Name: Sekwencyjne obrazowanie in vivo osteogennych komórek macierzystych/progenitorowych podczas naprawy złamań (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Poznaj metodę sekwencyjnego obrazowania in vivo komórek macierzystych/progenitorowych podczas naprawy złamań. Technika ta umożliwia śledzenie migracji, proliferacji i różnicowania endogennych osteogenicznych komórek macierzystych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy C. Parkowi za przeczytanie rękopisu. Praca ta była wspierana przez NIAMS w ramach Nagrody Numer K01AR061434 oraz Nagrody Stypendialnej Towarzystwa Białaczki i Chłoniaka (5127-09) dla D.P oraz grantów National Institutes of Health dla C.P.L. i D.T.S. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

1. Myszy i kondycjonowanie wstępne
Uwaga: Wszystkie myszy były utrzymywane w warunkach wolnych od patogenów, a wszystkie protokoły zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Massachusetts General Hospital. Wszystkie zabiegi chirurgiczne powinny być wykonywane w sterylnych warunkach przy użyciu sterylizowanego w autoklawie sterylnego sprzętu. Mx1-Cre15, Rosa26-loxP-stop-loxP-EYFP (Rosa-YFP) i Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Rosa-Tomato) zostały zakupione w Jackson Laboratories. Myszy z osteokalcyną-GFP zostały dostarczone przez dr Henry'ego Kronenberga. Do ilościowej analizy migracji i proliferacji OSPC in vivo wykorzystano myszy Mx1-Cre + Rosa-YFP + (pojedynczy kolorowy reporter). Aby bardziej szczegółowo śledzić ich różnicowanie się w dojrzałe osteoblasty Osteocalcin+, użyliśmy trigenicznych myszy Mx1-Cre + Rosa-Tomato + Ocn-GFP+.
<ol>
	<li>Aby oznaczyć komórki Mx1+ in vivo, przygotuj kwas poliinozynowo-policytydylowy (pIpC, 2,5 mg / ml) w sterylnym roztworze PBS i wstrzyknij 200 μl na 20 g myszy reporterowej Mx1-Cre + dootrzewnowo raz na drugi dzień przez 10 dni.</li>
	<li>Aby wyeliminować rezydujące komórki krwiotwórcze Mx1 +, należy napromienić myszy pojedynczą dawką 9,5 Gy. Po 24 godzinach napromieniania przeszczepić dożylnie komórki szpiku kostnego typu dzikiego (1x106 komórek/mysz)16. Uwaga: Ponieważ komórki indukowane Mx1 obejmują komórki hematopoetyczne i osteoklasty pochodzenia hematopoetycznego, eliminacja komórek krwiotwórczych Mx1 + poprawia jakość obrazowania i ilościowe oznaczanie komórek osteogennych Mx1 +.</li>
	<li>Po przeszczepie szpiku kostnego należy monitorować zwierzęta przez cztery do sześciu tygodni w celu pomyślnego ponownego zasiedlenia komórek dawcy.</li>
</ol>
2. Przygotowanie myszy
<ol>
	<li>Znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 50 μl ketaminy/ksylazyny (100 mg/kg, ksylazyny 12 mg/kg masy ciała) przy użyciu procedury zatwierdzonej przez IACUC. Uwaga: Czas działania może zostać wydłużony przez dodatkową dawkę ketaminy/ksylazyny.</li>
	<li>Ustal, czy mysz jest w pełni znieczulona przez brak reakcji na szczypanie palców u nóg i/lub ogona. (Opcjonalnie) Gdy mysz jest znieczulona, przymocuj maskę gazową izofluranową na nosie, przyklejając ją taśmą. Dostosuj poziom izofluranu, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni uspokojone.</li>
	<li>Przytnij włosy na skórze głowy za pomocą elektrycznego trymera lub małych nożyczek. Usuń fragmenty włosów i wysterylizuj odsłoniętą skórę wacikiem nasączonym 70% alkoholem. Zastosuj żel łzowy, aby zapobiec odwodnieniu rogówki.</li>
</ol>
3. Uraz spowodowany mikrozłamaniami
<ol>
	<li>Po upewnieniu się, że zwierzę jest w pełni uspokojone, wykonaj pojedyncze odwrócone nacięcie w kształcie litery L, aby otworzyć skórę głowy. Krótko wykonaj pierwsze poprzeczne nacięcie (mniej niż 1 cm), zaczynając od jednego ucha do drugiego ucha. Obrócić o ~60° i kontynuować nacinanie w kierunku nosa, aż do ~2-3 mm od nosa. Uwaga: To nacięcie minimalizuje tworzenie się tkanek bliznowatych nad obszarem, który ma być obrazowany.</li>
	<li>Oddziel płaty skóry, pociągając w kierunku boków kleszczami. Zarówno kości czołowe, jak i przecięcie szwów strzałkowych i koronalnych powinny być wyraźnie wyeksponowane.</li>
	<li>Oczyść otwartą powierzchnię, spłukując sterylnym PBS i delikatnie przecierając sterylną gazą lub wacikami, aż wszystkie resztki włosów zostaną usunięte.</li>
	<li>Aby wygenerować mikropęknięcia na kalwarii, jedną ręką przytrzymaj głowę myszy, a drugą igłę 30 G. Wykonać mikronakłucie (nawinąć o średnicy ~0,2 mm o głębokości < 1 mm) na lewej kości czołowej w pobliżu przecięcia szwów strzałkowych i koronalnych, wprowadzając końcówkę igły 30 G z delikatnym naciskiem i ruchem skręcającym. Uwaga: Bardzo ważne jest, aby nie dopuścić do wniknięcia igły do mózgu, minimalizując w ten sposób krwawienie i uszkodzenie tkanek.</li>
	<li>Zmień na większą igłę (20 lub 25 G) i poszerz otwór do nakłucia, przekręcając igłę (średnica ~0,5 mm).</li>
	<li>Powtórz krok 3.3-3.5, aby wygenerować drugie nakłucie na przeciwległej kości czołowej.</li>
	<li>Zetrzyj zranione miejsca poprzez ciągłe upuszczanie PBS, aż krwawienie ustanie. 
	Uwaga: Krwawienie w miejscach złamań zakłóca prawidłowe obrazowanie i powoduje powstawanie blizn.</li>
	<li>Nałóż kroplę sterylnego roztworu soli fizjologicznej lub 2% Methocel na czaszkę, aby uniknąć wysuszenia. Uwaga: Nie pozwól, aby powierzchnia czaszki wyschła, ponieważ zmniejszy to klarowność obrazu. Ważne jest, aby użyć wystarczającej ilości żelu lub soli fizjologicznej, aby pokryć obszar.</li>
</ol>
4. Obrazowanie przyżyciowe
<ol>
	<li>(Opcjonalnie) Przed obrazowaniem niektórym myszom wstrzykuje się barwnik naczyniowy, aby uwidocznić naczynia krwionośne. Wstrzyknąć retroorbitalnie 20 μl niedocelowego Qtracker 705 (2 μM roztwór w 50 mM buforze boranowym) rozcieńczonego w 80 ml PBS. Użyj strzykawki insulinowej, aby zminimalizować straty odczynników. Jeśli sygnał nie jest wystarczająco jasny, mogą być wymagane dodatkowe ilości.</li>
	<li>Włącz skaner. Uwaga: Wielokątny skaner laserowy umożliwia jednoczesną wielokanałową akwizycję obrazu z szybkością wideo (30 klatek na sekundę). Skanowanie z szybkością wideo jest bardzo ważne w przypadku obrazowania żywych zwierząt.</li>
	<li>Włącz laser wielofotonowy (femto-sekundowy laser tytanowo-szafirowy). Ustaw długość fali na 880 nm i dostosuj moc do obrazowania kości w drugiej generacji harmonicznej (440 nm). W przypadku wzbudzenia GFP i tdTomato włącz lasery na ciele stałym 491 nm i 561 nm.</li>
	<li>Włącz detektory PMT (lampa fotopowielacza) dla każdego sygnału (filtr pasmowo-przepustowy 435 ± 20 nm dla generowania drugiej harmonicznej, filtr pasmowo-przepustowy 528 ± 19 nm dla GFP i 590 ± 20 dla tdTomato). (Opcjonalnie) Do wykrywania sygnału Qtracker 705 należy użyć lasera helowo-neonowego o długości fali 638 nm i filtra pasmowo-przepustowego 695 ± 27,5 nm.</li>
	<li>Umieść zwierzę na zmotoryzowanym stoliku mikroskopu z osią XYZ. Utrzymuj mysz w najwygodniejszej pozycji dzięki elektrycznej poduszce grzewczej, która pomaga utrzymać temperaturę ciała (zmniejsza to ryzyko utraty przez zwierzęta). Użyj taśmy do przytrzymania myszy, aby zminimalizować ruch podczas obrazowania i utrzymać obrazowany obszar tak poziomo, jak to możliwe. </li>
	<li>Nałóż kroplę ciepłego 2% żelu metylocelulozowego lub roztworu soli fizjologicznej na czaszkę, aby uniknąć wysuszenia. Umieść szkło nakrywkowe na obszarze obrazowania. Użyj obiektywu o małym powiększeniu (obiektyw zanurzony w wodzie 30x i 0,9 NA), aby zeskanować kalwarię.</li>
	<li>Korzystając ze sterownika osi XYZ, znajdź powierzchnię kalwarii, wykrywając sygnał SHG z kości i zidentyfikuj kluczowe miejsce punktu orientacyjnego, takie jak przecięcie szwów strzałkowych i szwów koronalnych. Uzyskaj obraz i zapisz współrzędne XYZ.</li>
	<li>Kontynuuj poszukiwanie lokalizacji urazu, obserwując sygnały SHG i fluorescencyjne.</li>
	<li>Po znalezieniu miejsc uszkodzenia lub obszaru zainteresowania uzyskaj obraz najlepszej płaszczyzny ogniskowej zawierającej SHG i sygnały fluorescencyjne z komórek będących przedmiotem zainteresowania. Zapisz współrzędne XYZ i odległość do przecięcia szwów strzałkowych i koronalnych, aby określić ich dokładne położenie dla kolejnych rund obrazowania.</li>
	<li>Aby zebrać 3D struktury komórkowe i kostne urazów złamań, rejestruj obrazy za pomocą stosów Z (odstęp 2 - 5 μm) z głębokością ~100 μm od powierzchni kości śródkostnej. Po zakończeniu obrazowania jednej strony urazu należy powtórzyć proces obrazowania dla kolejnych miejsc urazu.</li>
</ol>
5. Procedury pooperacyjne
<ol>
	<li>Po obrazowaniu przepłukać miejsce obrazowania sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć żel metylocelulozowy z czaszki. Za pomocą sterylnego wacika nałóż niewielką ilość maści z potrójnym antybiotykiem na powierzchnię. Zakryj płaty skóry i ponownie zamknij skórę głowy za pomocą chirurgicznego szycia. Można to zrobić za pomocą hipoalergicznej nici do szycia (wchłanialny szew poliglaktynowy) i igły do szycia w rozmiarze 5-0. Uwaga: Dobra technika szycia minimalizuje powstawanie blizn.</li>
	<li>Leczyć wszystkie zwierzęta wstrzyknięciem IP 0,05-0,1 mg/kg buprenorfiny co 12 godzin przez 48 godzin po zabiegu. Trzymaj zwierzęta w ciepłej komorze rekonwalescencji, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności. Po 3 do 5 dniach ponownie otwórz szew i powtórz czynności obrazowania przyżyciowego, aby śledzić zmiany komórkowe podczas gojenia się złamań.</li>
</ol>

<ol><li>Harada, S., Rodan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+osteoblast+function+and+regulation+of+bone+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of osteoblast function and regulation of bone mass.</a> Nature. 423, 349-355 (2003).</li>
<li>Manolagas, S. C., Parfitt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+old+means+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">What old means to bone.</a> Trends Endocrinol Metab. 21, 369-374 (2010).</li>
<li>Khosla, S., Riggs, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+age-related+bone+loss+and+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinol+Metab+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of age-related bone loss and osteoporosis.</a> Endocrinol Metab Clin North Am. 34, 1015-1030 (2005).</li>
<li>Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Latsinik, N. V., Panasyuk, A. F., Keiliss-Borok, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+responsible+for+transferring+the+microenvironment+of+the+hemopoietic+tissues.+Cloning+in+vitro+and+retransplantation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo.</a> Transplantation. 17, 331-340 (1974).</li>
<li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466, 829-834 (2010).</li>
<li>Park, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+Bone+Marrow+MSCs+Are+Dynamic%2C+Fate-Restricted+Participants+in+Bone+Maintenance+and+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Endogenous Bone Marrow MSCs Are Dynamic, Fate-Restricted Participants in Bone Maintenance and Regeneration.</a> Cell Stem Cell. 10, 259-272 (2012).</li>
<li>Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+remodeling+during+fracture+repair%3A+The+cellular+picture%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture.</a> Semin Cell Dev Biol. 19, 459-466 (2008).</li>
<li>Holstein, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+affects+early+fracture+healing+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Rapamycin affects early fracture healing in mice.</a> Br J Pharmacol. 154, 1055-1062 (2008).</li>
<li>Maes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblast+precursors%2C+but+not+mature+osteoblasts%2C+move+into+developing+and+fractured+bones+along+with+invading+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels.</a> Dev Cell. 19, 329-344 (2010).</li>
<li>Grcevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fate+mapping+identifies+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells. 30, 187-196 (2012).</li>
<li>O'Neill, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-computed+tomography+assessment+of+the+progression+of+fracture+healing+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice.</a> Bone. 50, 1357-1367 (2012).</li>
<li>Kovar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared-labeled+tetracycline+derivative+is+an+effective+marker+of+bone+deposition+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Near-infrared-labeled tetracycline derivative is an effective marker of bone deposition in mice.</a> Anal Biochem. 416, 167-173 (2011).</li>
<li>Mayer-Kuckuk, P., Boskey, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+promotes+progress+in+orthopedic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging promotes progress in orthopedic research.</a> Bone. 39, 965-977 (2006).</li>
<li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells+in+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457, 92-96 (2009).</li>
<li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269, 1427-1429 (1995).</li>
<li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+bone+marrow+transplantation+%28BMT%29%3A+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%3A+JAALAS%22%5BJournal%5D)">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, 11-22 (2009).</li>
<li>Tu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osterix+overexpression+in+mesenchymal+stem+cells+stimulates+healing+of+critical-sized+defects+in+murine+calvarial+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone.</a> Tissue Eng. 13, 2431-2440 (2007).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Regulacja szkieletowych komórek macierzystych może mieć ogromne znaczenie dla określenia lepszych metod regeneracji kości. Obrazowanie ilościowe i sekwencyjne na poziomie komórkowym było wyzwaniem technicznym. Chociaż mysi model złamania kości długiej jest szeroko stosowany i nadaje się do badań biomechanicznych 17, jego głębokie umiejscowienie tkanek, nierówny rozmiar złamania, uszkodzenie tkanek miękkich i zastosowanie stabilizujących stabilizatorów mają ograniczone sekwencyjne obrazowanie przyżyciowe. W tym...

Choroby zwyrodnieniowe kości i związana z wiekiem utrata masy kostnej, prowadząca do wysokiego ryzyka złamań osteoporotycznych, stały się głównym wyzwaniemw zakresie zdrowia publicznego1. Utrzymanie kości jest kontrolowane przez osteoblasty tworzące kości i osteoklasty resorbujące kości. Ubytki komórek kościotwórczych są główną przyczyną związanej z wiekiem utraty masy kostnej i chorób zwyrodnieniowych kości2,3. Podczas gdy szeroko zakrojone badania koncentrowały się na poprawie gojenia się złamań, odkrycie niezawodnych leków do leczenia chorób zwyrodnieniowych kości i odwrócenia słabości złamań osteoporotycznych pozostaje ważną kwestią. W związku z tym badanie źródła komórek tworzących kości i ich mechanizmów kontrolnych w regeneracji i naprawie kości dostarcza nowych informacji na temat poprawy regeneracji szkieletu i odwrócenia chorób związanych z utratą masy kostnej.
Istnienie multipotencjalnych komórek mezenchymalnych w szpiku kostnym zostało zaproponowane na podstawie identyfikacji populacji klonogennych, które mogą różnicować się w linie osteogenne, adipogenne i chondrogenne ex vivo4. Ostatnio wiele badań wykazało, że szkieletowe/mezenchymalne komórki macierzyste (SSC/MSC) są naturalnym źródłem osteoblastów i mają kluczowe znaczenie dla obrotu kostnego, przebudowy i naprawy złamań5,6. Ponadto nasze badanie śledzące linię wykazało, że dojrzałe osteoblasty mają nieoczekiwanie krótki okres półtrwania (~60 dni) i są stale uzupełniane przez komórki macierzyste/progenitorowe zarównow normalnych warunkach homeostatycznych, jak i naprawie złamań6. Jednak tożsamość komórek macierzystych in vivo i to, jak takie komórki reagują na uszkodzenia spowodowane złamaniami i zaopatrują komórki kościotwórcze, są niejasne. Dlatego ważne jest, aby opracować metodę, która będzie w stanie analizować migrację, proliferację i różnicowanie endogennych SSC/MSCs w warunkach fizjologicznych.
Naprawa pęknięć to wielokomórkowy i dynamiczny proces regulowany przez szereg złożonych cytokin i czynników wzrostu7. Najpopularniejszym podejściem do badań złamań jest użycie modelu zwierzęcego ze złamaniem kości długiej oraz analiza kości za pomocą technik przekroju kości i immunofluorescencji8-10. Ten proces naprawy można monitorować za pomocą wielu technik obrazowania, w tym mikro-CT11, fluorescencji w bliskiej podczerwieni12 i obrazowania chemiluminescencyjnego13. Jednak każda technika ma pewne ograniczenia i nie ma skutecznego sposobu monitorowania funkcji SSC/MSC na poziomie komórkowym in vivo. Ostatnio opracowano mikroskopię przyżyciową konfokalną/dwufotonową, która jest wykorzystywana do wykrywania przeszczepionych komórek nowotworowych i hematopoetycznych komórek macierzystych w kontekście mikrośrodowiska szpiku kostnego, nawet w rozdzielczości pojedynczej komórki u żywych zwierząt14. Łącząc tę technologię z szeregiem modeli śledzenia linii, byliśmy w stanie określić, że osteogenne komórki macierzyste / progenitorowe mogą być genetycznie naznaczone przez przejściową aktywację promotora oporności na myksowirusa-1 (Mx1), a progenitory indukowane przez Mx1 mogą utrzymać większość dojrzałych osteoblastów w czasie, ale nie uczestniczą w generowaniu chondrocytów u dorosłej myszy6. Ponadto wykazaliśmy, że OSPC znakowane Mx1 dostarczają większość nowych osteoblastów w procesie gojenia złamań6.
Tutaj, korzystając z modeli śledzenia linii kostnych i mikroskopii przyżyciowej, dostarczany jest protokół do zdefiniowania in vivo kinetyki osteogennych komórek macierzystych/progenitorowych Mx1+ podczas naprawy złamań. Protokół ten oferuje obrazowanie sekwencyjne w celu śledzenia przemieszczania się osteogennych pni/progenitorów do miejsc złamań oraz ilościowego pomiaru ekspansji osteoprogenitorów we wczesnym procesie naprawy. Podejście to może być przydatne w wielu kontekstach, w tym w ocenie kandydatów terapeutycznych w celu poprawy naprawy kości.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J (H-2B)</td><td>Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy do wstrzykiwań</td><td>Bionichepharma</td><td>67457-001-10</td><td>&nbsp; Wielkość fiolki: 10 ml (50 mg/ml)</td></tr><tr><td>Sterylny roztwór ksylazyny</td><td>Lloyd Inc.</td><td>NADA# 139-236</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina Hl</td><td>BEDFORD LAB</td><td>NDC 55390-100-10</td><td>Fiolka: 0,3 mg / ml, Dawki: 0,05-0,1 mg / kg</td></tr><tr><td>DPBS, 1X</td><td>CORNING cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Podkładki nasączone alkoholem (70% alkoholu izopropylowego)</td><td>Kendall WEBCOL</td><td>5110</td><td></td></tr><tr><td>Drobne nożyczki chirurgiczne</td><td>FST</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>Bardzo cienkie kleszcze</td><td>FST</td><td>11150-10</td><td></td></tr><tr><td>VICRYL*Plus Nici</td><td>Ethicon</td><td>VCP490G</td><td></td></tr><tr><td>Qtracker 705 niecelowana kropka kwantowa</td><td>Invitrogen</td><td>Q21061</td><td></td></tr><tr><td>Methocel 2%</td><td>OmmiVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pIpC (kwas poliinozynowo-policytydylowy)&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P0913-50MG</td><td>100 &mu; l (2,5 mg/ml w PBS) dla 10 g myszy</td></tr><tr><td>Mai Tai Przestrajalne ultraszybkie lasery</td><td>Spectra Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS</td> laser <td>Cobolt AB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Radius-635 HeNe laser</td><td>Koherent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sekwencyjne obrazowanie in vivo osteogennych komórek macierzystych/progenitorowych podczas naprawy złamań

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Kość przewraca się w sposób ciągły i jest wysoce regenerująca po urazie. Od dawna przypuszczano, że osteogenne komórki macierzyste/progenitorowe istnieją, ale dopiero niedawno udało się wykazać istnienie takich komórek in vivo. W tym artykule przedstawiono techniki obrazowania in vivo w celu zbadania roli endogennych osteogennych komórek macierzystych/progenitorowych (OSPC) i ich potomstwa w naprawie kości. Korzystając z modeli śledzenia komórek osteo-liniowych i przyżyciowego obrazowania indukowanych mikrozłamań w kości nazębnej, OSPC można bezpośrednio obserwować w ciągu pierwszych kilku dni po urazie, w których dochodzi do krytycznych zdarzeń we wczesnym procesie naprawy. Miejsca urazów mogą być sekwencyjnie obrazowane, ujawniając, że OSPC przemieszczają się do urazu, zwiększają swoją liczbę i różnicują się w osteoblasty tworzące kość. Metody te pozwalają badać rolę wewnętrznych i zewnętrznych regulatorów molekularnych komórek macierzystych w regeneracji i naprawie kości.

Stabilizowany model złamania kości długiej jest popularny w badaniach nad złamaniami. Jednak modele złamań kości długich lub dużych złamań powodują wielokrotne uszkodzenia tkanek, co ogranicza możliwości ilościowego pomiaru funkcji komórek kostnych. Opracowaliśmy metodę małoinwazyjnego urazu (średnica mniej niż 1 mm, z minimalną lub brakiem naruszenia opony twardej) w obrębie czołowych kości czaszki za pomocą wiercenia igłowego (Figures 1A-1C). Do obrazowania in vivo mikrozłamań wybraliśmy widok...

Ilościowy pomiar funkcji progenitora kości w gojeniu złamań wymaga technologii obrazowania seryjnego o wysokiej rozdzielczości. W tym miejscu przedstawiono protokoły wykorzystujące mikroskopię przyżyciową i śledzenie linii kostnych w celu sekwencyjnego obrazowania i ilościowego określenia migracji, proliferacji i różnicowania endogennych osteogennych komórek macierzystych / progenitorowych w procesie naprawy złamań kości.

Sekwencyjne obrazowanie in vivo osteogennych komórek macierzystych/progenitorowych podczas naprawy złamań

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest sekwencyjne śledzenie i ilościowe określanie migracji, proliferacji oraz różnicowania endogennych mezenchymalnych komórek macierzystych i progenitorowych w procesie gojenia złamań kostnych. Osiąga się to poprzez najpierw znakowanie in vivo komórek pozytywnych pod kątem wirusa mixo, wirusa grypy lub MX1 za pomocą wstrzyknięcia kwasu policytylylowego, a następnie eliminację obecnych w organizmie komórek krwiotwórczych pozytywnych pod kątem MX1 poprzez napromieniowanie. W drugim kroku myszom napromieniowanym systematycznie podaje się komórki szpiku kostnego typu dzikiego.Następnie, poprzez wiercenie igłą, w obszarze Cal myszy generowane są mikrozłamania. Na koniec przeprowadzane jest sekwencyjne obrazowanie intravitalne naprawy mikrozłamań. Ostatecznie obrazy intravitalne te mogą zostać wykorzystane do oceny dynamiki napływu i ekspansji osteogenicznych komórek macierzystych oraz progenitorowych w miejscach złamań.Główną zaletą tej techniki jest umożliwienie powtarzalnego obrazowania in vivo osteogennych komórek macierzystych i progenitorowych w przebiegu gojenia złamań. Zastosowanie tej metody rozciąga się na terapię gojenia złamań oraz osteoporozy, ponieważ oferuje ona nowe narzędzie do monitorowania endogennych osteogennych komórek macierzystych i progenitorowych w procesach regeneracji i naprawy kości.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ wywołanie mikrozłamania przy minimalnym uszkodzeniu tkanek oraz powtarzalne obrazowanie urazu złamania in vivo bez indukowania silnego bliznowacenia są istotne dla tej metody i stanowią wyzwanie techniczne. Aby oznakować komórki MX1-dodatnie in vivo, należy rozpocząć od wstrzyknięcia 200 µL kwasu poliglukuronowego na 20 g masy ciała myszy reporterowej MX1 co drugi dzień przez 10 dni, drogą dosytroniczną. Następnie, aby wyeliminować rezydentne, MX1-dodatnie komórki hematopoetyczne, myszy należy poddać napromieniowaniu pojedynczą dawką 9,5 Gy. Po 24 godzinach należy przeszczepić dożylnie 1×10⁶ komórek szpiku kostnego typu dzikiego na każdą mysz.Po upływie od czterech do sześciu tygodni zanurzyć mysz w narkozie poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowo 50 µL ketaminy i ksylazyny. Po potwierdzeniu sedacji poprzez uciśnięcie palca u stopy, zgolić skórę głowy myszy z przeszczepionymi komórkami szpiku kostnego, a następnie zdezynfekować odsłoniętą skórę wacikiem nasączonym 70% alkoholem. Nałożyć żel do oczu, aby zapobiec odwodnieniu rogówki, a następnie wykonać poprzeczne nacięcie skóry głowy o długości mniejszej niż 1 cm, prowadząc je od jednego ucha do drugiego. Następnie obrócić zwierzę o około 60 stopni i za pomocą pęsety kontynuować nacięcie, aż do osiągnięcia odległości około 2–3 mm od nosa.Odciągnij płat tkanki w stronę boków zwierzęcia, aby oddzielić skórę; kości czołowe oraz przecięcie szwów strzałkowego i wieńcowego powinny być teraz wyraźnie odsłonięte. Przepłucz otwartą powierzchnię sterylnym PBS, a następnie delikatnie usuń pozostałe włosy za pomocą patyczków bawełnianych. Następnie, aby wywołać mikrozłamania w czaszce, przytrzymaj głowę myszy jedną ręką, a igłę o rozmiarze 30 G drugą ręką.Używając igły o rozmiarze 30 G, należy delikatnie wykonać mikronacięcie po jednej stronie kości czołowych, w pobliżu przecięcia szwów strzałkowego i wieńcowego. Aby uniknąć przebicia mózgu, należy zmienić igłę na większy rozmiar i obrócić nową igłę, aby poszerzyć otwór nacięcia do średnicy około 0,5 mm. Po wykonaniu drugiego nacięcia na przeciwległej kości czołowej, należy sukcesywnie wkraplać PBS w każde miejsce, przecierając je, aż do momentu ustąpienia krwawienia.Następnie, aby zapobiec wysychaniu, nanieś na czaszkę wystarczającą ilość sterylnego roztworu soli fizjologicznej, aby w pełni pokryć obszar niezbędny do uzyskania obrazów Vidal. Najpierw włącz wielobokowy skaner laserowy, aby umożliwić jednoczesną wielokanałową akwizycję obrazów z częstotliwością 30 klatek na sekundę. Następnie włącz femtosekundowy laser tytano-szafirowy do obrazowania wielofotonowego.Ustaw moc i długość fali na 880 nanometrów dla obrazowania generacji drugiej harmonicznej kości sklepienia czaszki przy 440 nanometrach dla wzbudzenia GFP i TD tomato, a następnie włącz laserowce stanu stałego o długości fali 491 nanometrów i 561 nanometrów. Następnie włącz detektory w postaci fotopowielaczy dla każdego sygnału: filtr przepustowy 435 ± 20 nanometrów dla generacji drugiej harmonicznej, filtr przepustowy 528 ± 19 nanometrów dla GFP oraz filtr przepustowy 590 ± 20 nanometrów dla TD tomato. Teraz umieść zwierzę na zmotoryzowanym stole mikroskopu w osiach XYZ, na elektrycznej podkładce grzewczej ustawionej na 37 °C.Użyj taśmy, aby unieruchomić mysz w odpowiedniej pozycji, a następnie nanieś kroplę ciepłego żelu na bazie 2% metylocelulozy na czaszkę. Aby zapobiec wysychaniu, nałóż szkiełko nakrywkowe na obszar obrazowania. Następnie użyj obiektywu imersyjnego wodnego 30x z aperturą numeryczną 0,9 oraz kontrolera osi XY i Z, aby wykryć sygnał SHG z kości.Aby zlokalizować powierzchnię czaszki, należy zidentyfikować kluczowy punkt orientacyjny, taki jak przecięcie szwów strzałkowych i czołowych, a następnie wykonać obraz. Zaznacz współrzędne XY i Z punktu orientacyjnego, a następnie kontynuuj poszukiwanie miejsca urazu, posługując się sygnałami SHG oraz sygnałami fluorescencyjnymi. Po odnalezieniu każdego obszaru zainteresowania wykonaj obraz w optymalnej płaszczyźnie ogniskowej, zawierającej sygnały SHG i fluorescencyjne z analizowanych komórek.Zapisz współrzędne XY, Z oraz odległość do przecięcia szwów strzałkowego i czołowego, aby precyzyjnie określić ich lokalizację dla kolejnej serii obrazowania. Następnie przeprowadź akwizycję trójwymiarowych struktur komórkowych i kostnych w miejscu urazu złamania. Rejestruj obrazy w odstępach Z-stack wynoszących w przybliżeniu od 2 do 5 µm, przy głębokości około 100 µm od powierzchni kostnej od strony wewnętrznej.Na koniec, po obrazowaniu obu miejsc urazu, użyj kilku kropel jałowej soli fizjologicznej, aby usunąć żel 2% Methylcellulose z czaszki. Następnie pokryj powierzchnię antybiotykami i przykryj czaszkę płatami skóry, ponownie zamknij skórę głowy za pomocą hipoalergicznej nici chirurgicznej i umieść zwierzę w ciepłej komorze rekonwalescencyjnej, aż odzyska wystarczającą świadomość. Po trzech do pięciu dniach powtórz etapy obrazowania intravitalnego, aby śledzić zmiany komórkowe podczas gojenia złamania.W tym reprezentatywnym eksperymencie utworzono dwie mikrozłamania w kościach czołowych myszy GFP z genicznym MX1 tomato osteocalcin po napromieniowaniu i wymianie szpiku kostnego. Sekwencyjne obrazowanie 3D in vivo mikrozłamań wykazało relokację komórek macierzystych i progenitorowych osteogennych tomato-dodatnich w miejscu złamania w drugim dniu, a także ich ekspansję w piątym dniu. Chociaż w tym czasie nie wykryto osteoblastów GFP-dodatnich, w 12. dniu podgrupa osteoprogenitorów w pobliżu powierzchni złamania rozpoczęła różnicowanie się w osteoblasty tomato-dodatnie i GFP-dodatnie, co wskazano strzałką. Nagromadzenie nowych osteoblastów i tworzenie nowej kości w 21. dniu wskazuje, że migracja i proliferacja komórek progenitorowych osteogennych była głównym mechanizmem dostarczania nowych osteoblastów do gojenia złamania. Aby sprawdzić, czy metoda ta zapewnia spójne i ilościowe wyniki liczby osteoprogenitorów podczas gojenia złamań, śledzono komórki macierzyste i progenitorowe osteogenne MX1 YFP-dodatnie przez 14 dni po urazie.Niewielka liczba progenitorów była konsekwentnie wykrywana w miejscu urazu do trzeciego dnia. Liczba komórek stale wzrastała w siódmym dniu, osiągając szczytową populację w 10. dniu, która utrzymywała się do 14. dnia. Kinetykę generowania progenitorów kostnych ilościowo określono poprzez pomiar intensywności sygnału YFP w czasie, co korelowało z wynikami uzyskanymi za pomocą mikroskopii intravitalnej.Komórki progenitorowe zaobserwowano po raz pierwszy w trzecim dniu, ich liczba osiągnęła szczyt w dziesiątym dniu i utrzymywała się na podobnie wysokim poziomie do czternastego dnia. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że biegłe techniki szycia oraz minimalizacja krwawienia mogą ograniczyć powstawanie blizn i obniżyć poziom autofluorescencji tła. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat obrazowania i śledzenia migracji, proliferacji oraz różnicowania endogennych osteogennych komórek progenitorowych w procesie gojenia złamań.

sequential-vivo-imaging-osteogenic-stemprogenitor-cells-during

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Sekwencyjne in vivo Obrazowanie komórek macierzystych/przodkowych osteogenicznych podczas gojenia złamań

Ludzkie okołonaczyniowe komórki macierzyste (PSCs) stanowią nową klasę komórek macierzystych do regeneracji tkanek szkieletowych, podobnie jak mezenchymalne komórki macierzyste (MSCs). PSCs można wyizolować za pomocą FACS (sortowania komórek aktywowanego fluorescencją) z tkanki tłuszczowej pobranej podczas standardowych procedur liposukcji, a następnie połączyć z rusztowaniem osteoindukcyjnym w celu uzyskania formowania kości in vivo.

Zastosowanie ludzkich peryvaskularnych komórek macierzystych w regeneracji kości

Niniejszy artykuł opisuje metodę stabilizacji złamań kości długich opartą na zastosowaniu zmodyfikowanych zewnętrznych stabilizatorów Ilizarova 1-3. Po zastosowaniu stabilizatorów i wywołaniu urazu kostnego można oceniać proces gojenia, przeprowadzać osteogenezę dystrakcyjną lub tworzyć staw rzekomy bądź defekt o rozmiarze krytycznym w celu badania interwencji terapeutycznych.

Tworzenie sztywno stabilizowanych złamań do oceny kostnienia błonowego, osteogenezy dystrakcyjnej lub gojenia ubytków o rozmiarze krytycznym

Natura interakcji między krwiotwórczymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi (HSPC) a niszami szpiku kostnego jest słabo poznana. Niestandardowe modyfikacje sprzętowe i wieloetapowy protokół akwizycji pozwalają na wykorzystanie mikroskopii dwufotonowej i konfokalnej do obrazowania znakowanych ex vivo HSPC umieszczonych w obszarach szpiku kostnego, śledząc interakcje i ruch.

4-wymiarowe śledzenie in vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w dorosłym szpiku kostnym nazębnym myszy

Ten protokół opisuje znakowanie radioaktywne mezenchymalnych komórek macierzystych koni i ich implantację do urazów ścięgien u konia w celu określenia przeżycia komórek i dystrybucji tkanek za pomocą scyntygrafii gamma.

In vivo (in vivo) Obrazowanie i śledzenie mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego znakowanych technetem-99m w tendinopatii koni

Ocena rozwoju tkanki w złamaniu modzeli podczas gojenia kości śródchrzęstnej jest niezbędna do monitorowania procesu gojenia. W tym miejscu informujemy o zastosowaniu zewnętrznego stabilizatora kompatybilnego z rezonansem magnetycznym (MRI) dla kości udowej myszy, aby umożliwić skany MRI podczas regeneracji kości u myszy.

In vivo (in vivo) Ocena rozwoju kalusa złamania podczas gojenia kości u myszy przy użyciu urządzenia do osteosyntezy kompatybilnego z MRI dla kości udowej myszy

Model mysiego zamkniętego złamania kości udowej jest potężną platformą do badania gojenia złamań i nowatorskich strategii terapeutycznych przyspieszających regenerację kości. Celem tego protokołu chirurgicznego jest wygenerowanie jednostronnie zamkniętych złamań kości udowej u myszy za pomocą śródszpikowego pręta stalowego do stabilizacji kości udowej.

Generowanie zamkniętych złamań kości udowej u myszy: model do badania gojenia kości

Model kostnoszkieletowego mięsaka (BEM) dla kostniakomięsaka (OS) jest dobrze znany i pokazany tutaj. Może być używany jako odpowiednie rusztowanie do naśladowania wzrostu guza pierwotnego in vitro i stanowi idealny model do badania histologicznej i cytogennej heterogeniczności OS.

Trójwymiarowy model macierzy zewnątrzkomórkowej kości dla kostniakomięsaka

Ten protokół opisuje wykrywanie migracji komórek macierzystych okostnej szkieletu za pośrednictwem CCL5 w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii intravital żywych zwierząt.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym indukowanej przez CCL5 migracji komórek macierzystych okostnej kostnej u myszy

Ten protokół opisuje procedurę chirurgiczną mającą na celu wykrycie złamania trzonu w kości udowej myszy, która jest stabilizowana drutem śródszpikowym, do badań nad gojeniem złamań.

Ustalenie modelu złamania kości udowej trzonu u myszy

Model uszkodzenia szpiku kostnego u myszy jest użytecznym narzędziem do badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste. Ten uproszczony protokół chirurgiczny opisuje procedurę ablacji szpiku kostnego w celu dalszej oceny tworzenia się nowej kości i odpowiedzi komórkowych po urazie.

Ulepszona metodologia badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste w mysim modelu uszkodzenia szpiku kostnego

Poznaj metodę sekwencyjnego obrazowania in vivo komórek macierzystych/progenitorowych podczas naprawy złamań. Technika ta umożliwia śledzenie migracji, proliferacji i różnicowania endogennych osteogenicznych komórek macierzystych w czasie rzeczywistym.

Sekwencyjne obrazowanie in vivo osteogennych komórek macierzystych/progenitorowych podczas naprawy złamań

Przeglądaj więcej filmów