Sekwencyjne obrazowanie in vivo osteogennych komórek macierzystych/progenitorowych podczas naprawy złamań

Ogólnym celem niniejszej procedury jest sekwencyjne śledzenie i ilościowe określanie migracji, proliferacji oraz różnicowania endogennych mezenchymalnych komórek macierzystych i progenitorowych w procesie gojenia złamań kostnych. Osiąga się to poprzez najpierw znakowanie in vivo komórek pozytywnych pod kątem wirusa mixo, wirusa grypy lub MX1 za pomocą wstrzyknięcia kwasu policytylylowego, a następnie eliminację obecnych w organizmie komórek krwiotwórczych pozytywnych pod kątem MX1 poprzez napromieniowanie. W drugim kroku myszom napromieniowanym systematycznie podaje się komórki szpiku kostnego typu dzikiego.

Następnie, poprzez wiercenie igłą, w obszarze Cal myszy generowane są mikrozłamania. Na koniec przeprowadzane jest sekwencyjne obrazowanie intravitalne naprawy mikrozłamań. Ostatecznie obrazy intravitalne te mogą zostać wykorzystane do oceny dynamiki napływu i ekspansji osteogenicznych komórek macierzystych oraz progenitorowych w miejscach złamań.

Główną zaletą tej techniki jest umożliwienie powtarzalnego obrazowania in vivo osteogennych komórek macierzystych i progenitorowych w przebiegu gojenia złamań. Zastosowanie tej metody rozciąga się na terapię gojenia złamań oraz osteoporozy, ponieważ oferuje ona nowe narzędzie do monitorowania endogennych osteogennych komórek macierzystych i progenitorowych w procesach regeneracji i naprawy kości.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ wywołanie mikrozłamania przy minimalnym uszkodzeniu tkanek oraz powtarzalne obrazowanie urazu złamania in vivo bez indukowania silnego bliznowacenia są istotne dla tej metody i stanowią wyzwanie techniczne. Aby oznakować komórki MX1-dodatnie in vivo, należy rozpocząć od wstrzyknięcia 200 µL kwasu poliglukuronowego na 20 g masy ciała myszy reporterowej MX1 co drugi dzień przez 10 dni, drogą dosytroniczną. Następnie, aby wyeliminować rezydentne, MX1-dodatnie komórki hematopoetyczne, myszy należy poddać napromieniowaniu pojedynczą dawką 9,5 Gy. Po 24 godzinach należy przeszczepić dożylnie 1×10⁶ komórek szpiku kostnego typu dzikiego na każdą mysz.

Po upływie od czterech do sześciu tygodni zanurzyć mysz w narkozie poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowo 50 µL ketaminy i ksylazyny. Po potwierdzeniu sedacji poprzez uciśnięcie palca u stopy, zgolić skórę głowy myszy z przeszczepionymi komórkami szpiku kostnego, a następnie zdezynfekować odsłoniętą skórę wacikiem nasączonym 70% alkoholem. Nałożyć żel do oczu, aby zapobiec odwodnieniu rogówki, a następnie wykonać poprzeczne nacięcie skóry głowy o długości mniejszej niż 1 cm, prowadząc je od jednego ucha do drugiego. Następnie obrócić zwierzę o około 60 stopni i za pomocą pęsety kontynuować nacięcie, aż do osiągnięcia odległości około 2–3 mm od nosa.

Odciągnij płat tkanki w stronę boków zwierzęcia, aby oddzielić skórę; kości czołowe oraz przecięcie szwów strzałkowego i wieńcowego powinny być teraz wyraźnie odsłonięte. Przepłucz otwartą powierzchnię sterylnym PBS, a następnie delikatnie usuń pozostałe włosy za pomocą patyczków bawełnianych. Następnie, aby wywołać mikrozłamania w czaszce, przytrzymaj głowę myszy jedną ręką, a igłę o rozmiarze 30 G drugą ręką.

Używając igły o rozmiarze 30 G, należy delikatnie wykonać mikronacięcie po jednej stronie kości czołowych, w pobliżu przecięcia szwów strzałkowego i wieńcowego. Aby uniknąć przebicia mózgu, należy zmienić igłę na większy rozmiar i obrócić nową igłę, aby poszerzyć otwór nacięcia do średnicy około 0,5 mm. Po wykonaniu drugiego nacięcia na przeciwległej kości czołowej, należy sukcesywnie wkraplać PBS w każde miejsce, przecierając je, aż do momentu ustąpienia krwawienia.

Następnie, aby zapobiec wysychaniu, nanieś na czaszkę wystarczającą ilość sterylnego roztworu soli fizjologicznej, aby w pełni pokryć obszar niezbędny do uzyskania obrazów Vidal. Najpierw włącz wielobokowy skaner laserowy, aby umożliwić jednoczesną wielokanałową akwizycję obrazów z częstotliwością 30 klatek na sekundę. Następnie włącz femtosekundowy laser tytano-szafirowy do obrazowania wielofotonowego.

Ustaw moc i długość fali na 880 nanometrów dla obrazowania generacji drugiej harmonicznej kości sklepienia czaszki przy 440 nanometrach dla wzbudzenia GFP i TD tomato, a następnie włącz laserowce stanu stałego o długości fali 491 nanometrów i 561 nanometrów. Następnie włącz detektory w postaci fotopowielaczy dla każdego sygnału: filtr przepustowy 435 ± 20 nanometrów dla generacji drugiej harmonicznej, filtr przepustowy 528 ± 19 nanometrów dla GFP oraz filtr przepustowy 590 ± 20 nanometrów dla TD tomato. Teraz umieść zwierzę na zmotoryzowanym stole mikroskopu w osiach XYZ, na elektrycznej podkładce grzewczej ustawionej na 37 °C.

Użyj taśmy, aby unieruchomić mysz w odpowiedniej pozycji, a następnie nanieś kroplę ciepłego żelu na bazie 2% metylocelulozy na czaszkę. Aby zapobiec wysychaniu, nałóż szkiełko nakrywkowe na obszar obrazowania. Następnie użyj obiektywu imersyjnego wodnego 30x z aperturą numeryczną 0,9 oraz kontrolera osi XY i Z, aby wykryć sygnał SHG z kości.

Aby zlokalizować powierzchnię czaszki, należy zidentyfikować kluczowy punkt orientacyjny, taki jak przecięcie szwów strzałkowych i czołowych, a następnie wykonać obraz. Zaznacz współrzędne XY i Z punktu orientacyjnego, a następnie kontynuuj poszukiwanie miejsca urazu, posługując się sygnałami SHG oraz sygnałami fluorescencyjnymi. Po odnalezieniu każdego obszaru zainteresowania wykonaj obraz w optymalnej płaszczyźnie ogniskowej, zawierającej sygnały SHG i fluorescencyjne z analizowanych komórek.

Zapisz współrzędne XY, Z oraz odległość do przecięcia szwów strzałkowego i czołowego, aby precyzyjnie określić ich lokalizację dla kolejnej serii obrazowania. Następnie przeprowadź akwizycję trójwymiarowych struktur komórkowych i kostnych w miejscu urazu złamania. Rejestruj obrazy w odstępach Z-stack wynoszących w przybliżeniu od 2 do 5 µm, przy głębokości około 100 µm od powierzchni kostnej od strony wewnętrznej.

Na koniec, po obrazowaniu obu miejsc urazu, użyj kilku kropel jałowej soli fizjologicznej, aby usunąć żel 2% Methylcellulose z czaszki. Następnie pokryj powierzchnię antybiotykami i przykryj czaszkę płatami skóry, ponownie zamknij skórę głowy za pomocą hipoalergicznej nici chirurgicznej i umieść zwierzę w ciepłej komorze rekonwalescencyjnej, aż odzyska wystarczającą świadomość. Po trzech do pięciu dniach powtórz etapy obrazowania intravitalnego, aby śledzić zmiany komórkowe podczas gojenia złamania.

W tym reprezentatywnym eksperymencie utworzono dwie mikrozłamania w kościach czołowych myszy GFP z genicznym MX1 tomato osteocalcin po napromieniowaniu i wymianie szpiku kostnego. Sekwencyjne obrazowanie 3D in vivo mikrozłamań wykazało relokację komórek macierzystych i progenitorowych osteogennych tomato-dodatnich w miejscu złamania w drugim dniu, a także ich ekspansję w piątym dniu. Chociaż w tym czasie nie wykryto osteoblastów GFP-dodatnich, w 12. dniu podgrupa osteoprogenitorów w pobliżu powierzchni złamania rozpoczęła różnicowanie się w osteoblasty tomato-dodatnie i GFP-dodatnie, co wskazano strzałką. Nagromadzenie nowych osteoblastów i tworzenie nowej kości w 21. dniu wskazuje, że migracja i proliferacja komórek progenitorowych osteogennych była głównym mechanizmem dostarczania nowych osteoblastów do gojenia złamania. Aby sprawdzić, czy metoda ta zapewnia spójne i ilościowe wyniki liczby osteoprogenitorów podczas gojenia złamań, śledzono komórki macierzyste i progenitorowe osteogenne MX1 YFP-dodatnie przez 14 dni po urazie.

Niewielka liczba progenitorów była konsekwentnie wykrywana w miejscu urazu do trzeciego dnia. Liczba komórek stale wzrastała w siódmym dniu, osiągając szczytową populację w 10. dniu, która utrzymywała się do 14. dnia. Kinetykę generowania progenitorów kostnych ilościowo określono poprzez pomiar intensywności sygnału YFP w czasie, co korelowało z wynikami uzyskanymi za pomocą mikroskopii intravitalnej.

Komórki progenitorowe zaobserwowano po raz pierwszy w trzecim dniu, ich liczba osiągnęła szczyt w dziesiątym dniu i utrzymywała się na podobnie wysokim poziomie do czternastego dnia. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że biegłe techniki szycia oraz minimalizacja krwawienia mogą ograniczyć powstawanie blizn i obniżyć poziom autofluorescencji tła. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat obrazowania i śledzenia migracji, proliferacji oraz różnicowania endogennych osteogennych komórek progenitorowych w procesie gojenia złamań.