Techniki mikroiniekcji u danio pręgowanego

Mikroiniekcja zarodków danio pręgowanego pozwala badaczom na bezpośrednie wprowadzanie roztworów do rozwijającego się organizmu w celu badania funkcji genów i dynamiki rozwoju. Do iniekcji często wykorzystuje się zarodki w stadium od 1 do 4 komórek. Ponieważ na tym wczesnym etapie nie istnieją błony oddzielające komórki od żółtka, roztwory wstrzyknięte do jednej z komórek lub do żółtka rozprzestrzenią się równomiernie w całym organizmie. Dzięki zastosowaniu mikroiniekcji można indukować ekspresję genów odpowiedzialnych za produkcję białek lub je wyciszać, w zależności od rodzaju wstrzykniętego materiału. W niniejszym filmie zaprezentowane zostanie przygotowanie pipety, pobieranie zarodków oraz procedura mikroiniekcji, a także omówione zostaną niektóre sposoby wykorzystania tej techniki w dzisiejszej praktyce laboratoryjnej.

Najpierw omówimy główne komponenty systemu do mikroiniekcji: stereoskop, mikroiniektor, uchwyt do pipet oraz mikromanipulator.

Mikroiniektor dostarcza precyzyjną objętość poprzez impulsy ciśnienia powietrza, które mogą być regulowane przez użytkownika. Uchwyt do pipet stabilizuje pipetę podczas procedury i łączy ją z linią powietrzną iniektora. Zazwyczaj uchwyt do pipet jest umieszczony w mikromanipulatorze. Instrument ten pozwala badaczowi na dokonywanie niewielkich i dokładnych korekt położenia pipety podczas procesu iniekcji. Do iniektora podłączony jest pedał nożny, który umożliwia badaczowi pracę obiema rękami przy jednoczesnym aktywowaniu impulsu ciśnienia w celu podania materiału do iniekcji. Na koniec, stereoskop pozwala badaczowi widzieć embriony i skupić się na położeniu pipety podczas procedury mikroiniekcji.

Przed rozpoczęciem mikroiniekcji należy przygotować szklane igły. Igły do mikroiniekcji muszą mieć jednolity rozmiar, aby zapewnić precyzyjne podawanie materiałów wstrzykiwanych. Wyciągacz pipet pomaga zapewnić każdorazowe przygotowanie cienkich i ostrych pipet. Wyciągacz ogrzewa szklaną rurkę kapilarną, jednocześnie wywierając siłę rozciągającą, co skutkuje powstaniem dwóch igieł pipetowych.

Pod mikroskopem, za pomocą pęsety, odcina się końcówkę w taki sposób, aby umożliwić podawanie stałej objętości cieczy, zachowując jednocześnie ostrość igły niezbędną do przebicia zarodka danio pręgowanego.

Czerwień fenolowa, barwnik stosowany w celu wizualizacji procedury iniekcji, może zostać zmieszana z roztworem do wstrzykiwania, aby monitorować prawidłowe wprowadzenie substancji do zarodka.

Igły można napełnić roztworem do iniekcji od strony końcówki poprzez działanie kapilarne lub napełnić je od tyłu za pomocą strzykawki mikroładownika. Po napełnieniu igły można ją umieścić w uchwycie do pipet w mikromanipulatorze.

Po przygotowaniu igieł do iniekcji dostosowuje się ustawienia ciśnienia i czasu mikroiniektora w celu skalibrowania każdej igły, co zapewni dostarczenie stałej objętości do każdego zarodka. Pod stereomikroskopem niewielką ilość roztworu wstrzykuje się do kropli oleju mineralnego na szkiełku. Następnie mierzy się rozmiar kropelki i oblicza objętość rozprzestrzenianą przez igłę. W dalszej kolejności można ponownie dostosować ciśnienie mikroiniektora i powtarzać ten proces, aż do momentu regularnego uzyskiwania kropelki o pożądanej wielkości.

Po przygotowaniu i skalibrowaniu igieł, pobiera się embriony i przygotowuje je do iniekcji.

Embriony muszą zostać ostrożnie ustawione i unieruchomione podczas iniekcji w komorze do mikroiniekcji. Aby stworzyć komorę do mikroiniekcji, w szalce Petriego umieszcza się formy, a następnie wlewa stopioną agarozę i pozostawia ją do stężenia. Po jej utwardzeniu formę usuwa się, a na wierzch wlewa pożywkę dla embrionów. Embriony można ustawić w rynienkach utworzonych przez formę, używając pipety transferowej. Alternatywą dla rozmieszczenia embrionów w agarozie jest ustawienie ich wzdłuż krawędzi szkiełka przedmiotowego, tak aby znajdowały się w kolumnie przygotowanej do mikroiniekcji.

Po ustawieniu w odpowiedniej pozycji zarodki są gotowe do iniekcji.

Iniekcję zarodków można przeprowadzić albo do żółtka, albo do cytoplazmy komórki. Iniekcja do żółtka jest prostsza i wymaga mniej zaawansowanej techniki, natomiast iniekcja do cytoplazmy jest trudniejsza, ale daje bardziej wiarygodne wyniki. Aby wykonać iniekcję do żółtka, należy za pomocą mikromanipulatora przesunąć igłę tak, aby przebiła ona chorion, a następnie żółtko. Następnie należy krótko nacisnąć pedał nożny, aby zawartość igły została wprowadzona do żółtka. Przepływ cytoplazmy i dyfuzja umożliwiają przedostanie się roztworu iniekcyjnego do komórki.

Iniekcja do cytoplazmy wymaga precyzyjnego ustawienia zarodka, aby można było skutecznie trafić w cytoplazmę.

Po iniekcji zarodki przenosi się do nowej szalki i inkubuje w temperaturze 28.5 °C. Są one regularnie sprawdzane w celu usunięcia martwych zarodków.

Aby ocenić powodzenie iniekcji, można analizować zarodki pod kątem ich ogólnego wyglądu, obecności markera fluorescencyjnego oraz badać zmiany w genomie za pomocą genotypowania.

Skoro już wiesz, jak przeprowadzać iniekcje u embrionów zebrafish, przyjrzyjmy się temu, jak naukowcy mogą wykorzystać tę technikę do poznania funkcji genów.

Po pierwsze, naukowcy mogą wstrzykiwać syntetyczne mRNA, aby nadekspresować określone geny i określić ich funkcję poprzez obserwację fenotypu. Tę samą technikę można wykorzystać do ekspresji białek uwidaczniających zdarzenia molekularne, takie jak reorganizacje cytoszkieletu zachodzące podczas rozwoju.

Po drugie, działanie genów można wyłączyć poprzez iniekcję morfolino. Morfolino są to stabilne syntetyczne analogi kwasów nukleinowych, które można zaprojektować tak, aby wiązały się ze specyficznymi sekwencjami mRNA poprzez standardowe parowanie zasad kwasów nukleinowych, blokując tym samym translację. Prowadzi to z kolei do utraty białka produkowanego przez dane mRNA. Efekt ten pozwala badaczom zrozumieć rolę konkretnego genu w rozwoju, obserwując, jak rozwój ten ulega zmianie w jego nieobecności.

Iniekcja może być również wykorzystywana do wprowadzania obcego DNA do organizmu zebrafish. Poprzez wstrzykiwanie sekwencji zawierających miejsca rozpoznawania dla enzymów modyfikujących DNA, naukowcy mogą efektywnie tworzyć ryby „transgeniczne” o zmodyfikowanych genomach, co oznacza, że obce geny będą przekazywane przyszłym pokoleniom. W zależności od projektu sekwencji, ekspresja genu może być ograniczona do konkretnych tkanek lub określonych etapów czasowych rozwoju.

Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do mikroiniekcji wczesnych embrionów zebrafish. W tym filmie przedstawiono konfigurację zestawu do mikroiniekcji, zademonstrowano sposób przygotowania igieł do mikroiniekcji oraz przygotowania embrionów do zabiegu, omówiono technikę mikroiniekcji oraz niektóre jej zastosowania. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!