Ekspresja, izolacja i oczyszczanie rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych białek biotynylowanych do regeneracji tkanki nerwowej

Ogólnym celem tej procedury jest pomyślne zaprojektowanie, ekspresja i wyizolowanie rekombinowanych biotynylowanych białek, które można włączyć do różnych zastosowań, takich jak sondy, czujniki, dostarczanie leków i inżynieria tkankowa. Osiąga się to poprzez najpierw przekształcenie specjalnie zaprojektowanego plazmidu w bakteryjną linię komórkową gospodarza przy użyciu kultur na małą skalę, a następnie indukowanie ekspresji białka docelowego. Następnie określa się obecność i rozpuszczalność białka docelowego w celu sformułowania odpowiednich procedur oczyszczania.

Następnie procedura jest zwiększana w celu uzyskania większej wydajności białka docelowego, które jest następnie izolowane przy użyciu technik chromatografii powinowactwa. Na koniec białka są oczyszczane, a następnie zagęszczane do dalszych zastosowań i analiz. Ostatecznie, strona SDS i wyniki FPLC potwierdzają, że rekombinowane białka zostały pomyślnie wyizolowane i oczyszczone, a białka są dalej testowane pod kątem funkcjonalności.

Główną zaletą inżynierii białek rekombinowanych jest to, że pozwala nam ona na tworzenie dużych ilości niestandardowych białek zaprojektowanych na dużą skalę lub w skali miligramowej, aby spełnić nasze dokładne specyfikacje naukowe. Na przykład, możemy dodać nowe funkcje do części tych białek, aby uzyskać nowe właściwości. Pokażemy wam dzisiaj, w jaki sposób można biotynować końce określonych białek, a my używamy tego do specyficznego unieruchamiania lub wiązania tych białek z powierzchniami, aby kierować funkcjami komórkowymi, takimi jak wzrost neuronów lub różnicowanie neuronów.

Osoby, które dopiero zaczynają stosować tę technikę, nie powinny mieć większych trudności z przestrzeganiem procedur izolacji białek natywnych lub nienatywnych. Wiele kroków jest takich samych, ale wymaga określonego buforu sformułowanego dla warunków natywnych lub nienatywnych. Na początku zwracaj uwagę na szczegóły.

Etapy transformacji i ekspresji testowej zapewnią wysoką wydajność białka podczas późniejszego, końcowego procesu zwiększania skali. Wizualna demonstracja tej metody jest ważna, ponieważ pokazuje, w jaki sposób można wytwarzać rekombinowane białka przy użyciu prostego sprzętu laboratoryjnego i materiałów laboratoryjnych. Wykorzystując prostą reakcję wsadową, pożywki wyrównujące i wzrostowe są hodowane w skali lidera, produkując 10 miligramów białka na główną hodowlę.

Ponadto techniki chromatograficzne mogą być wykorzystane i zademonstrowane, aby pokazać, w jaki sposób białka są dalej oczyszczane do dalszego zastosowania Dzisiaj Alicia, absolwentka Cinema Lab, zademonstruje procedurę Po sklonowaniu i przetestowaniu ekspresji w docelowym białku będącym przedmiotem zainteresowania oraz wyhodowaniu 20-mililitrowej kultury przez noc. Zgodnie z protokołem tekstowym, wlej nocną kulturę do 1,8 litra sterylnego podłoża wzrostowego z ampicyliną i użyj pipety do pasty, aby dodać sześć do ośmiu kropli sterylnego środka przeciwpieniącego 2 0 4 umieść kultury w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez filtr 0,2 mikrona, wprowadź sprężone powietrze do kultur przez kamienie napowietrzające. Gdy kultura osiągnie OD 600 od 0,7 do 0,8 przy jednym milimolowym IPTG i indukuj go przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub przez noc w temperaturze 18 stopni Celsjusza, w zależności od tego, czy białko znaleziono we frakcji rozpuszczalnej czy nierozpuszczalnej w wyrażeniu testowym.

Eksperymenty polegające na zebraniu komórek, przeniesieniu kultury do litrowych butelek wirówkowych i wirowaniu przez 15 minut w temperaturze 14 000 razy większej niż grawitacja i w czterech stopniach Celsjusza. Odlej super natin i za pomocą cienkiej szpatułki nabierz granulat bakteryjny do dwóch 50-mililitrowych probówek. Ponownie osadzaj komórki przez wirowanie przez kilka minut przed przechowywaniem granulek w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Aby wykonać białko nienatywne. Izolacja nierozpuszczalnego białka do każdej zamrożonej granulki E. coli. Dodaj 20 mililitrów lizy, bufor do płukania, wir i wstrząśnij, aby ponownie zawiesić, aby wyeliminować wszelkie duże kawałki.

Po inkubacji na mutatorze przez noc roztwór będzie wyglądał jak lepka wirówka do gnojowicy. Gnojowica w temperaturze 20, 500 razy większej od grawitacji i temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przenieść supernatant do świeżej probówki i wyrzucić osad w celu izolacji białka natywnego.

Resus zawiesić granulki w buforze do lizy w końcowej objętości 30 mililitrów z ponownie zawieszonym peletem na lodzie. Ustaw sonikat na amplitudę 30% z impulsem 30 sekund na 30 sekund wyłączonym i sonikuj przez pięć minut. Podskakiwanie rurką w górę iw dół podczas sonikacji, aby całkowicie rozbić osad komórkowy.

Odwiruj gnojowicę pod ciśnieniem 20, 500 razy większym niż grawitacja i w czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut. Następnie przenieść supernatant do świeżej probówki i wyrzucić osad. Aby przeprowadzić chromatografię powinowactwa na nienatywnym izolowanym białku, dodaj jeden mililitr roztworu żywicy niklowej NTA do każdej probówki wirówkowej i inkubuj na mutatorze lub wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez co najmniej jedną godzinę.

Wlać gnojowicę do kolumny powinowactwa i pozwolić, aby roztwór całkowicie spłynął przez zawór odcinający do zlewki na odpady. Dodać 10 mililitrów buforu do płukania do probówki wirówkowej w celu usunięcia resztek żywicy i dodać roztwór do kolumny po przepłynięciu roztworu. Użyj szklanego pręta do mieszania, aby wymieszać żywicę i pozwól jej przestać kapać przed dodaniem kolejnego prania.

Następnie użyj 10 mililitrów buforu do płukania, aby powtórzyć płukanie probówki wirówkowej i przenieść ją do kolumny. Następnie wykonaj osiem kolejnych płukań kolumny 10 mililitrami buforu do przemywania lizy na każde płukanie. Po zakończeniu mycia zamknij kurek odcinający i zastąp zlewkę na odpady 50-mililitrową probówką wirówkową.

Dodaj 15 mililitrów buforu elucjańskiego do kolumny, wymieszaj żywicę i pozostaw roztwór na pięć minut. Następnie otwórz kurek odcinający i zbierz EIT przed powtórzeniem z dodatkowymi 15 mililitrami buforu elucyjnego w celu oczyszczenia natywnego białka. Po dodaniu żywicy niklowej NTA do roztworu białka, inkubować na mutatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej jedną godzinę.

Po użyciu buforu do płukania do przemycia kolumny 10 razy, dodać pięć mililitrów buforu elucyjnego i inkubować żywicę przez pięć minut przed użyciem świeżej probówki do zebrania większości EIT, podczas gdy EIT kapie z kolumny, dodać 90 mikrolitrów odczynnika Bradforda na studzienkę do przezroczystej płytki 96-dołkowej. Po każdym pięciomililitrowym elucynie z buforem, pozwól, aby 10 mikrolitrów roztworu wyciekło z kolumny do studzienki zawierającej 90 mikrolitrów odczynnika Bradforda. Kontynuuj z EEU, aż białko przestanie być wykrywane do dializacji i/lub Rena.

Białka przenoszą każdy EIT do rurki dializacyjnej i dializują z odpowiednim buforem, jeden przez cztery godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie zastępują go odpowiednim buforem. Dwa noclegi w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyj koncentratorów wirowych, aby skoncentrować dializowane białka do mniej niż pięciu mililitrów i dalej oczyszczać za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar, jeśli jest to pożądane, za pomocą atin eight.

Zgodnie z protokołem tekstowym podczas ekspresji testowej, NGF i SE trzy A były najpierw indukowane przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a analiza strony SDS wykazała, że oba białka znajdowały się w tej rozpuszczalnej frakcji. Ekspresja białka wydawała się sprawiedliwa i dlatego zbadano kolejną ekspresję testową z nocną indukcją w temperaturze 18 stopni Celsjusza. Ekspresja NGF poprawiła się we frakcji rozpuszczalnej, podczas gdy nie było zauważalnej różnicy w przypadku SEMA 3.

NGF wyizolowano w warunkach natywnych i nienatywnych i przepuszczono przez kolumnę FPLC w celu oczyszczenia. Chociaż NGF znajdował się we frakcji rozpuszczalnej podczas ekspresji testowej, natywna izolacja dała niską wydajność zarówno przy indukcji 37 stopni Celsjusza, jak i 18 stopni Celsjusza. Jednak wyższą wydajność NGF uzyskano poprzez nienatywną izolację z ponownym naturyzacją.

W rezultacie, NGF został wyizolowany w warunkach nienatywnych. Po całonocnej indukcji w temperaturze 18 stopni Celsjusza, nierodzima izolacja spowodowała brak SEMA three, produkcję z 8,61 plus minus 3,1 miligrama na główną hodowlę dwóch litrów dla izolacji natywnej. W związku z tym SEMA 3 A indukowano przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i izolowano przy użyciu natywnych parametrów izolacji.

Pobrano piki FPLC i przeanalizowano próbki NGF i SEMA trzy A za pomocą strony SDS. Dodatkowe piki białkowe znalezione w wyjściu FPLC dla SEMA trzy A zostały zebrane i przeanalizowane za pomocą strony SDS i nie były zlokalizowane w regionie SEMA trzy o masie cząsteczkowej. Frakcje te są najprawdopodobniej produktami degradacji, ponieważ nie zachowywały się funkcjonalnie w testach komórkowych, tak jak miało to miejsce w przypadku SEMA trzy.

Szczyt wskazany tutaj. Po ustaleniu i opanowaniu białka rekombinowanego, izolacja i oczyszczanie powinny zająć tylko kilka dni, jeśli zostaną przeprowadzone prawidłowo. Jednak początkowe etapy transformacji bakterii i ekspresji w teście testowym trwają dłużej, aby prawidłowo określić rozpuszczalność białka.

Po określeniu rozpuszczalności biblioteka przekształconych bakterii może być przechowywana w temperaturze minus 80. Dodatkowo, po ekspresji białka, granulki E. coli mogą być również przechowywane w temperaturze minus 80, aż do dalszej izolacji i eksperymentów. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby upewnić się, że są wysterylizowane i świeże, aby zapobiec denaturacji i rozkładowi białek przez proteazy.

izolacyjne powinny być wykonane i sterylizowane co cztery do sześciu tygodni, a do dializy powinny być wykonane dzień przed izolacją. Kolumny N-I-N-T-A i FPLC powinny być czyste zgodnie z protokołami producenta, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu wieloma biotynylowanymi białkami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyrażać, izolować i oczyszczać specjalnie zaprojektowane biotynylowane białka przy użyciu bakteryjnego systemu ekspresji gospodarza.

Jest to podobne do tego, co robi się zarówno naukowo, jak i komercyjnie na małą i dużą skalę. Ma to więc szerokie zastosowanie.