Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie obrazowania i analizy mitozy progenitorowej neuronów w żywych wycinkach mózgu myszy. Osiąga się to poprzez najpierw preparację mózgów z embrionów. Drugim krokiem jest przygotowanie plasterków mózgu za pomocą vibrato.

Następnie wykonywane jest obrazowanie na żywo wycinków mózgu. Ostatnim krokiem jest wydobycie informacji z filmów w celu analizy interesujących parametrów mitozy. Ostatecznie mikroskopia poklatkowa służy do pokazania, jak populacje progenitorowe mózgu dzielą się w czasie rzeczywistym.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak analiza ustalona, jest to, że można uzyskać znaczący wgląd w temporalną dynamikę podziału neuro progenitorów w żywych wycinkach mózgu. Można go również wykorzystać do zrozumienia, w jaki sposób zaburzenia genetyczne mogą wpływać na podział neuro progenitorów. Chociaż używamy tej metody, aby zrozumieć rozwój kory mózgowej, opisaną przez nas analizę można zastosować do badania mitozy komórek macierzystych w innych obszarach mózgu, a nawet poza mózgiem.

Tę procedurę zademonstruje Louis Y, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od zebrania zarodków myszy i wypreparowania embrionalnych mózgów, w tym tylnych mózgów i czterech mózgów z dwiema półkulami mózgowymi. W wiadrze z lodem utwórz otwór w lodzie na formy do zatapiania.

Następnie wlej 3%aros podłoże do plastikowej formy i umieść tę foremkę w otworze w lodzie. Mieszaj pożywkę aros końcówką termometru cyfrowego, aż temperatura osiągnie 35 stopni Celsjusza. Następnie natychmiast przenieś mózg do pożywki osadzającej, aby usunąć nadmiar HBSS na granicy między mózgiem a aros.

Ostrożnie i delikatnie obracaj kilkakrotnie mózg w roztworze do osadzania. Za pomocą kleszczy na dnie formy w kontakcie z lodem utworzy się poduszka z żelowego aros. Gdy poduszkę można wyczuć czubkiem kleszczy, jednocześnie mieszając mózg, ustaw mózg grzbietową stroną do góry, mózg nie powinien opaść na samo dno formy.

Pozwól aros stwardnieć w lodzie przez co najmniej pięć minut, a następnie odetnij rogi formy żyletką. Ostrożnie wytnij blok aros wokół mózgu i staraj się zminimalizować liczbę cięć, aby uniknąć zakłóceń osadzonego mózgu. Dzięki VT 1000 s Viome generuje plastry o grubości od 200 do 250 mikronów.

Teraz rozcieńczyć cyto 11 do końcowego stężenia od 0,5 do jednego mikromola w pożywce do hodowli plastrów uzupełnionej czynnikami wzrostu i 12-dołkową płytką, inkubować wycinki z jednego mózgu w 2,5 mililitra roztworu barwiącego w każdym dołku przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umyj plastry w 2,5 mililitra pożywki do kultur plastrów bez roztworu barwiącego przez 20 minut. Aby zamontować sekcje mózgu, umieść kroplę roztworu kolagenu na dnie naczynia mikrostudzienkowego o średnicy 35 milimetrów ze szklanym dnem.

Rozprowadź go końcówką pipety, aby dopasować go do wielkości plasterka. Następnie przenieś plasterek do kropli kolagenu. Pozwól plastrom inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut przed przeniesieniem ich do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Po 20 minutach, w sumie 1,2 mililitra pożywki hodowlanej, pokrój ją na mikro dno ze szklanym dnem, dobrze naczyj 600 mikrolitrów pożywki na raz i rozprowadź ją końcówką pipety. Pozwól plastrom odzyskać siły w inkubatorze przez co najmniej godzinę i 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, a następnie przenieś je do komory inkubacyjnej mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem w tych samych warunkach. Jeśli chodzi o obrazowanie na żywo, użyj obiektywu z olejem silikonowym 60 x o odległości roboczej 300 mikronów i aperturze numerycznej 1,3.

W przypadku obrazu obrazowania komórek, komórki w stosie Z o grubości 30 mikronów ze środkiem stosu Z, znajdującym się około 40 mikronów pod powierzchnią wycinka. W razie potrzeby dostosuj moc lasera i czasy naświetlania, aby ograniczyć fotowybielanie i użyj czasu ekspozycji w zakresie od 30 do 200 milisekund w zależności od intensywności sygnału cyto 11. Oto reprezentatywne dane, które można uzyskać z tej analizy, aby zidentyfikować figury mitotyczne na obrazie J. Po otwarciu zestawu danych dla jednej pozycji jako hiperstosu, wybierz jedną płaszczyznę Z, na której tkanka i komórki wyglądają zdrowo

Przewiń w czasie, aby zidentyfikować punkt czasowy, w którym komórka wchodzi w mitozę. Komórka może poruszać się po płaszczyznach Z, ale rozdzielczość czasowa i opisane wcześniej parametry Zacka zostały zoptymalizowane, aby umożliwić ten proces. W arkuszu kalkulacyjnym zapisz cztery współrzędne D komórki w hiperstosie, gdy wchodzi ona w mitozę.

Znajomość tych współrzędnych zapobiegnie wielokrotnemu liczeniu tej samej komórki. Przewiń do przodu w czasie i zarejestruj czas, w którym komórka przechodzi z jednej fazy do drugiej. Udokumentuj czas trwania każdej fazy mitotycznej dla danej komórki, aby przeprowadzić rekonstrukcję 3D komórek i określić ilościowo rotację podczas metafazy.

Po zidentyfikowaniu wielu komórek mitotycznych użyj współrzędnych komórki i przewiń do przodu w czasie, aż do początku. Metaphase obraca cały hiperstos tak, aby granica komory była bardziej wyrównana. Użyj narzędzia kąt, aby określić kąt, który ma zostać zastosowany do tego obrotu.

Zidentyfikuj płaszczyznę Z, w której komórka zainteresowania jest najbardziej widoczna na tej płaszczyźnie. Użyj narzędzia do zaznaczania prostokąta, aby narysować zaznaczenie obejmujące całą komórkę. Następnie zidentyfikuj płaszczyzny Z, które zawierają interesującą komórkę, i użyj polecenia duplikowania obrazu, aby utworzyć stos podrzędny.

W oknie dialogowym pozostaw zduplikowany hyper stos zaznaczony plasterki. Parametr Z odpowiada płaszczyznom Z, w tym całej komórce, a parametr T klatek odpowiada bieżącemu punktowi czasowemu. Następnie wygeneruj rekonstrukcję 3D komórki.

W bieżącym punkcie czasowym. Odstępy między warstwami odpowiadają odstępowi między każdym z obrazów płaszczyzny Z w mikronach. Za pomocą paska przewijania obróć powstałą rekonstrukcję 3D tak, aby krawędź płytki metafazowej była widoczna.

Numer klatki odpowiada kątowi beta. Zapisz ten numer. Następnie zmierz kąt między poziomym a wyrównaniem według.

Rozwarstwianie płytki metafazowej prostopadle. To jest rekord kąta alfa. Te kąty dla wszystkich punktów czasowych metafazy komórki zainteresowania.

Kąt obrotu między punktami czasowymi t i t minus jeden jest równy wartości bezwzględnej różnicy między kątem t a tym kątem w T minus jeden wzdłuż grzbietowej osi brzusznej. Mitozę najłatwiej zobrazować w grzbietowych obszarach wycinków mózgu, ponieważ podstawowy proces G R jest krótszy, a zatem mniej prawdopodobne, że zostanie przecięty przez viome. Wzdłuż osi ROS rozpieszczanie wycinki w obszarach rozpieszczania kory grzbietowej dają najbardziej spójne wyniki.

Są to przykłady dobrego regionu i złego regionu do obrazowania. W dobrym regionie. Jądra mają kształt eliptyczny, a wiele komórek mitotycznych obserwuje się na granicy komory przed obrazowaniem poklatkowym w złym regionie, bardzo niewiele komórek mitotycznych obserwuje się na granicy komory, a jądra są okrągłe.

Oto przykład dobrego wycinka obserwowanego za pomocą mikroskopu o małym powiększeniu przed obrazowaniem na żywo, a oto kilka przykładów komórek znakowanych cyto 11 w różnych fazach mitozy. Pokazano tutaj montaż obszaru na granicy komory, w którym dwa neuronalne komórki progenitorowe przechodzą przez różne fazy mitozy zaznaczone różnymi kolorami Zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak neutralna elektroporacja konstruktów DNA, mogą być wykonane w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, m.in. jaki jest los dzielących się komórek i jak zachowuje się cytoszkielet?

Najlepiej jest również stosować metody wtórne poza CY 11 do śledzenia mitozy, takie jak H two VGFP transgeniczne myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak manipulować wycinkami mózgu, jakie pasujące parametry są najlepsze i jak analizować dane.