Name: Oznaczanie degradacji proteasomalnej w systemie bezkomórkowym u roślin (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-26T17:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Poznaj metodę oznaczania degradacji proteasomalnej w systemie bezkomórkowym u roślin Nicotiana benthamiana. Technika SDS-PAGE i western blotting pozwala analizować stabilność białek oraz rolę szlaku ubikityna-proteasom w regulacji komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca, która doprowadziła do powstania tej publikacji, otrzymała dofinansowanie z programu Marie Curie COFUND "U-Mobility", współfinansowanego przez Uniwersytet w Maladze iSiódmy Program Ramowy Unii Europejskiej (FP7/2007-2013) w ramach GA nr 246550. Prace w naszym laboratorium są wspierane przez granty z NIH, USDA/NIFA, NSF, BARD i BSF dla V.C.

1. Ekspresja białka
<ol>
	<li>Wybór systemu odciągu 
	Należy wybrać system, tj. wektory i metodę dostarczania wektorów, najlepiej nadające się do ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania w konkretnym organizmie/komórce modelowej. Należy pamiętać, że nasz test wymaga ekspresji badanych białek w łatwo wykrywalnych ilościach, co najlepiej osiąga się poprzez przejściową transformację dużej liczby komórek. Na przykład w roślinach najlepiej osiągnąć to za pomocą plazmidów binarnych jako wektorów ekspresji i Agrobacterium jako systemu dostarczania.</li>
	<li>Budowa binarnych wektorów wyrażeń 
	Sklonuj sekwencję kodującą (sekwencje) białka (białek) będącego przedmiotem zainteresowania do wektora ekspresyjnego samodzielnie lub w fuzji translacyjnej do znacznika epitopu. Użyj wektorów odpowiednich dla wybranego systemu ekspresji i standardowych procedur biologii molekularnej do klonowania genów. W przypadku dostarczania genów za pośrednictwem Agrobacterium należy zastosować wektory binarne i wprowadzić je, również przy użyciu standardowych protokołów, do szczepu Agrobacterium, takiego jak EHA105, w celu późniejszego zaszczepienia tkanek roślinnych.</li>
	<li>Wybór gatunków roślin 
	Należy wybrać gatunek rośliny, w którym białko (białka) będące przedmiotem zainteresowania będzie wyrażane. Należy pamiętać, że chociaż można użyć dowolnego gatunku roślin podatnego na transformację genetyczną za pośrednictwem Agrobacterium, naszym ulubionym gatunkiem rośliny jest Nicotiana benthamiana, która jest łatwa w uprawie, bardzo podatna na Agrobacterium i ma duże liście, które łatwo się zaszczepiają.</li>
	<li>Wzrost roślin 
	Hoduj jedną roślinę przez 4 do 6 tygodni w doniczce z Pro-Mix BX w doniczce (20 cm x 20 cm x 20 cm) w kontrolowanych warunkach środowiskowych (np. komora wzrostu) długiego dnia (tj. 16 godzin światła 130-150 μE m-2 s-1 w temperaturze 23°C i 8 godzin ciemności w temperaturze 20°C) i wilgotności względnej 40-65%. 
	1.5.2 Nawozić od czasu do czasu dostępnymi na rynku produktami zgodnie z instrukcjami producenta. Gdy roślina jest już wyrosła, wybierz liście o wymiarach 50 mm x 70 mm lub większych (te pomiary długości nie obejmują ogonka liściowego) do inokulacji Agrobacterium.</li>
	<li>Inokulacja preparatem Agrobacterium 
	Wyhodować szczep Agrobacterium zawierający konstrukt binarny eksprymujący badane białka z kroku 1.3 przez noc w temperaturze 28°C w pożywce YEP (1% peptonu, 1% ekstraktu drożdżowego i 0,5% NaCl) uzupełnionej odpowiednimi antybiotykami (np. 100 mg/L streptomycyny i 10 mg/L ryfampicyny dla wektorów opartych na pPZP-RSC224-25). 
	1.6.2 Odwirować komórki, zawiesić je do OD600 = 0,5 w buforze infiltracyjnym [10 mM MgCl2, 10 mM Mes (pH 5,6), 100 μM acetosyringonu] i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Naciekać kulturę do axialnej strony liścia za pomocą 1 ml strzykawki bezigłowej; Zauważ, że liście są zaszczepiane in situ, podczas gdy jest przyczepiony do rośliny. 
	1.6.3 Po infiltracji roślinę uprawiać przez 72 godziny w warunkach świetlnych 16 h 130-150 μE m-2 s-1 light w temperaturze 23°C/8 h ciemności w temperaturze 20°C przed zbiorem.</li>
	<li>Stosowanie inhibitorów proteasomalnych 
	Aby potwierdzić tezę, że badane białka są degradowane przez szlak proteasomalny, należy zastosować specyficzne inhibitory proteasomalne MG132 i laktacystynę28-29, które powinny zmniejszyć lub nawet zablokować degradację. Na cztery godziny przed zbiorem (patrz krok 2.1) naciekać obszary liści zaszczepionych przez Agrobacterium 10 μM MG132 (EMD Millipore) lub 10 μM laktacystyny (Sigma-Aldrich) lub pozorować działanie liści odpowiednimi rozpuszczalnikami, tj. 0,1% DMSO lub wodą destylowaną.</li>
</ol>
2. Przygotowanie ekstraktów bezkomórkowych
<ol>
	<li>Zbiór liści 
	Zbierz zaszczepione obszary liści, zwykle ok. 200-400 mg świeżej masy, i zmiel je na drobny proszek w ciekłym azocie. Alternatywnie, ubijaj tkanki za pomocą dowolnego ubijaka do kulek (np. Biospec) lub amalgamatora dentystycznego (np. TPC Advanced Technologies) bezpośrednio w buforze degradacji (patrz krok 2.2).</li>
	<li>Ekstrakcja białka 
	Przygotować ekstrakt białkowy całkowity, umieszczając zmieloną tkankę w 500 μl buforu degradacyjnego [50mM Tris-HCL (pH 7,5), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 5 mM adenozyno-5'-trifosforan i 1x koktajl inhibitorów proteazy (Sigma-Aldrich)]. Należy pamiętać, że koktajl inhibitorów proteazy wpływa głównie na serynę, cysteinę, asparadawkę i metaloproteazy i nie zakłóca proteazy 26S. Klarować ekstrakt przez dwa sekwencyjne wirowania przy 12 000 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Reakcja degradacji białek 
	Przenieś równe objętości ekstraktów, zwykle 20 μl, do probówek do mikrofuge i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez coraz dłuższy czas. Zazwyczaj próbkowany czas zero i 5, 10, 15, 20 i 30 minut punktów czasowych. Zatrzymaj reakcje, gotując je w żelowym buforze do próbek SDS i przeanalizuj je za pomocą western blot.</li>
</ol>
3. Wykrywanie degradacji białek przez immunoblotting
<ol>
	<li>Elektroforeza żelowa 
	3.1.1 Roztwory białek należy rozpuścić za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS i elektrotransferować rozwiązane białka do membrany nitrocelulozowej zgodnie ze standardowym protokołem30. 
	3.1.2 Oznaczyć stężenie białka metodą Bradforda (Bio-Rad) i załadować 50-80 μg białka całkowitego na pas. Upewnij się, że wszystkie próbki są załadowane jednakowo. W przypadku kontroli obciążenia należy porównać intensywności wszechobecnych gatunków białek, takich jak przypuszczalne duże łańcuchy RuBisCo, które migrują jako główne pasmo o względnej ruchliwości elektroforetycznej około 50 kDa; można je wykryć na niebiesko barwionych żelach Coomassie lub na membranach nitrocelulozowych barwionych metodą Ponceau S lub fluorescencyjnym SYPRO Ruby.</li>
	<li>Blokowanie 
	Zablokuj membranę 5% odtłuszczonym mlekiem w TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przeciwciało pierwszorzędowe 
	Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało antyepitopowe w 1% odtłuszczonym mleku w TBST do stężenia zalecanego przez producenta i inkubować z zablokowaną membraną przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4ºC z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Płukanie 
	Przepłukać membranę, przepłukuje się w 20 ml TBST przez 15 minut raz i dwa razy przez 5 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Przeciwciało drugorzędowe 
	Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe (np. anty-królicze IgG) sprzężone z peroksydazą chrzanowego (HRP) w 1% mleku odtłuszczonym w TBST zgodnie z zaleceniami producenta i inkubować z membraną przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Wykrywanie 
	Ponownie przepłukać membranę zgodnie z opisem w kroku 3.4. Po ostatnim płukaniu w TBST należy zobrazować interesujące białka za pomocą substratu chemiluminescencyjnego HRP, najczęściej przy użyciu zestawu ECL.  </li>
</ol>

<ol><li>Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+control+in+ubiquitin-dependent+proteolysis%3A+don%E2%80%99t+Skp+the+F-box+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis.</a> Trends Genet. 14, 236-243 (1998).</li>
<li>Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+and+cullin%2Fring+H2-based+ubiquitin+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases.</a> Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).</li>
<li>Callis, J., Vierstra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+degradation+in+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein degradation in signaling.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).</li>
<li>Hellmann, H., Estelle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+development%3A+regulation+by+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plant development: regulation by protein degradation.</a> Science. 297, 793-797 (2002).</li>
<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).</li>
<li>Dharmasiri, S., Estelle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+regulated+protein+degradation+in+auxin+response%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of regulated protein degradation in auxin response.</a> Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).</li>
<li>Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ubiquitination+in+the+regulation+of+plant+defence+against+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).</li>
<li>Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+ubiquitin-26S-proteasome+pathway+in+gibberellin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling.</a> Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).</li>
<li>Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+26S+proteasome+system+in+the+signaling+pathways+of+TGF-beta+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily.</a> Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).</li>
<li>Pagano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+DNA+synthesis+and+mitosis+by+the+Skp2-+p27-Cdk1%2F2+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis.</a> Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).</li>
<li>Magori, S., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hijacking+of+the+host+SCF+ubiquitin+ligase+machinery+by+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens.</a> Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).</li>
<li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+plant+transformation%3A+the+biology+behind+the+%26%2334%3Bgene-jockeying%26%2334%3B+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the &#34;gene-jockeying&#34; tool.</a> Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).</li>
<li>Lacroix, B., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+bacterial+and+host+plant+factors+in+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation.</a> Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).</li>
<li>Schrammeijer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+the+virulence+protein+VirF+of+Agrobacterium+tumefaciens+with+plant+homologs+of+the+yeast+Skp1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein.</a> Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).</li>
<li>Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+induces+expression+of+a+plant+host+F-box+protein+required+for+tumorigenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity.</a> Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).</li>
<li>Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+targeted+proteolysis+in+plant+genetic+transformation+by+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium.</a> Nature. 431, 87-92 (2004).</li>
<li>Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+of+synthetic+Agrobacterium+T-DNA-protein+complexes+via+the+host+SCFVBF+ubiquitin-ligase+complex+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).</li>
<li>Zhou, P., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+and+degradation+of+the+substrate+recognition+subunits+of+SCF+ubiquitin-protein+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases.</a> Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).</li>
<li>Galan, J. M., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-dependent+degradation+of+multiple+F-box+proteins+by+an+autocatalytic+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).</li>
<li>Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tome-1%2C+a+trigger+of+mitotic+entry%2C+is+degraded+during+G1+via+the+APC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC.</a> Cell. 113, 101-113 (2003).</li>
<li>Guardavaccaro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+meiotic+and+mitotic+progression+by+the+F+box+protein+b-Trcp1+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo.</a> Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).</li>
<li>Magori, S., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+counteracts+host-induced+degradation+of+its+F-box+protein+effector%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector.</a> Sci. Signal. 4, (2011).</li>
<li>Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prophase+destruction+of+Emi1+by+the+SCFbTrCP%2FSlimb+ubiquitin+ligase+activates+the+anaphase+promoting+complex+to+allow+progression+beyond+prometaphase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase.</a> Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).</li>
<li>Tzfira, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pSAT+vectors%3A+a+modular+series+of+plasmids+for+fluorescent+protein+tagging+and+expression+of+multiple+genes+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants.</a> Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).</li>
<li>Goderis, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+modular+plant+transformation+vectors+allowing+flexible+insertion+of+up+to+six+expression+units%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units.</a> Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).</li>
<li>Lee, L. Y., Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-DNA+binary+vectors+and+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">T-DNA binary vectors and systems.</a> Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).</li>
<li>Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+multiple+transgenes+to+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Delivery of multiple transgenes to plant cells.</a> Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).</li>
<li>Yang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+Arabidopsis+26+S+proteasome%3A+biochemical+and+molecular+analyses+revealed+the+presence+of+multiple+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms.</a> J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).</li>
<li>Fenteany, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+proteasome+activities+and+subunit-specific+amino-terminal+threonine+modification+by+lactacystin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin.</a> Science. 268, 726-731 (1995).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. Ausobel, F. M., et al. , Wiley-Interscience. New York. (1987).</li>
<li>Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from:
 
 <a target="_blank" href="imagej.nih.gov/ij">imagej.nih.gov/ij</a> (1997).</li>
<li>Kim, J. H., Kim, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+RING+E3+ubiquitin+ligase+AtAIRP3%2FLOG2+participates+in+positive+regulation+of+high+salt+and+drought+stress+responses%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses).</a> Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Test ten opiera się na ekspresji badanych białek w tkankach roślinnych; Tak więc potencjalny proces degradacji proteasomalnej zachodzi oczywiście już w żywych tkankach. Destabilizację białek badamy jednak tylko w ekstraktach, przy czym początkowym punktem odniesienia jest próbka o czasie zero. Dlatego definiujemy go jako test bezkomórkowy.
Jednym z ważnych aspektów dla powodzenia tego testu jest prawidłowy wybór wektora ekspresji, z którego zostanie wyprodukowane badane białko (białka). O ile ...

Szlak ubikwityny/proteasomu 26S staje się szeroko rozpowszechnionym mechanizmem kontroli różnych reakcji biologicznych, w tym regulacji transkrypcji, progresji cyklu komórkowego i transdukcji sygnału, regulacji receptora w dół lub endocytozy, między innymi procesów1-4. W tym szlaku białko docelowe jest znakowane resztami ubikwityny, które są najpierw przyłączane wiązaniem tiolestrowym do enzymu aktywującego ubikwitynę E1, a następnie przemieszczane do reszty aminokwasowej cysteiny enzymu koniugacji ubikwityny E2; wreszcie E2 oddziałuje z ligazą ubikwityny E3, powodując poliubikwitynację substratu białkowego. Ostatecznie poliubikwitynowane białka są rozpoznawane i degradowane przez proteasom 26S. W tym mechanizmie enzym E3 określa substrat i działa jako kluczowy składnik regulatorowy układu proteasomu ubikwityny/26S (UPS). Ligazy E3 mogą działać niezależnie, takie jak ligazy domeny RING, lub jako część wielopodjednostkowego kompleksu SCF (białko Skp1 / Cullin / F-box), takiego jak ligazy domeny F-box. Szlaki degradacji proteasomalnej, w których pośredniczy SCF, biorą udział w regulacji transkrypcji, cyklu komórkowego, transdukcji sygnału5-10 i wielu innych głównych funkcjach komórkowych.
Oprócz tych krytycznych ról w regulacji procesów komórkowych, UPS zajmuje centralne miejsce w wielu interakcjach roślina-patogen. Na przykład coraz więcej dowodów sugeruje, że kilka patogenów roślin, w tym Agrobacterium tumefaciens, polega na UPS gospodarza w celu ułatwienia procesu infekcji11. Agrobacterium wywołuje nowotwór na roślinach, które reprezentują jego naturalnych gospodarzy, a także może przekształcać szeroką gamę innych eukariontów, od grzybów1,2 po komórki ludzkie12,13. Podczas infekcji Agrobacterium eksportuje element DNA (T-DNA) i kilka białek wirulencji (Vir) do komórki gospodarza12-13. Jednym z tych białek jest VirF, pierwsze białko F-box, które zostało zakodowane przez genom prokariotyczny14. Jako część kompleksu ligazy ubikwityny SCF, VirF i jego funkcjonalny homolog gospodarza VBF15 ułatwiają infekcję Agrobacterium poprzez degradację białek za pośrednictwem UPS, co prawdopodobnie ułatwia odwarstwienie inwazyjnego bakteryjnego T-DNA od towarzyszących mu białek bakteryjnych i gospodarza, odpowiednio VirE2 i VIP116,17. Co ciekawe, wiele białek F-box, w tym VirF, jest wewnętrznie niestabilnych ze względu na własną proteolizę, w której pośredniczy aktywność autoubikwitynacji18,19 lub inne ligazy E3, dla których białka F-box mogą służyć jako substraty20-23.

Podczas badania aktywności biochemicznej białek F-box, innych ligaz ubikwityny i/lub ich substratów, bardzo przydatne byłoby zastosowanie prostego i wiarygodnego testu degradacji proteasomalnej. Tutaj opisujemy jeden z takich protokołów do analizy stabilności białek w systemie bezkomórkowym. W tym teście stabilność substratu UPS jest analizowana w obecności lub braku jednego z podstawowych składników szlaku degradacji proteasomalnej, takiego jak białko F-box, w systemie bezkomórkowym. Ogólnie rzecz biorąc, dokonujemy ekspresji badanych białek w tkankach roślinnych, przygotowujemy bezkomórkowe ekstrakty z tych tkanek i monitorujemy ilość białka (białek) będących przedmiotem zainteresowania za pomocą western blot. Zależny od UPS mechanizm degradacji białek jest wykazywany przez włączenie specyficznych inhibitorów proteasomalnych i/lub wykorzystanie koekspresji dominująco-ujemnej formy składnika SCF, Culliny. Podczas gdy ilustrujemy ten test za pomocą proteasomalnej degradacji białka Arabidopsis VIP117 przez białko F-box VBF15, można go wykorzystać do zbadania stabilności dowolnych innych substratów proteasomalnych.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do oznaczania białek</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0001</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteinaz&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>System Mini-Protean</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>Półsuchy system elektrotransferu SD do blottingu</td><td>zachodniego Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>Affinity Purified Rabbit Anti-Ha</td><td>ICL Lab</td><td>RHGT-45A-Z</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-królicza peroksydaza IgG sprzężona</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td></td></tr><tr><td>BioTrace, NT membrana transferowa nitrocelulozy</td><td>Pall Corporation</td><td>27377-000</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon zachodnie chemiluminescencyjne podłoże HRP</td><td>EMD Millipore</td><td>WBKL S0 050</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>EMD Millipore</td><td>474790-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Lactacystin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate</td><td>Pierce</td><td>35055</td><td></td></tr></tbody></table>

oznaczanie degradacji proteasomalnej w systemie bezkomórkowym u roślin

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

Szlak ubikwityny-proteasomu do degradacji białek okazał się jednym z najważniejszych mechanizmów regulacji szerokiego spektrum funkcji komórkowych w praktycznie wszystkich organizmach eukariotycznych. W szczególności u roślin system ubikwityny/proteasomu 26S (UPS) reguluje degradację białek i znacząco przyczynia się do rozwoju szerokiego zakresu procesów, w tym odpowiedzi immunologicznej, rozwoju i programowanej śmierci komórki. Co więcej, coraz więcej dowodów sugeruje, że liczne patogeny roślinne, takie jak Agrobacterium, wykorzystują UPS gospodarza do skutecznej infekcji, co podkreśla znaczenie UPS w interakcjach między roślinami a patogenami.
Specyficzność substratu UPS jest osiągana przez ligazę ubikwityny E3, która działa w porozumieniu z ligazami E1 i E2, rozpoznając i oznaczając specyficzne cząsteczki białka przeznaczone do degradacji poprzez dołączenie do nich łańcuchów cząsteczek ubikwityny. Jedną z klas ligaz E3 jest kompleks SCF (białko Skp1/Cullin/F-box), który specyficznie rozpoznaje substraty UPS i kieruje je do ubikwitynacji poprzez składnik białkowy F-box. Aby zbadać potencjalną rolę UPS w interesującym procesie biologicznym, ważne jest opracowanie prostego i wiarygodnego testu do degradacji białek za pośrednictwem UPS. W tym miejscu opisujemy jeden z takich testów wykorzystujących system bezkomórkowy roślinny. Test ten można zaadaptować do badań nad rolą regulowanej degradacji białek w różnych procesach komórkowych, ze szczególnym uwzględnieniem interakcji białko-substrat F-box.

Rysunek 1, zaadaptowany z pracy Zaltsman et al.17, przedstawia reprezentatywne eksperymenty służące do wykrywania degradacji proteasomalnej w systemie bezkomórkowym. W szczególności demonstrujemy destabilizację białka VIP1 związanego z odpornością roślin przez białko F-box VBF via szlak SCFVBF w N. benthamiana. Białka VBF z Arabidopsis oraz białko VIP1 znakowane HA (HA-VIP1) były przejściowo koekspresowane, a zawartość białka HA-VIP1 w ekstraktach z ekspon...

Ukierunkowana degradacja białek stanowi główny mechanizm regulujący funkcjonowanie komórki. Zachodzi za pośrednictwem konserwatywnego szlaku ubikwityna-proteasom, który przyłącza łańcuchy poliubikwityny do białka docelowego, które następnie służą jako molekularne "znaczniki" dla proteasomu 26S. W tym miejscu opisujemy prosty i niezawodny bezkomórkowy test proteasomalnej degradacji białek.

Oznaczanie degradacji proteasomalnej w systemie bezkomórkowym u roślin

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest analiza stabilności białka w systemie bezkomórkowym. Jest to realizowane poprzez inokulację Oceana Biana różnymi szczepami agrobacterium, które są nośnikami białka docelowego zawierającego konstrukt binarny.Następnie z liści rośliny ekstrahuje się całkowite białko. Liście przenosi się do probówek do wirówek mikrocentryfużowych i inkubuje w temperaturze pokojowej przez coraz dłuższe okresy czasu. Następnie próbki białek rozdziela się za pomocą elektroforezy w żelu z SDS i akrylamidem, a następnie przenosi elektroforetycznie na membranę nitrocelulozową.W celu wykrycia białka docelowego przy użyciu specyficznego przeciwciała, uzyskano wyniki obrazujące stabilność białka w obecności lub przy braku specyficznego inhibitora proteasomów na podstawie analizy western blotting. Opisujemy tutaj prostą metodologię badania stabilności substratu cysteiny proteasomu INE w obecności lub przy braku jednego z kluczowych komponentów szlaku degradacji proteasomalnej w systemie bezkomórkowym. Metody te mogą zatem dostarczyć informacji na temat bezpieczniejszej degradacji proteasomalnej.Metodę tę można zastosować również w innych systemach, np. w badaniach nad rolą regulowanej degradacji białek w różnych procesach komórkowych. W niniejszej demonstracji wykorzystano NCOA hamana. Roślina ta jest łatwa w hodowli, wykazuje wysoką podatność na infekcję agrobacterium i posiada duże liście, które są łatwe do inokulacji.Uprawiać jedną roślinę przez cztery do sześciu tygodni w doniczce z podłożem promix B w kontrolowanych warunkach środowiskowych przy długim dniu i wilgotności względnej od 40 do 65%. Nawozić roślinę okazjonalnie produktami dostępnymi w handlu zgodnie z instrukcjami producenta. Po wyrośnięciu rośliny wybrać liście o rozmiarach 50 mm na 70 mm lub większe.W celu inokulacji agrobakteriami należy hodować szczep Agrobacterium zawierający konstrukt binarny, wykazujący ekspresję badanego białka, przez noc w temperaturze 28°C w podłożu YEP uzupełnionym o odpowiednie antybiotyki. Po odwirowaniu komórek należy zawiesić je w buforze do infiltracji do gęstości optycznej 0,5 przy 600 nm i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Kulturę należy wprowadzić do bocznej części liścia AAL za pomocą jednofazyowej strzykawki bez igły. Po infiltracji roślinę należy hodować przez 72 godziny przy zachowaniu tego samego reżimu oświetlenia. Na cztery godziny przed zbiorem należy zinfiltrować obszary liści inokulowane agrobakteriami 10 µM inhibitora lub próbą kontrolną (mock).Potraktuj liść odpowiednimi rozpuszczalnikami, pobierz zaszczepione obszary liścia, zazwyczaj od 200 do 400 miligramów masy świeżej, i rozetrzyj je na drobny proszek w ciekłym azocie. Następnie przygotuj ekstrakt białek całkowitych, umieszczając rozdrobnioną tkankę w 500 mikrolitrach buforu degradacyjnego. Oczyść ekstrakt poprzez dwie następujące po sobie centryfugacje przy 12 000 ×g przez pięć minut, aby przeprowadzić reakcję degradacji białek.Przenieś równe objętości ekstraktów, zazwyczaj 20 µL, do probówek do wirówki i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez określone odstępy czasu. Typowo stosuje się punkt czasowy zero oraz punkty po 5, 10, 15, 20 i 30 minutach. Przerwij reakcje poprzez zagotowanie z buforem do próbek żelu SDS przed analizą metodą western blotting.Rozdziel próbki białek metodą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z SDS, najpierw określając stężenie białka metodą Bradforda i nakładając od 50 do 80 mikrogramów całkowitego białka na każdą ścieżkę. Należy upewnić się, że wszystkie próbki są nakładane w równych ilościach w celu zastosowania kontroli załadunku. Porównaj intensywność powszechnie występujących gatunków białek, takich jak domniemane duże łańcuchy rubisku, które migrują jako główny prążek o względnej ruchliwości elektroforetycznej wynoszącej około 50 kilodaltonów.Po przeniesieniu elektroforetycznym rozdzielonych białek na membranę nitrocelulozową zgodnie ze standardowymi protokołami, należy zablokować membranę 5% mlekiem odtłuszczonym w buforze TBST przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przeciwciało pierwszorzędowe anty-epitop należy rozcieńczyć w 1% mleku odtłuszczonym w TBST do stężenia zalecanego przez producenta. Przeciwciało należy inkubować z zablokowaną membraną przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy łagodnym mieszaniu.Następnie wypłucz membranę w 20 mililitrach TBST przez 15 minut raz, a potem dwukrotnie przez pięć minut w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu. Następnie rozcieńcz przeciwciało wtórne sprzężone z peroksydazą chrzanową w 1% Skim milk w TBST zgodnie z zaleceniami producenta. Po kolejnym płukaniu w TBST inkubuj membranę z przeciwciałem wtórnym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu, a następnie zwizualizuj badane białka za pomocą peroksydazy chrzanowej; reprezentatywne eksperymenty pokazują destabilizację białka związanego z obroną roślin.Wykazano, że białko VBF wywołuje degradację Veep1 poprzez szlak SCF w komórkach N hamana. Analiza Western blot wykazała, że ilość Veep1 uległa znacznemu zmniejszeniu podczas koekspresji z VBF, natomiast pozostała stosunkowo stabilna w przypadku braku koekspresji VBF. Mechanizm degradacji proteasomalnej prowadzący do destabilizacji Veep1 przez VBF wywnioskowano z faktu, że proces ten został zahamowany przez inhibitor proteasomów MG 1 32.Ilościowa analiza tych wyników wykazała niemal całkowite zahamowanie V one przez VBF, co zostało praktycznie zablokowane przez MG 1 32. Nieco wyższe poziomy V one w obecności MG 1 32 wynikają najprawdopodobniej z zahamowania aktywności endogennego homologu VBF. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat badania degradacji białek w początkowej fazie szlaku proteasomalnego.Taki sam schemat doświadczalny można zastosować dla dowolnych innych organizmów i przeprowadzić w celu znalezienia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak rola regulowanej degradacji białek w różnych procesach komórkowych.

assaying-proteasomal-degradation-in-a-cell-free-system-in-plants

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ocena degradacji proteasomowej w systemie wolnym od komórek w roślinach

Opisano metodę monitorowania aktywności ubikwityna-proteasomowej w żywych komórkach. Wygenerowano białka fuzyjne: destabilizowane degronem GFP- (GFP-dgn) oraz stabilne GFP-dgnFS, które następnie wprowadzono do komórek za pomocą lentiwirusem wektora ekspresyjnego. Technika ta pozwala na stworzenie stabilnej linii komórkowej wykazującej ekspresję GFP-dgn/GFP-dgnFS, w której aktywność ubikwityna-proteasomową można łatwo ocenić za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej.

Monitorowanie aktywności układu ubikwityna-proteasom w żywych komórkach przy użyciu białka reporterowego opartego na zielonym białku fluorescencyjnym (GFP) destabilizowanego przez degron (dgn)

W tym filmie demonstrujemy komórkowy test agregacji białek za pomocą inhibitorów proteasomów, które blokują aktywność proteasomu, zapobiegając nieprawidłowo sfałdowanym, zmutowanym białkom, połączonym z fluorescencyjnym znacznikiem, przed degradacją proteasomalną zależną od ubikwityny, prowadzącą do ich akumulacji w cytoplazmie komórki. Agregaty białkowe są następnie wizualizowane i oznaczane ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Test tworzenia agregatów białkowych: metoda wykrywania i ilościowego określania agregacji białek w hodowanych komórkach po indukcji przez inhibitor proteasomu

Ten film opisuje test degradacji dla nieprawidłowo sfałdowanych białek za pomocą leczenia cykloheksymidem wraz z frakcjonowaniem detergentem. Metoda ta pomaga w badaniu dynamiki nieprawidłowo sfałdowanych białek i odkrywaniu dogłębnych mechanizmów obrotu białkami.

Test degradacji białek podatnych na nieprawidłowe fałdowanie: technika monitorowania nieprawidłowo sfałdowanej degradacji białek przy użyciu obróbki cykloheksymidem i frakcjonowania detergentem

Opisujemy tutaj protokół oczyszczania i charakterystyki kompleksów białek roślinnych. Pokazujemy to, immunoprecypitując pojedyncze białko w kompleksie, dzięki czemu możemy zidentyfikować jego modyfikacje potranslacyjne i oddziałujących partnerów.

Identyfikacja modyfikacji potranslacyjnych kompleksów białek roślinnych

Tutaj opisujemy solidny test biologiczny do ilościowego określania względnego tempa proteolizy przez układ ubikwityna-proteasom. Odczyt testu to tempo wzrostu drożdży w płynnej kulturze, które zależy od poziomów komórkowych białka reporterowego składającego się z sygnału degradacji połączonego z niezbędnym markerem metabolicznym.

Test wzrostu oparty na reporterze do systematycznej analizy degradacji białek

Ten artykuł opisuje test oparty na wzroście drożdży do określania wymagań genetycznych dla degradacji białek. Zademonstrowano również metodę szybkiej ekstrakcji białek drożdży, nadającą się do western blot w celu biochemicznego potwierdzenia wymagań degradacji. Techniki te można dostosować do monitorowania degradacji różnych białek.

Oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

Ten raport opisuje protokoły pomiaru szybkości degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek za pomocą testów western blot lub opartych na fluorescencji. Metody te mogą być stosowane do analizy innych nieprawidłowo sfałdowanych białek oraz do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Testy degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek w komórkach

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Interakcje białko-białko i białko-metabolit są kluczowe dla wszystkich funkcji komórkowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który umożliwia równoległą analizę tych interakcji z wybranym białkiem. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem hodowli komórek roślinnych i łączy oczyszczanie powinowactwa z wykrywaniem białek i metabolitów opartym na spektrometrii mas.

2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

Przedstawione tutaj jest podejście fosfoproteomiczne, a mianowicie fosfoproteomiczne oparte na końcówce do ekstrakcji stop and go, które zapewnia wysoką przepustowość i głębokie pokrycie fosfoproteomu Arabidopsis. Podejście to wyznacza przegląd sygnalizacji stresu osmotycznego u Arabidopsis.

Fosfoproteomiczna strategia profilowania sygnalizacji stresu osmotycznego u rzodkiewnika

Ten protokół opisuje proces metabolicznego znakowania starzejących się i niedzielących się komórek za pomocą pulsacyjnego SILAC, nieukierunkowaną analizę spektrometrii mas i uproszczone obliczanie okresów półtrwania białek.

Pomiar szybkości obrotu białek w starzejących się i niedzielących się hodowanych komórkach z etykietowaniem metabolicznym i spektrometrią mas

Poznaj metodę oznaczania degradacji proteasomalnej w systemie bezkomórkowym u roślin Nicotiana benthamiana. Technika SDS-PAGE i western blotting pozwala analizować stabilność białek oraz rolę szlaku ubikityna-proteasom w regulacji komórkowej.

Oznaczanie degradacji proteasomalnej w systemie bezkomórkowym u roślin

Przeglądaj więcej filmów