Sekwencyjne obrazowanie in vivo osteogennych komórek macierzystych/progenitorowych podczas naprawy złamań

Ogólnym celem tej procedury jest sekwencyjne śledzenie i ilościowe określenie migracji, proliferacji i różnicowania endogennych osteogennych komórek macierzystych i progenitorowych w procesie naprawy złamań kości. Osiąga się to najpierw poprzez znakowanie wirusa mixo, oporności na wirusa grypy, jednej lub jednej dodatniej komórki MX one in vivo za pomocą wstrzyknięcia kwasu policynicznego policytoilinowego, a następnie wyeliminowanie rezydentnych komórek krwiotwórczych MX one dodatnich przez napromienianie. W drugim etapie napromieniowanym myszom systematycznie podaje się komórki szpiku kostnego typu dzikiego.

Następnie w obszarze myszy Cal generowane są mikropęknięcia poprzez wiercenie igłą. Na koniec wykonuje się sekwencyjne obrazowanie wewnątrzfiolkowe naprawy mikrozłamań. Ostatecznie te obrazy przyżyciowe mogą być wykorzystane do oceny dynamiki napływu i ekspansji osteogennych komórek macierzystych i progenitorowych do miejsc złamań.

Tak więc główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na powtarzalne obrazowanie in vivo osteogennych komórek macierzystych i progenitorowych w trakcie gojenia się złamań. Implikacje tej techniki rozszerzyły się na terapię gojenia złamań i osteoporozy. Ponieważ metoda ta stanowi nowe narzędzie do monitorowania endogennych osteogennych komórek progenitorowych macierzystych w procesie regeneracji i naprawy kości.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ generowanie mikrozłamań przy minimalnym uszkodzeniu tkanek i powtarzane obrazowanie in vivo uszkodzenia złamania bez wywoływania poważnej blizny są ważne dla metody i stanowią wyzwanie techniczne. Aby oznaczyć MX one dodatnie komórki in vivo, zacznij od wstrzyknięcia 200 mikrolitrów polikwaśnego kwasu policytonikowego na 20 gramów MX jeden Cree reporter o masie myszy reporterowej dootrzewnowej raz na drugi dzień przez 10 dni. Następnie, aby wyeliminować rezydenta MX, jedną dodatnią komórkę krwiotwórczą należy napromienić wstrzyknięte myszy pojedynczą dawką 9,5 gras. Po 24 godzinach przeszczep raz 10 razy do szóstej komórki szpiku kostnego typu dzikiego dożylnie na mysz.

Cztery do sześciu tygodni później znieczulij mysz przez wstrzyknięcie dootrzewnowe 50 mikrolitrów ketaminy ksylazyny Po potwierdzeniu sedacji przez uszczypnięcie palca u nogi, przytnij parę skóry głowy myszy z przeszczepionymi komórkami szpiku kostnego, a następnie wysterylizuj odsłoniętą skórę wacikiem nasączonym 70% alkoholem. Nałóż żel przeciwłzowy, aby zapobiec odwodnieniu rogówki, a następnie wykonaj poprzeczne nacięcie o długości mniejszej niż jeden centymetr w poprzek skóry głowy, zaczynając od jednego ucha, a kończąc na drugim. Następnie obróć zwierzę o około 60 stopni i kontynuuj nacięcie, aż osiągnie około dwóch do trzech milimetrów od nosa za pomocą kleszczy.

Pociągnij płat tkanki w kierunku boków zwierzęcia, aby oddzielić skórę, zarówno kości czołowe, jak i przecięcie szwów strzałkowych i koronalnych powinny być teraz wyraźnie odsłonięte. Spłucz otwartą powierzchnię sterylnym PBS, a następnie delikatnie zetrzyj resztki włosów bawełnianymi wacikami. Następnie, aby wygenerować mikropęknięcia na łydce, przytrzymaj głowę myszy jedną ręką, a drugą igłę o rozmiarze 30.

Użyj końcówki igły o rozmiarze 30, aby delikatnie wywiercić mikronakłucie po jednej stronie kości czołowych w pobliżu przecięcia szwów strzałkowych i koronowych. Aby uniknąć penetracji mózgu, zmień na większy miernik i przekręć nową igłę, aby poszerzyć otwór do nakłucia do około 0,5 milimetra średnicy. Po wygenerowaniu drugiego nakłucia na przeciwległej kości czołowej, należy w sposób ciągły wrzucać PBS do każdego miejsca, wycierając, aż krwawienie ustanie.

Następnie, aby uniknąć wysuszenia, nałóż wystarczającą ilość kropli sterylnego roztworu soli fizjologicznej na czaszkę, aby całkowicie pokryć obszar uzyskania obrazów Vidal. Najpierw włącz skaner laserowy oparty na wielokątach, aby umożliwić jednoczesną wielokanałową akwizycję obrazu z szybkością 30 klatek na sekundę. Następnie włącz femtosekundowy laser szafirowy tytanowy do obrazowania wielofotonowego.

Ustaw moc i długość fali na 880 nanometrów dla obrazowania kości nazębnej drugiej generacji harmonicznej przy 440 nanometrach dla wzbudzenia pomidorów GFP i TD, włącz lasery półprzewodnikowe 491 nanometrów i 561 nanometrów. A następnie włącz detektory lampy powielacza fotograficznego dla każdego sygnału: filtr pasmowy 435 plus minus 20 nanometrów do generowania drugiej harmonicznej, filtr pasmowy 528 plus minus 19 nanometrów dla GFP i 590 plus minus 20 nanometrów dla pomidora TD. Teraz umieść zwierzę na zmotoryzowanym stoliku mikroskopu z osią XYZ na elektrycznej poduszce grzewczej ustawionej na 37 stopni Celsjusza.

Użyj taśmy, aby przytrzymać mysz w odpowiedniej pozycji, a następnie nałóż kroplę ciepłego żelu na bazie 2% metylocelulozy na czaszkę. Aby uniknąć wysuszenia, umieść szkło nakrywkowe na obszarze obrazowania. Następnie użyj obiektywu 30 x zanurzonego w wodzie z aperturą numeryczną 0,9 i kontrolerem osi XY, Z, aby wykryć sygnał SHG z kości.

Aby znaleźć powierzchnię łydki, zidentyfikuj kluczowe miejsce punktu orientacyjnego, takie jak przecięcie szwów strzałkowych i szwów koronalnych, i uzyskaj obraz. Zaznacz współrzędne XY, Z punktu orientacyjnego, a następnie kontynuuj wyszukiwanie miejsca urazu, używając SHG i sygnałów fluorescencyjnych jako wskazówek. Po znalezieniu każdego obszaru zainteresowania uzyskaj obraz najlepszej płaszczyzny ogniskowej zawierającej SHG i sygnały fluorescencyjne z komórek będących przedmiotem zainteresowania.

Zapisz współrzędne XY, Z i odległość do przecięcia szwów strzałkowych i koronalnych, aby określić ich dokładne położenie dla następnej rundy obrazowania. Następnie, aby pobrać 3D struktury komórkowe i kostne urazu złamania. Rejestruj obrazy w przybliżonych odstępach od dwóch do pięciu mikronów Z na głębokości około 100 mikronów od powierzchni kości endo

Na koniec, po zobrazowaniu obu miejsc urazu, użyj wielu kropli sterylnej soli fizjologicznej, aby usunąć 2% żel metylocelulozowy z czaszki. Teraz pokryj powierzchnię antybiotykami i przykryj czaszkę płatami skóry, ponownie zamknij skórę głowy hipoalergiczną nicią do szycia i trzymaj zwierzę w ciepłej komorze rekonwalescencji, aż odzyska wystarczającą przytomność. Po trzech do pięciu dniach powtórz kroki obrazowania przyżyciowego, aby śledzić zmiany komórkowe podczas gojenia się złamania.

W tym reprezentatywnym eksperymencie wygenerowano dwa mikrozłamania na kościach czołowych genowej osteokalcyny pomidorowej MX one, myszy GFP po napromienianiu i sekwencyjnym obrazowaniu 3D wewnątrzżyciowym wymiany szpiku kostnego mikrozłamań wykazało przemieszczenie pomidorowo-dodatnich osteogennych komórek macierzystych i progenitorowych w miejscu złamania w drugim dniu, a także ich ekspansję w piątym dniu. Chociaż w tym czasie nie wykryto żadnych osteoblastów GFP, w dniu 12 podgrupa komórek progenitorowych układu kostno-wytrzymałościowego w pobliżu powierzchni złamania zainicjowała różnicowanie osteoblastów GFP dodatnich dla pomidorów, jak wskazano strzałką, akumulacja nowych osteoblastów i tworzenie nowych kości w dniu 21 wskazuje, że migracja i proliferacja osteogennych komórek progenitorowych była głównym mechanizmem dostarczania nowych osteoblastów do gojenia złamania. Aby sprawdzić, czy ta metoda zapewnia spójne i ilościowe wyniki liczby progenitorów kości podczas gojenia złamań, MX one YFP dodatnie osteogenne komórki macierzyste i progenitorowe były śledzone przez 14 dni po urazie.

Niewielka liczba komórek progenitorowych była konsekwentnie wykrywana w miejscu urazu przez trzy dni. Liczba komórek stale rosła w siódmym dniu, osiągając szczyt populacji w 10 dniu, który utrzymywał się przez 14 dni. Kinetykę wytwarzania komórek progenitorowych układu kostno-szkieletowego określono ilościowo, mierząc intensywność sygnału YFP w czasie i skorelowano z tą obserwowaną za pomocą mikroskopii intrażyciowej.

Przodkowie zostali po raz pierwszy zaobserwowani w trzecim dniu, osiągnęli szczyt w 10 dniu i pozostali na podobnie wysokim poziomie do 14 dnia. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że wykwalifikowane techniki szycia i minimalne krwawienie mogą zmniejszyć powstawanie blizn i obniżyć autofluorescencję tła. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obrazować i śledzić proliferację migracji i różnicowanie endogennych osteogennych komórek progenitorowych macierzystych w procesie naprawy złamań.