Tworzenie modelu in vitro bariery krew-mózg szczura (BBB): skupienie się na nieprzepuszczalności bariery krew-mózg i transporcie za pośrednictwem receptorów

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie wysoce powtarzalnego modelu in vitro bariery krew-mózg szczura. Osiąga się to poprzez usunięcie nerwów wzrokowych, móżdżku i opon mózgowych pod mikroskopem stereoskopowym, a następnie oddzielenie dwóch półkul mózgowych i wypreparowanie ich w celu uzyskania czystego fragmentu kory. Drugim krokiem jest wyizolowanie mikronaczyń z kory poprzez obróbkę enzymatyczną i wirowanie w zależności od gęstości.

Następnie mikronaczynia są powlekane i inkubowane z pur mycyną w celu oczyszczenia komórek śródbłonka z komórek zanieczyszczających, takich jak pasożyty. Czyste kultury komórek śródbłonka mózgu owijanego namnażają się, aż komórki osiągną 90% zbieżności. Ostatnim krokiem jest wywołanie różnicowania komórek śródbłonka mózgu szczura przez komórki w górnej komorze filtrów wprowadzanych i kohodowla ich z astrocytami szczurów, które zostały wcześniej przygotowane i platerowane.

Ostatecznie zróżnicowaną monowarstwę komórek śródbłonka mózgu można scharakteryzować przez ekspresję specyficznych białek połączeń ścisłych oraz przez wskaźnik przepuszczalności związku referencyjnego w poprzek monowarstwy komórek śródbłonka od górnego przedziału. Modele BBB in vitro, takie jak ten przedstawiony tutaj, są przydatne do badania dystrybucji komórkowej kluczowych cząsteczek i odkrywania podstawowych komórkowych i molekularnych mechanizmów funkcjonowania BBB. W szczególności takie modele pozwalają na eksplorację receptorów BBB, ich udziału w endocytozie, transporcie i transcytozie w naszych rękach.

Modele BBB in vitro są wykorzystywane głównie do badania celowania w określone receptory za pomocą wektorów peptydowych, które opracowujemy Aby ułatwić dostarczanie leków do OUN przez barierę krew-mózg, stosujemy proces zwany transcytozą za pośrednictwem receptora, znany również jako podejście konia trojańskiego. Opis wizualny ma kluczowe znaczenie dla jednostek. Nowość w tej metodzie będzie wymagała umiejętności preparacji, a mikroskop jest wystarczająco szybki i dokładny, aby wprowadzić przeżycie tkanki podczas procesu produkcji komórek.

Innym krytycznym punktem jest przedwczesne zakończenie obszaru delikatnego i tele łososia, aby uniknąć otwarcia bariery podczas eksperymentów. Wreszcie, ten pomysł pokaże szczegóły wzdłuż protokołu, które zrobią różnicę między czerwonymi a wizualizowanymi protokołami, pokazując, że procedura zostanie wykonana przeze mnie i mojego kolegę. Rozpocznij tę procedurę od pokrycia dwóch kolb T 75 kolagenem typu czwartego i fibronektyną w ilości jednego mikrograma na centymetr kwadratowy w sterylnej wodzie hodowlanej i pozwól im przylegać w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza do momentu wysiewu mikronaczyń.

Dwa dni później wyjęto mózg z czaszki trzech pięciotygodniowych szczurów Vista i przeniesiono je na szalkę Petriego wypełnioną zimnym buforem preparacyjnym trzymanym na lodzie. Wypreparuj mózgi bez móżdżku i nerwów wzrokowych. Następnie przetnij każdy mózg na pół, aby oddzielić dwie półkule mózgowe pod mikroskopem stereoskopowym.

Wykonaj kolejne cięcie, aby usunąć śródmózgowie i przenieś wszystkie cztery mózgi na czystą szalkę Petriego na lodzie z buforem preparacyjnym. Następnie przenieś jedno przodomózgowie na nową szalkę Petriego wypełnioną zimnym buforem preparacyjnym. Przytrzymaj go zaciskiem i ostrożnie odłącz opony mózgowe od krawędzi przodomózgowia.

Następnie odwróć przodomózgowie i ostrożnie oderwij opony mózgowe, nie rozrywając ich. Upewnij się, że przodomózgowie jest oczyszczone z opon mózgowych i odetnij pozostałą część nerwów wzrokowych. Celem tego etapu jest usunięcie kołdry z istoty białej w celu uzyskania powłoki kory mózgowej.

Zacznij od zaciśnięcia przodomózgowia na krawędzi, a następnie ostrożnie przeciągnij kleszcze po powierzchni, uważając, aby nie rozerwać powierzchni kory. Następnie upewnij się, że mózg jest wolny od opon mózgowych, przewracając go, aby sprawdzić, czy nie ma szczątkowych opon mózgowych lub dużych naczyń powierzchniowych. Następnie, zaczynając od ekstrakcji trzech mózgów z ich czaszki, pełny czas na sekcję nie powinien zająć więcej niż dwie godziny na zachowanie tkanek i przeżycie komórek.

Przenieś korę trzech mózgów do sześciu mililitrów zimnego buforu rozwarstwiającego w siedmiomililitrowym homogenizatorze w dół, a następnie zdysocjuj korę za pomocą 10 ruchów w górę iw dół pierwszym tłuczkiem o większym prześwicie, a następnie 10 ruchów w górę iw dół z drugim palcem o mniejszym prześwicie. Następnie przenieś sześć mililitrów zawiesiny do nowej 50-mililitrowej rurki Falcon i przemyj homogenizator downs 24 mililitrami bufora do rozwarstwiania węgla, podziel zawiesinę na trzy rurki Falcon, aby uzyskać odpowiednik jednej kory na probówkę. Następnie odwirować w temperaturze 1000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Obserwacja granulki pokazuje gradient różowego koloru, który reprezentuje mikronaczynia będące częścią kory mózgowej. Homogenat teraz wyrzuć snat i homogenizuj osad z jednej kory za pomocą jednego mililitra roztworu enzymatycznego zawierającego mieszaninę kolagenaz dyse, DNA typu pierwszego i gentamycyny. Umieść probówki w shakerze na 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie wymieszaj jeden mililitr trawienia z 10 mililitrami 25% B-S-A-H-B-S-S jeden X i delikatnie zwiruj probówki, a następnie oddziel je przez zależne od gęstości wirowanie w temperaturze 3 600 G przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu zależnym od gęstości osad zawiera mikronaczynia, a górny krążek zawiera mielinowy miąższ mózgu i resztkowe mikronaczynia. Ostrożnie przenieś górny dysk i supernatant do czystych 50-mililitrowych probówek Falcon

Uważaj, aby nie zassać granulatu mikronaczyń, delikatnie zawirować probówkę i powtórzyć wirowanie zależne od gęstości podczas drugiego wirowania. Powstały osad zawierający mikronaczynia należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po drugim wirowaniu zależnym od gęstości ostrożnie wyrzuć górny krążek i mieszankę snat i ponownie zawieś powstałe granulki zawierające mikronaczynia z obu wirówek z jednym mililitrem zimnego HBSS jeden x.

Następnie umyj mikronaczynia 20 mililitrami zimnego hbss one x i odwiruj w temperaturze 1000 G przez pięć minut. Następnie wyrzuć nadnatant, uważając, aby nie zgubić mikronaczyń. Osad homogenizuje mikro naczynia osad z jednej kory z jednym mililitrem tego samego roztworu enzymatycznego po delikatnym wirze rurek.

Dalej trawić mikronaczynia przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w shakerze. Następnie wymieszaj strawione mikronaczynia z trzech kory mózgowej w jednej probówce. Ponownie rozdziel mieszaninę na dwie 50-mililitrowe probówki sokoła, aby uzyskać mikronaczynia wyekstrahowane z odpowiednika półtorej kory na probówkę.

Następnie odwirować w temperaturze 1000 g przez pięć minut. W temperaturze pokojowej, tuż przed posiewem mikronaczyń, wyjąć z inkubatora dwie powlekane kolby T 75 i odessać nadmiar powłoki. Wyrzuć snat i ponownie zawieś osad mikronaczyń w jednym mililitrze ECM, doprowadź każdą probówkę do 10 mililitrów za pomocą ECM uzupełnionego czterema mikrogramami na mililitr.

Usuń mycynę, aby rozpocząć proces oczyszczania i umieść mikronaczynia w kolbie. Następnie umieść kolby w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2, aby umożliwić przyleganie mikronaczyń do matrycy fibronektyny kolagenowej w celu śledzenia procesu oczyszczania. 24 godziny po posiewie mikronaczyń przemyć resztki komórek świeżym ECM i zastąpić pożywkę hodowlaną ECM uzupełnionym czterema mikrogramami na mililitr pur mycyny do piątego dnia w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO 2 24 godziny po posiewie mikronaczyń komórki śródbłonka zaczynają migrować i rozprzestrzeniać się na matrycy fibronektyny kolagenu w piątym dniu, aby zakończyć proces oczyszczania, przemyć resztki komórek świeżym ECM i zastąpić pożywkę hodowlaną ECM uzupełnionym o dwa mikrogramy na mililitr.

Puram mycyna jeszcze przez trzy dni w celu proliferacji. Ósmego dnia umyj komórki i dodaj insulinę transferynę i selenin sodu. Uzupełnij pożywkę hodowlaną, aż kultury osiągną 90% zbiegu w 10 dniu.

Ósmego dnia przygotuj filtry z trzech 12-dołkowych płytek, pokrywając je mieszanką kolagenu. Typ czwarty i fibronektyna w dawce 0,5 mikrograma na centymetr kwadratowy w sterylnej wodzie hodowlanej. Zacznij od dodania 1,5 mililitra sterylnej wody hodowlanej do dolnej komory.

Następnie dodaj 0,5 mililitra mieszanki do górnej komory. Pozostawić matrycę do przylegania w temperaturze 37 stopni Celsjusza do wysiewu komórek śródbłonka tego samego dnia, pięć dni przed ustanowieniem kokultury. Rozmrozić astrocyty z fiolek kriogenicznych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i przenieść komórki do 15-mililitrowej probówki sokoła z 10 mililitrami wirówki GCM.

Zawiesina w temperaturze 120 G przez osiem minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawieś osad astrocytów w GCM i płytkę o gęstości 30 000 komórek na centymetr kwadratowy. W 12-dołkowych płytkach umieść 12-dołkowe płytki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2 w dniu 10, tuż przed dysocjacją RBEC z trypsyną.

Umyj wstępnie zakodowany filtr medium DMM F 12, wstępnie napełnij komory ECM i umieść je z powrotem w inkubatorze do czasu posiewu RBEC tego samego dnia. Umyj RBEC dwukrotnie DPBS bez wapnia i magnezu. Dodać cztery mililitry ciepłego roztworu EDTA trypsyny na kolbę T 75 w temperaturze 37 stopni Celsjusza dokładnie przez 30 sekund i usunąć 3,5 mililitra roztworu trypsyny EDTA.

Uważaj, aby zawsze mieć warstwę trypsyny EDTA pokrywającą komórki śródbłonka. Następnie śledź oderwanie komórek przez obserwację pod mikroskopem. Gdy warstwa komórek zacznie odłączać się od matrycy, delikatnie postukaj w krawędź kolby T 75, aż wszystkie komórki zaczną unosić się na wodzie.

Dodać trzy mililitry ECM do każdej kolby T 75 i przenieść do 50-mililitrowej probówki Falcon. Powtórz ten krok dwukrotnie. Poprzez przepłukanie pożywki w celu odzyskania wszystkich komórek.

Bardzo delikatnie rozdzielić zawiesinę komórek, pipetując czterokrotnie w górę i w dół za pomocą 10-mililitrowej pipety wyposażonej w żółtą końcówkę. Policz komórki w zawiesinie i natychmiast umieść je na wstępnie zakodowanych i wstępnie napełnionych filtrach o wysokiej gęstości następnego dnia. Zmień pożywkę w górnej komorze dwukrotnie, aby usunąć resztki komórek, aby uniknąć rozerwania monowarstwy komórek podczas wymiany pożywki.

Płytkę należy lekko ustawić pod kątem i nie zbliżać się do pipety aspiracyjnej, zawsze pozostawiając trochę pożywki nad monowarstwą komórki, aby uniknąć wysuszenia monowarstwy komórek podczas wymiany pożywki. Myj tylko sześć wkładów na raz. 24 godziny po posianiu monowarstwa ogniw musi znajdować się w punkcie zgrywania.

Następnie tego samego dnia, na dzień przed ustanowieniem kokultury, zastąp pożywkę do hodowli astrocytów 1,5 mililitra uzupełnionej pożywki różnicującej w dniu 12, który definiuje się jako pierwszy dzień różnicowania. Zastąp pożywki hodowlane z filtrów zawierających RBEC pożywką różnicującą. Następnie przenieś filtry RBEC do studzienek zawierających astrocyty w tych warunkach.

Modele in vitro różnicują i wyrażają białka związane ze złączami w ciągu trzech dni, a optymalne różnicowanie trwa jeszcze przez trzy dni. W tym przypadku monowarstwa komórkowa była immunostainowana z mentonem, aby odsłonić zlewającą się monowarstwę komórek śródbłonka mózgu o nienakładającej się morfologii i typowych komórkach w kształcie wrzeciona o morfologii śródbłonka, a także ekspresję białek ścisłego połączenia z pazurami w pięciu ZO jeden i szczelność monowarstwy okludyny w 12. Otóż model BBB został oceniony poprzez pomiar transportu żółtego Lucyfera.

Wyniki są wyrażone w przepuszczalności lub PE w 10 do minus trzech centymetrów na minutę, a barierę uważa się za przepuszczalną lub otwartą, gdy PE LY jest powyżej 0,6 razy 10 do minus trzech centymetrów na minutę. W ostatnich dziesięcioleciach wiele publikacji i przeglądów dostarczyło informacji na temat statycznego i dynamicznego modelu BBB in vitro u różnych gatunków. Jednak takie modele są nadal trudne w obsłudze, a powtarzalność jakości bariery pozostaje głównym celem.

Po obejrzeniu tego filmu naukowcy powinni dobrze zrozumieć, jak wyprodukować i scharakteryzować model PBB in vitro.