Ekscytotoksyczna stymulacja mikrowycinków mózgu jako model udaru in vitro
4 lutego 2014
Opracowaliśmy model wycinka mózgu, który może być wykorzystany do zbadania mechanizmów molekularnych związanych z uszkodzeniem mózgu za pośrednictwem ekscytotoksyczności. Ta technika generuje żywotną dojrzałą tkankę mózgową i zmniejsza liczbę zwierząt wymaganych do eksperymentów, jednocześnie utrzymując częściowo nienaruszone obwody neuronalne, interakcje komórkowe i przedziały postsynaptyczne.
Ogólnym celem tej procedury jest zastosowanie stymulacji cytotoksycznej do mikrowarstw mózgu w celu stworzenia modelu udaru in vitro. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw mikro plasterków ze świeżo wyizolowanego mózgu. Drugim krokiem jest zrównoważenie mikroplastrów z delikatnym mieszaniem.
Po zrównoważeniu mikroplastry są gotowe do poddania się różnorodnym manipulacjom eksperymentalnym. Ostatecznie wyniki pokazują, że mikroplasterki są żywotne przez co najmniej dwie godziny po wygenerowaniu. Główną przewagą naszej techniki nad innymi istniejącymi technikami, takimi jak pierwotne hodowle embrionalne, neuronalne, jest to, że nasza technika wykorzystuje wycinki dojrzałej tkanki mózgowej, które zawierają więcej niż jeden typ komórek, a zatem są bardziej reprezentatywne dla nienaruszonej tkanki mózgowej.
Pierwszym krokiem jest pozyskanie świeżej tkanki mózgowej. Zanurz mózg w niewielkiej ilości ciepłego buforu Krebsa. Aby usunąć resztki skóry, futra lub krwi, przygotuj rozdrabniacz do makle z dwoma arkuszami bibuły filtracyjnej zwilżonymi ciepłym buforem Krebsa.
Gdy będziesz gotowy, umieść mózg na stoliku helikoptera. Utrzymuj mózg i bibułę filtracyjną wilgotną ciepłym buforem krebowym podczas pracy, aby zapobiec ślizganiu się mózgu. Unikaj gromadzenia się zbyt dużej ilości płynu na powierzchni.
Pokrój mózg na 250-mikrometrowe odcinki koronalne. Następnie obróć stolik o 90 stopni i utwórz plastry strzałkowe o grubości 250 mikrometrów. Po tym kroku sekcje mózgu są określane jako mikroplasterki.
Umieść mikro plastry w dwóch okrągłych dnie z 10 do 15 mililitrami ciepłego bufora do naleśników. Delikatnie poruszaj rurką, aż poszczególne mikro plastry zostaną zawieszone, a następnie pozwól im osiąść pod wpływem grawitacji. Ostrożnie usuń supernatant, który będzie mętny z powodu zawieszonych resztek komórek, i dodaj 10 mililitrów świeżego, ciepłego buforu do probówki.
Powtórz procedurę prania cztery razy, aby usunąć większość zanieczyszczeń po dokładnym umyciu. Zrównoważ mikroplastry w temperaturze 37 stopni Celsjusza z delikatnym potrząsaniem lub odwróceniem i zmieniaj bufor Krebsa co 15 minut, łącznie przez godzinę. Po tym czasie dodaj dwa mililitry świeżego bufora Krebsa o temperaturze 37 stopni Celsjusza i przenieś 15 do 20 mikro plasterków do płaskiej probówki z polistyrenu o pojemności pięciu mililitrów.
Używając końcówki do pipet o bardzo szerokim otworze i gładkich krawędziach, rozprowadź mikroplastry równomiernie na podstawie probówki w jednej warstwie, tak aby każda mikrokropelka nie znajdowała się dalej niż kilka milimetrów od natlenionej atmosfery. Po prawidłowym ułożeniu inkubuj mikroplastry w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zapewnić odpowiednie natlenienie mikroplastrów. Stale przepuszczaj karbogen przez zawieszenie mikroplasterków z przewodem gazowym umieszczonym tuż nad powierzchnią, aby uniknąć mechanicznego zakłócenia mikroplastrów w bezpośrednim kontakcie z gazem Aby uzyskać najlepsze wyniki.
Bardzo ważne jest, aby plastry mikros były prawidłowo napowietrzone. Ważne jest, aby przewód gazowy był umieszczony w odpowiedniej odległości od powierzchni zawiesiny mikrowitryny. Kilka linii można ze sobą połączyć, aby umożliwić wielokrotne stymulacje.
Jednocześnie można stosować różne bodźce. W tym przykładzie mikroplastry poddawane są stymulacji AMPA. Potraktuj mikroplasterki samym bodźcem cytotoksycznym lub buforem Krebsa.
Do kontroli grupy stymulowanej. Usuń roztwór inkubacyjny w różnych momentach po stymulacji i zastąp go 300 mikrolitrami lodowatego buforu homogenizacyjnego w żądanym punkcie czasowym. Po stymulacji homogenizuj mikroplastry na lodzie za pomocą szklanego homogenizatora z teflonowym puchem, przechowuj jednorodny materiał w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do dalszej analizy.
Tempo oddychania pokazuje, że mikroplastry pobrane z przodomózgowia kurczaka są żywotne do dwóch godzin po porodzie. Wysoki poziom A TP i niski poziom A DP występujący w mikro plasterkach jest również charakterystyczny dla żywotnych komórek. W tym przykładzie zmierzono zawartość potasu w tkankach i stwierdzono, że po rozbiorze znajduje się tuż nad tłem, ale po inkubacji z buforem Krebsa dodanie WABE i EGTA spowodowało spadek zawartości potasu w tkankach, co pokazuje, że mikroplasterki normalnie aktywnie pompują potas i że poziomy nie są spowodowane potasem uwięzionym w martwej tkance lub przestrzeniach śródmiąższowych.
Tutaj mikro plasterki zostały wygenerowane z prążkowia i kory czuciowej samców szczurów i zdepolaryzowane za pomocą buforu krebów o wysokiej zawartości potasu. Szybkość fosforylacji kleju N dwa B różniła się między korą a prążkowiem, podczas gdy szybkość fosforylacji kleju a jednego była podobna między tymi dwoma obszarami. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około dwie godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia model skrawka mózgu zaprojektowany do badania mechanizmów molekularnych uszkodzeń mózgu indukowanych ekscytotoksycznością. Technika ta umożliwia uzyskanie żywej, dojrzałej tkanki mózgowej przy jednoczesnym ograniczeniu liczby wykorzystywanych zwierząt i zachowaniu obwodów neuronalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Modele in vitro
Wstęp
- Ekscytotoksyczność jest istotnym czynnikiem w uszkodzeniach mózgu.
- Istniejące modele często opierają się na pierwotnych kulturach neuronów.
- Wykorzystanie dojrzałej tkanki mózgowej zapewnia dokładniejszą reprezentację warunków in vivo.
- Celem tego modelu jest zmniejszenie liczby zwierząt wykorzystywanych w badaniach.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego modelu udaru in vitro.
- Zbadanie wpływu stymulacji cytotoksycznej na mikroplastry mózgu.
- Zachowanie interakcji komórkowych i przedziałów postsynaptycznych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie mikroskib ze świeżo wyizolowanej tkanki mózgowej.
- Równoważenie mikroskib przy łagodnym wytrząsaniu.
- Zastosowanie różnych manipulacji eksperymentalnych po etapie równoważenia.
- Ocena żywotności skib przez co najmniej dwie godziny po ich przygotowaniu.
Główne wyniki
- Mikroplastry pozostają żywotne do celów eksperymentalnych przez dwie godziny.
- Technika ta pozwala na zachowanie wielu typów komórek w obrębie plastrów.
- Wyniki wskazują, że model ten jest bardziej reprezentatywny dla nienaruszonej tkanki mózgowej.
- Wykazuje on przewagi nad tradycyjnymi metodami hodowli neuronów.
Wnioski
- Opracowany model skrawków mózgu jest skuteczny w badaniu ekscytotoksyczności.
- Podejście to ogranicza liczbę wykorzystywanych zwierząt, zachowując jednocześnie integralność tkanki.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać ten model do pogłębienia wiedzy na temat mechanizmów uszkodzeń mózgu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Modelowanie ekscytotoksycznego uszkodzenia mózgu w dojrzałej tkance nerwowej wypełnia krytyczną lukę w neurobiologii translacyjnej, umożliwiając bardziej predykcyjną ocenę mechanizmów molekularnych istotnych dla udaru niedokrwiennego. Ta platforma mikropłatków mózgu wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego i walidację celów terapeutycznych poprzez zachowanie złożoności komórkowej i architektury tkanki, których brakuje w pierwotnych kulturach neuronów. Jej adaptacyjność w odniesieniu do różnych gatunków i obszarów mózgu zwiększa znaczenie portfela badań w fazie wczesnego odkrywania i w badaniach przedklinicznych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie ścieżek ekscytotoksyczności w dojrzałych, wielokomórkowych środowiskach neuronalnych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez modelowanie śmierci komórek i sygnalizacji w nienaruszonych tkankach.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez odróżnianie reakcji dojrzałych tkanek od artefaktów charakterystycznych dla niedojrzałych kultur.
- Zwiększa pewność prognostyczną w przypadku potencjalnych celów terapeutycznych zaangażowanych w udary i neurodegenerację.
Przesiew i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowany, powtarzalny system do ilościowego określania wyników funkcjonalnych, takich jak żywotność komórek i zdarzenia fosforylacji.
- Wspiera standaryzację testów, umożliwiając równoległe stosowanie warunków stymulacji i kontroli w obrębie tego samego kontekstu tkankowego.
- Pozwala na skalowalną adaptację do wielu obszarów mózgu i gatunków, co poszerza możliwości zastosowania w badaniach przesiewowych.
- Umożliwia wiarygodną ocenę wpływu związków na odpowiedzi dojrzałej tkanki nerwowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z mechanizmami istotnymi dla choroby poprzez modelowanie uszkodzenia ekscytotoksycznego w dojrzałych skrawkach mózgu.
- Wspiera odkrywanie biomarkerów translacyjnych poprzez pomiar punktów końcowych molekularnych po stymulacji.
- Zapewnia ciągłość od wczesnych badań mechanistycznych do walidacji przedklinicznej w bardziej złożonych systemach.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez wypełnienie luki między kulturami komórkowymi a modelami in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy model mikrosliców mózgu znajduje zastosowanie na etapie pomiędzy wczesnym odkrywaniem a walidacją przedkliniczną, umożliwiając testowanie hipotez i badania mechanistyczne przed rozpoczęciem prac in vivo.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego w odniesieniu do celów związanych z ekscytotoksycznością i neuroprotekcją.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników, takich jak żywotność komórek i status fosforylacji, w celu oceny związków.
- Analityka: Umożliwia analizę porównawczą odpowiedzi molekularnych w różnych obszarach mózgu i warunkach terapeutycznych.
- Badania translacyjne: Ułatwia dostosowanie do punktów końcowych istotnych dla choroby oraz strategii biomarkerowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Adaptacyjny protokół wspiera zastosowanie międzyprogramowe i standaryzację w ramach portfolio neuronauki.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad neurodegeneracją.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie tkanki i stymulację w celu uzyskania powtarzalnych i skalowalnych przepływów pracy.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), dostarczając danych z dojrzałych tkanek przed rozpoczęciem badań na zwierzętach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów neuroprotekcyjnych i modulujących ekscytotoksyczność z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w sekcji mózgu, obchodzeniu się z tkanką oraz ocenie żywotności skrawków.
- Wymaga dostępu do specjalistycznego sprzętu do krojenia tkanki, inkubacji i oxygenacji.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji protokołów stymulacji i punktów końcowych analizy pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych gatunków i obszarów mózgu, lecz może wymagać optymalizacji protokołu dla każdego przypadku.
- Okno żywotności ogranicza czas trwania eksperymentu do około dwóch godzin po przygotowaniu skrawków.
