Bioenergetyka i wybuch oksydacyjny: protokoły izolacji i oceny ludzkich leukocytów i płytek krwi

W poniższym protokole zostanie zademonstrowany pomiar profili bioenergetycznych i odpowiedzi na wybuch oksydacyjny monocytów ludzkiej krwi, limfocytów, neutrofili i płytek krwi. Osiąga się to poprzez pobranie najpierw kożucha i frakcji osocza bogatopłytkowego ze świeżo pobranej krwi. W drugim etapie heterogeniczna populacja białych krwinek jest dzielona na warstwy komórek jednojądrzastych i wielojądrzastych za pomocą gradientu gęstości.

Następnie czyste populacje neutrofili i limfocytów monocytów są dalej izolowane przez maksymalną separację, a następnie siane w celu uzyskania strumienia zewnątrzkomórkowego lub analizy XF. Ostatecznie, czuły i powtarzalny pomiar funkcji mitochondriów w monocytach, limfocytach i płytkach krwi, a także wybuch oksydacyjny wskaźników zużycia tlenu przez monocyty i neutrofile można zmierzyć za pomocą technologii XF. Zaletą techniki, którą dzisiaj pokażemy, jest to, że z małej próbki krwi można przygotować wszystkie główne komórki, które znajdują się we krwi pacjenta.

Są to płytki krwi i leukocyty w czystej inaktywowanej formie i mierzą ich funkcję mitochondrialną. To, jak sądzimy, może odzwierciedlać różne choroby i stany pacjenta w czasie rzeczywistym. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące metabolizmu, takie jak rola stylu życia, diety i patologicznego stresu na funkcjonowanie mitochondriów.

Protokół ten łączy w sobie wiele technologii izolacji i oznaczania bioenergetyki komórkowej w różnych populacjach leukocytów i płytkach krwi. Ten etap protokołu jest bardzo istotny, ponieważ gradient gęstości i separacja magnetyczna wymagają precyzyjnego pipetowania. Ponadto musisz zdawać sobie sprawę z tego, gdzie znajdują się populacje komórek podczas frakcjonowania.

Zademonstrujemy izolację komórek krwi obwodowej i analizę bioenergetyki komórkowej na 24-dołkowym analizatorze strumienia zewnątrzkomórkowego lub XF 24. Jednak tę metodę można również wykonać na XF 96, co najmniej dwie godziny przed rozpoczęciem zabiegu. Uwodnić sondy z wkładem czujnika XF roztworem XF cran.

Następnie wirować świeżo pobraną krew pełną przez 15 minut w temperaturze 500 razy G i temperaturze pokojowej w wirówce z obracającym się wirnikiem kubełkowym. Za pomocą pipety transferowej usuń górną warstwę zawierającą osocze bogatopłytkowe, aż jeden centymetr osocza pozostanie ponad warstwą płaszcza kożucha erytrocytów i odłóż osocze na bok w temperaturze pokojowej do późniejszego przetworzenia. Następnie przenieś płaszcz Buffy do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i rozcieńcz białe krwinki do 24 mililitrów.

Następnie dodaj trzy mililitry o niskiej gęstości, jego nieprzezroczyste 1,077 do każdej z trzech 15-mililitrowych stożkowych rurek. Następnie umieść końcówkę wąskiej pipety o pojemności pięciu mililitrów na dnie każdej probówki. Z kolei i powoli uwalniaj trzy mililitry o dużej gęstości, jego nieprzezroczyste 1.119.

Teraz użyj automatycznej pipety na ustawieniu niskiej mocy, aby ostrożnie dodać osiem mililitrów rozcieńczonej krwi do każdego gradientu, nie naruszając warstw. Niebieski barwnik został dodany do gradientu o niskiej gęstości w celu wizualizacji wszystkich warstw gradientu. Po oddzielnym oddzieleniu komórek przez odwirowanie, zebrać komórki jednojądrzaste i wielojądrzaste za pomocą sterylnych szklanych pipet, nie naruszając pozostałych pasm komórkowych.

Połącz populacje komórek jednojądrzastych i wielojądrzastych z każdej probówki w pojedyncze sterylne stożkowe probówki o pojemności 50 mililitrów dla każdego typu komórek i dodaj cztery objętości RPMI do obu probówek. Po odwirowaniu ogniwa przenoszą granulki do 1,5-mililitrowej tuby, ponownie osadzają i ponownie zawieszają w 80 mikrolitrach świeżego RPMI uzupełnionego BSA. Następnie dodaj 20 mikrolitrów kulek magnetycznych oznaczonych przeciwciałami anty CD 14 i anty CD 15 odpowiednio do frakcji komórek jednojądrzastych i wielojądrzastych.

Inkubować zawiesinę każdej komórki przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie umyć każdą probówkę jednym mililitrem pożywki R-P-M-I-B-S-A, ponownie zawiesić granulki w 500 mikrolitrach R-P-M-I-B-S-A. Następnie nałóż zawiesiny komórek na poszczególne umyte kolumny LS R-P-M-I-B-S-A i przemyj każdą kolumnę trzykrotnie trzema mililitrami pożywki R-P-M-I-B-S-A Zbierz przepływ zawiesiny komórkowej i przepłuczyny kolumny do sterylnych probówek w celu wyizolowania monocytów i neutrofili, usuń kolumny z pola magnetycznego po końcowym płukaniu i wymyj pozytywnie wybrane komórki do sterylnej probówki z pięcioma mililitrami R-P-M-I-B-S-A. Aby wyizolować limfocyty, należy przepuścić przepływ przez frakcję płuczącą kolumny komórkowej, ponownie zawiesić osad komórkowy w 80 mikrolitrach R-P-M-I-B-S-A i inkubować komórki w 20 mikrolitrach przeciwciał CD 61 i CD 2 35 A przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie powtórzyć maksymalną separację jak poprzednio i zebrać przepływ przez zawierające limfocyty, aby wyizolować płytki krwi, odwirować, zarezerwowane osocze bogatopłytkowe, a następnie usunąć osocze i przemyć osad komórkowy raz pięcioma mililitrami sterylnego PBS uzupełnionego jednym mikrogramem na mililitr prostaglandyny I dwa ponownie zawiesić osad płytek krwi w jednym mililitrze świeżego PBS prostaglandyny I dwa do płytki izolowanych monocytów, limfocyty, neutrofile i płytki krwi. Najpierw policz komórki i doprowadź je do odpowiedniej objętości w pożywce testowej XF, aby umożliwić gęstość wysiewu 2,5 razy 10 do piątych komórek na studzienkę w objętości 200 mikrolitrów. W 24-dołkowej mikropłytce do hodowli komórkowej XF pokrytej komórką T dla płytek krwi, wysiewaj się 2,5 razy 10 do siedmiu komórek na studzienkę w objętości 200 mikrolitrów.

Po odwirowaniu komórek na płytce, doprowadzić końcowe objętości studzienki do 660 mikrolitrów za pomocą pożywki XF i inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut przed testem XF podczas wsadu inkubacyjnego, 75 mikrolitrów odczynników do testu w podanej kolejności do portów iniekcji wkładu czujnika XF. Jeśli mają zostać uzyskane pomiary wybuchu oksydacyjnego, PMA można wstrzyknąć po antymycynie, a następnie po załadowaniu portu iniekcyjnego umieścić wkład na analizatorze strumienia zewnątrzkomórkowego, aby rozpocząć test. Profile bioenergetyczne leukocytów i płytek krwi można określić za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse XF, który nieinwazyjnie mierzy zużycie tlenu w komórkach w czasie rzeczywistym.

Każdy typ ogniwa jest posiany na mikropłytce XF 24 z pięcioma powtórzeniami, jak pokazano w tabeli. Reprezentatywne wartości wybuchu podstawowego i oksydacyjnego mierzone podczas testu oraz średnie stężenia białka na studzienkę są pokazane w zależności od typu komórki Wartości wskaźnika zużycia tlenu są znormalizowane do całkowitej zawartości białka w odpowiednich studzienkach i wyrażone jako p moli na minutę na mikrogram białka. Podstawowy wskaźnik zużycia tlenu jest następnie ustalany na podstawie pierwszych trzech pomiarów.

Oligo mycyna, inhibitor mitochondrialnej syntazy A TP, jest wstrzykiwana do pożywki XF w celu oszacowania szybkości zużycia tlenu sprzężonego z syntezą TP i jest reprezentowana jako TP sprzężona z szybkością zużycia tlenu resztkowego pomniejszoną o niemitochondrialną szybkość zużycia tlenu można przypisać wyciekowi protonów. Dodanie rozprzęgającego FCCP pozwala na określenie maksymalnego wskaźnika zużycia tlenu, a następnie wstrzyknięcie antymycyny a i inhibitora oddychania mitochondrialnego w celu zmierzenia niemitochondrialnych źródeł zużycia tlenu. Pojemność rezerwowa jest miarą ilości dodatkowej pracy, którą mitochondria mogą wykonać przy zwiększonym zapotrzebowaniu na energię i może być obliczona jako różnica między maksymalnym tempem oddychania a podstawowym w celu określenia zdolności oksydacyjnej monocytów i neutrofili.

Agonista P-M-A-A-P-K-C jest wstrzykiwany, a wzrost szybkości zużycia tlenu jest związany z wytwarzaniem utleniacza przez oksydazę N-A-D-P-H Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu zaledwie trzech godzin po pobraniu krwi, nie wliczając w to samego testu, jeśli zostanie on wykonany prawidłowo. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby zachować sterylne warunki, wykonując każdy krok w komorze bezpieczeństwa biologicznego i używając sterylnych i pożywek o temperaturze pokojowej. Zgodnie z tą procedurą możemy wykonać inne protokoły, takie jak analiza faksowa w celu określenia czystości komórek, stanu aktywacji leukocytów, a także w celu określenia bioenergetyki komórkowej w subpopulacjach leukocytów.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć teraz dość jasne pojęcie o tym, jak przygotować płytki krwi, limfocyty, monocyty i neutrofile, a następnie umieścić je w koniu morskim i zmierzyć wybuch oksydacyjny i funkcję mitochondriów na podstawie tych danych. Następnie możesz przeanalizować populacje pacjentów i określić, jak zmienia się ich bioenergetyka w czasie rzeczywistym. Nie zapominaj, że praca z próbkami pobranymi od ludzi może być bardzo niebezpieczna.

Dlatego podczas tej procedury należy nosić środki ochrony osobistej, a także korzystać z komory bezpieczeństwa biologicznego.