Techniki mikroiniekcji danio pręgowanego

Mikroiniekcja zarodków danio pręgowanego pozwala naukowcom dostarczać roztwory bezpośrednio do rozwijającego się zwierzęcia w celu zbadania funkcji genów i dynamiki rozwoju. Zarodki w stadium od 1 do 4 komórek są często wykorzystywane do wstrzykiwań. Ponieważ na tym wczesnym etapie nie ma błon oddzielających komórki od żółtka, roztwory wstrzyknięte do jednej komórki lub żółtka będą równomiernie rozprzestrzeniać się po całym organizmie. Dzięki zastosowaniu mikroiniekcji geny produkujące białka mogą ulegać ekspresji lub wyłączać, w zależności od rodzaju wstrzykiwanego materiału. W tym filmie zademonstrujemy przygotowanie pipet, pobranie zarodków, procedurę mikroiniekcji oraz omówimy niektóre ze sposobów stosowania tej techniki w dzisiejszych laboratoriach.

Najpierw omówmy główne elementy systemu mikroiniekcji: stereoskop, mikrowtryskiwacz, uchwyt na pipety i mikromanipulator.

Mikrowtryskiwacz dostarcza precyzyjną objętość poprzez impulsy ciśnienia powietrza, które mogą być regulowane przez użytkownika. Uchwyt na pipetę zabezpiecza pipetę do użycia podczas zabiegu i łączy ją z przewodem powietrznym wtryskiwacza. Zazwyczaj uchwyt na pipety jest umieszczany w mikromanipulatorze. Przyrząd ten pozwala badaczowi na dokonywanie niewielkich i dokładnych korekt położenia pipety podczas procedury wstrzykiwania. Pedał nożny jest podłączony do wtryskiwacza i pozwala badaczowi utrzymać użycie rąk, jednocześnie aktywując impuls ciśnienia do dostarczania materiału do wstrzykiwań. Wreszcie, stereoskop pozwala badaczowi zobaczyć zarodki i skupić się na lokalizacji pipety podczas procedury mikroiniekcji.

Przed rozpoczęciem mikroiniekcji należy przygotować szklane igły. Igły do mikroiniekcji muszą mieć stały rozmiar, aby umożliwić precyzyjne dostarczanie materiałów iniekcyjnych. Ściągacz do pipet pomaga zapewnić przygotowanie cienkich i ostrych pipet za każdym razem. Ściągacz podgrzewa szklaną rurkę kapilarną, wywierając jednocześnie siłę, która ciągnie rurkę, w wyniku czego powstają dwie igły do pipet.

Pod mikroskopem, za pomocą kleszczy, końcówka jest odcinana w sposób, który pozwala na dostarczenie stałej objętości płynu, przy jednoczesnym zachowaniu ostrości igły do przekłuwania zarodka danio pręgowanego.

Czerwień fenolowa, barwnik używany do wizualizacji procedury wstrzyknięcia, może być mieszany z roztworem do wstrzykiwań w celu śledzenia udanego wstrzyknięcia do zarodka.

Igły mogą być ładowane roztworem do wstrzykiwań od strony końcówki za pomocą działania kapilarnego lub mogą być wypełnione strzykawką z mikroładowarką. Po załadowaniu igły do wstrzykiwań można ją włożyć do uchwytu pipety na mikromanipulatorze.

Po przygotowaniu igieł do wstrzykiwań, ustawienia ciśnienia i czasu mikrowstrzykiwacza są dostosowywane w celu kalibracji każdej igły, co zapewni stałą objętość dostarczaną do każdego zarodka. Pod stereoskopem niewielką ilość roztworu wstrzykuje się do kropli oleju mineralnego na szkiełku. Mierzy się wielkość kropli i można obliczyć objętość, jaką igła rozprasza. Następnie ciśnienie mikrowtryskiwacza można dalej regulować, a proces powtarzać, aż do regularnego uzyskiwania kropli o pożądanej wielkości.

Po przygotowaniu i skalibrowaniu igieł pobiera się zarodki i przygotowuje je do wstrzyknięcia.

Zarodki muszą być ostrożnie umieszczone i utrzymywane nieruchomo podczas wstrzykiwania w komorze do mikroiniekcji. Aby stworzyć komorę do mikroiniekcji, formy umieszcza się na szalce Petriego, a stopioną agarozę wlewa się do naczynia i pozostawia do stwardnienia. Po zestaleniu pleśni usuwa się pleśń, a na wierzch wylewa się pożywkę zarodkową. Zarodki można ułożyć w rowkach, które zostały utworzone przez pleśń za pomocą pipety transferowej. Jedną z alternatyw dla ułożenia zarodków w agarozie jest ułożenie ich wzdłuż krawędzi szkiełka mikroskopowego, tak aby były umieszczone w kolumnie do mikroiniekcji

Po umieszczeniu zarodków na swoim miejscu są one gotowe do wstrzyknięcia.

Zarodki można wstrzykiwać do żółtka lub cytoplazmy komórki. Wstrzyknięcie do żółtka jest prostsze i wymaga mniej wyrafinowanej techniki wstrzykiwania, podczas gdy wstrzyknięcie do cytoplazmy jest trudniejsze, ale daje bardziej solidne wyniki. Aby wstrzyknąć do żółtka, należy za pomocą mikromanipulatora przesunąć igłę tak, aby przebiła kosmówkę, a następnie żółtko. Następnie naciska się pedał nożny, aby zawartość igły została wyrzucona do żółtka. Przepływ i dyfuzja cytoplazmatyczna umożliwia przepływ roztworu do wstrzykiwań do komórki.

Wstrzyknięcie do cytoplazmy wymaga starannego ułożenia zarodka, tak aby cytoplazma mogła być skutecznie namierzona.

Po wstrzyknięciu zarodki przenosi się do nowego naczynia i inkubuje w temperaturze 28,5 °C. Często są sprawdzane w celu usunięcia martwych zarodków.

Aby określić powodzenie wstrzyknięcia, zarodki można analizować na podstawie ich ogólnego wyglądu, obecności markera fluorescencyjnego oraz szukając zmian w ich genomie za pomocą genotypowania.

Teraz, gdy już wiesz, jak wstrzykiwać zarodki danio pręgowanego, przyjrzyjmy się, jak naukowcy mogą wykorzystać tę technikę, aby zrozumieć funkcję genów.

Po pierwsze, naukowcy mogą wstrzyknąć zsyntetyzowane mRNA w celu nadekspresji niektórych genów i określić ich funkcję, obserwując fenotyp. Ta sama technika może być również wykorzystana do ekspresji białek, które podkreślają zdarzenia molekularne, takie jak przegrupowania cytoszkieletu, które zachodzą podczas rozwoju.

Po drugie, geny mogą zostać wyłączone przez wstrzyknięcie morfolinosów. Morfoliny to stabilne syntetyczne analogi kwasów nukleinowych, które można zaprojektować do wiązania się z określonymi sekwencjami mRNA poprzez standardowe parowanie zasad kwasów nukleinowych i translację blokową. To z kolei prowadzi do utraty białka wytwarzanego przez to mRNA. Efekt ten pozwala naukowcom zrozumieć rolę konkretnego genu w rozwoju, obserwując, jak rozwój zmienia się pod jego nieobecność.

Wstrzyknięcie może być użyte do włączenia obcego DNA do danio pręgowanego. Poprzez wstrzykiwanie sekwencji zawierających miejsca rozpoznawania enzymów modyfikujących DNA, naukowcy mogą skutecznie generować "transgeniczne" ryby ze zmodyfikowanymi genomami, co oznacza, że obce geny zostaną przekazane przyszłym pokoleniom. W zależności od projektu sekwencji, ekspresja genów może być ograniczona do określonych tkanek lub określonych punktów czasowych rozwoju.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do mikroiniekcji wczesnych zarodków danio pręgowanego. W tym filmie przedstawiono konfigurację mikroiniekcji, pokazano, jak przygotować igły do mikroiniekcji, pokazano, jak przygotować zarodki do mikroiniekcji, wykonać technikę mikroiniekcji oraz niektóre zastosowania mikroiniekcji. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!