Bioenergetyka i wybuch oksydacyjny: protokoły izolacji i oceny ludzkich leukocytów i płytek krwi

W poniższym protokole zaprezentowany zostanie pomiar profili bioenergetycznych oraz odpowiedzi w postaci wyrzutu oksydacyjnego monocytów, limfocytów, neutrofili i płytek krwi człowieka. Celem tym osiąga się poprzez najpierw pobranie frakcji warstwy leukocytowej (buffy coat) oraz osocza bogatego w płytki krwi ze świeżo pobranej krwi. W drugim kroku heterogenna populacja białych krwinek zostaje rozdzielona na warstwy komórek jediojądrowych i wielojądrowych za pomocą gradientu gęstości.

Następnie czyste populacje monocytów, neutrofili i limfocytów są dalej izolowane za pomocą separacji maksymalnej, a potem wysiewane do analizy strumienia zewnątrzkomórkowego lub analizy XF. W rezultacie technologia XF pozwala na czuły i powtarzalny pomiar funkcji mitochondriów w monocytach, limfocytach i płytkach krwi, a także pomiar szybkości zużycia tlenu podczas wybuchu oksydacyjnego monocytów i neutrofili. Zaletą techniki, którą dzisiaj zaprezentujemy, jest możliwość przygotowania wszystkich głównych komórek obecnych we krwi pacjenta z niewielkiej próbki krwi.

Są to płytki krwi oraz leukocyty w czystej, inaktywowanej formie, w których mierzy się funkcje mitochondriów. Uważamy, że pozwala to odzwierciedlić w czasie rzeczywistym różne choroby i stany organizmu pacjenta. Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące metabolizmu, takie jak wpływ stylu życia, diety i stresu patologicznego na funkcje mitochondriów.

Niniejszy protokół łączy wiele technologii służących do izolacji i oznaczania bioenergetyki komórkowej w różnych populacjach leukocytów oraz w płytkach krwi. Ten etap protokołu jest krytyczny, ponieważ gradient gęstości i separacja magnetyczna wymagają precyzyjnego pipetowania. Ponadto należy ściśle kontrolować położenie poszczególnych populacji komórek podczas frakcjonowania.

Zaprezentujemy izolację komórek krwi obwodowej oraz analizę bioenergetyki komórkowej przy użyciu 24-dołkowego analizatora przepływu zewnątrzkomórkowego XF 24. Metoda ta może być jednak przeprowadzona również na urządzeniu XF 96. Co najmniej dwie godziny przed rozpoczęciem procedury należy nawodnić sondy kartridża z sensorami XF za pomocą roztworu XF calib.

Następnie odwiruj świeżo pobraną krew pełną przez 15 minut przy 500 ×g w temperaturze pokojowej w wirówce z rotorem z koszykami odchylającymi. Za pomocą pipety transferowej usuń górną warstwę zawierającą osocze bogate w płytki krwi, aż nad warstwą przekładką erytrocytarną pozostanie jeden centymetr osocza, a następnie odstaw osocze w temperaturze pokojowej do późniejszej obróbki. Przenieś warstwę przekładkową do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml i rozcieńcz leukocyty do objętości 24 ml.

Następnie, używając podstawowego medium RPMI, dodaj trzy mililitry mało gęstego, nieprzezroczystego roztworu Histopaque 1.077 do każdej z trzech 15-mililitrowych probówek stożkowych. Następnie umieść końcówkę wąskiej pipety o pojemności pięciu mililitrów na dnie każdej probówki. Kolejno i powoli nlej trzy mililitry gęstego, nieprzezroczystego roztworu Histopaque 1.119.

Następnie, używając automatycznej pipety ustawionej na niską moc, ostrożnie dodaj osiem mililitrów rozcieńczonej krwi do każdego gradientu, nie zakłócając struktur warstw. Do gradientu o niskiej gęstości dodano niebieski barwnik w celu wizualizacji wszystkich warstw gradientu. Po rozdzieleniu komórek za pomocą osobnych wirowań, pobierz komórki mononuklearne i polimorfonuklearne za pomocą sterylnych pipet szklanych, nie zakłócając pozostałych pasm komórkowych.

Połącz populacje komórek jednojądrowych i wielojądrowych z każdej probówki do osobnych sterylnych probówek stożkowych o pojemności 50 ml dla każdego typu komórek, a następnie dodaj do obu probówek cztery objętości pożywki RPMI. Po odwirowaniu komórek przenieś osady do probówek o pojemności 1,5 ml, ponownie je odwiruj i resuspenduj w 80 µl świeżej pożywki RPMI uzupełnionej o BSA. Następnie dodaj 20 µl przeciwciał anty-CD14 i anty-CD15 znakowanych kuleczkami magnetycznymi odpowiednio do frakcji komórek jednojądrowych i wielojądrowych.

Inkubować każdą zawiesinę komórkową przez 15 minut w temperaturze 4 °C, a następnie przemyć każdą probówkę 1 mL pożywki R-P-M-I-B-S-A i resuspender osady w 500 µL R-P-M-I-B-S-A. Następnie nanieść zawiesiny komórkowe na poszczególne kolumny LS przemyte pożywką R-P-M-I-B-S-A i przemyć każdą kolumnę trzykrotnie 3 mL pożywki R-P-M-I-B-S-A. Zebrać frakcje przepływowe zawiesiny komórkowej oraz płukania kolumn do sterylnych probówek w celu wyizolowania monocytów i neutrofili, usunąć kolumny z pola magnetycznego po ostatnim płukaniu i eluować dodatnio wyselekcjonowane komórki do sterylnej probówki za pomocą 5 mL R-P-M-I-B-S-A. Aby wyizolować limfocyty, odwirować frakcję przepływową i płukania z kolumny komórkowej, resuspender osad komórkowy w 80 µL R-P-M-I-B-S-A i inkubować komórki z 20 µL przeciwciał CD 61 i CD 2 35 A przez 15 minut w temperaturze 4 °C.

Następnie powtórzyć procedurę maksymalnego rozdzielenia jak wcześniej i zebrać frakcję przepływową zawierającą limfocyty w celu izolacji płytek krwi; odwirować zarezerwowaną osocze bogate w płytki krwi, a następnie usunąć osocze i raz przemyć osad komórkowy pięcioma mililitrami sterylnego PBS uzupełnionego o jeden mikrogram na mililitr prostaglandyny I2; resuspendować osad płytek w jednym mililitrze świeżego buforu PBS z prostaglandyną I2, aby wysiać izolowane monocyty, limfocyty, neutrofile i płytki krwi. Najpierw policzyć komórki i doprowadzić je do odpowiedniej objętości w medium do analiz XF, aby uzyskać gęstość siewu 2,5 × 10⁵ komórek na studzienkę w objętości 200 µL. W 24-dołkowej mikro płytce do hodowli komórkowych XF pokrytej CellT dla płytek krwi, wysiać 2,5 × 10⁷ komórek na studzienkę w objętości 200 µL.

Po odwirowaniu komórek na płytkę, należy uzupełnić końcową objętość w dołkach do 660 µL za pomocą pożywki XF i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 30 minut przed analizą XF; podczas inkubacji należy wprowadzić 75 µL odczynników analitycznych w podanej kolejności do portów wtryskowych kartridża sensora XF. W przypadku pomiaru wyrzutu tlenowego, po antymycynie można wstrzyknąć PMA do kolejnego portu wtryskowego, a następnie umieścić kartridż w analizatorze strumienia zewnątrzkomórkowego XF, aby rozpocząć analizę. Profile bioenergetyczne leukocytów i płytek krwi można wyznaczyć przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse XF, który nieinwazyjnie mierzy zużycie tlenu przez komórki w czasie rzeczywistym.

Każdy typ komórek wysiano na mikropłytkę XF 24 w pięciu powtórzeniach, zgodnie z przedstawioną w tabeli prezentacją. Reprezentatywne wartości spoczynkowe oraz wartości dla wyrzutu oksydacyjnego zmierzone podczas analizy, a także średnie stężenia białka na studzienkę, są przedstawione w podziale na typy komórek. Wartości szybkości zużycia tlenu zostały znormalizowane względem całkowitej zawartości białka w odpowiadających im studzienkach i wyrażone w pmolach na minutę na mikrogram białka. Spoczynkowa szybkość zużycia tlenu została następnie ustalona na podstawie trzech pierwszych pomiarów.

Oligomycyna, inhibitor mitochondrialnej syntazy ATP, jest wstrzykiwana do medium XF w celu oszacowania szybkości zużycia tlenu sprzężonego z syntezą ATP; wartość ta reprezentuje zużycie tlenu powiązane z ATP. Pozostała szybkość zużycia tlenu pomniejszona o niemitochondrialną szybkość zużycia tlenu może być przypisana do przecieku protonów. Dodatek odsprzęgacza FCCP umożliwia oznaczenie maksymalnej szybkości zużycia tlenu, po czym następuje wstrzyknięcie antymycyny A, inhibitora oddychania mitochondrialnego, w celu pomiaru niemitochondrialnych źródeł zużycia tlenu. Wydolność rezerwowa jest miarą ilości dodatkowej pracy, jaką mitochondria mogą wykonać przy zwiększonym zapotrzebowaniu energetycznym, i może być obliczona jako różnica między maksymalną szybkością oddychania a podstawową, w celu określenia zdolności do wyrzutu oksydacyjnego monocytów i neutrofili.

Wstrzykuje się agonistę P-M-A-A-P-K-C, a wzrost szybkości zużycia tlenu wiąże się z produkcją utleniaczy przez oksydazę N-A-D-P-H. Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać przeprowadzona w czasie zaledwie trzech godzin po pobraniu krwi, nie wliczając czasu trwania samego pomiaru, o ile zostanie wykonana prawidłowo. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest zachowanie warunków sterylnych poprzez wykonywanie każdego kroku w komorze bezpieczeństwa biologicznego oraz stosowanie sterylnych buforów i pożywek w temperaturze pokojowej. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne protokoły, takie jak analiza FACS w celu określenia czystości komórek, stanu aktywacji leukocytów, a także w celu określenia bioenergetyki komórkowej w subpopulacjach leukocytów.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć już dość jasne wyobrażenie o tym, jak przygotować płytki krwi, limfocyty, monocyty i neutrofile, umieścić je w analizatorze Seahorse oraz zmierzyć wyrzut tlenowy i funkcję mitochondriów na podstawie uzyskanych danych. Następnie można przeanalizować populacje pacjentów i określić, jak zmienia się ich bioenergetyka w czasie rzeczywistym. Należy pamiętać, że praca z próbkami pobranymi od ludzi może być niezwykle ryzykowna.

W związku z tym podczas tej procedury należy stosować środki ochrony indywidualnej oraz pracować w komorze bezpieczeństwa biologicznego.