbitalną z prędkością 60 obr./min przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w GCM. Jeśli T75 nie może być umieszczony w inkubatorze z 5% CO2 / 95% powietrzem w wilgotnej atmosferze 37 °C, uzupełnij pożywkę 5 mM HEPES. Umyj komórki dwukrotnie, aby usunąć nieprzylegające komórki mikrogleju.</li>
	<li>Trzy tygodnie po wysianiu przemyj komórki dwukrotnie DPBS bez wapnia i magnezu. Dodać 3 ml ciepłej trypsyny 0,05%-EDTA 0,02%, inkubować w temperaturze 37 °C i czekać, aż warstwa komórkowa się rozproszy (zwykle 5 min). Zahamować aktywność trypsyny przez dodanie 10 ml GCM, przenieść zawiesinę komórkową do 15 ml probówki Falcona i odwirować przy 120 x g przez 8 min.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad astrocytów w 90% FBS – 10% DMSO, przenieść je do kriowiali (2 x 106 komórek na kriowial) i przechowywać w ciekłym azocie.</li>
</ol>
2. Izolacja mikronaczyń mózgu szczura
Nasze procedury eksperymentalne są zatwierdzone przez Komisję Etyki Wydziału Medycznego w Marsylii i są zgodne z krajowymi i europejskimi przepisami (dyrektywa UE nr 86/609). Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie zwierząt i zmniejszyć liczbę wykorzystywanych zwierząt.
<ol>
	<li>Do każdego preparatu i dla jednego eksperymentatora użyj 3 pięciotygodniowych szczurów rasy Wistar.</li>
	<li>W poniedziałek pierwszego tygodnia przygotować 2 kolby T75, pokrywając je kolagenem typu IV i fibronektyną, w stężeniu 1 μg/cm2 w sterylnej wodzie hodowlanej (10 ml na T75). Pozostawić do przylegania w temperaturze 37 °C do momentu wysiewu mikronaczyń.</li>
	<li>W środę rano pierwszego tygodnia poddać szczury eutanazji pod wpływem rosnącego strumienia CO2 w celu wywołania senności, utraty postawy i przerwy w oddychaniu, a następnie zwichnięcia szyjki macicy. Spryskaj głowice 70% etanolem. Odetnij głowy nożyczkami i przenieś je na suchą szalkę Petriego pod okapem z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Usunąć mózgi z czaszki bez móżdżku i nerwów wzrokowych, a następnie przenieść je na szalkę Petriego schłodzoną na lodzie i wypełnioną zimnym buforem preparacyjnym (HBSS uzupełniony 1% BSA, penicylina 100 jednostek/ml i streptomycyna 100 μg/ml).</li>
	<li>Przetnij mózgi na pół, aby oddzielić 2 półkule mózgowe i oddzielić śródmózgowie od przodomózgowia. Przenieś przodomózgowie na czystą szalkę Petriego na lodzie z buforem preparacyjnym.</li>
	<li>Weź kilka półkul na nowej szalce Petriego z zimnym buforem preparacyjnym, aby ostrożnie usunąć opony mózgowe z przodomózgowia pod mikroskopem stereoskopowym z zakrzywionymi kleszczami nr 5. Następnie oczyść wnętrze mózgu, aby usunąć kołdrę z mieliny i uzyskać powłokę kory. Te kroki nie powinny zająć więcej niż 2 godziny w celu zachowania tkanek i przeżycia komórek.</li>
	<li>Odciąć korę mózgową od 3 mózgów do 6 ml zimnego buforu rozwarstwiającego w homogenizatorze o pojemności 7 ml przez 10 ruchów w górę iw dół każdym z 2 tłuczków o różnych odstępach, 71 μm, a następnie 20 μm.</li>
	<li>Podzielić zawiesinę w celu uzyskania ekwiwalentu 1 kory w 1 ml probówki Falcon o pojemności 50 ml i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić sklarowany szwaczek.</li>
	<li>Trawić zawiesinę z 1 kory za pomocą 1 ml roztworu enzymatycznego zawierającego mieszaninę kolagenaz / dypazy (60 μg/ml – 0,3 U/ml), DNazy typu I (35 μg/ml – 20 K jednostek/ml) i gentamycyny (50 μg/ml) w wytrząsarce przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zmieszać 1 ml roztworu trawionego z 1 kory mózgowej z 10 ml 25 % BSA/HBSS 1X i rozdzielić przez odwirowanie zależne od gęstości przy 3 600 x g przez 15 minut w temperaturze suchej masy. Ostrożnie przenieść górny krążek (mielinę i miąższ mózgu) oraz supernatant do czystej probówki Falcona o pojemności 50 ml i powtórzyć wirowanie. Powstałą osadkę zawierającą mikronaczynia mózgowe przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie wyrzuć górny dysk i supernatant. Zawiesić oba powstałe granulki zawierające mikronaczynia mózgowe za pomocą 1 ml zimnego HBSS 1X i przenieść do czystej probówki Falcon o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Przemyć mikronaczynia przez dodanie 20 ml zimnego HBSS 1X i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Dalej trawić mikronaczynia z 1 kory za pomocą 1 ml tego samego roztworu enzymatycznego, jak opisano w kroku 2.9, przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w shakerze.</li>
	<li>Następnie wymieszaj strawione mikronaczynia z każdej z 3 kory w jednej probówce, a następnie rozdziel na dwie probówki Falcon o pojemności 50 ml, aby uzyskać mikronaczynia wyekstrahowane z odpowiednika półtorej (1,5) kory na probówkę. Dodać 30 ml zimnego buforu do rozwarstwiania i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zawiesić osad mikronaczyniowy w 10 ml DMEM/F12 uzupełnionego 20% surowicą pochodzącą z osocza bydła ubogiego w płytki krwi, zasadowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF, 2 ng/ml), heparyną (100 μg/ml), gentamycyną (50 μg/ml) i HEPES (2,5 mM), nazwaną pożywką z komórek śródbłonka (ECM) uzupełnioną puromycyną w stężeniu 4 μg/ml.</li>
	<li>Pobrać 2 powlekane kolby T75 z inkubatora, odessać nadmiar powłoki i umieścić mikronaczynia z każdej probówki w jednej kolbie T75 (mikronaczynia wyekstrahowane z 1,5 kory na kolbę T75).</li>
</ol>
3. Oczyszczanie i rozprzestrzenianie prymokultur RBEC
<ol>
	<li>Oczyszczanie: Od środy do piątku dodać puromycynę w ilości 4 μg/ml do pożywki hodowlanej. Zmień medium w czwartek. W piątek umyj komórki i dodaj puromycynę w ilości 2 μg/ml do poniedziałku.</li>
	<li>Proliferacja: w poniedziałek drugiego tygodnia umyj komórki i dodaj insulinę, transferynę i suplement seleninu sodu do pożywki, aż kultury osiągną 90% zbieżności w środę drugiego tygodnia.</li>
</ol>
4. Różnicowanie: Ustawianie modelu BBB In Vitro
<ol>
	<li>W poniedziałek drugiego tygodnia przygotuj filtry (polietylen, 12 studzienek, wielkość porów 1,0 μm), pokrywając mieszanką kolagenu typu IV i fibronektyny w ilości 0,5 μg /cm2 w sterylnej wodzie hodowlanej (500 μl mieszanki w górnej komorze i 1,5 ml sterylnej wody hodowlanej w dolnej komorze). Pozostawić do przylegania w temperaturze 37 °C do wysiewu RBEC.</li>
	<li>W poniedziałek drugiego tygodnia, pięć dni przed ustanowieniem kokultury, rozmrozić astrocyty z kriowiali w temperaturze 37 °C i przenieść do 15 ml Falcona z 10 ml GCM. Odwirować zawiesinę o sile 120 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad astrocytów w GCM i płytce o gęstości 30 x 103 komórki na cm, 2 w płytkach 12-dołkowych.</li>
	<li>W środę drugiego tygodnia, tuż przed dysocjacją RBEC z trypsyną, należy dwukrotnie przemyć wstępnie pokryty filtr pożywką DMEM/F12. Wstępnie napełnij komory ECM: 1,5 ml w dolnej komorze i 0,5 ml w górnej komorze.</li>
	<li>W środę drugiego tygodnia przemyj dwukrotnie RBEC DPBS bez wapnia i magnezu. Dodać 4 ml ciepłego roztworu trypsyny 0,05% - EDTA 0,02% o temperaturze 37 °C na kolbę T75 dokładnie przez 30 sekund. Następnie usuń 3,5 ml roztworu trypsyny i obserwuj pod mikroskopem. Kiedy warstwa komórek zacznie odłączać się od matrycy, pomóż im, delikatnie stukając w krawędź kolby T75, aż wszystkie komórki zaczną się unosić.</li>
	<li>Dodać 9 ml ECM do kolby T75 i przenieść do 15 ml probówki Falcon. Bardzo delikatnie rozdzielić zawiesinę komórek, pipetując 4 razy w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml wyposażonej w żółtą końcówkę (unikać tworzenia się pęcherzyków w roztworze). Policz komórki w zawiesinie (około 3 x 106 komórek/T75) i natychmiast pokryj je wstępnie pokrytymi i wstępnie napełnionymi filtrami o dużej gęstości (160 x 10,3 ogniwa/filtr, a więc około 18 filtrów/T75) (Rysunek 8). Następnego dnia (czwartek) zmień dwukrotnie pożywkę górnej komory, aby usunąć resztki komórek.</li>
	<li>W czwartek drugiego tygodnia, dzień przed ustanowieniem kohodowli, zastąp pożywkę do hodowli astrocytów 1,5 ml pożywki różnicującej (ECM z hydrokortyzonem przy 500 nM), którą można uzupełnić 1/3 kondycjonowanej pożywki z podstawnego przedziału poprzedniej kokultury (3 dni kontaktu między komórkami śródbłonka a astrocytami).</li>
	<li>Piątek drugiego tygodnia definiuje się jako dzień 0 różnicowania; pożywki hodowlane z filtrów zawierających RBEC zastąpić pożywką różnicującą. Przenieś filtry RBEC do studzienek zawierających astrocyty. W tych warunkach modele in vitro różnicują i wyrażają białka związane z połączeniami w ciągu 3 dni.</li>
	<li>Modele zachowują swoje optymalne zróżnicowanie przez kolejne 3 dni, między poniedziałkiem a środą trzeciego tygodnia.</li>
</ol>

Michel Khrestchatisky jest dyrektorem laboratorium UMR7259, współzałożycielem i doradcą naukowym firmy biotechnologicznej VECT-HÓRUS.

Opisujemy wdrożenie cotygodniowego powtarzalnego protokołu izolacji i posiewu mikronaczyń mózgowych, po oczyszczeniu i hodowli RBEC oraz dalszym tworzeniu kokultur z pierwotnymi astrocytami szczurów w celu wygenerowania modelu BBB in vitro o charakterystycznych właściwościach BBB.
Pomyślne ustanowienie standaryzowanych kultur BBB in vitro wymaga optymalnych warunków w wielu kolejnych etapach procesu. Model został (a) zoptymalizowany w celu uzyskania najniższej przepuszczalności parakomórkowej, która pozostaje "Świętym Graalem" modeli BBB in vitro , oraz (b) zwalidowany pod kątem mechanizmów wypływu i RMT.
Produkcja, oczyszczanie i proliferacja RBEC
Największym wyzwaniem podczas uprawy RBEC jest osiągnięcie odtwarzalności między różnymi kulturami. Standaryzacja protokołu wymaga wysokiej jakości narzędzi do preparacji, wysokiej jakości odczynników i przestrzegania dat ważności odczynników. Eksperymentator musi być biegły w mikropreparowaniu pod mikroskopem stereoskopowym w celu szybkiego usunięcia opon mózgowych i dużych naczyń z powierzchni kory. Po wyizolowaniu i mechanicznej dysocjacji mózgów jednym z głównych wyzwań jest optymalne trawienie enzymatyczne świeżo wyizolowanych mikronaczyń mózgowych. Rodzaj i jakość użytych enzymów ma kluczowe znaczenie. Zastosowano mieszaninę kolagenaz typu I i II oraz dypazy w wysokim stężeniu o małej zmienności między partiami. Ważny jest również czas trwania trawienia enzymatycznego oraz stosunek stężenia enzymu do masy tkanki i objętości trawienia. Najlepszą wydajność produkcji mikronaczyń mózgowych uzyskano przy użyciu odpowiednika kory mózgowej z 1 mózgu w 1 ml kolagenazy / mieszanki dispazy w stężeniu 60 μg/ml podczas obu trawień, odpowiednio 30 min i 1 godz.
Kluczowe jest również eliminowanie komórek zanieczyszczających (astrocytów i głównie perycytów). Komórki te namnażają się szybciej niż komórki śródbłonka i nie tworzą ścisłych połączeń z tymi ostatnimi, zapobiegając w ten sposób tworzeniu się jednorodnej monowarstwy komórkowej o dobrej restrykcyjności parakomórkowej. Biorąc pod uwagę, że komórki śródbłonka mózgu wyrażają znacznie wyższe poziomy pomp wypływowych, zwłaszcza P-gp, w porównaniu z innymi typami komórek występującymi w mikronaczyniach, lepiej tolerują one toksyczne stężenia leków ligandowych P-gp, podczas gdy komórki nieśródbłonkowe są eliminowane. Po leczeniu Puromycyną w dawce 4 μg/ml przez pierwsze dwa dni, po dwóch kolejnych dniach podawano dawkę 2 μg/ml w celu uzyskania dobrej czystości komórek śródbłonka. Ta selekcja może również faworyzować komórki śródbłonka naczyń włosowatych w porównaniu z komórkami z żyłek, tętniczek przedwłosowatych lub większych mikronaczyń i prowadzić do ciaśniejszych monowarstw. Ponadto użycie surowicy bydlęcej pochodzącej z osocza o niskiej jakości jest konieczne do uzyskania czystych kultur komórek śródbłonka47,48. Surowica pochodząca z osocza nie zawiera płytkowego czynnika wzrostu (PDGF), który jest mitogenny dla fibroblastów, komórek mięśni gładkich, a tym samym dla perycytów.
Zaobserwowaliśmy, że leczenie plastiku i filtrów mieszanką kolagenu typu IV od myszy i ludzkiej fibronektyny daje znaczącą przewagę, z 2-krotnym wzrostem wydajności proliferacji w porównaniu z tradycyjnie zalecanym kolagenem typu I ze szczurzego ogona. Ważne wskazówki dotyczące proliferacji komórek są dostarczane przez macierz zewnątrzkomórkową, taką jak aktywacja integryny i czynnika wzrostu (bFGF)49. Opisano stężenie buforu i pH pożywki hodowlanej jako pozytywnie wpływające na szczelność okołokomórkową50 i zaobserwowaliśmy lepszą odtwarzalność między kulturami po dodaniu buforu HEPES w 5 mM.
Zróżnicowanie RBEC: Ustanowienie wspólnej kultury na filtrach wsuwanych
Gdy komórki śródbłonka mózgu zostaną oczyszczone i będą się namnażać przez 6 dni, można je umieścić na filtrach. Posiewanie komórek o dużej gęstości ma kluczowe znaczenie dla uzyskania idealnej warstwy monocznej. Gęstość wysiewu 160x103 komórki na 12-dołkowe filtry płytkowe była konieczna i wystarczająca do uzyskania zlewającej się monowarstwy 24 godziny po wysiewie. Jednak izolacja pierwotnych komórek śródbłonka naczyń włosowatych mózgu od ich środowiska jest paradoksem w budowie modelu BBB in vitro , ponieważ wiadomo, że komórki pierwotne, a zwłaszcza komórki śródbłonka naczyń włosowatych mózgu, są silnie regulowane przez środowisko i czynniki indukcyjne wytwarzane przez różne otaczające typy komórek. Komórki śródbłonka naczyń włosowatych mózgu hodowane samodzielnie szybko się różnicują i tracą pewne specyficzne markery śródbłonka mózgu. Tak więc pierwotne komórki śródbłonka powinny być używane przy niskim pasażu (P1) i ponownie połączone, przynajmniej częściowo, ze swoim środowiskiem poprzez kohodowlę z astrocytami lub pożywką kondycjonowaną przez astrocyty47,51. Dotyczy to różnicowania astrocytów, ponieważ komórki śródbłonka mózgu i astrocyty są zaangażowane w dwukierunkową indukcję. Hodowla RBEC z astrocytami doprowadziła do silnej indukcji międzyśródbłonkowego TJ52,23. Molekularne mechanizmy reindukcji pozostają w dużej mierze nieznane, a w kilku laboratoriach trwają badania mające na celu zidentyfikowanie specyficznych czynników modulujących wydzielanych przez astrocyty, które mogą promować optymalne różnicowanie komórek śródbłonka53,54. Wykazano, że czynniki wydzielane przez komórki śródbłonka mózgu, w tym czynnik hamujący białaczkę (LIF), indukują różnicowanie astrocytów55,56. Przed ustanowieniem wspólnej hodowli astrocyty wystawiono na działanie pożywki różnicującej zawierającej agonistę receptora glikokortykosteroidowego hydrokortyzonu i pożywki kondycjonowanej współkulturą. Hydrokortyzon jest znany z tego, że poprawia szczelność komórek śródbłonka mózgu i jest stosowany w modelach BBB, zwłaszcza z komórek śródbłonka szczura57 i myszy58,59 . Kondycjonowaną pożywkę pobiera się z dolnego przedziału systemu kohodowli komórek śródbłonka/astrocytów po 3 dniach i zamraża do późniejszego wykorzystania. Zastosowanie pożywki kondycjonowanej współhodowlą skróciło czas różnicowania komórek śródbłonka do 3 dni przy optymalnej przepuszczalności parakomórkowej przez kolejne 2 dni, a także poprawiło odtwarzalność między kulturami.
Ogólnie rzecz biorąc, opisany przez nas protokół daje powtarzalny TEER powyżej 300 omów ·cm2 i średni współczynnik przepuszczalności parakomórkowej Pe(LY) wynoszący 0,26 ± 0,11 x 10-3 cm/min, podobnie jak najlepsze pierwotne modele BBB oparte na komórkach22,12. Protokół, który opisujemy w niniejszym manuskrypcie z proponowaną modulacją trawienia enzymatycznego mikronaczyń, może zostać rozszerzony na komórki śródbłonka z rdzenia kręgowego szczura60 i z mózgu myszy.
Charakterystyka molekularna i funkcjonalna
Oprócz indukcji TJ, astrocyty przyczyniają się również do ekspresji transporterów wypływu, takich jak P-gp, w komórkach śródbłonka mózgu61. Rzeczywiście pokazujemy ekspresję transportera wypływu P-gp w modelu BBB i pokazujemy polarność lokalizacji pompy wypływowej P-gp za pomocą podejść biochemicznych oraz aktywności P-gp za pomocą testu funkcjonalnego. Ekspresję GLT-1 wykryto we frakcji błony podstawnej mikronaczyń, ale nie wykryto jej w hodowanym RBEC. Stawiamy hipotezę, że GLT-1 był regulowany w dół w naszej hodowli RBEC w porównaniu z warunkami in vivo , a zatem nie był wykrywalny przez analizę western blot. Nadmiar glutaminianu jest neurotoksyczny i in vivo GLT-1 jest odpowiedzialny za wypływ glutaminianu z przedziału podstawnego (miąższu) do przedziału wierzchołkowego (krążenie krwi). W hodowlach astrocytów ekspresja GLT-1 pozostaje bardzo niska i jest indukowana przez dodanie glutaminianu do pożywki62,63.
Potwierdzamy również ekspresję transporterów napływu na błonie wierzchołkowej, takich jak LRP1, LDLR i TfR. Funkcjonalność TfR i LDLR wykazano za pomocą eksperymentów wiązania i transportu Tf-Cy3 i DiLDL ze strony luminalnej do abluminalnej monowarstwy, jak wcześniej wykazano w przypadku bydlęcego modelu BBB in vitro 64. Co ciekawe, wykazano, że zapotrzebowanie na lipidy od astrocytów zwiększa ekspresję LDLR na komórkach śródbłonka naczyń włosowatych mózgu65,66 , co dodatkowo potwierdza fizjologiczny przesłuch między astrocytami a komórkami śródbłonka mózgu, w tym in vitro. Zdecydowaliśmy się na przykład transportu za pomocą barwników fluorescencyjnych, takich jak Cy3 i DiI, biorąc pod uwagę, że analiza spektrofluorymetryczna jest dostępna w większości laboratoriów i może okazać się przydatna do walidacji modeli BBB in vitro . Jednak kwantyfikacja fluorescencji jest znacznie mniej czuła niż radioaktywność i wymaga zwiększenia liczby eksperymentów w celu uzyskania istotnych danych. Idealnie, Tf i LDL są zwykle znakowane radioaktywnie (jod 125) do takich eksperymentów wiązania/wychwytu i transportu.
Pokazujemy również, że zróżnicowana monowarstwa komórek śródbłonka uzyskana za pomocą proponowanego protokołu reaguje na stan zapalny wywołany przez TNF-α, co ujawnia się przez uwolnienie CCL2 i otwarcie BBB. CCL2 (MCP-1) i jego receptor CCR2 są zaangażowane w patologie OUN, takie jak stwardnienie rozsiane, eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE)67, uraz OUN68 i są znane jako mediatory migracji leukocytów do OUN w stanach neurozapalnych69,70. Na podstawie testowanego protokołu nie możemy stwierdzić spolaryzowanego wydzielania CCL2, ponieważ otwarcie BBB pozwala stężeniu CCL2 zrównoważyć się zarówno między górnymi (wierzchołkowymi), jak i dolnymi (podstawnymi) przedziałami. W związku z tym wyraźnie zaniżamy ilość CCL2 wytwarzanego przez RBEC w komplemencie wierzchołkowym po 24 godzinach (Figura 5A).
Ogólny przegląd i ograniczenia modeli BBB in vitro: In Vivo kontra porównania in vitro i gryzonie kontra ludzie
Wiele obiecujących leków na OUN, które okazały się skuteczne w pasażu BBB in vitro , nie powiodło się w badaniach klinicznych z powodu braku przewidywalności na podstawie modeli BBB in vitro , często opartych na komórkach wyizolowanych z innych gatunków niż człowiek. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, modele BBB in vitro są prawdopodobnie bardziej predykcyjne, jeśli chodzi o badanie mechanistycznych aspektów sieci białkowych, transdukcji sygnału, transporterów i receptorów. Każdy mechanizm, szlak lub cel, który ma być badany in vitro , musi być scharakteryzowany pod kątem jego regulacji przez uzupełniające się sygnały środowiskowe (inne typy komórek, substancje chemiczne, białka) i połączony z badaniami in situ z tymi samymi gatunkami zwierząt oraz, jeśli to możliwe, z mikronaczyniami i komórkami śródbłonka wyizolowanymi od ludzi, z ograniczeniami i ostrożnością przywołanymi poniżej.
Metody in vitro Modele BBB muszą być postrzegane jako systemy autonomiczne, odizolowane od regulacji ciała, ale nadal obdarzone ważnymi właściwościami in vivo i potencjałem regulacji przez sygnały środowiskowe. Nie zaproponowano jeszcze "idealnego" modelu BBB in vitro 71,72,73 , ponieważ monowarstwy komórek śródbłonka nie mają wielu ważnych składników jednostki nerwowo-glejowej (NGVU) i są odizolowane od regulacji krwi i ciała. Brak perycytów74,16 lub neuronów17,18 lub różnych składników macierzy zewnątrzkomórkowej używanej do powlekania tworzywem sztucznym lub pożywki hodowlanej i surowicy używanej do wzrostu komórek w najpowszechniejszych i "najłatwiejszych do wykonania" modelach BBB in vitro opartych na komórkach śródbłonka zróżnicowanych astrocytami może modulować ekspresję białka w porównaniu z sytuacją in vivo75. Modele te mogą wyrażać wiele transporterów wyświetlanych in vivo, ale nie wszystkie. W niektórych przypadkach parametry transportu najpierw zweryfikowano w izolowanych mikronaczyniach (najbardziej zbliżonych do sytuacji in vivo ), a następnie zbadano w systemach hodowli komórkowych76,61.
Badania z zakresu biologii molekularnej pozwoliły na scharakteryzowanie ekspresji genów i białek w izolowanych mikronaczyniach i kulturach komórek śródbłonka o niskim pasażu tego samego gatunku i między różnymi gatunkami, najczęściej od małych zwierząt, takich jak gryzonie (myszy i szczury) lub od krów i świń w porównaniu z ludźmi77,78,75,15. Porównanie transkryptomiczne między komórkami śródbłonka mikronaczyń mózgowych in vivo i in vitro wykazało liczne transkrypty genów, które ulegały zróżnicowanej ekspresji i najczęściej znacznie obniżone in vitro. Transkrypty kodujące transportery napływu, takie jak TfR i białka biorące udział w transporcie pęcherzyków, są głównie regulowane w dół w hodowanych komórkach śródbłonka mózgu, co sugeruje ogólny spadek endocytozy i transportu pęcherzykowego w takich komórkach. Manipulacja kulturą pod kątem czystości (leczenie puromycyną) i leczenie hydrokortyzonem może pomóc w przywróceniu bardziej "in vivo" profilu ekspresji genów77. Badania transkryptomiczne ujawniły również istotne różnice między gatunkami, które dodatkowo komplikują przewidywania dotyczące przyjmowania narkotyków przez ludzi w oparciu o modele BBB in vitro gryzoni 75. Metody in vitro Opisano modele BBB polegające na jednoczesnej hodowli ludzkich komórek śródbłonka i astrocytów15. Chociaż modele te są istotne, są trudniejsze do regularnego wdrażania, ponieważ wymagają regulowanego dostępu do pośmiertnych tkanek ludzkich i występują niejednorodności w jakości/właściwościach komórek śródbłonka ludzkiego mózgu w zależności od wieku, chorób i ewentualnego leczenia dawców. Należy dołożyć starań w celu opracowania nowych modeli in vitro , które lepiej odwzorowują fizjologiczne, anatomiczne i funkcjonalne cechy wirusa BBB in vivo . Kohodowle obejmujące trzy typy komórek są bardzo restrykcyjne i wydają się trudne do rutynowego wdrożenia. Do tej pory najbardziej złożonymi modelami BBB in vitro są dynamiczne modele in vitro (DIV-BBB), które obejmują organizację podobną do naczynia z astrocytami i obejmują przepływ pożywki naśladującej przepływ krwi 75,79,80,81,82,83,84,85. Kiedy komórki śródbłonka mózgu są wystawione na przepływ, wygenerowane naprężenie ścinające aktywuje mechanoprzetworniki na powierzchni komórki, które modulują ekspresję różnych genów zaangażowanych w fizjologię komórek śródbłonka, takich jak podział komórek, różnicowanie, migracja i apoptoza80. In vivo naprężenie ścinające generowane przez przepływ krwi jest odpowiedzialne za zatrzymanie mitotyczne na styku komórki, co pozwala na utworzenie monowarstwy komórek śródbłonka w naczyniach krwionośnych80. Analiza genomiczna i proteomiczna prawidłowych komórek śródbłonka mikronaczyniowego ludzkiego mózgu wykazała wpływ naprężenia ścinającego na fizjologię śródbłonkaBBB 84. Naprężenie ścinające jest odpowiedzialne za przeżycie komórek, wyższy stopień adhezji komórek śródbłonka, indukcję pompy wypływowej i lepszą polaryzację transporterów75, regulację metabolizmu glukozy75,86, utlenianie za pośrednictwem enzymów CYP45075 oraz regulację przepuszczalności parakomórkowej poprzez zwiększenie ekspresji genów kodujących międzykomórkowe elementy połączeniowe, takie jak okludyna i ZO-187,75,80 a co za tym idzie wysoki TEER około 1 500 - 2 000 omów · cm2, najbliższy znanym parametrom in vivo 79,80
W przemyśle biotechnologicznym i farmaceutycznym rutynowe badania przesiewowe leków, a nawet wysokoprzepustowe badania przesiewowe (HTS) oraz wysiłki na rzecz ograniczenia eksperymentów na zwierzętach doprowadziły do opracowania różnych linii komórkowych, które mają być wykorzystywane do zastąpienia pierwotnej hodowli komórek śródbłonka mózgu, które pozostają trudniejsze do rutynowego stworzenia. W większości przypadków pierwotne hodowle komórek śródbłonka mózgu były transdukowane genem unieśmiertelniającym (SV40 lub wirus polioma duży antygen T lub adenowirus E1A), albo przez transfekcję plazmidowego DNA, albo przez infekcję za pomocą wektorów retrowirusowych88,89,75. Opracowano kilka linii komórek śródbłonka pochodzenia mózgowego, takich jak linie komórek szczurzych RBE4, GP8 / 3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBB lub rBCEC488,75, linia komórkowa myszy b.End390,75, linia komórek świń PBMEC / C1-2 87,75 i linia komórek ludzkich hCMEC / D389,75. Inne modele opierają się na komórkach pochodzenia niemózgowego, takich jak nerka psa Madin-Darby (MDCK) lub linie komórkowe Caco212,75. Wśród różnych linii komórkowych śródbłonka ludzkiego mózgu, hCMEC / D3 jest szeroko cytowany i ulepszany jako model BBB od czasu jego powstania w 2005 r.91,92. Podobnie jak hodowle pierwotne, linie komórkowe mają zalety i ograniczenia. Są łatwiejsze w obsłudze niż kultury pierwotne, mają wydłużoną żywotność, są dobrze scharakteryzowane i umożliwiają powtarzalność między eksperymentami na dużą skalę. Jednak linie komórkowe mogą utracić funkcje specyficzne dla tkanki, utracić regulację środowiska i uzyskać fenotyp molekularny zupełnie inny niż komórki in vivo75,89. W szczególności monowarstwy wytworzone z linii komórkowych charakteryzują się zmniejszoną szczelnością, niskim TEER i wykazują zmienność profilu transportera75,89. W związku z tym często preferowane są eksperymenty na zwierzętach lub badania na komórkach pierwotnych, pomimo ich dodatkowej złożoności.

Wiele leków opracowanych do leczenia zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego (OUN) nie jest w stanie dotrzeć do miąższu mózgu w stężeniach istotnych terapeutycznie. Bariera krew-mózg chroni tkankę nerwową mózgu przed wahaniami składu osocza, przed czynnikami chorobotwórczymi i utrzymuje homeostazę miąższu mózgu poprzez ograniczenie niespecyficznego przepływu jonów, peptydów, białek, a nawet komórek do i z mózgu1.
Cechy BBB są indukowane i utrzymywane przez bliskość i wzajemne przenikanie się komórek śródbłonka mikronaczyń mózgowych klasy wyspecjalizowanej a sąsiednimi elementami jednostki nerwowo-glejowo-naczyniowej (NGVU), takimi jak neurony, komórki glejowe (dokładniej astrocyty na końcach) i perycyty otoczone błoną podstawną, która składa się głównie z kolagenu typu IV, fibronektyny, lamininy i proteoglikanów2,3. Perycyty pokrywają około 22 - 32% śródbłonka na poziomie naczyń włosowatych i odgrywają ważną rolę w regulacji proliferacji śródbłonka, angiogenezy i procesów zapalnych. Komórki śródbłonka tworzą ciągły arkusz pokrywający wewnętrzną powierzchnię naczyń włosowatych. Są one połączone przez TJ, które tworzą strukturę przypominającą pas w okolicy wierzchołkowej i przyczyniają się do polaryzacji komórek. Astrocyty regulują właściwości BBB i są źródłem ważnych czynników regulacyjnych, takich jak TGF-β, GDNF, bFGF i IL-6. Astrocyty z niedoborem GFAP o niepełnej funkcjonalności nie są w stanie regulować właściwości BBB4. Neurony nie są bezpośrednio zaangażowane strukturalnie w tworzenie bariery krew-mózg, ale także regulują ważne aspekty ekspresji białek i funkcji bariery krew-mózg5.
W celu dalszego badania struktury, fizjologii i patologii BBB, opracowano modele in vitro BBB jako narzędzia badawcze. Komórki śródbłonka mózgu zostały wyekstrahowane od różnych gatunków w celu wdrożenia modeli BBB in vitro opartych na kulturach pierwotnych o niskim pasażowaniu od bydła6,7, świni8,9, szczura10,11,12, myszy13, a także człowieka14,15. Wiadomo, że modele te naśladują BBB in vivo, szczególnie gdy są hodowane wspólnie z komórkami glejowymi szczurów lub myszy i / lub perycytów16,12 i / lub astrocytów pochodzących z nerwowych komórek progenitorowych17 i / lub neuronów18. Modele "in lab" są często produkowane z gryzoni, ponieważ umożliwiają eksperymenty i porównania in vitro / in vivo i/lub badanie komórek śródbłonka mózgu wytworzonych z modeli transgenicznych19.
Nowo opracowane modele BBB in vitro zostały również zaprojektowane, aby pomóc przewidzieć pobieranie przez mózg potencjalnych kandydatów na leki na OUN przed testami in vivo 15,20,21,3,6,22,11,23. Metody in vitro Modele bariery krew-mózg są zwykle używane do porównywania transportu leków z: i) znaną penetracją do OUN lub z niską przepuszczalnością przez barierę krew-mózg i brakiem efektów centralnych, oraz ii) pozornym Pe tych samych leków mierzonym w modelach zwierzęcych tego samego gatunku. Leki, które łatwo przenikają przez barierę krew-mózg, są w większości lipofilowe i przenikają przez błony komórkowe śródbłonka mózgu poprzez swobodną dyfuzję za pośrednictwem lipidów (kofeina, karbamazepina itp.). Ujemnie transportowane leki, takie jak digoksyna, werapamil lub cyklosporyna A, są aktywnie wytłaczane przez transportery wypływu śródbłonka mózgu, takie jak P-gp. Jednak wiele z nowo opracowanych cząsteczek terapeutycznych to biofarmaceutyki, takie jak białka rekombinowane, siRNA lub przeciwciała monoklonalne. Większość z nich nie przekracza bariery krew-mózg z powodu: i) braku specyficznych transporterów oraz ii) ciasno upakowanej warstwy komórek śródbłonka, które uniemożliwiają cząsteczkom o dużej masie cząsteczkowej przejście przez komórkę parakomórkową. Mając te ograniczenia, strategie "konia trojańskiego" zostały wdrożone przy użyciu wektorów (przeciwciał, peptydów) przeciwko znanym receptorom w BBB, zaangażowanym w transport lub transcytozę za pośrednictwem receptora (RMT), takim jak receptor transferyny (Tf) (TfR), receptor insuliny (IR) lub członkowie rodziny receptorów związanych z receptorem LDL (LDLR), LRP1). Takie receptory znaleziono na izolowanych naczyniach włosowatych mózgu oraz w BBB in vivo24,25. Profile transkrypcyjne dla tych receptorów, w szczególności tych z rodziny LDLR, przeanalizowano i porównano między komórkami śródbłonka mózgu a komórkami śródbłonka mózgu hodowanymi wspólnie z astrocytami lub w naczyniach włosowatych mózgu bezpośrednio po ich ekstrakcji z mózgu26. Pardridge24 otworzył pole z przeciwciałem OX-26 przeciwko receptorowi transferyny (TfR), a następnie przeciwciałami przeciwko receptorowi insuliny i receptorowi insulinowego czynnika wzrostu27,28. Dzięki tym wektorom opartym na przeciwciałach, firma ArmaGen Technologies opracowała technologię molekularnej platformy konia trojańskiego BBB do dostarczania leków, w tym białek, przez BBB29. Literatura jest bogata w dane pokazujące ekspresję LRP1 w komórkach śródbłonka mózgu i jego rolę jako silnego receptora endocytarnego/zmiatającego. Analiza Western blot sugerowała, że LRP1 ulega ekspresji we frakcjach wzbogaconych w naczynia włosowate mózgu i komórkach śródbłonka naczyń włosowatych mózgu szczura30. Firmy takie jak Angiochem celują w LRP1 za pomocą wektorów peptydowych pochodzących z aprotyniny, które promują efektywny napływ leków przez barierę BBB31. Jednak LRP1 jest również zaangażowany w aktywny transport Aβ i jego wypływ/klirens z miąższu mózgu do krwi32. Takie dane obejmują LRP1 w dwukierunkowym transporcie przez barierę krew-mózg w zależności od jego ligandów. biOasis opracowuje technologię Transcend wykorzystującą białko melanotransferynę do transportu leków biologicznych, takich jak enzymy lizosomalne i przeciwciała, przez barierę krew-mózg33, podczas gdy VECT-HORUS opracowuje wektory peptydowe, które celują w LDLR34. Istnieją dane sugerujące, że LRP i LDLR mogą być wykorzystywane do transportu różnych cząsteczek, takich jak enzymy lizosomalne35,36 lub kompleksy nanocząstek przez BBB37.
Naszym polem zainteresowań jest dostarczanie leków do OUN za pomocą molekuł wektorowych i wektoryzowanych kandydatów na leki do leczenia chorób OUN. W szczególności dostarczanie leków przez barierę krew-mózg należy rozpatrywać w kontekście zapalenia nerwów, procesu, który może mieć różny zakres, ale jest prawdopodobnie wspólny dla wszystkich zmian i chorób OUN, w tym zapalenia mózgu, stwardnienia rozsianego, choroby Alzheimera itp. Zapalenie nerwów jest związane ze stanem zapalnym BBB i potencjalnie ze zmianami w fizjologii i przepuszczalności BBB, biorąc pod uwagę, że transport parakomórkowy i transkomórkowy może być wzmocniony w stanach patologicznych38,39,40,41,42,43. Na przykład TNF-α, TWEAK i inne cytokiny modulują stan zapalny, a eksperymenty z modelami BBB in vitro wykazały, że mogą zmieniać właściwości parakomórkowe monowarstwy komórek śródbłonka38,39,40 i że TNF-α prowadzi również do wzrostu transportu transkomórkowego LDL41, holotransferyny42 i laktoferyny43.
Naszym celem było opracowanie i scharakteryzowanie zoptymalizowanego i wysoce powtarzalnego modelu syngenicznego BBB u szczurów przy użyciu kokultur pierwotnych komórek śródbłonka mózgu i astrocytów. Użyliśmy 5-tygodniowych i nowonarodzonych szczurów rasy Wistar odpowiednio do produkcji komórek śródbłonka mózgu i produkcji astrocytów. Jednym z wyzwań było opracowanie protokołu umożliwiającego produkcję "odtwarzalnych co tydzień" modeli BBB. Aby osiągnąć ten cel, każdy etap protokołu produkcyjnego został wykonany w określonych dniach tygodnia, zaczynając od produkcji mikronaczyń mózgowych w środę pierwszego tygodnia. W ciągu ostatnich 3 lat sekcje były wykonywane prawie co tydzień. Aby jeszcze bardziej poprawić odtwarzalność kultur, ustanowiono system zapewnienia jakości. Wszystkie odczynniki i chemikalia zostały wymienione w bazie danych (data wprowadzenia, stan magazynowy, termin ważności itp.).
Model został scharakteryzowany według wielu kryteriów, takich jak organizacja i czystość komórek śródbłonka, TEER, przepuszczalność LY, odpowiedź na czynniki prozapalne, jakościowa i ilościowa ekspresja białek TJ, funkcjonalność transporterów wypływu, takich jak P-gp, oraz receptory zaangażowane w transcytozę w monowarstwie komórek śródbłonka, takie jak TfR lub LDLR.

<table><tbody><tr><td>BSA frakcja V niska endotoksyna</td><td>PAA</td><td>K45-011-500g</td><td>4 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122-20</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054-20</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>DMEM wysoki poziom glukozy</td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td>4 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Invitrogen</td><td>10270-098-20</td> <td>&deg; C / 1 rok</td></tr><tr><td>Kolby T75</td><td>Becton Dickinson Falcon</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>bufor HEPES (1 M)</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>4 &deg; C / 1 rok</td></tr><tr><td>Mysz z kolagenem typu IV (10 x 1 mg)</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> <td>356233-20 &deg; C / 1 miesiąc</td></tr><tr><td>Fibronectin humain osocze (5 mg)</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> <td>356008-20 &deg; C / 1 miesiąc</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas, proste (9 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki, proste (9 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5/45 (11 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Kleszcze, szerokość końcówki 0,8 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Kleszcze, szerokość końcówki krzywej 0,8 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenazy / mieszanina dypazy (2 x 5 mg)</td><td>Roche Diagnostics</td><td>05 401 054 001-20</td> <td>&deg; C / 3 miesiące</td></tr><tr><td>DNaza I (100 mg / 569 KU / mg)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25-100</td> <td>mg-20 &deg; C / 1 rok</td></tr><tr><td>Gentamycyna (10 mg / ml)</td><td>Invitrogen</td><td>15710-049</td><td>4 &deg; C / 1 rok</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>31331-028</td><td>4 &stopnie; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca z osocza ubogiego w płytki krwi (500 ml)</td><td>Clinisciences</td><td>BT-214-100-20</td> <td>&deg; C / 1 rok</td></tr><tr><td>bFGF (10 &mikro; g)</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029-20</td> <td>&deg; C / 6 miesięcy</td></tr><tr><td>Heparyna Na sól z błony śluzowej świni Grade I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149-100KU</td><td>4 &deg; C / 1 rok</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833-10</td> <td>mg-20 &deg; C / 6 miesięcy</td></tr><tr><td>ITSX</td><td>Invitrogen</td><td>51500-056</td><td>4 &stopnie; C / 1 rok</td></tr><tr><td>Polietylenowa wkładka do zawieszania komórek do płytek 12-dołkowych</td><td>Millipore</td><td>PIRP15R48</td><td>Porowatość: 1 &mikro; m Powierzchnia: 1,1 cm2</td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma</td><td>Aldrich H0888-1</td> <td>g-20 &deg; C / 1 rok</td></tr><tr><td>Mysz anty-CD31 / PECAM&nbsp;</td><td>Chemicon</td><td>MAB1393, klon TLD-3A12 (1 mg/mL)</td><td>1/200 - utrwalenie PFA 4%</td></tr><tr><td>Królik anty-Von Willebrand</td><td>Chemicon</td><td>AB7356</td><td>1/200 - utrwalenie PFA 4%</td></tr><tr><td>Mysz anty-Desmine</td><td>Chemicon</td><td>MAB3430</td><td>1/200 - utrwalenie PFA 4%</td></tr><tr><td>Mysz anty-Vimentine</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>08-0052 klon V9, (58 &mikro; g/ml)&nbsp;</td><td>1/50 - utrwalenie PFA 4%</td></tr><tr><td>Mysz anty-Claudin-5</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>35-2500, (500 &mikro; g/ml)</td><td>1/200 - utrwalanie PFA 4%</td></tr><tr><td>Królik anty-ZO-1</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>61-7300 (250 &mikro; g/ml)</td><td>1/200 - utrwalacz PFA 4%</td></tr><tr><td>Królik anty-Okludyna&nbsp;</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>71-1500 (250 &mikro; g/ml)</td><td>1/200 - utrwalenie PFA 4%</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488, 594 sprzężone przeciwciała drugorzędowe</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>1/800</td></tr><tr><td>Lucifer Yellow CH, sól dilithium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L0259-20</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>TNF-alfa człowiek</td><td>PeproTech</td><td>300-01A-20</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>Rat MCP-1 Zestaw ELISA</td><td>PeproTech</td><td>900-K59</td><td>4 & stopnie; C / -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Mysia anty-glikoproteina P</td><td>Covance, Eurogentec</td><td>SIG-38710-1000, klon C219 (1 mg / ml)</td> <td>1/400 - utrwalenie PFA 4% 1/200 (western blot)</td></tr> <tr><td>Królik anty-GLT-1</td><td>Abcam</td><td>ab41621</td><td>1/1,000 (western blot)</td></tr><tr><td>Rodamina 123</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83702</td><td>4 &deg; C</td></tr><tr><td>Chlorowodorek werapamilu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V4629</td><td>4 &deg; C</td></tr><tr><td>Cyklosporyna A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30024</td><td>4 &deg; C</td></tr><tr><td>Monoklonalny receptor makroglobuliny anty-a2 (CD91, LRP1) przeciwko łańcuchowi b aminokwasu 4291-4344 w powtórzeniu EGF</td><td>American Diagnostica</td><td>3501 (100 &mikro; g/ml)</td><td>1/5 - utrwalenie PFA 4%</td></tr><tr><td>Mysz anty-LDLR</td><td>R& Systemy D</td><td>AF2255 (200 &micro; g/ml)</td><td>1/50 - utrwalenie PFA 4%</td></tr><tr><td>Transferyna dla szczurów-Cy3</td><td>Gentaur</td><td>JOR160050</td><td>4 &deg; C</td></tr><tr><td>DiILDL</td><td>Invitrogen</td><td>L-3482</td><td>4 &deg; Z</td></tr></tbody></table>

tworzenie modelu in vitro bariery krew-mózg szczura (bbb): skupienie się na nieprzepuszczalności bariery krew-mózg i transporcie za pośrednictwem receptorów

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

Bariera krew-mózg (BBB) specyficznie reguluje przepływ molekularny i komórkowy między krwią a tkanką nerwową. Naszym celem było opracowanie i scharakteryzowanie wysoce powtarzalnego syngenicznego modelu in vitro wirusa BBB u szczurów przy użyciu kohodowli pierwotnych komórek śródbłonka mózgu szczura (RBEC) i astrocytów w celu zbadania receptorów zaangażowanych w transcytozę w monowarstwie komórek śródbłonka. Astrocyty wyizolowano przez mechaniczną sekcję po trawieniu trypsyny i zamrożono w celu późniejszej wspólnej hodowli. RBEC wyizolowano z 5-tygodniowej kory mózgowej szczura. Mózgi zostały oczyszczone z opon mózgowych i istoty białej, a następnie mechanicznie zdysocjowane po trawieniu enzymatycznym. Następnie homogenat tkankowy odwirowano w albuminie surowicy bydlęcej w celu oddzielenia fragmentów naczyń krwionośnych od tkanki nerwowej. Fragmenty naczyń zostały poddane drugiemu trawieniu enzymatycznemu w celu uwolnienia komórek śródbłonka z ich macierzy zewnątrzkomórkowej. Pozostałe zanieczyszczające komórki, takie jak perycyty, zostały dodatkowo wyeliminowane przez posiew fragmentów mikronaczyń w pożywce zawierającej puromycynę. Następnie przeniesiono je do filtrów w celu wspólnej hodowli z astrocytami wyhodowanymi na dnie studzienek. RBEC wykazywał ekspresję wysokich poziomów białek ścisłego połączenia (TJ), takich jak okludyna, klaudyna-5 i ZO-1 z typową lokalizacją na granicach komórek. Transśródbłonkowy opór elektryczny (TEER) monowarstw śródbłonka mózgu, wskazujący na szczelność TJ, osiągnął średnio 300 omów·cm2. Współczynniki przepuszczalności śródbłonka (Pe) dla żółcienia lucyfera (LY) były wysoce powtarzalne ze średnią 0,26 ± 0,11 x 10-3 cm/min. Komórki śródbłonka mózgu zorganizowane w monowarstwy wykazywały ekspresję transportera wypływu P-glikoproteiny (P-gp), wykazywały spolaryzowany transport rodaminy 123, liganda dla P-gp, i wykazywały specyficzny transport transferyny-Cy3 i DiILDL przez monowarstwę komórek śródbłonka. Podsumowując, przedstawiamy protokół tworzenia modelu BBB in vitro, który jest wysoce powtarzalny ze względu na metody zapewnienia jakości i który jest odpowiedni do badań nad transporterami i receptorami BBB.

Celem niniejszego badania było sprawdzenie odtwarzalności modelu BBB in vitro z udziałem syngenicznej kohodowli komórek śródbłonka i astrocytów na szczurach. Monowarstwa komórek śródbłonka charakteryzowała się wysoką przepuszczalnością TEER i niską przepuszczalnością LY. Oceniano ekspresję specyficznych białek TJ, funkcjonalne odpowiedzi na stan zapalny oraz funkcjonalność transporterów i receptorów.

Tworzenie modelu in vitro bariery krew-mózg szczura (BBB): skupienie się na nieprzepuszczalności bariery krew-mózg i transporcie za pośrednictwem receptorów

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie wysoką powtarzalnością modelu in vitro bariery krew-mózg szczura. Osiąga się to poprzez usunięcie nerwów wzrokowych, móżdżku oraz opon mózgowych pod mikroskopem stereoskopowym, a następnie rozdzielenie dwóch półkul mózgu i ich wypreparowanie w celu uzyskania czystego fragmentu kory mózgowej. Drugim krokiem jest izolacja mikonaczyni z kory mózgowej za pomocą obróbki enzymatycznej i wirowania w zależności od gęstości.Następnie mikro-naczynia są wysiewane i inkubowane z purmycyną w celu oczyszczenia komórek śródbłonka z komórek zanieczyszczających, takich jak pasożyty. Czyste hodowle komórek śródbłonka mózgu szczura proliferują, aż komórki osiągną 90% konfluencji. Ostatnim krokiem jest indukcja różnicowania komórek śródbłonka mózgu szczura poprzez umieszczenie komórek w górnej komorze filtrów insertowych i ich kokulturę z wcześniej przygotowanymi i wysiewanymi astrocytami szczura.Ostatecznie zdiferencjowaną monowarstwę komórek śródbłonka mózgu można scharakteryzować poprzez ekspresję specyficznych białek połączeń ścisłych oraz poprzez wskaźnik przepuszczalności związku referencyjnego przez monowarstwę komórek śródbłonka z komory górnej. Modele BBB in vitro, takie jak przedstawiony tutaj, są przydatne do badania rozkładu komórkowego kluczowych cząsteczek oraz do odkrywania podstawowych mechanizmów komórkowych i molekularnych funkcji BBB. W szczególności modele te pozwalają na badanie receptorów BBB oraz ich udziału w endocytozie, transporcie wewnątrzkomórkowym i transcytozie w naszych warunkach laboratoryjnych.Modele BBB in vitro są wykorzystywane głównie do badania celowania w specyficzne receptory za pomocą opracowywanych przez nas wektorów peptydowych. Aby usprawnić dostarczanie leków do OUN poprzez barierę krew-mózg, stosujemy proces nazywany transcytozą zależną od receptorów, znany również jako metoda konia trojańskiego. Opis wizualny jest kluczowy, ponieważ osoby rozpoczynające pracę z tą metodą będą wymagać umiejętności sekcyjnych oraz dostępu do mikroskopu, aby działać wystarczająco szybko i precyzyjnie, zapewniając przeżywalność tkanki podczas procesu produkcji komórek.Kolejnym krytycznym punktem jest przedwczesne zakończenie obszarów fragilnych i tele-łososiowych, aby uniknąć otwarcia barier podczas eksperymentów. Na koniec, koncepcja ta przedstawi szczegóły w ramach protokołu, które pozwolą odróżnić protokoły czerwone od wizualizowanych, demonstrując procedurę wykonaną przeze mnie oraz mojego współpracownika. Rozpocznij tę procedurę od pokrycia dwóch kolb T 75 kolagenem typu IV oraz fibronektyną w stężeniu 1 µg/cm² w sterylnej wodzie hodowlanej, a następnie pozostaw je w inkubatorze w temperaturze 37 °C do momentu wysiewania mikronaczyń.Dwa dni później wyjmij mózg z czaszki trzech pięciotygodniowych szczurów rasy Vista i przenieś mózgi do szalki Petriego wypełnionej zimnym buforem do sekcji, utrzymywaną na lodzie. Wypreparuj mózgi, usuwając móżdżek i nerwy wzrokowe. Następnie, korzystając z mikroskopu stereoskopowego, przekrój każdy mózg na pół, aby rozdzielić dwie półkule mózgowe.Wykonaj kolejne cięcie, aby usunąć śródmózowie, a następnie przenieś wszystkie cztery mózgi do czystej, schłodzonej na lodzie szalki Petriego z buforem do sekcji. Następnie przenieś jeden przedmózg do nowej szalki Petriego wypełnionej zimnym buforem do sekcji. Przytrzymaj go pęsetą i ostrożnie oddziel opony mózgowe od krawędzi przedmózgu.Następnie odwróć przedmózowie i ostrożnie usuń oponu mózgowe, uważając, aby ich nie przerwać. Upewnij się, że przedmózowie jest całkowicie oczyszczone z opon i odetnij pozostałą część nerwów wzrokowych. Celem tego kroku jest usunięcie warstwy białej w celu uzyskania samej skorupy kory.Zacznij od zaciśnięcia przedmózgowia na krawędzi, a następnie ostrożnie przesuń pęsetę wzdłuż powierzchni, uważając, aby nie rozedrzeć kory mózgowej. Następnie upewnij się, że mózg jest wolny od opon mózgowych, obracając go w celu sprawdzenia, czy nie pozostały fragmenty opon lub duże naczynia powierzchniowe. Dalej, począwszy od wyjęcia trzech mózgów z czaszek, całkowity czas sekcji nie powinien przekroczyć dwóch godzin, aby zapewnić zachowanie tkanek i przeżywalność komórek.Przenieś korę trzech mózgów do 6 ml zimnego buforu do sekcji w homogenizatorze o pojemności 7 ml, a następnie rozdrobnij korę, wykonując 10 ruchów góra-dół pierwszym tłokiem o większym prześwicie, a następnie 10 ruchów góra-dół drugim tłokiem o mniejszym prześwicie. Następnie przenieś 6 ml zawiesiny do nowej probówki Falcon o pojemności 50 ml i wypłucz homogenizator 24 ml zimnego buforu do sekcji; podziel zawiesinę do trzech probówek Falcon, aby uzyskać równowartość jednej kory na probówkę. Po tym odwiruj próbki przy 1000 G przez 5 minut w temperaturze pokojowej.Obserwacja osadu wykazuje różowy gradient barwy, który reprezentuje część mikronaczyń korowej części mózgu. Po odrzuceniu nadsączu, homogenizować osad z jednej kory z jednym mililitrem roztworu enzymatycznego zawierającego mieszaninę kolagenaz, DNazy typu I oraz gentamycyny. Umieścić probówki w wytrząsarce na 30 minut w temperaturze 37 °C.Następnie zmieszaj 1 ml trawionego materiału z 10 ml 25% B-S-A-H-B-S-S 1X, delikatnie wymieszaj próbki na wirówce typu vortex, a następnie rozdziel je za pomocą wirowania gradientowego przy 3 600 G przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu gradientowym osad zawiera naczynia mikrokrwionośne, a górny dysk zawiera mielinę miąższu mózgowego oraz pozostałe naczynia mikrokrwionośne. Ostrożnie przenieś górny dysk i nadsad do czystych probówek typu Falcon o pojemności 50 ml.Należy uważać, aby nie odessać osadu z mikro-naczyniami; delikatnie wymieszać próbkę w wirówce wortex i powtórzyć wirowanie w gradiencie gęstości podczas drugiej centrifugacji. Powstały osad zawierający mikro-naczynia przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po drugim wirowaniu w gradiencie gęstości ostrożnie usunąć górny dysk oraz mieszaninę snat i resuspendować osady zawierające mikro-naczynia z obu wirowań w 1 mL zimnego HBSS 1x.Następnie przemyj mikro-naczynia 20 mililitrami zimnego hbss one x i odwiruj przy 1000 Gs przez pięć minut. Po tym odlej nadsącz, uważając, aby nie zgubić mikro-naczyń. Homogenizuj osad z mikro-naczyń z jednej kory z jednym mililitrem tego samego roztworu enzymatycznego, delikatnie wstrząsając probówkami na vortexie.Kolejnie trawienie mikonaczyni trawiono przez jedną godzinę w temperaturze 37°C w wytrząsarce. Następnie przetrawione mikonaczynia z trzech kory połączono w jednej probówce. Ponownie podzielono mieszaninę do dwóch probówek Falcon o pojemności 50 ml, aby uzyskać mikonaczynia wyekstrahowane z równowartości półtorej kory na probówkę.Następnie odwiruj próbkę przy 1000 Gs przez pięć minut. W temperaturze pokojowej, bezpośrednio przed wysiewaniem mikonaczyń, wyjmij z inkubatora dwie pokryte flaski T 75 i odessa nadmiar substancji pokrywającej. Odlej nadsącz i resuspenduj osad z mikonaczyń w 1 ml ECM, a następnie dopełnij objętość w każdej probówce do 10 ml za pomocą ECM uzupełnionego o 4 µg/ml.Dodaj puromycynę, aby rozpocząć proces oczyszczania, a następnie wysiej mikro naczynia do kolby. Kolby umieść w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ aby umożliwić adhezję mikro naczyń do macierzy kolagenowo-fibonektynowej w ramach procesu oczyszczania. 24 godziny po wysiewie mikro naczyń wypłucz resztki komórkowe świeżą pożywką ECM i zastąp medium hodowlane pożywką ECM uzupełnioną o 4 µg/ml puromycyny; inkubuj do piątego dnia w temperaturze 37 °C i 5% CO₂. 24 godziny po wysiewie mikro naczyń komórki śródbłonka zaczynają migrować i rozprzestrzeniać się na macierzy kolagenowo-fibonektynowej. W piątym dniu, aby zakończyć proces oczyszczania, wypłucz resztki komórkowe świeżą pożywką ECM i zastąp medium hodowlane pożywką ECM uzupełnioną o 2 µg/ml.Stosuj Puramycynę przez kolejne trzy dni w celu proliferacji. Ósmego dnia przemyj komórki i dodaj insulinę, transferrynę oraz selenian sodu. Suplementuj pożywkę hodowlaną aż do momentu, gdy hodowle osiągną 90% konfluencji w dziesiątym dniu.Ósmego dnia przygotować filtry trzech płytek 12-dołkowych, pokrywając je mieszaniną kolagenu typu IV i fibronektyny, oba w stężeniu 0,5 µg/cm² w sterylnym wodzie do hodowli. Rozpocząć od dodania 1,5 ml sterylnej wody do hodowli do dolnej komory.Następnie dodaj 0,5 ml mieszaniny do górnej komory. Pozostaw macierz do przywarcia w temperaturze 37 °C aż do wysiewu komórek śródbłonka w tym samym dniu, na pięć dni przed ustanowieniem kokultury. Rozmroź astrocyty z fiolek kriogenicznych w temperaturze 37 °C i przenieś komórki do probówki Falcon o pojemności 15 ml z 10 ml GCM, a następnie odwiruj.Wirować zawiesinę przy 120 Gs przez osiem minut w temperaturze pokojowej. Następnie resuspendować osad astrocytów w GCM i wysiać z gęstością 30 000 komórek na centymetr kwadratowy. W przypadku płytek 12-dołkowych, umieścić płytki 12-dołkowe w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w 10. dniu, tuż przed dysocjacją RBEC za pomocą trypsyny.Przemyć zakodowany filtr pożywką DMM F 12, wstępnie napełnić komory ECM i umieścić je ponownie w inkubatorze do czasu wysiania RBEC tego samego dnia. Przemyć RBEC dwukrotnie DPBS bez wapnia i magnezu. Dodać cztery mililitry ciepłego roztworu trypsyny z EDTA na każdą kolbę T 75 w temperaturze 37 °C dokładnie na 30 sekund, a następnie usunąć 3,5 mililitra roztworu trypsyny z EDTA.Należy zadbać o to, aby warstwa trypsyny EDTA stale pokrywała komórki śródbłonka. Następnie należy obserwować proces odrywania się komórek pod mikroskopem. Gdy warstwa komórkowa zacznie odrywać się od macierzy, delikatnie opukać krawędź kolby T 75, aż wszystkie komórki będą unosić się w zawiesinie.Do każdej kolby T 75 należy dodać trzy mililitry ECM, a następnie przenieść zawartość do probówki Falcon o pojemności 50 mililitrów. Powtórzyć ten krok dwukrotnie, przepłukując podłoże w celu odzyskania wszystkich komórek.Bardzo delikatnie zdysocjuj zawiesinę komórkową, pipetując ją w górę i w dół cztery razy za pomocą pipety 10 ml z żółtą końcówką. Policz komórki w zawiesinie i niezwłocznie wysiej je z wysoką gęstością na wcześniej zakodowane i wypełnione filtry na dzień następny. Dwukrotnie wymień medium w górnej komorze, aby usunąć szczątki komórkowe i uniknąć przerwania monowarstwy komórek podczas wymiany medium.Pod kątem ustaw płytkę i nie zbliżaj pipety aspiracyjnej zbyt blisko, pozostawiając zawsze niewielką ilość pożywki nad monowarstwą komórek, aby zapobiec jej wysuszeniu podczas wymiany medium. Przemywaj tylko sześć wkładów jednocześnie. Po 24 godzinach od wysiania monowarstwa komórek powinna osiągnąć konfluencję.Następnie tego samego dnia, na jeden dzień przed ustanowieniem kokultury, należy wymienić pożywkę hodowlaną astrocytów na 1,5 mililitrów uzupełnionej pożywki różnicującej w dniu 12, który definiuje się jako pierwszy dzień różnicowania. Wymień pożywkę hodowlaną z filtrów zawierających RBEC na pożywkę różnicującą. Następnie przenieś filtry RBEC do studni zawierających astrocyty w tych warunkach.Modele in vitro różnicują się i wykazują ekspresję białek związanych z połączeniami w ciągu trzech dni, a optymalna różnicowanie trwa przez kolejne trzy dni. W tym przypadku monowarstwa komórek została poddana barwieniu immunohistochemicznemu w celu wykazania konfluencyjnej monowarstwy komórek śródbłonka mózgu o niemal niezatłoczonej morfologii i typowych komórkach wrzecionowatych o morfologii śródbłonka, a także ekspresji białek połączeń ścisłych, takich jak ZO-1 i okludyna. Szczelność monowarstwy w modelu BBB w płytce 12-dołkowej została oceniona poprzez pomiar transportu lucyferowego żółtego (Lucifer yellow).Wyniki wyrażono jako przepuszczalność lub PE w 10⁻³ cm/min; barierę uznaje się za przepuszczalną lub otwartą, gdy PE dla LY przekracza 0,6 × 10⁻³ cm/min. W ostatnich dziesięcioleciach w wielu publikacjach i przeglądach dostarczono informacji na temat statycznych i dynamicznych modeli BBB in vitro dla różnych gatunków. Niemniej jednak modele te pozostają trudne w obsłudze, a powtarzalność jakości bariery wciąż stanowi główny cel badawczy.Po obejrzeniu tego filmu naukowcy powinni uzyskać gruntowną wiedzę na temat tego, jak wytworzyć i scharakteryzować model in vitro bariery krew-mózg (PBB).

setting-up-an-vitro-model-rat-blood-brain-barrier-bbb-focus-on-bbb

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ustanowienie in vitro modelu bariery kręgowo-mózgowej (BBB) szczura: skupienie na nieprzepuszczalności BBB i transporcie pośredniczonym przez receptory

Ten film opisuje test przepuszczalności do oceny przepuszczalności bariery krew-mózg in vitro przy użyciu cząsteczek fluoresceiny sodu.

Test przepuszczalności naśladującej barierę krew-mózg: Test in vitro do oceny przepuszczalności naśladownictwa BBB dla cząsteczek znacznikowych

Ten film demonstruje metodę badania przenikania przez model bariery krew-mózg (BBB) in vitro przy użyciu astrocytów i komórek śródbłonka na wkładce membranowej, z wolnym FITC i ferrytyną obciążoną FITC. FITC-ferrytyna wiązała się z receptorami na komórkach śródbłonka i przenikała przez barierę błonową do dolnej komory, podczas gdy wolna FITC wykazywała ograniczoną przenikalność i pozostawała w górnej komorze.

Badanie przenikania FITC i FITC-ferrytyny przez model bariery krew-mózg in vitro

Opisano i zweryfikowano metodę tworzenia modelu in vitro bariery krew-mózg opartej na wspólnej hodowli komórek mikronaczyniowych śródbłonka i astrocytów mózgu szczura. System ten okazał się przydatnym narzędziem do badania wpływu nanoformulacji na przenikanie przez barierę cząsteczek fluorescencyjnych.

In vitro Przenikanie ferrytyn obciążonych FITC przez barierę krew-mózg szczura: model do badania dostarczania nanoformułowanych cząsteczek

Tutaj opisujemy mysi model bariery krew-mózg in vitro, który wykorzystuje impedancję spektroskopii komórek, koncentrując się na konsekwencjach dla integralności i przepuszczalności komórek śródbłonka po interakcji z aktywowanymi limfocytami T.

Model in vitro bariery krew-mózg przy użyciu spektroskopii impedancyjnej: skupienie się na interakcji limfocytów T z komórkami śródbłonka

Utrzymanie zasięgu bariery krew-mózg jest kluczowe dla homeostazy ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje techniki in vitro w celu nakreślenia podstawowych i patologicznych procesów, które modulują pokrycie bariery krew-mózg.

In vitro Testy oceniające tworzenie i rozrywanie naczyń przypominających siatkę bariery krew-mózg

Celem protokołu jest przedstawienie zoptymalizowanej procedury tworzenia modelu bariery krew-mózg (BBB) in vitro opartego na pierwotnych komórkach śródbłonka mózgu świni (pBECs). Model wykazuje wysoką odtwarzalność, wysoką szczelność i nadaje się do badań nad transportem i transportem wewnątrzkomórkowym w odkrywaniu leków.

Ulepszona metoda tworzenia modelu bariery krew-mózg in vitro na podstawie komórek śródbłonka mózgu świni

Tutaj prezentujemy test przepuszczalności naczyń krwionośnych mózgu myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzykiwania znaczników fluorescencyjnych, a następnie perfuzji, który ma zastosowanie do zwierzęcych modeli dysfunkcji bariery krew-mózg. Jedna półmózg służy do ilościowej oceny przepuszczalności, a druga do wizualizacji znacznika/barwienia immunologicznego. Zabieg trwa 5 - 6 godzin dla 10 myszy.

Test przepuszczalności bariery krew-mózg in vivo u myszy przy użyciu znaczników znakowanych fluorescencyjnie

Tutaj opisana jest metoda izolacji mikronaczyń mózgowych szczurów i przygotowania próbek błonowych. Protokół ten ma wyraźną zaletę polegającą na wytwarzaniu wzbogaconych próbek mikronaczyń o akceptowalnej wydajności białka od poszczególnych zwierząt. Próbki można następnie wykorzystać do solidnych analiz białek w śródbłonku mikronaczyniowym mózgu.

Prosta i powtarzalna metoda przygotowania próbek błonowych ze świeżo wyizolowanych mikronaczyń mózgu szczura

Ten protokół opisuje metodę tworzenia ludzkiej bariery krew-mózg (BBB) w modelu in vitro. Komórki śródbłonka i perycyty są wysiewane po obu stronach wkładki filtracyjnej (przedział krwi), a astrocyty są wysiewane w dolnej studzience (przedział mózgowy). Scharakteryzowany model wykorzystano w eksperymentach z transportem nanocząstek.

System potrójnej hodowli komórkowej modelujący ludzką barierę krew-mózg

Bariera krew-mózg (BBB) odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu stabilnego i zdrowego środowiska mózgu. Dysfunkcja bariery krew-mózg jest związana z wieloma chorobami neurologicznymi. Opracowaliśmy trójwymiarowy model bariery krew-mózg pochodzący z komórek macierzystych, aby zbadać patologię naczyń mózgowych, integralność bariery krew-mózg oraz sposób, w jaki bariera krew-mózg jest zmieniona przez genetykę i chorobę.

Rekonstrukcja bariery krew-mózg in vitro w celu modelowania i terapeutycznego ukierunkowania choroby neurologicznej

Ten protokół opisuje niezawodny i skuteczny model in vitro bariery mózgowo-krwiennej. Metoda wykorzystuje mysie komórki śródbłonka naczyniowego mózgu bEnd.3 i mierzy transbłonowy opór elektryczny.

Zapis integralności funkcjonalnej bariery na komórkach śródbłonka naczyniowego bEnd.3 poprzez transśródbłonkową detekcję oporu elektrycznego

Poznaj metodę tworzenia modelu in vitro bariery krew-mózg szczura z wykorzystaniem współkultury komórek śródbłonowych i astrocytów. Model ten charakteryzuje się wysoką rezystancją elektryczną i niską przepuszczalnością.

Tworzenie modelu in vitro bariery krew-mózg szczura (BBB): skupienie się na nieprzepuszczalności bariery krew-mózg i transporcie za pośrednictwem receptorów (Wideo) | JoVE Journal

Tworzenie modelu in vitro bariery krew-mózg szczura (BBB): skupienie się na nieprzepuszczalności bariery krew-mózg i transporcie za pośrednictwem receptorów

Przeglądaj więcej filmów