Ekspresja, izolacja i oczyszczanie rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych białek biotynylowanych do regeneracji tkanki nerwowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomyślne zaprojektowanie, ekspresja i izolacja rekombinowanych białek biotynylowanych, które mogą zostać wykorzystane w różnorodnych zastosowaniach, takich jak sondy, sensory, dostarczanie leków oraz inżynieria tkankowa. Cel ten osiąga się poprzez transformację specjalnie zaprojektowanego plazmidu do bakteryjnej linii komórek gospodarza z wykorzystaniem kultur w małej skali, a następnie indukcję ekspresji białka docelowego. W kolejnym kroku określa się obecność i rozpuszczalność białka docelowego, aby opracować odpowiednie procedury oczyszczania.

Następnie skaluje się procedurę w celu uzyskania większych wydajności białka docelowego, które są następnie izolowane przy użyciu technik chromatografii powinowactwa. Na koniec białka są oczyszczane, a następnie zagęszczane do dalszych zastosowań i analiz. Ostatecznie wyniki SDS-PAGE oraz FPLC potwierdzają, że białka rekombinowane zostały pomyślnie wyizolowane i oczyszczone, a następnie białka są poddawane dalszym testom funkcjonalnym.

Główną zaletą inżynierii białek rekombinowanych jest możliwość otrzymywania białek o specjalnej konstrukcji w ilościach od skali miligramowej do wielkoskalowej, zgodnie z naszymi dokładnymi specyfikacjami naukowymi. Przykładowo, możemy dodać nowe funkcjonalności do fragmentów tych białek, aby nadać im nowe właściwości. Pokażemy dzisiaj, w jaki sposób można biotynilować końce konkretnych białek, co wykorzystujemy do ich specyficznego unieruchamiania lub wiązania z powierzchniami w celu sterowania funkcjami komórkowymi, takimi jak wypustki neuronalne czy różnicowanie neuronów.

Osoby rozpoczynające pracę z tą techniką nie powinny mieć większych trudności z przestrzeganiem procedur izolacji białek w warunkach natywnych lub denaturujących. Wiele etapów jest identycznych, jednak wymagają one zastosowania konkretnego buforu sformułowanego dla warunków natywnych lub denaturujących. Należy zachować szczególną staranność w początkowej fazie procesu.

Etapy transformacji i ekspresji testowej zapewnią wysoką wydajność białka podczas późniejszego procesu końcowego skalowania. Wizualna demonstracja tej metody jest istotna, ponieważ pokazuje, w jaki sposób można wytwarzać białka rekombinowane przy użyciu prostego sprzętu i materiałów laboratoryjnych. Dzięki zastosowaniu prostej reakcji okresowej, media wyrównujące i wzrostowe są hodowane w skali pilotażowej, co pozwala na uzyskanie 10 mg białka z głównej hodowli.

Dodatkowo można zastosować i zaprezentować techniki chromatograficzne, aby pokazać, w jaki sposób białka są dalej oczyszczane do zastosowań w dalszych etapach procesu. Dzisiaj Alicia, doktorantka z Cinema Lab, zaprezentuje tę procedurę. Po sklonowaniu i przetestowaniu ekspresji docelowego białka oraz wyhodowaniu 20 mililitrów kultury przez noc, zgodnie z protokołem tekstowym, należy przelać kulturę nocną do 1,8 litra sterylnego pożywki wzrostowej z ampicyliną i za pomocą pipety Pasteura dodać od sześciu do ośmiu kropli sterylnego odpieniacza 2 0 4. Kultury należy umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C; przez filtr 0,2 mikrona należy napowietrzać kultury sprężonym powietrzem za pomocą kamieni napowietrzających. Gdy kultura osiągnie OD 600 na poziomie 0,7 do 0,8, należy dodać 1 millimolar IPTG i indukować ekspresję przez cztery godziny w 37 °C lub przez noc w 18 °C, w zależności od tego, czy białko w teście ekspresji znajdowało się w frakcji rozpuszczalnej, czy nierozpuszczalnej.

Przeprowadzić eksperymenty w celu zebrania komórek, przenosząc kulturę do jednolitrowych butelek wirówkowych i wirując przez 15 minut przy 14 000 ×g w temperaturze 4 °C. Odlać nadsącz i za pomocą cienkiej szpatułki przenieść osad bakteryjny do dwóch probówek o pojemności 50 ml. Ponownie sfelutować komórki poprzez wirowanie przez kilka minut, a następnie przechowywać osady w temperaturze -80 °C.

Aby przeprowadzić izolację białka niepochodzącego z danego organizmu w przypadku białka nierozpuszczalnego, do każdej zamrożonej pellety E. coli należy dodać 20 ml buforu do lizy i przemywania, a następnie wymieszać w wstrząsarze wirującym, aby resuspenderować próbkę i wyeliminować wszelkie duże grudki.

Po inkubacji w mutatorze przez noc roztwór będzie przypominał lepki szlam. Szlam należy wirować przy 20 500 ×g w temperaturze pokojowej przez 30 minut. W celu izolacji białka natywnego należy przenieść nadsącz do nowej probówki, a osad odrzucić.

Resuspenduj osad w buforze lizującym do końcowej objętości 30 ml, utrzymując resuspendowany osad na lodzie. Ustaw sonikator na amplitudę 30% z cyklem 30 sekund pracy i 30 sekund przerwy, a następnie sonikuj przez pięć minut. Podczas sonikacji poruszaj probówką w górę i w dół, aby całkowicie rozbić osad komórkowy.

Odwiruj zawiesinę z prędkością 20 500 ×g w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Następnie przenieś nadsącz do nowej probówki, a osad odrzuć. Aby przeprowadzić chromatografię powinowactwa w przypadku białka izolowanego w formie nienatywnej, dodaj 1 mL roztworu żywicy niklowej NTA do każdej probówki wirówkowej i inkubuj na rotatorze lub wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez co najmniej jedną godzinę.

Wlej zawiesinę do kolumny powinowactwa i pozwól roztworowi całkowicie spłynąć przez zawór odcinający do zlewki z odpadami. Do probówki wirówkowej dodaj 10 mililitrów buforu płuczącego, aby usunąć pozostałości żywicy, a następnie dodaj roztwór do kolumny po tym, jak poprzednia frakcja całkowicie spłynęła. Użyj szklanej bagietki, aby wymieszać żywicę i poczekaj, aż przestanie kapać przed dodaniem kolejnej porcji buforu płuczącego.

Następnie należy użyć 10 ml buforu do płukania, aby ponownie przepłukać probówkę wirówkową i przenieść płyn do kolumny. Następnie należy przeprowadzić osiem kolejnych płukań kolumny, używając po 10 ml buforu do płukania lizatu dla każdego cyklu. Po zakończeniu płukania należy zamknąć kranik odcinający i zastąpić zlew z odpadami probówką wirówkową o pojemności 50 ml.

Do kolumny dodaj 15 mililitrów buforu elucyjnego, wymieszaj żywicę i pozostaw roztwór na pięć minut. Następnie otwórz kranik i zbierz EIT, a następnie powtórz czynność, używając kolejnych 15 mililitrów buforu elucyjnego, aby oczyścić natywne białko. Po dodaniu żywicy niklowej NTA do roztworu białka, inkubuj go na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej jedną godzinę.

Po dziesięciokrotnym przemyciu kolumny buforem płuczącym, należy dodać pięć mililitrów buforu eluującego i inkubować żywicę przez pięć minut, a następnie użyć nowej probówki do zebrania większości EIT. W czasie, gdy EIT ścieka z kolumny, do przezrozystej płytki 96-dołkowej należy dodać po 90 µL odczynnika Bradforda do każdego dołka. Po każdej elucji pięcioma mililitrami buforu, należy pozwolić, aby 10 µL roztworu ściekło z kolumny do dołka zawierającego 90 µL odczynnika Bradforda. Należy kontynuować proces EEU aż do momentu, gdy białko nie będzie już wykrywane, w celu dializy i lub Rena.

Przenieś białka każdego EIT do rurek dializacyjnych i poddaj dializie przeciwko odpowiedniemu buforowi; pierwszą partię przez cztery godziny w temperaturze czterech stopni Celsius, a następnie wymień na właściwy bufor. Drugą partię pozostaw na noc w temperaturze czterech stopni Celsius. Użyj koncentratorów wirówkowych, aby skoncentrować zdializowane białka do objętości poniżej pięciu mililitrów, a w razie potrzeby przeprowadź dalszą puryfikację za pomocą chromatografii wykluczania cząsteczkowego przy użyciu kolumny atin eight.

Zgodnie z protokołem tekstowym podczas ekspresji testowej, NGF i SE3A były najpierw indukowane przez cztery godziny w temperaturze 37 °C, a analiza SDS-PAGE wykazała, że oba białka znajdowały się w frakcji rozpuszczalnej. Ekspresja białek wydawała się umiarkowana, dlatego zbadano kolejną ekspresję testową z indukcją nocną w temperaturze 18 °C. Ekspresja NGF w frakcji rozpuszczalnej uległa poprawie, natomiast w przypadku SEMA3 nie odnotowano zauważalnej różnicy.

Białko NGF wyizolowano w warunkach natywnych oraz nienatywnych, a następnie poddano oczyszczaniu przy użyciu kolumny FPLC. Chociaż podczas ekspresji testowej NGF znajdował się w frakcji rozpuszczalnej, izolacja natywna przy indukcji w 37 °C oraz 18 °C dała niską wydajność. Wyższą wydajność NGF uzyskano natomiast poprzez izolację nienatywną z późniejszą renaturacją.

W rezultacie NGF został wyizolowany w warunkach nienatywnych. Po nocnej indukcji w temperaturze 18 °C izolacja nienatywna nie doprowadziła do produkcji SEMA 3A, podczas gdy dla izolacji natywnej uzyskano 8,61 ± 3,1 mg z głównej kultury o objętości 2 l. W związku z tym indukcję SEMA 3A prowadzono przez cztery godziny w temperaturze 37 °C, a następnie zastosowano parametry izolacji natywnej.

Zbiór frakcji z pików FPLC został poddany analizie za pomocą elektroforezy SDS-PAGE w celu sprawdzenia próbek NGF oraz SEMA 3A. Dodatkowe piki białkowe zidentyfikowane w wynikach FPLC dla SEMA 3A zostały również zebrane i przeanalizowane metodą SDS-PAGE; nie znajdowały się one w obszarze odpowiadającym masie cząsteczkowej SEMA 3A. Frakcje te są najprawdopodobniej produktami degradacji, ponieważ w przeciwieństwie do SEMA 3 nie wykazały one aktywności funkcjonalnej w testach komórkowych.

Tutaj wskazano pik. Po opracowaniu i opanowaniu produkcji białka rekombinowanego, izolacja i oczyszczanie powinny zająć tylko kilka dni, jeśli zostaną przeprowadzone prawidłowo. Jednak początkowe etapy transformacji bakterii i ekspresji testowej trwają dłużej, aby właściwie określić rozpuszczalność białka.

Po określeniu rozpuszczalności bibliotekę przekształconych bakterii można przechowywać w temperaturze -80 °C. Ponadto, po ekspresji białka, pellety E. coli mogą być również przechowywane w -80 °C do czasu dalszej izolacji i przeprowadzania doświadczeń. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest upewnienie się, że bufory są wysterylizowane i świeżo przygotowane, aby zapobiec działaniu proteaz denaturujących i rozkładających białka.

Bufory do izolacji należy przygotowywać i sterylizować co cztery do sześciu tygodni, natomiast bufory do dializy należy przygotować w dniu poprzedzającym izolację. Kolumny N-I-N-T-A oraz FPLC powinny zostać oczyszczone zgodnie z protokołami producenta, aby zapobiec zanieczyszczeniom krzyżowym pochodzącym z wielu biotynylowanych białek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak eksponować, izolować i oczyszczać białka biotynylowane o niestandardowej konstrukcji z wykorzystaniem bakteryjnego systemu ekspresyjnego.

Jest to analogiczne do procedur stosowanych zarówno w celach naukowych, jak i komercyjnych, w skali małej i dużej. W związku z tym metoda ta ma szerokie zastosowanie.