Oznaczanie degradacji proteasomalnej w systemie bezkomórkowym u roślin

Ukierunkowana degradacja białek stanowi główny mechanizm regulujący funkcjonowanie komórki. Zachodzi za pośrednictwem konserwatywnego szlaku ubikwityna-proteasom, który przyłącza łańcuchy poliubikwityny do białka docelowego, które następnie służą jako molekularne "znaczniki" dla proteasomu 26S. W tym miejscu opisujemy prosty i niezawodny bezkomórkowy test proteasomalnej degradacji białek.

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest analiza stabilności białek w systemie bezkomórkowym. Osiąga się to poprzez inokulację Oceana Biana różnymi szczepami agrobacterium. Zawiera białko będące przedmiotem zainteresowania zawierające konstrukt binarny.

Całkowite białko jest następnie ekstrahowane z liści rośliny. Liście są przenoszone do mikroprobówek fuge i inkubowane w temperaturze pokojowej przez coraz dłuższy czas. Następnie próbki białek są rozpuszczane za pomocą SDS Akrylamidu, żelu, elektroforezy i elektrotransferu do membrany nitrocelulozowej.

W celu wykrycia białka będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą specyficznego przeciwciała, uzyskuje się wyniki, które wykazują stabilność białka w obecności lub braku specyficznego inhibitora proteasomalnego w oparciu o analizę western blot. Opisujemy tutaj prostą metodologię badania stabilności substratu torbieli protosomu INE w obecności lub braku jednego z podstawowych składników szlaku degradacji proteasomalnej w systemie bezkomórkowym. Metody te mogą więc dostarczyć informacji na temat bezpieczniejszej degradacji proteasomalnej.

Może być również stosowany w innych systemach, takich jak badania roli regulowanej degradacji białek w różnych procesach komórkowych. W tej demonstracji używana jest NCOA hamana. Roślina jest łatwa w uprawie, bardzo podatna na agrobacterium i ma duże liście, które łatwo się zaszczepiają.

Uprawiaj jedną roślinę przez cztery do sześciu tygodni w doniczce z promix B w kontrolowanych warunkach długiego dnia i wilgotności względnej od 40 do 65%. Od czasu do czasu nawozić roślinę dostępnymi w handlu produktami zgodnie z instrukcjami producenta. Gdy roślina wyrośnie, wybierz liście o wymiarach 50 milimetrów na 70 milimetrów lub większych.

W przypadku inokulacji agrobacterium należy wyhodować szczep Agrobacterium zawierający konstrukt binarny, poddając ekspresji badanego białka przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza w pożywce YEP uzupełnionej odpowiednimi antybiotykami po odwirowaniu komórek, ponownie zawiesić do gęstości optycznej 0,5 w temperaturze 600 nanometrów w buforze infiltracyjnym i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Naciekać kulturę do strony AAL liścia za pomocą jednomililitrowej strzykawki bezigłowej. Po infiltracji hoduj roślinę przez 72 godziny w tym samym reżimie świetlnym Przed zbiorem, cztery godziny przed zbiorem, naciekaj obszary liści zaszczepione agrobacterium 10 inhibitorem mikromolowym lub makietą.

Potraktuj liść odpowiednimi rozpuszczalnikami, zbierz zaszczepione obszary liścia, zwykle od 200 do 400 miligramów świeżej masy, i zmiel je na drobny proszek w ciekłym azocie. Następnie przygotuj całkowity ekstrakt białkowy, umieszczając zmieloną tkankę w 500 mikrolitrach buforu degradacyjnego. Klarować ekstrakt przez dwa sekwencyjne wirowania pod ciśnieniem 12 000 razy większym niż grawitacja przez pięć minut, aby przeprowadzić reakcję degradacji białka.

Przenieś równe objętości ekstraktów, zwykle 20 mikrolitrów, do probówek do mikrofuge i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez coraz dłuższy czas. Zazwyczaj używany jest czas próbkowania zero oraz 5, 10, 15, 20 i 30-minutowe punkty czasowe. Zatrzymaj reakcje, gotując bufor próbki żelu SDS przed analizą ich za pomocą western blot.

Roztwory białek należy rozpuścić za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS, najpierw oznaczając stężenie białka przy użyciu metody Bradforda i ładując od 50 do 80 mikrogramów całkowitego białka na pas. Upewnij się, że wszystkie próbki są załadowane równomiernie do kontroli załadunku. Porównaj intensywność wszechobecnych gatunków białek, takich jak przypuszczalne duże łańcuchy rubis, które migrują jako główne pasmo ze względną ruchliwością elektroforetyczną wynoszącą około 50 kilodaltonów.

Po elektrotransferze rozwiązanych białek do membrany nitrocelulozowej zgodnie ze standardowymi protokołami, zablokuj błonę 5% odtłuszczonym mlekiem w TBST na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało antyepitopowe w 1% Odtłuszczone mleko w TBST do stężenia zalecanego przez producenta. Inkubować przeciwciało z zablokowaną błoną przez godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem.

Następnie płukać membranę w 20 mililitrach TBST przez 15 minut raz, a następnie dwa razy przez pięć minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Następnie rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe sprzężone z peroksydazą chrzanowego w 1% Odtłuszczone mleko w TBST zgodnie z zaleceniami producenta. Inkubować przeciwciało drugorzędowe z błoną przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem po kolejnym płukaniu w TBST, wizualizować interesujące białka za pomocą peroksydazy chrzanowej reprezentatywne eksperymenty wykazujące destabilizację białka związanego z obroną roślin.

Veep one przez białko VBFF box za pośrednictwem szlaku SCF wykazano w N hamana. Zachodnia analiza krwi wykazała, że ilości Veep one były znacznie zmniejszone w przypadku jednoczesnej ekspresji z VBF, ale pozostawały stosunkowo stabilne przy braku koekspresji VBF. Mechanizm degradacji proteasomalnej destabilizacji Veep one przez VBF został wywnioskowany z jego hamowania przez inhibitor proteasomu MG 1 32.

Kwantyfikacja tych wyników wykazała prawie całkowite zahamowanie V 1 przez VBF, które zostało praktycznie zablokowane przez MG 1 32. Nieco wyższe poziomy V 1 w obecności MG 1 32 najprawdopodobniej tłumaczy się hamowaniem endogennej aktywności homologu VBF. Po umyciu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać degradację białek przez początkowy szlak proteasomu.

Ten sam projekt eksperymentalny może być wykorzystany do badań nad innymi organizmami i może być przeprowadzony w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak rola regulowanej degradacji białek w różnych procesach komórkowych.