Name: Ekscytotoksyczna stymulacja mikrowycinków mózgu jako model udaru in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Poznaj technikę ekscytotoksycznej stymulacji mikrowycinków mózgu jako model udaru in vitro. Ta metoda wykorzystuje dojrzałą tkankę mózgową, zachowuje wielokomórkowe interakcje i pozwala zmniejszyć liczbę zwierząt używanych w badaniach nad urazami mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze badawcze z Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych Australii, Hunter Medical Research Institute oraz Uniwersytetu w Newcastle.

Wszystkie procedury są wykonywane za zgodą Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki Uniwersytetu w Newcastle, a także zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami, w tym Ustawą o Badaniach na Zwierzętach w Nowej Południowej Walii, Ustawą o Badaniach na Zwierzętach w Nowej Południowej Walii oraz Australijskim Kodeksem Postępowania w zakresie opieki i wykorzystywania zwierząt do celów naukowych.
1. Sekcja tkanki mózgowej
<ol>
	<li>Składaj w ofierze dwunastotygodniowe samce szczurów przez ścięcie. Szczury mogą być albo uśmierzane przez ogłuszenie i ścięcie, albo mogą być najpierw znieczulone izofluranem (5% indukcji, 1,5-2% konserwacji) w 70% N2 i 30% O2, a następnie pozbawione głowy.</li>
	<li>Usuń mózg z czaszki tak szybko, jak to możliwe (najlepiej zrobić to w czasie krótszym niż 2 minuty).</li>
	<li>Usuń korę przez rozbiór z wolnej ręki. Sekcja powinna być wykonana w jak najkrótszym czasie, z jak najmniejszym uszkodzeniem mózgu, aby zachować integralność plastrów.</li>
	<li>W celu usunięcia resztek skóry, sierści, krwi itp., należy zanurzyć mózg w niewielkiej ilości (3-5 ml) buforu Krebsa o temperaturze 37 °C (118 mM chlorku sodu, 4,7 mM chlorku potasu, 1,3 mM chlorku wapnia, 1,2 mM diwodorofosforanu potasu, 1,2 mM siarczanu magnezu, 25 mM wodorowęglanu sodu, 11,7 mM glukozy, 0,03 mM kwasu disodowego etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), zrównoważony 95% tlenu/5% dwutlenku węgla (karbogen), pH 7,4).</li>
</ol>
2. Przygotowanie mikroplastrów
<ol>
	<li>Umieść mózg na stoliku rozdrabniacza McIlwain, na którym umieszczono dwie plastry bibuły filtracyjnej i zwilżono ciepłym buforem Krebsa. Utrzymuj mózg i bibułę filtracyjną zwilżoną ciepłym buforem Krebsa, ale nie na tyle mokrą, aby na powierzchni bibuły znajdował się wolny płyn, który może powodować ślizganie się mózgu.</li>
	<li>Pokrój mózg na sekcje koronalne o grubości 250 μm. Ponieważ składniki odżywcze, tlen i materiały odpadowe, które normalnie są wymieniane z krwią, są wymieniane z płynem, który otacza tkankę w izolowanej tkance nerwowej, rozmiar plastrów nie powinien przekraczać 400 μm grubości, aby umożliwić odpowiednie natlenienie i wymianę składników odżywczych</li>.
	<li>Obróć stolik McIlwaina o 90°.</li>
	<li>Pokrój mózgi na plastry strzałkowe o grubości 250 μm. W tym przypadku te skrawki mózgu (plastry 250 μm x 250 μm o różnej długości w zależności od grubości tkanki) są określane jako mikroplasterki.</li>
	<li>Umieść mikroplastry w probówce z okrągłym dnem z 10-15 ml buforu Krebsa o temperaturze 37 °C (ilość użytego buforu Krebsa będzie zależeć od ilości tkanki).</li>
</ol>
3. Równowaga mikroplasterków
<ol>
	<li>Delikatnie mieszaj, aż poszczególne mikroplasterki zostaną zawieszone, a następnie pozwól im osiąść pod wpływem grawitacji.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć sklarowany nad osadem, który będzie mętny z powodu zawieszonych resztek komórek, i dodać do probówki 10 ml świeżego buforu Krebsa o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Powtórz tę procedurę prania cztery razy, co spowoduje usunięcie większości zanieczyszczeń.</li>
	<li>Następnie zrównoważyć mikroplastry w temperaturze 37 °C z delikatnym potrząsaniem/odwróceniem i zmieniać bufor Krebsa co 15 minut, łącznie przez 1 godzinę.</li>
	<li>W tym czasie dodać 2 ml świeżego buforu Krebsa o temperaturze 37 °C i przenieść 15-20 mikrokropek (150 μl zawiesiny mikroplastków) do płaskodennych probówek polistyrenowych o pojemności 5 ml za pomocą końcówki do pipet o bardzo szerokim otworze i wygładzonymi krawędziach (którą można uzyskać, wycinając ~2 mm od końca końcówki P1000). Rozłóż mikroplasterki równomiernie na podstawie probówki w jednej warstwie, tak aby każdy mikroplasterek nie znajdował się dalej niż kilka milimetrów od natlenionej atmosfery.</li>
</ol>
4. Stymulacja ekscytotoksyczna
<ol>
	<li>Inkubować mikroplastry w temperaturze 37 °C i w sposób ciągły przepuszczać karbogen po powierzchni zawiesiny mikroplastrów o objętości 150 μl, używając przewodu gazowego, który jest umieszczony tuż nad powierzchnią zawiesiny mikroplastrów (w celu uniknięcia zakłóceń mechanicznych).</li>
	<li>Mikroplastry należy traktować 150 μl 5 mM glutaminianu + 100 μM glicyny w buforze Krebsa (bodziec ekscytotoksyczny: końcowe stężenie 2,5 mM glutaminianu + 50 μM glicyny) lub 150 μl samego buforu Krebsa (kontrola niestymulowana). Na tym etapie można zastosować różne bodźce (w tym między innymi AMPA, NMDA + glicyna, depolaryzacja KCl i deprywacja tlenu/glukozy).</li>
	<li>Usunąć roztwór inkubacyjny w różnych momentach po stymulacji (0, 30, 60, 90, 120 i 300 sekund) i zastąpić go 300 μl lodowatego buforu homogenizacyjnego (30 mM Tris, pH 7,4, 1 mM glikolu etylenowego kwasu tetraoctowego, 4 mM EDTA, 100 μM molibdenianu amonu, 5 mM pirofosforanu sodu, 25 mM fluorku sodu, 1 mM ortowanadanu sodu, 1 mM fluorek fenylometanosulfonylu, kompletny koktajl inhibitorów proteazy).</li>
	<li>Homogenizuj mikroplastry na lodzie za pomocą homogenizatora szklano-teflonowego (20 uderzeń; 700 obr./min).</li>
	<li>Przechowuj homogenaty w temperaturze -80 °C, a różne cząsteczki sygnałowe, cząsteczki śmierci itp. mogą być mierzone za pomocą western blot.</li>
</ol>

<ol><li>Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms%2C+challenges+and+opportunities+in+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms, challenges and opportunities in stroke.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).</li>
<li>Wang, Y., Qin, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+mechanisms+of+excitotoxic+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death.</a> Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).</li>
<li>Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+cAMP%2FPKA+and+MAPK+signaling+in+neuronal+cells+is+dependent+on+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Coupling of cAMP/PKA and MAPK signaling in neuronal cells is dependent on developmental stage.</a> Exp. Neurol. 169 (1), 44-55 (2001).</li>
<li>Kharlamov, E., Cagnoli, C. M., Atabay, C., Ikonomovic, S., Grayson, D. R., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+effect+of+protein+synthesis+inhibitors+on+potassium+deficiency-induced+apoptotic+cell+death+in+immature+and+mature+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Opposite effect of protein synthesis inhibitors on potassium deficiency-induced apoptotic cell death in immature and mature neuronal cultures.</a> J. Neurochem. 65 (3), 1395-1398 (1995).</li>
<li>Kristensen, B. W., Noraberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+excitotoxic+profiles+of+ATPA%2C+AMPA%2C+KA+and+NMDA+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of excitotoxic profiles of ATPA, AMPA, KA and NMDA in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Brain Res. 917 (1), 21-44 (2001).</li>
<li>Lecrux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneously+hypertensive+rats+are+highly+vulnerable+to+AMPA-induced+brain+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Spontaneously hypertensive rats are highly vulnerable to AMPA-induced brain lesions.</a> Stroke. 38, 3007-3015 (2007).</li>
<li>Sattler, R., Charlton, M. P., Hafner, M., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+influx+pathways%2C+not+calcium+load%2C+determine+neuronal+vulnerability+to+calcium+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity.</a> J. Neurochem. 71, 2349-2364 (1998).</li>
<li>Morrison, B. 3rd, Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+central+nervous+system+models+of+mechanically+induced+trauma%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">In vitro central nervous system models of mechanically induced trauma: a review.</a> J. Neurotrauma. 15, 911-928 (1998).</li>
<li>McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Neurochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Practical Neurochemistry.</a> , Churchill Livingstone. London. (1975).</li>
<li>Skelding, K. A., Spratt, N. J., Fluechter, L., Dickson, P. W., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha+CaMKII+is+differentially+regulated+in+brain+regions+that+exhibit+differing+sensitivities+to+ischemia+and+excitotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">alpha CaMKII is differentially regulated in brain regions that exhibit differing sensitivities to ischemia and excitotoxicity.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (12), 2181-2192 (2012).</li>
<li>Kavanagh, J. M., Dodd, P. R., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3H%5DMK-801+binding+in+immature+and+mature+chicken+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain.</a> Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).</li>
<li>Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+glutamate+receptor+stimulated+inositol+phospholipid+metabolism+and+45Ca%282%2B%29-accumulation+in+posthatch+chicken+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain.</a> Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).</li>
<li>Sharps, E. S., McCarl, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+performance+liquid+chromatographic+method+to+measure+32P+incorporation+into+phosphorylated+metabolites+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells.</a> Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).</li>
<li>Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurment+of+the+ADP%3AATP+ratio+in+human+leukaemic+cell+lines+can+be+used+as+an+indicator+of+cell+viability%2C+necrosis+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis.</a> J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).</li>
<li>Rodnight, R., McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+in+tissue+metabolism%3A+3.+Study+of+tissue+fragments+with+little+or+no+added+aqueous+phase%2C+and+in+oils%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils.</a> Biochem. J. 57, 649-661 (1954).</li>
<li>Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+assembly+in+the+absence+of+added+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microtubule assembly in the absence of added nucleotides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów w związku z żadną z prac prowadzonych w ramach niniejszego manuskryptu.

W niniejszym artykule opisano technikę in vitro wytwarzania mikroplasterków, którą można wykorzystać do zbadania mechanizmów molekularnych związanych z ekscytotoksycznością i śmiercią komórek za pośrednictwem niedokrwienia w nienaruszonej dojrzałej tkance mózgowej. Technika ta wytwarza żywotną tkankę (ryc. 1-3), która jest metabolicznie podobna do większych wycinków organotypowych15. Co więcej, ten model mikrowarstwowy ściśle odpowiada reakcji obserwowanej po urazach mózgu in vivo...

Najczęstszą formą udaru jest udar niedokrwienny, który występuje, gdy mózgowe naczynie krwionośne zostaje zablokowane. Niedokrwienie tkanek, które wynika z ustania przepływu krwi, powoduje rozległą depolaryzację błon, uwalnianie neuroprzekaźników pobudzających i utrzymujący się wzrost wewnątrzkomórkowego wapnia, co prowadzi do aktywacji szlaków śmierci komórki 1. Proces ten został nazwany "ekscytotoksycznością" i jest powszechnym szlakiem zaangażowanym w śmierć neuronów wytwarzaną przez różne patologie, w tym udar 2. Hamowanie szlaków sygnałowych zaangażowanych w ekscytotoksyczność i inne kaskady śmierci komórek neuronalnych jest atrakcyjnym podejściem do ograniczania uszkodzeń neuronów po udarze.
Identyfikacja precyzyjnych mechanizmów molekularnych związanych z ekscytotoksycznością i udarem niedokrwiennym może być trudna przy użyciu całych układów zwierzęcych. W związku z tym często stosuje się pierwotne embrionalne i "neuronopodobne" (np. unieśmiertelnione linie nerwiaka zarodkowego i gruczolakoraka) systemy hodowli komórek. Głównymi zaletami tych modeli jest to, że są łatwe w obsłudze, stosunkowo opłacalne, a śmierć komórek można łatwo zmierzyć i określić ilościowo. Jednak szlaki sygnałowe mogą być zmieniane przez zastosowane warunki hodowli 3,4, a niedojrzałe neurony i nieśmiertelne linie mogą wyrażać różne receptory i cząsteczki sygnałowe w porównaniu z dojrzałym mózgiem 5-8. Co więcej, hodowane neurony pozwalają na badanie tylko jednego typu komórek (lub dwóch, jeśli stosuje się system kokultury), podczas gdy nienaruszona tkanka mózgowa jest niejednorodna, zawierająca różne typy komórek, które oddziałują ze sobą. Stosowane są również organotypowe systemy hodowli warstw (cienkie eksplantaty tkanki mózgowej), a modele te umożliwiają badanie heterogenicznych populacji komórek występujących in vivo. Jednak przy użyciu tej techniki można uzyskać tylko ograniczoną ilość tkanki z każdego zwierzęcia, plastry nie mogą być hodowane tak długo, jak unieśmiertelnione linie komórkowe, a hodowla średnio- i długoterminowa może powodować zmiany w szlakach sygnałowych i receptorach w plasterkach. Podczas gdy dojrzały mózg może być używany do generowania wycinków organotypowych, wycinki z niedojrzałego mózgu są bardziej podatne na hodowlę i są częściej wykorzystywane. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania modeli, które naśladują lub reprezentują nienaruszony dojrzały mózg, które są łatwe w użyciu, w których można badać neuronalne szlaki sygnałowe.
Tutaj opisana jest technika in vitro obejmująca nienaruszoną tkankę nerwową, która może być użyta do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych związanych ze śmiercią komórki po zniewadze ekscytotoksycznej lub niedokrwiennej. Technika ta zmniejsza liczbę zwierząt potrzebnych do przeprowadzenia eksperymentu, jest odtwarzalna i generuje żywotną tkankę, która zachowuje się metabolicznie podobnie do większych plasterków organotypowych. Ponadto obwody neuronalne, interakcje komórkowe i przedział postsynaptyczny pozostają częściowo nienaruszone. Zastosowany bufor fizjologiczny umożliwia "ponowne uszczelnienie" błon komórkowych i odzyskanie przez komórki ich pierwotnej odporności błonowej 9. Ten model wycinka mózgu jest w stanie wiernie naśladować reakcje obserwowane po urazach mózgu za pośrednictwem ekscytotoksyczności 10 i może być wykorzystany do zbadania mechanizmów molekularnych związanych z udarem.

<table><tbody><tr><td>Gilotyna</td><td></td><td></td><td>Służy do ścinania głów zwierząt</td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td> chirurgiczny <td>Kleszcze, nożyczki, pęsety, etc., do usuwania i sekcji</td></tr><tr><td>mózgu Siekacz McIlwain Chopper</td><td>McIlwain są produkowane / dystrybuowane przez szereg firm, w tym Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments i Ted Pella.</td><td></td><td>Służy do generowania 100-400 &#181; m sekcje mózgu.</td></tr><tr><td>Rurki z tworzywa sztucznego z okrągłym dnem</td><td>Greiner</td><td></td><td></td></tr><tr>Kąpiel <td></td><td></td><td>wodna</td><td>Do utrzymywania tkanki w temperaturze 37 & stopni; C</td></tr><tr>Urządzenie <td></td><td></td><td>do nawilżania/napowietrzania</td><td>Służy do przechowywania mikroplasterków w wilgotnym, natlenionym środowisku</td></tr><tr><td>Rurki polistyrenowe z płaskim dnem Homogenizator</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td>Nunc<td>Dounce</td></tr></tbody></table>

ekscytotoksyczna stymulacja mikrowycinków mózgu jako model udaru in vitro

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Badanie mechanizmów molekularnych związanych ze stanami neuropatologicznymi, takimi jak udar niedokrwienny, może być trudne przy użyciu całych układów zwierzęcych. W związku z tym powszechnie stosuje się pierwotne lub "neuronalne" systemy hodowli komórek. Chociaż systemy te są stosunkowo łatwe w obsłudze i są użytecznymi systemami modelowymi, w których różne wyniki funkcjonalne (takie jak śmierć komórki) można łatwo określić ilościowo, badane wyniki i szlaki w hodowanych niedojrzałych neuronach (takie jak szlaki śmierci komórki zależne od ekscytotoksyczności) niekoniecznie są takie same, jak te obserwowane w dojrzałym mózgu lub w nienaruszonej tkance. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania modeli, w których można by badać mechanizmy komórkowe w dojrzałej tkance nerwowej. Opracowaliśmy technikę in vitro, która może być wykorzystana do badania różnych szlaków molekularnych w nienaruszonej tkance nerwowej. Opisana tutaj technika wykorzystuje tkankę korową szczura, ale technikę tę można dostosować do wykorzystania tkanek różnych gatunków (takich jak mysz, królik, świnka morska i kurczak) lub regionów mózgu (na przykład hipokamp, prążkowie itp.). Dodatkowo można zastosować różne stymulacje/zabiegi (na przykład ekscytotoksyczne, podawanie inhibitorów itp.). Podsumowując, opisany tutaj model wycinka mózgu może być wykorzystany do zbadania różnych mechanizmów molekularnych zaangażowanych w uszkodzenie mózgu za pośrednictwem ekscytotoksyczności.

Mikroplastry otrzymane za pomocą tej procedury są żywotne, a do ich wytwarzania można wykorzystać różne gatunki (na przykład szczura, myszy i kurczaka). Wykorzystano trzy niezależne miary żywotności: tempo oddychania (Rysunek 1), stosunki nukleotydów adeninowych (Rysunek 2) oraz zawartość potasu w tkance (Rysunek 3). Przy użyciu tych miar wykazano, że mikroplastry pozostają żywotne przez co najmniej 2 hr po ich przygotowaniu.
Mikroplastry mózg...

Opracowaliśmy model wycinka mózgu, który może być wykorzystany do zbadania mechanizmów molekularnych związanych z uszkodzeniem mózgu za pośrednictwem ekscytotoksyczności. Ta technika generuje żywotną dojrzałą tkankę mózgową i zmniejsza liczbę zwierząt wymaganych do eksperymentów, jednocześnie utrzymując częściowo nienaruszone obwody neuronalne, interakcje komórkowe i przedziały postsynaptyczne.

Ekscytotoksyczna stymulacja mikrowycinków mózgu jako model udaru in vitro

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zastosowanie stymulacji cytotoksycznej w mikroplastrach mózgu w celu stworzenia modelu udaru in vitro. Jest to realizowane poprzez przygotowanie mikroplastrów z nowo wyizolowanego mózgu, a następnie ich równoważenie przy łagodnym mieszaniu.Po osiągnięciu stanu równowagi mikropłatki są gotowe do poddania różnym manipulacjom eksperymentalnym. Wyniki końcowe wykazują, że mikropłatki pozostają żywotne przez co najmniej dwie godziny po przygotowaniu. Główną zaletą naszej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak pierwotne hodowle neuronalne z zarodków, jest fakt, że nasza technika wykorzystuje plastry dojrzałej tkanki mózgowej, które zawierają więcej niż jeden typ komórek i są zatem bardziej reprezentatywne dla nienaruszonej tkanki mózgu.Pierwszym krokiem jest pobranie świeżej tkanki mózgowej. Zanurz mózg w niewielkiej ilości ciepłego buforu Krebsa. Aby usunąć pozostałości skóry, futra lub krwi, przygotuj siekaczkę Macle Waina z dwoma arkuszami papieru filtracyjnego zwilżonego ciepłym buforem Krebsa.Po przygotowaniu umieść mózg na stole urządzenia do cięcia (choppera). Podczas pracy utrzymuj mózg i papier filtracyjny w stanie wilgotnym, używając ciepłego buforu Crebsa, aby zapobiec przesuwaniu się tkanki. Unikaj gromadzenia się nadmiernej ilości płynu na powierzchni.Przetnij mózg na 250 µm przekroje w płaszczyźnie czołowej. Następnie obróć stolik o 90 stopni i wykonaj 250 µm przekroje w płaszczyźnie strzałkowej. Po tym etapie przekroje mózgu określa się mianem mikroprzekrojów.Umieść mikroprzekroje w probówce z okrągłym dnem zawierającej 10 do 15 mililitrów ciepłego buforu Crebsa. Delikatnie wstrząśnij probówką, aż poszczególne mikroprzekroje zostaną zawieszone, a następnie pozwól im opaść pod wpływem grawitacji. Ostrożnie usuń nadsącz, który będzie mętny z powodu zawieszonych szczątków komórkowych, i dodaj do probówki 10 mililitrów świeżego ciepłego buforu Crebsa.Powtórz procedurę płukania czterokrotnie, aby usunąć większość zanieczyszczeń po dokładnym przemyciu. Równoważ mikromaszyny w temperaturze 37 °C przy łagodnym wstrząsaniu lub odwracaniu, wymieniając bufor Krebsa co 15 minut przez łącznie jedną godzinę. Po tym czasie dodaj 2 mL świeżego buforu Krebsa o temperaturze 37 °C i przenieś od 15 do 20 mikromaszyn do polistyrenowej probówki o płaskim dnie o pojemności 5 mL.Używając końcówki do pipety o bardzo szerokim otworze i gładkich krawędziach, równomiernie rozprzestrzenij mikroplastry na dnie probówki w jednej warstwie, tak aby każdy mikroplaster nie znajdował się dalej niż kilka milimetrów od natlenionej atmosfery. Po odpowiednim rozmieszczeniu inkubuj mikroplastry w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, aby zapewnić im właściwe natlenienie. Ciągle przepuszczaj karbogen nad zawiesiną mikroplastrów, umieszczając linię doprowadzającą gaz tuż nad powierzchnią, aby dla uzyskania najlepszych wyników uniknąć mechanicznego uszkodzenia mikroplastrów poprzez bezpośredni kontakt z gazem.Kluczowe jest prawidłowe napowietrzanie plastrów mikroskopowych. Ważne jest, aby linię gazową umieścić w odpowiedniej odległości od powierzchni zawiesiny mikromiejsca. Można połączyć kilka linii, aby umożliwić przeprowadzenie wielu stymulacji.W tym samym czasie można zastosować różne bodźce. W niniejszym przykładzie mikropłatki poddano stymulacji AMPA. Należy poddać mikropłatki działaniu bodźca cytotoksycznego lub samego buforu Krebsa.W przypadku grupy kontrolnej stymulowanej: w wybranych odstępach czasu po stymulacji usunąć roztwór inkubacyjny i zastąpić go 300 µl lodowatego buforu do homogenizacji w wyznaczonym punkcie czasowym. Po stymulacji zhomogenizować mikroplastry na lodzie za pomocą homogenizatora szklano-teflonowego, a uzyskany homogenat przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu dalszej analizy.Wskaźniki oddychania wykazują, że mikropłatki pobrane z przedmózgowia kurczaka pozostają żywe do dwóch godzin po przygotowaniu. Wysokie poziomy ATP i niskie poziomy ADP stwierdzone w mikropłatkach są również charakterystyczne dla żywych komórek. W tym przykładzie zmierzono zawartość potasu w tkance, która po sekcji znajdowała się tuż powyżej poziomu tła, a następnie wzrosła podczas inkubacji w buforze Krebsa; dodanie WABE i EGTA spowodowało spadek zawartości potasu w tkance, co dowodzi, że mikropłatki zazwyczaj aktywnie pompują potas, a stwierdzone poziomy nie wynikają z potasu uwięzionego w martwej tkance lub przestrzeniach śródmiąższowych.W ramach niniejszej procedury przygotowano mikropłatki z prążkowia oraz kory sensorycznej samców szczurów, które następnie zdepolaryzowano przy użyciu buforu Crebs o wysokim stężeniu potasu. Szybkość fosforylacji GluN2B różniła się pomiędzy korą a prążkowiem, podczas gdy szybkość fosforylacji GluA1 była zbliżona w obu tych obszarach. Po opanowaniu metody, prawidłowo przeprowadzony proces zajmuje około dwóch godzin.

excitotoxic-stimulation-brain-microslices-as-an-vitro-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Stymulacji wzbudzających otoczowiskowo mikrokromek mózgu jako in vitro model udaru

Źródło: Zeynalov, E. et al., Ciągły wlew dożylny jest wybraną drogą leczenia blokera receptora argininy-wazopresyny koniwaptanu u myszy w celu zbadania obrzęku mózgu wywołanego udarem. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje dożylne podawanie antagonisty receptora argininy-wazopresyny (AVP) w modelu mysim. Przejściowe zamknięcie tętnicy środkowej mózgu wywołuje obrzęk mózgu. Antagonista receptora AVP jest podawany przez cewnik w lewej żyle szyjnej, łagodząc obrzęk.

Dożylne podawanie blokerów receptorów w celu zmniejszenia obrzęku mózgu w modelu mysim

Fotozakrzepica to szybka, minimalnie inwazyjna technika wywoływania małego i dobrze zdefiniowanego zawału w obszarach zainteresowania w wysoce powtarzalny sposób. Jest szczególnie przydatny do badania odpowiedzi komórkowych i molekularnych leżących u podstaw plastyczności mózgu u myszy transgenicznych.

Fotozakrzepowe niedokrwienie: minimalnie inwazyjny i powtarzalny fotochemiczny model zmiany korowej do badań nad udarem u myszy

Tutaj prezentujemy metodologię wytwarzania ogniskowego udaru w mysiej istocie białej poprzez miejscowe wstrzyknięcie nieodwracalnego inhibitora śródbłonkowej syntazy tlenku azotu (eNOS) (L-Nio). Przedstawiono dwie odmiany stereotaktyczne, wsteczne śledzenie neuronów oraz znakowanie i rozwarstwianie świeżych tkanek, które rozszerzają potencjalne zastosowania tej techniki.

Wszechstronny mysi model podkorowego udaru istoty białej do badania zwyrodnienia aksonów i neurobiologii istoty białej

Tutaj opisujemy przygotowanie organicznych plastrów kory nosa i hipokampa. Przy stopniowym i kontrolowanym pozbawianiu surowicy, plastry te przedstawiają ewoluujące zdarzenia podobne do padaczki i mogą być uważane za model epileptogenezy ex vivo. System ten stanowi doskonałe narzędzie do monitorowania dynamiki spontanicznej aktywności, a także do oceny progresji cech neurozapalnych w całym przebiegu epileptogenezy.

Model epileptogenezy w organotypowych kulturach warstwowych kory nosa i hipokampa

Tutaj opisany jest model udaru fotozakrzepowego, w którym udar jest wytwarzany przez nienaruszoną czaszkę poprzez wywołanie trwałej okluzji mikronaczyniowej za pomocą oświetlenia laserowego po podaniu barwnika światłoczułego.

Modelowanie udaru u myszy: ogniskowe zmiany korowe spowodowane fotozakrzepicą

Protokół ma na celu dostarczenie metod dla encefalomiozyangiozy - przeszczepu płata mięśnia skroniowego naczynia krwiotwórczego na powierzchni niedokrwionej tkanki mózgowej - do leczenia ostrego udaru niedokrwiennego bez Moyamoya. Skuteczność tego podejścia w zwiększaniu angiogenezy ocenia się przy użyciu przejściowego modelu niedrożności tętnicy środkowej mózgu u myszy.

Model leczenia encefalomiozyangiozy po udarze wywołanym niedrożnością środkowej tętnicy mózgowej u myszy

Ten protokół opisuje ektopową ekspresję Neurod1 za pośrednictwem wirusa po korowym udarze niedokrwiennym. Neurod1 jest dostarczany (1) za pomocą systemu Cre-Flex AAV u myszy typu dzikiego w fazie podostrej po udarze (7 dni) oraz (2) przy użyciu pojedynczego wektora AAV u myszy z warunkowym reporterem w fazie przewlekłej po udarze (21 dni).

Systemy AAV i modele mysie do badania ektopowej ekspresji Neurod1 w transdukowanych komórkach w czasie podostrym i przewlekłym po udarze niedokrwiennym

Protokół ten zawiera szczegółowy opis krok po kroku podejścia dla przewlekłego modelu myszy z przewlekłym oknem czaszki oraz mikronaczyniowym zatorem naczyniowym, zoptymalizowanego do mikroskopii in vivo dwufotonowej z użyciem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych.

Model mikronaczyniowej embolii myszy do mikroskopii in vivo dwufotonowej z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych

Ten protokół zapewnia zintegrowaną metodę, która obejmuje dostarczenie wirusowe, implantację optrodu, indukcję fototrombotyczną, jednoczesne rejestrowanie aktywności astrocytów i neuronów oraz optogenetyczną stymulację astrocytów. Ta zintegrowana metoda ma na celu zapewnienie jednoczesnego badania relacji astrocyt-neuron na wszystkich etapach przewlekłych udaru niedokrwiennego.

Zintegrowana metoda modelowania udaru fototrombotycego i in vivo rejestracji optrodem aktywności neuronowej i astrocytów u myszy wykonujących zachowania

Przybywa dowodów na to, że przeciwwarunkowanie niedokrwienne (PC) – nieuszkadzający bodziec niedokrwienny dla mózgu – zapewnia przejściową ochronę przed następującym po nim uszkadzającym niedokrwieniem. Zastosowaliśmy obustronną okluzję wspólnej tętnicy szyjnej (BCCAO) jako bodziec przeciwwarunkujący w celu wywołania wczesnej tolerancji na niedokrwienie (IT) w odpowiedzi na przejściowe ogniskowe niedokrwienie mózgu (wywołane okluzją środkowej tętnicy mózgowej, MCAO) u myszy C57Bl6/J.

Dwustronne zamknięcie wspólnych tętnic szyjnych jako odpowiedni bodziec prekondycjonujący w celu indukcji wczesnej tolerancji niedokrwiennej na ogniskowe niedokrwienie mózgu

Poznaj technikę ekscytotoksycznej stymulacji mikrowycinków mózgu jako model udaru in vitro. Ta metoda wykorzystuje dojrzałą tkankę mózgową, zachowuje wielokomórkowe interakcje i pozwala zmniejszyć liczbę zwierząt używanych w badaniach nad urazami mózgu.

Ekscytotoksyczna stymulacja mikrowycinków mózgu jako model udaru in vitro

Przeglądaj więcej filmów