Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obrazowanie i analiza mitozy progenitorów neuronalnych w żywych przekrojach mózgu myszy. Cel ten osiąga się poprzez wstępne wycięcie mózgów z embrionów, a w kolejnym kroku przygotowanie przekrojów mózgu przy użyciu wibratomu.

Następnie przeprowadza się obrazowanie na żywo skrawków mózgu. Ostatnim krokiem jest wyodrębnienie informacji z filmów w celu analizy interesujących parametrów mitozy. W rezultacie mikroskopia poklatkowa służy do pokazania, w jaki sposób populacje progenitorowe mózgu dzielą się w czasie rzeczywistym.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza utrwalonych tkanek, jest możliwość uzyskania istotnych informacji na temat dynamiki czasowej podziałów progenitorów neuronalnych w żywych skrawkach mózgu. Może ona również służyć do zrozumienia, w jaki sposób zaburzenia genetyczne wpływają na podziały progenitorów neuronalnych. Choć stosujemy tę metodę do badania rozwoju kory mózgowej, opisana przez nas analiza może zostać wykorzystana w badaniu mitozy komórek macierzystych w innych obszarach mózgu, a nawet poza nim.

Procedurę tę zaprezentuje Louis y, stażysta postdoctoralny z mojego laboratorium. Rozpocznij procedurę od pobrania embrionów myszy i wypreparowania mózgów embrionalnych, w tym mózgu tylnego oraz czteromózgowia z dwiema półkulami mózgowymi. W wiadrze z lodem wykonaj otwór na formy do zatapiania.

Następnie wlej medium aros 3% do plastikowej formy i umieść ją w otworze w lodzie. Mieszaj medium aros końcówką termometru cyfrowego, aż temperatura osiągnie 35 °C. Następnie bezzwłocznie przenieś mózg do medium zatapiającego, aby usunąć nadmiar HBSS z powierzchni styku mózgu i aros.

Ostrożnie i delikatnie obracaj mózg wielokrotnie w roztworze zatapiającym. Za pomocą pęsety uformuj na dnie formy, w kontakcie z lodem, poduszkę z żelобразной agarozy. Gdy podczas mieszania mózgu będzie można wyczuć poduszkę końcówką pęsety, ustaw mózg stroną grzbietową do góry; mózg nie powinien opaść na samo dno formy.

Pozostaw aros w lodzie do stwardnienia przez co najmniej pięć minut, a następnie odetnij narożniki formy za pomocą żyletki. Ostrożnie wytnij blok aros wokół mózgu, starając się zminimalizować liczbę cięć, aby uniknąć naruszenia zatopionego organu. Za pomocą urządzenia VT 1000 s Viome przygotuj skrawki o grubości od 200 do 250 micron.

Następnie rozcieńcz cyto 11 do stężenia końcowego od 0,5 do 1 µM w pożywce do hodowli plastrów uzupełnionej o czynniki wzrostu. W płytce 12-dołkowej inkubuj plastry z jednego mózgu w 2,5 ml roztworu barwiącego w każdym dołku przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C. Następnie przemyj plastry w 2,5 ml pożywki do hodowli plastrów bez roztworu barwiącego przez 20 minut. Aby zamocować przekroje mózgu, nanieś kroplę roztworu kolagenu na dno szklanego naczynia typu microwell o średnicy 35 mm.

Rozprowadzić za pomocą końcówki pipety tak, aby dopasować do rozmiaru plastra. Następnie przenieść plaster do kropli kolagenu. Inkubować plastry w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie przenieść je do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5% carbon dioxide.

Po 20 minutach wlej łącznie 1,2 ml pożywki do hodowli skrawków do szklanej płytki mikrodołkowej, dodając po 600 µl pożywki i rozprowadzając ją końcówką pipety. Pozostaw skrawki do regeneracji w inkubatorze przez co najmniej 1 godzinę i 30 minut w temperaturze 37°C przy 5% CO2 przed ich przeniesieniem do komory inkubacyjnej konfokalnego mikroskopu z dyskiem spinningowym w tych samych warunkach. Do obrazowania żywych komórek użyj obiektywu z olejkiem silikonowym 60x o odległości roboczej 300 µm i aperturze numerycznej 1,3.

W przypadku obrazowania komórek, wykonuje się stos komórkowy (Z stack) o grubości 30 micronów, którego środek znajduje się około 40 micronów poniżej powierzchni skrawka. W razie potrzeby należy dostosować moc lasera oraz czasy ekspozycji, aby ograniczyć fotobielenie, stosując czas ekspozycji w zakresie od 30 do 200 milisekund, zależnie od intensywności sygnału cyto 11. Poniżej przedstawiono reprezentatywne dane, jakie można uzyskać z tej analizy w celu identyfikacji postaci mitotycznych w programie ImageJ. Po otwarciu zestawu danych dla jednej pozycji jako hyperstack, należy wybrać jedną płaszczyznę Z, na której tkanka i komórki wyglądają na zdrowe.

Przewiń zapis wstecz, aby zidentyfikować moment czasu, w którym komórka wchodzi w fazę mitozy. Komórka może przemieszczać się między płaszczyznami Z, jednak rozdzielczość czasowa oraz parametry Zack opisane wcześniej zostały zoptymalizowane, aby umożliwić ten proces. W arkuszu kalkulacyjnym zapisz cztery współrzędne D komórki w hiperstosie w momencie wejścia w fazę mitozy.

Znajomość tych współrzędnych zapobiegnie wielokrotnemu przeliczeniu tej samej komórki. Przewiń zapis w czasie i odnotuj moment, w którym komórka przechodzi z jednej fazy do drugiej. Udokumentuj czas trwania każdej fazy mitozy dla danej komórki, aby przeprowadzić rekonstrukcję 3D komórek oraz kwantyfikację rotacji podczas metafazy.

Po zidentyfikowaniu wielu komórek w mitozie, należy wykorzystać współrzędne jednej z komórek i przewijać obraz do przodu w czasie aż do początku metafazy. Następnie należy obrócić cały hiperstos tak, aby granica komór zewnętrznych była w jednej płaszczyźnie. Do określenia kąta obrotu należy użyć narzędzia do pomiaru kątów.

Zidentyfikuj płaszczyznę Z, w której interesująca komórka jest najlepiej widoczna. Użyj narzędzia prostokątnego zaznaczenia, aby obrysować obszar obejmujący całą komórkę. Następnie wyznacz płaszczyzny Z zawierające interesującą komórkę i użyj polecenia duplikowania obrazu, aby utworzyć podstos (sub stack).

W oknie dialogowym pozostaw zaznaczoną opcję duplicate hyper stack dla warstw. Parametr Z odpowiada płaszczyznom Z, obejmując całą komórkę i klatki, natomiast parametr T odpowiada aktualnemu punktowi czasowemu. Następnie wygeneruj rekonstrukcję 3D komórki.

W aktualnym punkcie czasowym. Odstęp między plastrami odpowiada interwałowi między poszczególnymi obrazami płaszczyzny Z w mikronach. Używając paska przewijania, obróć powstałą rekonstrukcję 3D tak, aby widoczna była krawędź płytki metafazowej.

Numer klatki odpowiada kątowi beta. Zapisz tę liczbę. Następnie zmierz kąt między poziomem a liniami wyrównania.

Przecinanie płytki metafazowej prostopadle. Jest to zapis kąta alfa. Kąty te dla wszystkich punktów czasowych metafazy badanej komórki.

Kąt obrotu pomiędzy punktami czasowymi t a t minus jeden jest równy wartości bezwzględnej różnicy między kątem w czasie t a tym kątem w czasie T minus jeden wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej. Mitozę najłatwiej obrazować w regionach grzbietowych skrawków mózgu, ponieważ wypustka podstawna RGC jest krótsza, a zatem rzadziej ulega przecięciu podczas nacinania. Wzdłuż osi ROS-caudalne skrawki w regionach caudalnych kory grzbietowej dają najbardziej spójne wyniki.

Są to przykłady odpowiedniego i nieodpowiedniego obszaru do obrazowania. W odpowiednim obszarze jądra mają kształt eliptyczny, a przy brzegu komory przed obrazowaniem time-lapse obserwuje się wiele komórek w fazie mitozy; w nieodpowiednim obszarze przy brzegu komory obserwuje się bardzo mało komórek w fazie mitozy, a jądra są okrągłe.

Oto przykład prawidłowego skrawka obserwowanego pod mikroskopem przy małym powiększeniu przed obrazowaniem na żywo, a tutaj kilka przykładów komórek znakowanych cyto 11 w różnych fazach mitozy. Przedstawiony tutaj montaż obszaru na granicy komory ukazuje dwa progenitory neuronalne przechodzące przez różne fazy mitozy, oznaczone różnymi kolorami po zastosowaniu tej procedury. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, w tym dotyczące losów dzielących się komórek oraz zachowania cytoszkieletu, można zastosować inne metody, takie jak electroporacja konstruktów DNA do neuronów.

Zaleca się również stosowanie metod pomocniczych poza CY 11 do śledzenia mitozy, takich jak transgeniczne myszy H two VGFP. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat manipulowania skrawkami mózgu, optymalnych parametrów dopasowania oraz sposobu analizy danych.