Name: Ekspresja, izolacja i oczyszczanie rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych białek biotynylowanych do regeneracji tkanki nerwowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Naucz się ekspresji i izolacji biotynylowanych białek rekombinowanych w celach inżynierii tkanki nerwowej. Metoda obejmuje transformację plazmidów, indukcję ekspresji oraz oczyszczanie chromatografią afinityczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Uniwersytetowi w Akron za finansowanie, które wsparło tę pracę.

<ol><li>Itakura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+in+Escherichia+coli+of+a+chemically+synthesized+gene+for+the+hormone+somatostatin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin.</a> Science. 198 (4321), 1056-1063 (1977).</li>
<li>Goeddel, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+in+Escherichia+coli+of+chemically+synthesized+genes+for+human+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (1), 106-110 (1979).</li>
<li>Romano, N. H., Sengupta, D., Chung, C., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-engineered+biomaterials%3A+nanoscale+mimics+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Protein-engineered biomaterials: nanoscale mimics of the extracellular matrix.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810 (3), 339-349 (2011).</li>
<li>Sengupta, D., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-engineered+biomaterials%3A+highly+tunable+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein-engineered biomaterials: highly tunable tissue engineering scaffolds.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 16 (3), 285-293 (2010).</li>
<li>Kamionka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+therapeutic+proteins+production+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of therapeutic proteins production in Escherichia coli.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 12 (2), 268-274 (2011).</li>
<li>Rao, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+outlook+for+protein+engineering+in+crop+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The outlook for protein engineering in crop improvement.</a> Plant Physiol. 147 (1), 6-12 (2008).</li>
<li>Wen, F., Nair, N. U., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+in+designing+tailored+enzymes+and+microorganisms+for+biofuels+production%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protein engineering in designing tailored enzymes and microorganisms for biofuels production.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20 (4), 412-419 (2009).</li>
<li>Singh, R. K., Tiwari, M. K., Singh, R., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+protein+engineering+to+immobilization%3A+promising+strategies+for+the+upgrade+of+industrial+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">From protein engineering to immobilization: promising strategies for the upgrade of industrial enzymes.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (1), 1232-1277 (2013).</li>
<li>Bernaudat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+of+membrane+proteins%3A+choosing+the+appropriate+host%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host.</a> PLoS One. 6 (12), (2011).</li>
<li>McCormick, A. M., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+immobilization+of+biotinylated+fusion+proteins+NGF+and+Sema3A+utilizing+a+photo-cross-linkable+diazirine+compound+for+controlling+neurite+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific immobilization of biotinylated fusion proteins NGF and Sema3A utilizing a photo-cross-linkable diazirine compound for controlling neurite extension.</a> Bioconjug. Chem. 24 (9), 1515-1526 (2013).</li>
<li>Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S., Kim, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+differences+between+genome+sequences+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22B+strains+REL606+and+BL21%28DE3%29+and+comparison+of+the+E.+coli+B+and+K-12%22%5BJournal%5D)">Understanding the differences between genome sequences of Escherichia coli.</a> B strains REL606 and BL21(DE3) and comparison of the E. coli B and K-12. 394 (4), 653-680 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Novagen+pET+System+Manual%22">Novagen pET System Manual</a>. Merck KGaA, , 11, User Protocol TB055 Rev. C 0611JN. Darmstadt, Germany. 1-63 (2011).</li>
<li>Balbas, P., Bolivar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back+to+basics%3A+pBR322+and+protein+expression+systems+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Back to basics: pBR322 and protein expression systems in E. coli.</a> Methods Mol. Biol. 267, 77-90 (2004).</li>
<li>Studier, F. W., Moffatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+to+direct+selective+high-level+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol.%22%5BJournal%5D)">Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.</a> J. Mol. Biol.. 189 (1), 113-130 (1986).</li>
<li>Dubendorff, J. W., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+basal+expression+in+an+inducible+T7+expression+system+by+blocking+the+target+T7+promoter+with+lac+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor.</a> J. Mol. Biol. 219 (1), 45-59 (1991).</li>
<li>Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+T7+RNA+polymerase+to+direct+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes.</a> Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).</li>
<li>Tucker, J., Grisshammer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+rat+neurotensin+receptor+expressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J.%22%5BJournal%5D)">Purification of a rat neurotensin receptor expressed in Escherichia coli.</a> Biochem. J.. 317, 891-899 (1996).</li>
<li>Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+peptide+libraries+to+map+the+substrate+specificity+of+a+peptide-modifying+enzyme%3A+a+13+residue+consensus+peptide+specifies+biotinylation+in+Escherichia+coli%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Use of peptide libraries to map the substrate specificity of a peptide-modifying enzyme: a 13 residue consensus peptide specifies biotinylation in Escherichia coli).</a> Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).</li>
<li>Anfinsen, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+that+govern+the+folding+of+protein+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Principles that govern the folding of protein chains.</a> Science. 181 (4096), 223-230 (1973).</li>
<li>Villaverde, A., Carrio, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+in+recombinant+bacteria%3A+biological+role+of+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation in recombinant bacteria: biological role of inclusion bodies.</a> Biotechnol. Lett. 25 (17), 1385-1395 (2003).</li>
<li>Leipzig, N. D., Wylie, R. G., Kim, H., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+neural+stem+cells+in+three-dimensional+growth+factor-immobilized+chitosan+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 32 (1), 57-64 (2011).</li>
<li>Tam, R. Y., Cooke, M. J., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+covalently+modified+hydrogel+blend+of+hyaluronan-methyl+cellulose+with+peptides+and+growth+factors+influences+neural+stem%2Fprogenitor+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">A covalently modified hydrogel blend of hyaluronan-methyl cellulose with peptides and growth factors influences neural stem/progenitor cell fate.</a> J. Mater. Chem. 22, 19402-19411 (2012).</li>
<li>Li, H., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Differentiation+of+Neural+Stem+Cells+in+Macroporous+Photopolymerizable+Hydrogel+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">3D Differentiation of Neural Stem Cells in Macroporous Photopolymerizable Hydrogel Scaffolds.</a> PLoS One. 7 (11), (2012).</li>
<li>McCormick, A. M., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regenerative+strategies+incorporating+biomolecular+axon+guidance+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Neural regenerative strategies incorporating biomolecular axon guidance signals.</a> Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 578-597 (2012).</li>
<li>Kay, B. K., Thai, S., Volgina, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+biotinylation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput biotinylation of proteins.</a> Methods Mol. Biol. 498, 185-196 (2009).</li>
<li>Bayer, E. A., Wilchek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Protein biotinylation.</a> Methods Enzymol. 184, 138-160 (1990).</li>
<li>Weber, P. C., Ohlendorf, D. H., Wendoloski, J. J., Salemme, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+origins+of+high-affinity+biotin+binding+to+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural origins of high-affinity biotin binding to streptavidin.</a> Science. 243 (4887), 85-88 (1989).</li>
<li>Chen, I., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+labeling+of+proteins+with+small+molecules+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Site-specific labeling of proteins with small molecules in live cells.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 35-40 (2005).</li>
<li>Howarth, M., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+proteins+in+live+mammalian+cells+with+biotin+ligase+and+monovalent+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin.</a> Nat. Protoc. 3 (3), 534-545 (2008).</li>
<li>Hutsell, S. Q., Kimple, R. J., Siderovski, D. P., Willard, F. S., Kimple, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+immobilization+of+proteins+using+biotin-+and+GST-based+coupling+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-affinity immobilization of proteins using biotin- and GST-based coupling strategies.</a> Methods Mol. Biol. 627, 75-90 (2010).</li>
<li>Marek, P., Senecal, K., Nida, D., Magnone, J., Senecal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+biotin+functionalized+QD+assay+for+determining+available+binding+sites+on+electrospun+nanofiber+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Application of a biotin functionalized QD assay for determining available binding sites on electrospun nanofiber membrane.</a> J. Nanobiotechnol. 9, 48 (2011).</li>
<li>Cull, M. G., Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation+of+proteins+in+vivo+and+in+vitro+using+small+peptide+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Biotinylation of proteins in vivo and in vitro using small peptide tags.</a> Methods Enzymol. 326, 430-440 (2000).</li>
<li>Miller, R. E., Kopesky, P. W., Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+delivery+through+self-assembling+peptide+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Growth factor delivery through self-assembling peptide scaffolds.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 469 (10), 2716-2724 (2011).</li>
<li>Davis, M. E., Hsieh, P. C., Grodzinsky, A. J., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Custom+design+of+the+cardiac+microenvironment+with+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Custom design of the cardiac microenvironment with biomaterials.</a> Circ. Res. 97 (1), 8-15 (2005).</li>
<li>Tokatlian, T., Shrum, C. T., Kadoya, W. M., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease+degradable+tethers+for+controlled+and+cell-mediated+release+of+nanoparticles+in+2-+and+3-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Protease degradable tethers for controlled and cell-mediated release of nanoparticles in 2- and 3-dimensions.</a> Biomaterials. 31 (31), 8072-8080 (2010).</li>
<li>Gill, R. T., Valdes, J. J., Bentley, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+global+stress+gene+regulation+in+response+to+overexpression+of+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Metab.+Eng%22%5BJournal%5D)">A comparative study of global stress gene regulation in response to overexpression of recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Metab. Eng. 2 (3), 178-189 (2000).</li>
<li>Sivashanmugam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+protocols+for+production+of+very+high+yields+of+recombinant+proteins+using+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli.</a> Protein Sci. 18 (5), 936-948 (2009).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat. Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Marston, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+purification+of+eukaryotic+polypeptides+synthesized+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia coli.</a> Biochem. J. 240 (1), 1-12 (1986).</li>
<li>Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+expression+of+recombinant+proteins+in+the+cytoplasm+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli.</a> Microb. Cell Fact. 4 (1), (2005).</li>
<li>de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-based+procedure+to+increase+yields+of+soluble+recombinant+proteins+produced+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli.</a> BMC Biotechnol. 7, 32 (2007).</li>
<li>de Groot, N. S., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+temperature+on+protein+quality+in+bacterial+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Effect of temperature on protein quality in bacterial inclusion bodies.</a> FEBS Lett. 580 (27), 6471-6476 (2006).</li>
<li>Ventura, S., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+quality+in+bacterial+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Protein quality in bacterial inclusion bodies.</a> Trends Biotechnol. 24 (4), 179-185 (2006).</li>
<li>Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conformational+quality+of+insoluble+recombinant+proteins+is+enhanced+at+low+growth+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures.</a> Biotechnol. Bioeng. 96 (6), 1101-1106 (2007).</li>
<li>Peternel, S., Komel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biologically+active+nanomaterial+%28inclusion+bodies%29+from+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Isolation of biologically active nanomaterial (inclusion bodies) from bacterial cells.</a> Microb. Cell Fact. 9, 66 (2010).</li>
<li>Garcia-Fruitos, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+bodies%3A+a+new+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact.+9%22%5BJournal%5D)">Inclusion bodies: a new concept.</a> Microb. Cell Fact. 9. 9, 80 (2010).</li>
<li>Li, Y., Sousa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+E.+coli+BirA+biotin+ligase+for+in+vitro+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of E. coli BirA biotin ligase for in vitro biotinylation.</a> Protein Expr. Purif. 82 (1), 162-167 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Inżynieria białek rekombinowanych jest bardzo potężną techniką, która obejmuje wiele dyscyplin. Jest to opłacalna, dostrajalna i stosunkowo prosta procedura, pozwalająca na produkcję wysokiej wydajności specjalnie zaprojektowanych białek. Należy zauważyć, że projektowanie i ekspresja białek docelowych nie zawsze jest prosta. Podstawowa ekspresja i stabilność białka rekombinowanego zależą od konkretnych wyborów wektora, szczepów komórek E. coli , dodatków znaczników peptydowych i parametrów hodowli. Nasze specyfi...

Białka obejmują szeroki zakres biomolekuł, które są odpowiedzialne za wiele funkcji biologicznych, ostatecznie prowadząc do prawidłowego tworzenia i organizacji tkanek. Cząsteczki te inicjują tysiące szlaków sygnałowych, które kontrolują regulację w górę i/lub w dół genów i innych białek, utrzymując równowagę w ludzkim ciele. Zakłócenie działania pojedynczego białka wpływa na całą tę sieć sygnałów, co może prowadzić do wystąpienia wyniszczających zaburzeń lub chorób. Inżynieria pojedynczych białek w laboratorium oferuje jedno z rozwiązań do zwalczania tych niekorzystnych skutków i stanowi alternatywę dla leków małocząsteczkowych. W 1977 roku gen kodujący sekwencję 14-aminokwasowej somatostatyny był jednym z pierwszych zmodyfikowanych polipeptydów stworzonych przy użyciu E. coli1. Wkrótce potem, w 1979 roku, insulina została sklonowana w plazmidzie pBR322, przekształcona, poddana ekspresji i oczyszczona2. Od tego czasu rekombinowane białka rozszerzyły swój wpływ na wiele dziedzin badań, takich jak biomateriały, dostarczanie leków, inżynieria tkankowa, biofarmaceutyki, rolnictwo, enzymy przemysłowe, biopaliwa itp. Wynika to w dużej mierze z wszechstronności, jaką oferuje ta technika, poprzez dodawanie specyficznych dla aplikacji ugrupowań chemicznych lub sekwencji białkowych do celów obejmujących między innymi identyfikację, stabilizację i oczyszczanie białka docelowego.

Dzięki technologii rekombinacji DNA, rekombinowane białka mogą być wyrażane w różnych systemach gospodarzy eukariotycznych i prokariotycznych, w tym u ssaków, roślin, owadów, drożdży, grzybów lub bakterii. Każdy host oferuje inne zalety i zazwyczaj najlepszy system jest określany na podstawie funkcji białka, wydajności, stabilności, całkowitego kosztu i skalowalności. Komórkom bakteryjnym często brakuje mechanizmów modyfikacji potranslacyjnej, które zapewniają gospodarze eukariotyczni (tj. glikozylacji, mostkowania dwusiarczków itp.)5. W rezultacie systemy ssaków i owadów zwykle skutkują lepszą kompatybilnością i ekspresją białek eukariotycznych; Jednak te hosty są zazwyczaj droższe i bardziej czasochłonne9. Dlatego E. coli jest preferowanym gospodarzem dla naszego systemu ekspresji, ponieważ komórki szybko się rozwijają w niedrogich warunkach wzrostu, a mechanizmy ekspresji genetycznej są dobrze poznane5,9. Ponadto system ten można łatwo skalować do celów produkcyjnych i skutkuje funkcjonalnymi białkami pomimo braku modyfikacji potranslacyjnych10. Szczep E. coli K12 został wybrany w tym protokole do klonowania, ponieważ szczep ten oferuje doskonałą wydajność plazmidu w oparciu o wysoką wydajność transformacji. Dodatkowo do ekspresji wykorzystuje się szczep E. coli BL21, ponieważ ten szczep gospodarza zawiera gen polimerazy RNA T7, który zapewnia kontrolowaną ekspresję i stabilność białka11.
Po wyborze gospodarza, należy zachować ostrożność przy wyborze idealnego wektora ekspresji, aby ułatwić wyselekcjonowaną i kontrolowaną ekspresję białka. Synteza rekombinowanych białek rozpoczyna się od docelowej sekwencji DNA, która jest klonowana pod kierunkiem sygnałów transkrypcji i translacji T7 bakteriofaga, a ekspresja jest indukowana w komórkach gospodarza zawierających chromosomalne kopie genu polimerazy T7 RNA12. Wektory te, pochodzące z wektora plazmidowego pBR322 (w celu zapoznania się z odniesieniem13), są ściśle kontrolowane przez promotor T7 początkowo opracowany przez Studiera i współpracowników14 i zapewniają dodatkową kontrolę poprzez włączenie operatora lac i represora lac (lac1)15,16. W przypadku inżynierii białek rekombinowanych ten system ekspresji oferuje możliwość dostosowania określonej sekwencji aminokwasowej pożądanego białka poprzez wstawienie różnych docelowych sekwencji DNA lub tworzenie białek fuzyjnych składających się z połączonych domen z pojedynczych białek. Ponadto niektóre serie wektorów zawierają modyfikacje znaczników peptydowych, które należy umieścić na końcu N lub C. Dla naszych celów projektowych znacznik histydyny (His) został dodany do docelowej sekwencji DNA w celu oczyszczenia, a sekwencja 15 aminokwasów biotynylowanych została dołączona do biotynylacji17,18. W tym protokole wybrano plazmid zawierający gen oporności na ampicylinę, który przenosi nasze biotynylowane sekwencje białek fuzyjnych. Ekspresja w tym wektorze jest kontrolowana przez promotor lak T7 i jest łatwo indukowana za pomocą izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG).
Wyrażenia testowe (hodowle na małą skalę) są używane do określenia obecności i rozpuszczalności docelowego białka, które może być wyrażone zarówno w formie rozpuszczalnej, jak i nierozpuszczalnej, w celu sformułowania procedur oczyszczania. Rozpuszczalne białko ulegające ekspresji w komórce bakteryjnej ulegnie spontanicznemu fałdowaniu, aby zachować swoją natywną strukturę19. Zazwyczaj struktura natywna jest korzystna termodynamicznie. W wielu przypadkach aktywność metaboliczna gospodarza nie sprzyja białku docelowemu, co powoduje stres w systemie, co prowadzi do produkcji nierozpuszczalnych białek i tworzenia ciał inkluzyjnych złożonych z nierozpuszczalnych agregatów białkowych. W ten sposób docelowe białko ulega denaturacji, co czyni je na ogół biologicznie nieaktywnymi20. Oba wyrażenia testowe są skalowane w górę, a procedury izolacji są określane na podstawie rozpuszczalności białka docelowego. W przypadku białek nierozpuszczalnych wymagany jest dodatkowy etap renaturacji lub ponownego fałdowania. Otrzymane rekombinowane białka można dalej oczyszczać za pomocą chromatografii wykluczania wielkości.
Produkcja białek rekombinowanych w domu oferuje przewagę kosztową nad produktami komercyjnymi, ponieważ na litr głównej hodowli można wyizolować miligramy białka docelowego. Większość wymaganego sprzętu jest dostępna w typowym laboratorium biologicznym lub chemicznym. Inżynieria białkowa pozwala na tworzenie niestandardowych białek fuzyjnych z dodatkowymi funkcjami, które nie zawsze są dostępne na rynku. Rysunek 1 przedstawia główne procedury związane z inżynierią białek rekombinowanych. Dzięki temu systemowi ekspresji stworzyliśmy wiele białek biotynylowanych, takich jak interferon-gamma, płytkowy czynnik wzrostu i białko morfogenetyczne kości21-23, ale skupimy się na dwóch białkach, które zaprojektowaliśmy do prowadzenia aksonów, NGF (29 kDa) i Sema3A (91 kDa)10 (przegląd patrz odniesienie24). Biotynylacja jest powszechną techniką identyfikacji, immobilizacji i izolacji znakowanych białek wykorzystującą dobrze znaną interakcję biotyna-streptawidyna25-27. Sondy biofizyczne28,29, biosensory30 i kropki kwantowe31 to tylko niektóre przykłady systemów, które wykorzystują wysokie powinowactwo koniugacji biotyny-streptawidyny z Kd rzędu 10-15 M 27. Ligaza biotyny E. coli, BirA, pomaga w kowalencyjnym przyłączeniu biotyny do łańcucha bocznego lizyny znajdującego się w sekwencji oznaczonej biotyną18,32. Wiązanie biotyny z materiałami i biomolekułami zapewniło trwałe dostarczanie czynników wzrostu do komórki w wielu zastosowaniach inżynierii tkankowej21,33-35. Dlatego inżynieria tych specjalnie zaprojektowanych biotynolowanych białek jest potężnym narzędziem, które może wykraczać poza wiele zainteresowań badawczych.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithio-DL-treitol, DTT, 99,5%</td><td>Chem-Impex International</td><td>127</td><td>100 g</td></tr><tr><td>2-hydroksyetylomerkaptan &beta;-merkaptoetanol</td><td>Chem-Impex International</td><td>642</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Kwas octowy, lodowaty</td><td>EMD</td><td>AX0073-9</td><td>2,5 L</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bioshop</td><td>AGR001.500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Sól sodowa ampicyliny&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Przeciwpieniący 204</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6426</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Barstar-NGF pET-21a(+)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>4 i mikro; g</td></tr><tr><td>BL21(DE3) Kompetentne komórki</td><td>Novagen</td><td>69450</td><td>1 ml; Expression Host</td></tr><tr><td>Bradford odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>BugBuster</td><td>Novagen</td><td>70922-3</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Żel filtracyjny standard</td><td>Bio-Rad</td><td>151-1901</td><td>6 fiolek</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Chlorowodorek guanidyny amioformamidyny</td><td>Chem-Impex International</td><td>152</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Żywica His-Pur Ni-NTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>88222</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>EMD</td><td>HX0603-3</td><td>2,5 L</td></tr><tr><td>Imidazol&nbsp;</td><td>Chem-Impex International</td><td>418</td><td>250 g</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Chem-Impex International</td><td>194</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Laemmli bufor do próbek</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>30 ml</td></tr><tr><td>Sól sodowa laurylosiarczanu, powierzchnia dodecylowa sodu</td><td>Chem-Impex International</td><td>270</td><td>500 g</td></tr><tr><td>LB Rosół&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>NovaBlue Kompetentne Komórki</td><td>Novagen</td><td>69825</td><td>1 ml; Klonowanie gospodarza</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td>10 sztuk</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Chem-Impex International</td><td>01247</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Sema3A-pET-21a(+)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>4 i mikro; g</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886-1KG</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Fosforan sodu diabasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136-500G</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Terrific Bulion</td><td>Bioshop</td><td>TER409.5</td><td>5 kg</td></tr><tr><td>Chlorowodorek tetracykliny</td><td>Chem-Impex International</td><td>667</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Bufor Tris/Glycine/SDS, 10x</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Trypton, trzustka</td><td>EMD</td><td>1.07213.1000</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy, granulowany</td><td>EMD</td><td>1.03753.0500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>&nbsp; &Auml; KTApurifier10</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td>Zawiera zestawy i akcesoria</td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE4000</td><td>MAXQ 4000</td></tr><tr><td>BirA500</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td>Enzym jest dostarczany z reakcyjnymi i roztworem biotyny</td></tr><tr><td>Kaseta do dializy</td><td>Thermo Scientific</td><td>66380</td><td>Slide-A-Lyzer (Extra Strength)</td></tr><tr><td>Rurki</td> <td>do dializySpectrum Laboratories</td><td>132127, 132129</td><td>MWCO: 25 000 i 50 000</td></tr><tr><td>Zawór przekierowania przepływu FV-923</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0011-70</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania ilościowego biotyny FluoReporter</td><td>Invitrogen</td><td>1094598</td><td></td></tr><tr><td>Stojaki na probówki Frac-950, stojak C</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-13</td><td></td></tr><tr><td>Kolektor frakcji Frac-950</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-00</td><td>Zawiera zestawy i akcesoria</td></tr><tr><td>Cyrkulator grzewczy/chłodniczy&nbsp;</td><td>VWR</td><td>13271-102</td><td>Model 1156D</td></tr><tr><td>Piec grzewczy</td><td>Spoiwo</td><td></td> serii FD <td>Model FD 115</td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1069-01</td><td>Wycofane - Produkt zamienny: Wirówka HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td></tr><tr><td>J-26 XPI Avanti</td><td>Redlica Beckman 393126</td><td></td> JA 25.50 Rotor Beckman Coulter 363055 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>JLA 8.1 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>969329</td><td>Zawiera butelki z poliporpylenu 1 l</td></tr><tr><td>JS 5.3 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>Okap z przepływem laminarnym</td><td>Themo Scientific</td><td>1849</td><td>Forma 1800 Series Clean Bench</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>TECAN</td><td></td><td>infinite M200</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8004</td><td>4-żelowy pionowy system do elektroforezy</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Prefabrykowane żele</td><td>Bio-Rad</td><td>456-9036</td><td>Dowolna kDa, 15-dołkowa kolumna grzebieniowa</td></tr><tr><td>Ni-NTA</td><td>Bio-Rad</td><td>737-2512</td><td>49 ml&nbsp; objętość ECONO-Kolumna</td></tr><tr><td>Plasmid Miniprep</td><td>Kit Omega Bio-Tek</td><td>D6943-01</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC Zasilacz</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5052</td><td>250 V, 3 A, 300 W</td></tr><tr><td>Rurki z kopolimeru polipropylenowego okrągłego dna</td><td>VWR</td><td>3119-0050</td><td>50 ml&nbsp; rury do wirnika JA 25.50</td></tr><tr><td>Koncentratory Spin-X UF</td><td>Corning</td><td>431488, 431483</td><td>&nbsp; 20 i 6 ml; MWCO: 10 000 Da</td></tr><tr><td>usługa subklonowania</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>Usługi białkowe</td></tr><tr><td>Procesor ultradźwiękowy&nbsp;</td><td>Cole-Parmer</td><td>18910445A</td><td>Model CV18</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Przemysł naukowy</td><td>SI-0236</td><td>Model G560</td></tr></tbody></table>

ekspresja, izolacja i oczyszczanie rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych białek biotynylowanych do regeneracji tkanki nerwowej

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Inżynieria białek rekombinowanych wykorzystuje systemy ekspresji Escherichia coli (E. coli) od prawie 4 dekad, a dziś E. coli jest nadal najczęściej używanym organizmem gospodarza. Elastyczność systemu pozwala na dodawanie ugrupowań, takich jak znacznik biotyny (do interakcji streptawidyny) i większych białek funkcjonalnych, takich jak białko zielonej fluorescencji lub białko wiśniowe. Ponadto integracja nienaturalnych aminokwasów, takich jak chelatory jonów metali, unikalnie reaktywne grupy funkcyjne, sondy spektroskopowe i cząsteczki nadające modyfikacje potranslacyjne, umożliwiła lepszą manipulację właściwościami i funkcjonalnościami białek. W rezultacie technika ta tworzy konfigurowalne białka fuzyjne, które oferują znaczącą użyteczność w różnych dziedzinach badań. Mówiąc dokładniej, biotynolowana sekwencja białkowa została włączona do wielu białek docelowych ze względu na wysokie powinowactwo interakcji między biotyną a awidyną i streptawidyną. Dodatek ten przyczynił się do poprawy wykrywania i oczyszczania znakowanych białek, a także otworzył drogę do zastosowań wtórnych, takich jak sortowanie komórek. W związku z tym cząsteczki znakowane biotyną wykazują coraz większy i powszechny wpływ w dziedzinach bioprzemysłu i biomedycyny. Na potrzeby naszych badań zaprojektowaliśmy rekombinowane biotynylowane białka fuzyjne zawierające regiony funkcjonalne czynnika wzrostu nerwów (NGF) i semaforyny3A (Sema3A). Informowaliśmy wcześniej, w jaki sposób te biotynylowane białka fuzyjne, wraz z innymi aktywnymi sekwencjami białkowymi, mogą być powiązane z biomateriałami w celu inżynierii tkankowej i celów regeneracyjnych. Protokół ten przedstawia podstawy inżynierii białek biotynolacyjnych w skali miligramowej, wykorzystując wektor indukowany przez T7 lac i gospodarzy ekspresji E. coli, począwszy od transformacji do skalowania i oczyszczania.

Klonowanie i ekspresja testowa
Przy prawidłowym wysiewaniu powinny powstać pojedyncze, odizolowane kolonie, co zwiększa szansę na wyizolowanie klonalnych, transformowanych komórek bakteryjnych (Rycina 2A). Jednakże, jeśli wysiano zbyt wiele komórek, płytki były inkubowane zbyt długo w 37 °C lub transformacja była wątpliwa, kolonie mogą pokryć płytkę z agarem lub tworzyć większe agregaty komórek (Ryciny 2B oraz 2C). Podczas tes...

Rozwój biotynylowalnych białek fuzyjnych ma wiele potencjalnych zastosowań w różnych dziedzinach badań. Inżynieria białek rekombinowanych to prosta procedura, która jest opłacalna, zapewniając wysoką wydajność niestandardowych białek.

Ekspresja, izolacja i oczyszczanie rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych białek biotynylowanych do regeneracji tkanki nerwowej

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomyślne zaprojektowanie, ekspresja i izolacja rekombinowanych białek biotynylowanych, które mogą zostać wykorzystane w różnorodnych zastosowaniach, takich jak sondy, sensory, dostarczanie leków oraz inżynieria tkankowa. Cel ten osiąga się poprzez transformację specjalnie zaprojektowanego plazmidu do bakteryjnej linii komórek gospodarza z wykorzystaniem kultur w małej skali, a następnie indukcję ekspresji białka docelowego. W kolejnym kroku określa się obecność i rozpuszczalność białka docelowego, aby opracować odpowiednie procedury oczyszczania.Następnie skaluje się procedurę w celu uzyskania większych wydajności białka docelowego, które są następnie izolowane przy użyciu technik chromatografii powinowactwa. Na koniec białka są oczyszczane, a następnie zagęszczane do dalszych zastosowań i analiz. Ostatecznie wyniki SDS-PAGE oraz FPLC potwierdzają, że białka rekombinowane zostały pomyślnie wyizolowane i oczyszczone, a następnie białka są poddawane dalszym testom funkcjonalnym.Główną zaletą inżynierii białek rekombinowanych jest możliwość otrzymywania białek o specjalnej konstrukcji w ilościach od skali miligramowej do wielkoskalowej, zgodnie z naszymi dokładnymi specyfikacjami naukowymi. Przykładowo, możemy dodać nowe funkcjonalności do fragmentów tych białek, aby nadać im nowe właściwości. Pokażemy dzisiaj, w jaki sposób można biotynilować końce konkretnych białek, co wykorzystujemy do ich specyficznego unieruchamiania lub wiązania z powierzchniami w celu sterowania funkcjami komórkowymi, takimi jak wypustki neuronalne czy różnicowanie neuronów.Osoby rozpoczynające pracę z tą techniką nie powinny mieć większych trudności z przestrzeganiem procedur izolacji białek w warunkach natywnych lub denaturujących. Wiele etapów jest identycznych, jednak wymagają one zastosowania konkretnego buforu sformułowanego dla warunków natywnych lub denaturujących. Należy zachować szczególną staranność w początkowej fazie procesu.Etapy transformacji i ekspresji testowej zapewnią wysoką wydajność białka podczas późniejszego procesu końcowego skalowania. Wizualna demonstracja tej metody jest istotna, ponieważ pokazuje, w jaki sposób można wytwarzać białka rekombinowane przy użyciu prostego sprzętu i materiałów laboratoryjnych. Dzięki zastosowaniu prostej reakcji okresowej, media wyrównujące i wzrostowe są hodowane w skali pilotażowej, co pozwala na uzyskanie 10 mg białka z głównej hodowli.Dodatkowo można zastosować i zaprezentować techniki chromatograficzne, aby pokazać, w jaki sposób białka są dalej oczyszczane do zastosowań w dalszych etapach procesu. Dzisiaj Alicia, doktorantka z Cinema Lab, zaprezentuje tę procedurę. Po sklonowaniu i przetestowaniu ekspresji docelowego białka oraz wyhodowaniu 20 mililitrów kultury przez noc, zgodnie z protokołem tekstowym, należy przelać kulturę nocną do 1,8 litra sterylnego pożywki wzrostowej z ampicyliną i za pomocą pipety Pasteura dodać od sześciu do ośmiu kropli sterylnego odpieniacza 2 0 4. Kultury należy umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C; przez filtr 0,2 mikrona należy napowietrzać kultury sprężonym powietrzem za pomocą kamieni napowietrzających. Gdy kultura osiągnie OD 600 na poziomie 0,7 do 0,8, należy dodać 1 millimolar IPTG i indukować ekspresję przez cztery godziny w 37 °C lub przez noc w 18 °C, w zależności od tego, czy białko w teście ekspresji znajdowało się w frakcji rozpuszczalnej, czy nierozpuszczalnej.Przeprowadzić eksperymenty w celu zebrania komórek, przenosząc kulturę do jednolitrowych butelek wirówkowych i wirując przez 15 minut przy 14 000 ×g w temperaturze 4 °C. Odlać nadsącz i za pomocą cienkiej szpatułki przenieść osad bakteryjny do dwóch probówek o pojemności 50 ml. Ponownie sfelutować komórki poprzez wirowanie przez kilka minut, a następnie przechowywać osady w temperaturze -80 °C.Aby przeprowadzić izolację białka niepochodzącego z danego organizmu w przypadku białka nierozpuszczalnego, do każdej zamrożonej pellety E. coli należy dodać 20 ml buforu do lizy i przemywania, a następnie wymieszać w wstrząsarze wirującym, aby resuspenderować próbkę i wyeliminować wszelkie duże grudki.Po inkubacji w mutatorze przez noc roztwór będzie przypominał lepki szlam. Szlam należy wirować przy 20 500 ×g w temperaturze pokojowej przez 30 minut. W celu izolacji białka natywnego należy przenieść nadsącz do nowej probówki, a osad odrzucić.Resuspenduj osad w buforze lizującym do końcowej objętości 30 ml, utrzymując resuspendowany osad na lodzie. Ustaw sonikator na amplitudę 30% z cyklem 30 sekund pracy i 30 sekund przerwy, a następnie sonikuj przez pięć minut. Podczas sonikacji poruszaj probówką w górę i w dół, aby całkowicie rozbić osad komórkowy.Odwiruj zawiesinę z prędkością 20 500 ×g w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Następnie przenieś nadsącz do nowej probówki, a osad odrzuć. Aby przeprowadzić chromatografię powinowactwa w przypadku białka izolowanego w formie nienatywnej, dodaj 1 mL roztworu żywicy niklowej NTA do każdej probówki wirówkowej i inkubuj na rotatorze lub wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez co najmniej jedną godzinę.Wlej zawiesinę do kolumny powinowactwa i pozwól roztworowi całkowicie spłynąć przez zawór odcinający do zlewki z odpadami. Do probówki wirówkowej dodaj 10 mililitrów buforu płuczącego, aby usunąć pozostałości żywicy, a następnie dodaj roztwór do kolumny po tym, jak poprzednia frakcja całkowicie spłynęła. Użyj szklanej bagietki, aby wymieszać żywicę i poczekaj, aż przestanie kapać przed dodaniem kolejnej porcji buforu płuczącego.Następnie należy użyć 10 ml buforu do płukania, aby ponownie przepłukać probówkę wirówkową i przenieść płyn do kolumny. Następnie należy przeprowadzić osiem kolejnych płukań kolumny, używając po 10 ml buforu do płukania lizatu dla każdego cyklu. Po zakończeniu płukania należy zamknąć kranik odcinający i zastąpić zlew z odpadami probówką wirówkową o pojemności 50 ml.Do kolumny dodaj 15 mililitrów buforu elucyjnego, wymieszaj żywicę i pozostaw roztwór na pięć minut. Następnie otwórz kranik i zbierz EIT, a następnie powtórz czynność, używając kolejnych 15 mililitrów buforu elucyjnego, aby oczyścić natywne białko. Po dodaniu żywicy niklowej NTA do roztworu białka, inkubuj go na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej jedną godzinę.Po dziesięciokrotnym przemyciu kolumny buforem płuczącym, należy dodać pięć mililitrów buforu eluującego i inkubować żywicę przez pięć minut, a następnie użyć nowej probówki do zebrania większości EIT. W czasie, gdy EIT ścieka z kolumny, do przezrozystej płytki 96-dołkowej należy dodać po 90 µL odczynnika Bradforda do każdego dołka. Po każdej elucji pięcioma mililitrami buforu, należy pozwolić, aby 10 µL roztworu ściekło z kolumny do dołka zawierającego 90 µL odczynnika Bradforda. Należy kontynuować proces EEU aż do momentu, gdy białko nie będzie już wykrywane, w celu dializy i lub Rena.Przenieś białka każdego EIT do rurek dializacyjnych i poddaj dializie przeciwko odpowiedniemu buforowi; pierwszą partię przez cztery godziny w temperaturze czterech stopni Celsius, a następnie wymień na właściwy bufor. Drugą partię pozostaw na noc w temperaturze czterech stopni Celsius. Użyj koncentratorów wirówkowych, aby skoncentrować zdializowane białka do objętości poniżej pięciu mililitrów, a w razie potrzeby przeprowadź dalszą puryfikację za pomocą chromatografii wykluczania cząsteczkowego przy użyciu kolumny atin eight.Zgodnie z protokołem tekstowym podczas ekspresji testowej, NGF i SE3A były najpierw indukowane przez cztery godziny w temperaturze 37 °C, a analiza SDS-PAGE wykazała, że oba białka znajdowały się w frakcji rozpuszczalnej. Ekspresja białek wydawała się umiarkowana, dlatego zbadano kolejną ekspresję testową z indukcją nocną w temperaturze 18 °C. Ekspresja NGF w frakcji rozpuszczalnej uległa poprawie, natomiast w przypadku SEMA3 nie odnotowano zauważalnej różnicy.Białko NGF wyizolowano w warunkach natywnych oraz nienatywnych, a następnie poddano oczyszczaniu przy użyciu kolumny FPLC. Chociaż podczas ekspresji testowej NGF znajdował się w frakcji rozpuszczalnej, izolacja natywna przy indukcji w 37 °C oraz 18 °C dała niską wydajność. Wyższą wydajność NGF uzyskano natomiast poprzez izolację nienatywną z późniejszą renaturacją.W rezultacie NGF został wyizolowany w warunkach nienatywnych. Po nocnej indukcji w temperaturze 18 °C izolacja nienatywna nie doprowadziła do produkcji SEMA 3A, podczas gdy dla izolacji natywnej uzyskano 8,61 ± 3,1 mg z głównej kultury o objętości 2 l. W związku z tym indukcję SEMA 3A prowadzono przez cztery godziny w temperaturze 37 °C, a następnie zastosowano parametry izolacji natywnej.Zbiór frakcji z pików FPLC został poddany analizie za pomocą elektroforezy SDS-PAGE w celu sprawdzenia próbek NGF oraz SEMA 3A. Dodatkowe piki białkowe zidentyfikowane w wynikach FPLC dla SEMA 3A zostały również zebrane i przeanalizowane metodą SDS-PAGE; nie znajdowały się one w obszarze odpowiadającym masie cząsteczkowej SEMA 3A. Frakcje te są najprawdopodobniej produktami degradacji, ponieważ w przeciwieństwie do SEMA 3 nie wykazały one aktywności funkcjonalnej w testach komórkowych.Tutaj wskazano pik. Po opracowaniu i opanowaniu produkcji białka rekombinowanego, izolacja i oczyszczanie powinny zająć tylko kilka dni, jeśli zostaną przeprowadzone prawidłowo. Jednak początkowe etapy transformacji bakterii i ekspresji testowej trwają dłużej, aby właściwie określić rozpuszczalność białka.Po określeniu rozpuszczalności bibliotekę przekształconych bakterii można przechowywać w temperaturze -80 °C. Ponadto, po ekspresji białka, pellety E. coli mogą być również przechowywane w -80 °C do czasu dalszej izolacji i przeprowadzania doświadczeń. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest upewnienie się, że bufory są wysterylizowane i świeżo przygotowane, aby zapobiec działaniu proteaz denaturujących i rozkładających białka.Bufory do izolacji należy przygotowywać i sterylizować co cztery do sześciu tygodni, natomiast bufory do dializy należy przygotować w dniu poprzedzającym izolację. Kolumny N-I-N-T-A oraz FPLC powinny zostać oczyszczone zgodnie z protokołami producenta, aby zapobiec zanieczyszczeniom krzyżowym pochodzącym z wielu biotynylowanych białek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak eksponować, izolować i oczyszczać białka biotynylowane o niestandardowej konstrukcji z wykorzystaniem bakteryjnego systemu ekspresyjnego.Jest to analogiczne do procedur stosowanych zarówno w celach naukowych, jak i komercyjnych, w skali małej i dużej. W związku z tym metoda ta ma szerokie zastosowanie.

expression-isolation-purification-soluble-insoluble-biotinylated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ekspresja, izolacja i oczyszczanie rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych białek z biotinylowaną grupą dla regeneracji tkanki nerwowej

Regulowana endocytoza kontroluje poziomy ekspresji na powierzchni komórki dla większości białek błonowych. W niniejszym opracowaniu wykorzystujemy redukowalne, nieprzenikające przez błonę odczynniki do biotinylacji, aby zmierzyć tempo endocytozy transportera dopaminy (DAT), który jest politopeowym białkiem błonowym. Metoda ta umożliwia prostą procedurę pomiaru tempa endocytozy większości białek błony plazmatycznej.

Pomiar szybkości endocytozy białek błony plazmatycznej za pomocą odwracalnego znakowania biotyną

Ten film pokazuje izolację białek powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych z hodowli astrocytów. Hodowlę astrocytów umieszcza się na lodzie w celu zahamowania endocytozy, a następnie białka na powierzchni komórki znakuje się odczynnikiem biotynylacyjnym. Komórki są poddawane lizie w celu uwolnienia biotynylowanych białek powierzchniowych komórek i niebiotynylowanych białek wewnątrzkomórkowych. Wreszcie, kulki pokryte streptawidyną są używane do oddzielania biotynylowanych białek powierzchniowych...

Izolacja białek powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych z hodowli astrocytów

Ruch błony neuronalnej dynamicznie kontroluje dostępność białek błony plazmatycznej i znacząco wpływa na neuroprzekaźnictwo. Do tej pory trudno było zmierzyć neuronalny transport endocytarny w dorosłych neuronach. W tym miejscu opisujemy wysoce skuteczną, ilościową metodę pomiaru szybkich zmian ekspresji białek powierzchniowych ex vivo w ostrych wycinkach mózgu.

Biotynylacja wycinków mózgu: podejście ex vivo do pomiaru specyficznego dla regionu transportu białek błony plazmatycznej w dorosłych neuronach

Axonalny transport BDNF, czynnika neurotroficznego, jest krytyczny dla przetrwania i funkcjonowania kilku populacji neuronów. Niektóre zaburzenia zwyrodnieniowe charakteryzują się zaburzeniem struktury i funkcji aksonów.  Zademonstrowaliśmy techniki stosowane do badania żywego transportu QD-BDNF w komorach mikroprzepływowych przy użyciu neuronów pierwotnych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym transportu aksonalnego BDNF znakowanego kropkami kwantowymi w neuronach pierwotnych

Metodologia wirowania o zmodyfikowanej gęstości oparta na gradimencie została wykorzystana do izolacji komórek nabłonkowych z tkanki jelitowej Rhipicephalus microplus. Białka związane z powierzchnią poddano biotynylacji i oczyszczono za pomocą kulek magnetycznych streptawidyny w celu wykorzystania w dalszych zastosowaniach.

Oczyszczanie biotynylowanych białek powierzchniowych komórek z nabłonkowych komórek jelitowych Rhipicephalus microplus

W tym raporcie przedstawiono dwie metody oparte na biotynylacji, przeznaczone do określania ekspresji na powierzchni komórki i szybkości endocytarnej białek wyrażanych na błonie plazmatycznej.

Określanie ekspresji białek na powierzchni komórki i szybkości endocytów w pierwotnych kulturach astrocytów za pomocą biotynylacji

Prezentowany tutaj jest protokół, który łączy system kohodowli neuronalno-śródbłonkowej in vitro i metaboliczną inkorporację sialoglikanu z bioortogonalnymi grupami funkcyjnymi w celu rozszerzenia pierwotnych nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych oraz oznaczenia ich powierzchniowych sialoglykoprotein do obrazowania lub analizy spektrometrii mas markerów powierzchni komórki.

Identyfikacja markerów powierzchniowych pierwotnych nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez znakowanie metaboliczne sialoglikanu

Przedstawione tutaj są protokoły do testów biochemicznych in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny, które mogą być szeroko stosowane do badania interakcji białko-kwas nukleinowy.

Testy biochemiczne in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny do badania interakcji białko-kwas nukleinowy

Rekombinowany BDNF zawierający sekwencję Avi (BDNFAvi) jest wytwarzany w komórkach HEK293 w opłacalny sposób i oczyszczany przez chromatografię powinowactwa. BDNFavi jest następnie bezpośrednio monobiotynylowany enzymem BirA w probówce. BDNFavi i monobiotynylowany BDNFavi zachowują swoją aktywność biologiczną w porównaniu z dostępnym na rynku BDNF.

Ulepszony protokół oczyszczania i bezpośredniego monobiotynylowania rekombinowanego BDNF w probówce do badań nad transportem komórkowym w neuronach

W protokole przedstawiono metodę kowalencyjnego przyłączania biotyny do białek in vivo w oparciu o ich bliskość do ligazy biotyny połączonej z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Modyfikacja ta pozwala na selektywne wzbogacanie białek za pomocą kulek streptawidyny, zgodnie z potrzebami w badaniach interakcji białkowych.

In vivo (in vivo ) Biotynylacja zbliżeniowa w badaniach interakcji białkowych w Pantofelku czworobocznym

Naucz się ekspresji i izolacji biotynylowanych białek rekombinowanych w celach inżynierii tkanki nerwowej. Metoda obejmuje transformację plazmidów, indukcję ekspresji oraz oczyszczanie chromatografią afinityczną.

Ekspresja, izolacja i oczyszczanie rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych białek biotynylowanych do regeneracji tkanki nerwowej

Przeglądaj więcej filmów