Podłużny pomiar sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej w modelach 3D guzów przy użyciu mikroreologii śledzenia cząstek

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar podłużnych zmian właściwości mechanicznych macierzy zewnątrzkomórkowej w trójwymiarowych modelach nowotworowych. Osiąga się to poprzez najpierw pobranie komórek nowotworowych i hodowlę sferoidu nowotworowego odpowiednią metodą, aż do osiągnięcia pożądanego rozmiaru. Drugim krokiem jest osadzenie sferoidu nowotworowego w kolagenie lub innej odpowiedniej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Następnie tworzona jest siatka punktów pomiarowych i w każdym z nich rejestrowane jest nagranie wideo. Ostatnim krokiem jest analiza danych wideo oraz obliczenie i korejestracja rzeczywistych właściwości logicznych w każdym punkcie przestrzennym. Ostatecznie protokół ten wykorzystuje analizę trajektorii sond znacznikowych do podłużnego ilościowego określania zmian przestrzennych w mechanice macierzy zewnątrzkomórkowej w sposób nieniszczący.

Koncepcja ta polega na tym, że dzięki połączeniu pomiarów radiologicznych macierzy zewnątrzkomórkowej opartych na obrazowaniu z in vitro 3D modelami nowotworowymi, które przywracają oddziaływania macierzy zewnątrzkomórkowej, podejście to może dostarczyć ilościowych informacji na temat zależnych od czasu zmian w mechanicznym mikrośrodowisku, które towarzyszą wzrostowi guza, procesom inwazji oraz odpowiedzi na leczenie. Metoda przedstawiona w tym filmie wykorzystuje podejście z nałożeniem aros w celu generowania nieprzylegających 3D OID z ustalonej linii komórkowej raka trzustki pan one. Aby rozpocząć, wymieszaj 10 ml wody klasy do hodowli komórkowych z 0,1 g aros, aby uzyskać 1% roztwór aros.

Podgrzać roztwór aros do temperatury powyżej 70 °C przed aplikacją. Odpipetować 40 µl roztworu do każdego dołka płytki 96-dołkowej i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Zebrać komórki nowotworowe za pomocą trypsyny i przygotować zawiesinę pojedynczych komórek, a następnie rozcieńczyć zawiesinę do stężenia 1000 komórek/ml. Dodać 100 µl tego rozcieńczenia do dołka zawierającego utwardzoną warstwę aros.

Po inkubacji umieść próbkę na wytrząsarce w inkubatorze ustawionym na 37 °C i 5% CO2 na noc. Zdejmij próbkę z wytrząsarki, dodaj 100 µL pożywki do hodowli komórkowej, a następnie inkubuj powstały sferoid, aż osiągnie on pożądany rozmiar. Przykładowo, po dziewięciu dniach jeden sferoid będzie miał średnicę około 450 µm.

W pierwszej kolejności należy przygotować stanowisko pracy w komorze z laminarnym przepływem powietrza, wyposażając je w dwie probówki o pojemności 2 ml. Pierwsza probówka będzie zawierać steroid nowotworowy, a druga będzie służyć jako kontrola wolna od komórek. Przygotuj rozcieńczoną mieszaninę fluorescencyjnych sond znacznikowych o średnicy 1 µm modyfikowanych grupami karboksylowymi, dodając dwie części roztworu zapasowego sond do 25 części wody sterylnej.

Wyjąć z lodówki butelkę kolagenu bydlęcego o stężeniu 3,1 mg/mL i umieścić ją w lodzie. Do pierwszej probówki odpipekować 125 µL kolagenu, a następnie 50 µL rozcieńczonego roztworu sondy znacznikowej; krótko wymieszać w wirówce typu vortex w celu równomiernego rozprowadzenia sond. Następnie dodać 235 µL odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowej zawierającej czerwień fenolową, aby uzyskać objętość całkowitą 410 µL, i krótko wymieszać w wirówce typu vortex przed pobraniem 205 µL i przeniesieniem ich do drugiej probówki. Następnie do probówki dodać około 2 µL 1 M wodorotlenku sodu.

Aby przywrócić roztworowi neutralne pH, należy go krótko wymieszać w wortexie. Następnie należy natychmiast przenieść go na statyw z lodem, aby zapobiec rozpoczęciu procesu sieciowania. Ostrożnie pobrać 40 µL medium z dołka zawierającego steroid nowotworowy.

Zachowaj te 40 µL podczas wykonywania następnego kroku. Sprawdź studzienkę, aby upewnić się, czy steryd został usunięty w poprzednim kroku. Jeśli nie, przenieś 40 µL z powrotem do studzienki i powtórz poprzedni krok.

Jeśli tak, dodaj 40 µL zawierających steroid do fiolki. Delikatnie wymieszaj zawartość fiolki pierwszej, a następnie przenieś mieszaninę w porcjach po 60 µL do trzech oddzielnych dołków płytki 96-dołkowej. Po dodaniu mieszaniny obejrzyj każdy dołek pod mikroskopem, aby ustalić, który z nich zawiera steroid. Następnie dodaj około 2 µL 1 M wodorotlenku sodu oraz 40 µL pożywki do hodowli komórkowych do fiolki drugiej i wymieszaj w wortexie przed alikwotowaniem.

Przenieś 60 µL tej mieszaniny do pustej studzienki na płytce 96-dołkowej i oznacz ją jako kontrolę bezkomórkową. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na co najmniej jedną godzinę, aby utworzyła się siatka punktów próbnych. Następnie przenieś płytkę z próbkami z inkubatora na stolik mikroskopu.

Jeśli dostępny nie jest stolik grzejny, odczekać 10 minut, aż próbka wyrówna temperaturę do temperatury pokojowej. Próbkę należy obejrzeć przy użyciu obiektywów o małym powiększeniu, aby upewnić się, że jest ona nienaruszona i gotowa do obrazowania. Należy określić położenie guza w studzience i udokumentować je za pomocą obrazu w świetle przechodzącym w celu późniejszej korejestracji przestrzennej.

Zazwyczaj 20 punktów próbkowania w każdej studzience, rozmieszczonych w koncentrycznych pierścieniach wokół sferoidu S, pozwoli na uzyskanie odpowiednio szczegółowych wyników. Przesuń stolik w każdą z pożądanych pozycji i użyj oprogramowania interfejsu mikroskopu, aby zapisać współrzędne XNY. Przełącz mikroskop na obiektyw o dużym powiększeniu i wybierz odpowiedni kostkę filtrów dla długości fali ekscytacji sond znacznika.

Korzystając z listy utworzonych punktów, przejdź do pierwszego punktu w siatce. Przed przesunięciem w górę dostosuj ostrość, aby zlokalizować dno dołka. Znajdź pole widzenia zawierające kilka ostrych sond znacznikowych.

Obserwuj histogram intensywności i dostosuj natężenie oraz czas ekspozycji, aby uzyskać jak największy zakres dynamiczny, zapewniając jednocześnie, że obraz nie zostanie przesycony. Pozyskaj sekwencję wideo przy częstotliwości klatek od 20 do 30 milisekund na klatkę i zapisz ją, stosując odpowiedną konwencję nazewnictwa. Podczas nagrywania nie dotykaj mikroskopu ani stołu.

Powtórz pomiar dla każdego punktu próbkowania w siatce. Następnie powtórz cały proces w celu utworzenia siatki dla każdej studni w eksperymencie oraz powtórz całą procedurę dla każdego punktu czasowego w trakcie monitorowania podłużnego.

Aby rozpocząć analizę danych, skopiuj wszystkie dane wideo do folderu analizy. Zaimportuj dane obrazowe do programu MATLAB lub innego oprogramowania analitycznego.

Skalibruj oprogramowanie poprzez analizę kilku klatek filmu, aby odpowiednio określić parametry selekcji i odrzucania służące do identyfikacji pozycji środków sond. Następnie wykorzystaj oprogramowanie do automatycznego wyznaczenia pozycji każdej sondy dla wszystkich klatek filmu, a następnie połącz te pozycje w trajektorie. Wykorzystaj dane z trajektorii do obliczenia średniego przesunięcia kwadratowego (MSD) jako funkcji czasu opóźnienia, pamiętając o zastosowaniu odpowiedniego współczynnika kalibracji przestrzennej dla konkretnego obiektywu lub zastosowanego binningu pikseli.

Oblicz G* korzystając z uogólnionej relacji Stokesa-Einsteina, biorąc pod uwagę granice stosowalności tej relacji dla danej próbki. Powtórz kroki analizy dla każdego pola widzenia w eksperymencie. Przeprowadź korejestrację danych pozycyjnych z modułem wiskoelastycznym I przy danej częstotliwości, w zależności od producenta użytego mikroskopu.

Ten etap może zostać ułatwiony dzięki niestandardowej procedurze odczytującej metadane mikroskopu lub dane o położeniu można zestawić ręcznie. Sekwencje wideo są pozyskiwane z wielu pozycji przestrzennych w obrębie reprezentatywnej studzienki zawierającej 3D guza nowotworowego i łączone w celu stworzenia przestrzennej mapy mikroradiologicznej próbki podczas monitorowania podłużnego populacji komórek na obwodzie naczynia. Jedna z linii komórkowych użytych w tym przykładzie będzie spontanicznie degradować otaczające włókna kolagenowe i naciekać do macierzy zewnątrzkomórkowej w ciągu kilku dni.

W tym przykładzie korejestracja obrazowania mikroskopowego zapewnia ilościowy odczyt wyraźnej inwazji w macierz, która zachodzi po lewej, ale nie po prawej stronie steroidu. Monitorowanie podłużne tych odrębnych obszarów przestrzennych wykazuje spadek części rzeczywistej zespolonego modułu ścinania lepko-sprężystego o około cztery rzędy wielkości towarzyszący inwazji. Pełne dane zależne od częstotliwości przedstawiają kontrast właściwości reologicznych materiału w regionie pierwszym i regionie drugim w czwartym dniu.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu ostrożności, aby uniknąć powszechnych błędów w analizie trajektorii sond, które mogą prowadzić do niewłaściwych wniosków. Zachęcamy czytelników do zapoznania się z przywołaną tutaj literaturą dotyczącą PTM, w której omówiono kwestie takie jak dryf próbki oraz interpretacja heterogeniczności. Procedurę tę można połączyć z dodatkowym podłużnym lub końcowym obrazowaniem fluorescencyjnym w celu udzielenia odpowiedzi na inne pytania, na przykład dotyczące tego, jak przebudowa mechaniczna koreluje z kluczowymi zdarzeniami sygnalizacyjnymi lub odpowiedzią cytotoksyczną na interwencję.