Name: Podłużny pomiar sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej w modelach 3D guzów przy użyciu mikroreologii śledzenia cząstek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Poznaj metodę mikroreologii śledzenia cząstek do pomiaru zmian sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej w trójwymiarowych modelach guzów. Technika ta umożliwia nieinwazyjną analizę mechaniki nowotworowej w czasie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z wdzięcznością dziękujemy za udostępnienie kodu śledzenia cząstek MATLAB na otwartym kodzie źródłowym dostarczonego przez Marię Kilfoil (<a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/</a>), wraz z wcześniejszym kodem IDL i obszerną dokumentacją dostarczoną przez Johna C. Crockera i Erica R. Weeksa. Prace te były możliwe dzięki finansowaniu z National Cancer Institute (NCI/NIH), K99CA155045 and R00CA155045 (PI: JPC).

1. Hodowla sferoid nowotworowych
<ol>
	<li>Wymieszaj 10 ml wody klasy do hodowli komórkowych z 0,1 g agarozy, aby uzyskać 1% roztwór agarozy.</li>
	<li>Podgrzać roztwór agarozy do temperatury powyżej 70 °C (około 14 sekund w standardowej kuchence mikrofalowej lub przy użyciu płyty grzewczej) przed podaniem 40 μl roztworu agarozy do studzienki na 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę podczas pobierania komórek przy użyciu standardowych technik.</li>
	<li>Użyj hemytometru, aby określić stężenie komórek w zawiesinie.</li>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę komórkową do 1000 komórek/ml i dodać 100 μl tego rozcieńczenia do studzienki zawierającej utwardzone złoże agarozy.</li>
	<li>Umieścić próbkę na wytrząsarce na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Usunąć próbkę z wytrząsarki i dodać 100 μl pożywki do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Inkubuj sferoidy, aż do osiągnięcia pożądanej średnicy. Na przykład po 9 dniach sferoida będzie miała średnicę około 450 μm. W tym czasie do studzienek można dodać świeże pożywki wzrostowe, ale należy unikać aspiracji, ponieważ spowoduje to usunięcie sferoidy.</li>
</ol>
2. Przygotowanie sferoid 3D Guz osadzonych w ECM
<ol>
	<li>Przygotuj stanowisko pracy z potrzebnymi materiałami w okapie z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczoną mieszaninę fluorescencyjnych sond znacznikowych modyfikowanych karboksylanem o średnicy 1 μm, dodając 2 części sond podstawowych (2% ciał stałych) do 25 części sterylnej wody.</li>
	<li>Wyjmij butelkę z 3,1 mg/ml kolagenu bydlęcego z lodówki i umieść ją na lodzie.</li>
	<li>Porcję 125 μl kolagenu do pustej fiolki o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Dodać 50 μl rozcieńczonego roztworu sondy znacznikowej do fiolki zawierającej kolagen i krótko odwirować, aby rozprowadzić sondy.</li>
	<li>Dodać 235 μl odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych zawierającej czerwień fenolową (która zmieni kolor na żółty) o łączną objętość 410 ml i krótko przemieszać przed wyjęciem 205 ml (połowa całkowitej objętości) i umieszczeniem jej w nowej fiolce o pojemności 2 ml. Fiolka 1 będzie zawierała sferoid guza, a fiolka 2 będzie mieszaniną kontrolną.</li>
	<li>Dodać ~ 2 μl 1 M NaOH do fiolki 1, aby przywrócić roztwór do neutralnego pH (pożywka hodowlana zawierająca czerwień fenolową powinna powrócić do czerwieni). Należy pamiętać, że spowoduje to, że mieszanina zacznie się utwardzać, jeśli nie będzie trzymana na lodzie. Krótko zmieszać, a następnie natychmiast wrócić do stojaka na lód. 
	UWAGA: Sferoida jest ledwo widoczna gołym okiem po 9 dniach hodowli, a jej usunięcie ze złoża agarozy jest delikatnym zadaniem. Korzystanie z mikroskopu preparacyjnego może być pomocne dla niektórych użytkowników. Utrzymanie integralności sferoidy podczas przenoszenia ma kluczowe znaczenie.</li>
	<li>Za pomocą końcówki pipety z szeroką szyjką delikatnie usuń 40 μl pożywki ze studzienki zawierającej sferoidę guza. Zachowaj te 40 μl podczas wykonywania następnego kroku.</li>
	<li>Sprawdź studnię, aby zobaczyć, czy sferoida została usunięta w poprzednim kroku. Jeśli tak, dodaj 40 μl zawierające sferoidę do fiolki 1. Jeśli nie, umieść 40 μl z powrotem w studzience i powtórz poprzedni krok.</li>
	<li>Delikatnie wymieszać fiolkę 1 (nie ryzykować wirowania, może to spowodować uszkodzenie sferoidy) przed przeniesieniem mieszaniny w porcjach 60 μl do trzech oddzielnych dołków na 96-dołkowej płytce. Po dodaniu mieszaniny sprawdź każdą studzienkę pod mikroskopem, aby określić, która studzienka zawiera sferoidę.</li>
	<li>Dodać ~2 μl 1 M NaOH i 40 μl pożywki do hodowli komórkowych do fiolki 2 i odwirować przed porcjowaniem 60 μl tej mieszaniny do pustego dołka na płytce 96-dołkowej i etykietowaniem jako kontrolą.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C do utwardzania przez co najmniej 1 godzinę.</li>
</ol>
3. Skonstruuj siatkę punktów próbkowania i nagraj film w każdym punkcie
<ol>
	<li>Przenieść płytkę z próbką z inkubatora na stolik mikroskopowy. Odczekać 10 minut, aby próbka zrównoważyła się z temperaturą pokojową, jeżeli podgrzewany stage nie jest dostępny.</li>
	<li>Obserwuj próbkę za pomocą soczewek obiektywowych o małej mocy, aby upewnić się, że jest nienaruszona i gotowa do obrazowania. Określ położenie guza w studni.</li>
	<li>Zdecyduj, ile punktów próbkowania chcesz pobrać. Zazwyczaj 20 punktów próbkowania w każdym dołku, rozmieszczonych w koncentrycznych pierścieniach wokół sferoidy, daje odpowiednio szczegółowe wyniki.</li>
	<li>Przesuń stolik do każdej żądanej pozycji i użyj oprogramowania do łączenia mikroskopów, aby zarejestrować współrzędne x i y (lub zarejestrować współrzędne ręcznie, jeśli oprogramowanie do łączenia jest niedostępne).</li>
	<li>Przełącz mikroskop na soczewkę obiektywu o dużej mocy (zwykle 100X) i wybierz odpowiednią kostkę filtrującą dla długości fali wzbudzenia sond znacznikowych. Użyj listy punktów utworzonych w kroku 3.4, aby przejść do pierwszego punktu w siatce.</li>
	<li>Dostosuj ostrość, aby znaleźć dno studzienki, a następnie przesuń w górę, aby znaleźć pole widzenia (fov) zawierające kilka ostrych sond śledzących.</li>
	<li>Obserwuj histogram intensywności i dostosuj intensywność i czas ekspozycji, aby uzyskać jak największy zakres dynamiki, jednocześnie upewniając się, że obraz nie zostanie nasycony.</li>
	<li>Uzyskaj sekwencję wideo z szybkością 20-30 ms na klatkę (zaleca się około 800 klatek lub 16-24 sekundy, aby zapewnić wystarczające statystyki do solidnych obliczeń MSD, zrównoważone potrzebą zminimalizowania czasu akwizycji w każdym punkcie siatki przestrzennej) i zapisz z odpowiednią konwencją. Podczas nagrywania nie dotykaj mikroskopu ani stołu.</li>
	<li>Powtórz kroki od 3.6 do 3.9 dla każdego punktu próbkowania w siatce.</li>
	<li>Powtórz kroki od 3.3 do 3.10 dla każdego dołka w eksperymencie.</li>
</ol>
4. Analizuj dane wideo, aby obliczyć właściwości reologiczne w każdym punkcie próbkowania
<ol>
	<li>Skopiuj wszystkie dane wideo do folderu analizy (prawdopodobnie na innym komputerze).</li>
	<li>Importuj dane obrazu do MATLAB lub innego oprogramowania analitycznego. 
	UWAGA: Obszerna dokumentacja dotycząca zestawu przyjętych tutaj procedur śledzenia cząstek MATLAB jest dostępna pod adresem <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil</a>. Zaleca się użycie niestandardowej funkcji wywoływania w celu zautomatyzowania przetwarzania wielu plików w różnych pozycjach.</li>
	<li>Skalibruj oprogramowanie, analizując kilka klatek wideo, aby odpowiednio określić parametry wyboru i odrzucenia (rozmiar, pasmo przepustowe itp.) w celu identyfikacji pozycji środkowej sondy. Obszerne tło tych kluczowych kroków zostało opisane przez Crockera i Griera.</li>
	<li>Użyj oprogramowania, aby automatycznie określić pozycję każdej sondy dla wszystkich klatek wideo, a następnie połączyć te pozycje w trajektorie.</li>
	<li>Użyj danych trajektorii, aby obliczyć średnie kwadratowe przemieszczenie (MSD) w funkcji czasu opóźnienia, upewniając się, że zastosowano odpowiedni współczynnik kalibracji przestrzennej (μm na piksel) dla konkretnej soczewki obiektywu, dowolnego łączenia pikseli itp. (zwykle przenoszonych w metadanych).</li>
	<li>Oblicz G*(używając uogólnionej relacji Stokesa-Einsteina z uwzględnieniem granic stosowalności GSER dla określonej próbki24,28,43. Alternatywnie, użytkownicy mogą chcieć interpretować właściwości ECM bezpośrednio z MSD, po prostu porównując skalowanie prawa potęgowego, wartości plateau, wskaźniki niejednorodności lub inne parametry.</li>
	<li>Powtórz kroki od 4.2 do 4.6 dla każdego pola widzenia w eksperymencie.</li>
	<li>Współrejestruj dane o położeniu z kroku 3.4 z modułami lepkosprężystości przy określonej częstotliwości będącej przedmiotem zainteresowania. W zależności od producenta używanego mikroskopu, etap ten może być ułatwiony przez niestandardową procedurę, która odczytuje metadane mikroskopu lub dane dotyczące położenia mogą być ręcznie zestawione w tabeli.</li>
	<li>Użyj funkcji interpolacji 3D, aby wygenerować przestrzenną mapę reologiczną ECM.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym protokole wprowadzamy solidną i szeroko stosowaną strategię śledzenia wzdłużnego lokalnych zmian sztywności ECM w modelach 3D nowotworów. Przewidujemy, że ta metodologia może zostać przyjęta przez biologów nowotworów i biofizyków zainteresowanych mechanowrażliwym zachowaniem związanym z przebudową macierzy podczas procesów wzrostu i inwazji guza. Precyzyjna kwantyfikacja kinetyki degradacji matrycy może być szczególnie cenna dla osób badających aktywność metaloproteaz macierzy, oksydazy lizylowej lub innych istotny...

Z rosnącej ilości dowodów w literaturze jasno wynika, że komórki nowotworowe, podobnie jak w przypadku niezłośliwych komórek nabłonkowych ssaków, są bardzo wrażliwe na mechaniczne i biofizyczne właściwości otaczającej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i innych składników mikrośrodowiska1-9. Eleganckie badania mechanistyczne dostarczyły informacji na temat roli sztywności zewnątrzkomórkowej jako złożonego mechanowrażliwego partnera sygnalizacyjnego, który reguluje złośliwe zachowanie wzrostu i morfogenezę2,3,10,11. Prace te zostały ułatwione w szczególności dzięki opracowaniu trójwymiarowych modeli nowotworów in vitro, które przywracają biologicznie istotną architekturę tkanek i mogą być hodowane w materiałach rusztowań o regulowanej mechanice i obrazowane za pomocą mikroskopii optycznej12-19. Jednak druga strona tego mechanoregulacyjnego dialogu między guzem a mikrośrodowiskiem, za pomocą którego komórki rakowe z kolei modyfikują reologię swojego otoczenia, pozostaje nieco trudniejsza do zbadania. Na przykład podczas procesów inwazji komórki na obrzeżach guza mogą przechodzić przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) i zwiększać ekspresję metaloproteaz macierzy (MMP), które powodują lokalną degradację ECM20-22, co z kolei wpływa na mechanowrażliwe zachowanie wzrostu innych proksymalnych komórek nowotworowych. Poprzez różnorodne procesy biochemiczne komórki rakowe nieustannie dostosowują lokalną sztywność swojego środowiska w górę i w dół, aby dopasować się do różnych procesów w różnym czasie. Opisana tutaj metodologia jest motywowana potrzebą narzędzi analitycznych, które raportują lokalne zmiany sztywności i podatności ECM podczas wzrostu, które można zintegrować z modelami 3D guzów i skorelować podłużnie ze zmianami biochemicznymi i fenotypowymi bez przerywania hodowli.
W poszukiwaniu odpowiedniej techniki do wdrożenia w tym kontekście, mikroreologia śledzenia cząstek (PTM) wyłania się jako mocny kandydat. Metoda ta, zapoczątkowana pierwotnie przez Masona i Weitza23,24, wykorzystuje ruch sond znacznikowych osadzonych w złożonym płynie do raportowania zależnego od częstotliwości zespolonego lepkosprężystego modułu ścinania, G * (ω) w skalach długości mikronów. To ogólne podejście zostało opracowane z wieloma wariantami dostosowanymi do różnych zastosowań w miękkiej materii skondensowanej, koloidach, biofizyce i fizyce polimerów25-31. PTM ma pewne zalety w porównaniu z innymi metodami, ponieważ odczyty lokalnej lepkosprężystości są dostarczane przez nieniszczące obrazowanie wideo biochemicznie nieaktywnych sond znacznikowych, które są włączane w czasie przygotowywania hodowli i pozostają na miejscu przez dłuższe okresy wzrostu. Jest to przeciwieństwo złotego standardu pomiarów za pomocą reometru oscylacyjnego z naciskiem na ścinanie masowe, który z konieczności wymaga zakończenia hodowli i podaje masową makroskopową reologię próbki, a nie pomiary punktowe w złożonym mikrośrodowisku 3D guza. Rzeczywiście, wiele badań zilustrowało użyteczność interpretacji pomiarów ruchów sondy znacznikowej w lub wokół komórek rakowych lub nienowotworowych w celu pomiaru deformacji związanych z migracją komórek32, naprężeń mechanicznych wywołanych przez rozszerzającą się sferoidę33, reologii wewnątrzkomórkowej34,35 oraz do mapowania naprężeń mechanicznych i odkształceń w tkankach inżynieryjnych36 oraz związku między wielkością porów a prędkością inwazji37. Można zastosować inne techniki odpowiednie dla mikroreologii, takie jak mikroskopia sił atomowych (AFM), ale przede wszystkim do sondowania punktów na powierzchni próbki, a także mogą stwarzać problemy ze sterylnością hodowli, które komplikują pomiary podłużne38.
Tutaj opisujemy kompleksowy protokół obejmujący metody wzrostu sferoid nowotworowych 3D nadających się do transferu do ECM z wbudowanymi sondami fluorescencyjnymi do śledzenia cząstek wideo i metodami analizy dla niezawodnego mapowania zmian przestrzennych w mikroreologii w czasie w hodowli. W obecnym wdrożeniu modele 3D nowotworów są hodowane w formacie wielodołkowym w celu włączenia pomiarów mikroreologicznych do innych tradycyjnych testów (np. cytotoksyczności), którym ten format sprzyja. W tej reprezentatywnej ilustracji tej metodologii hodujemy in vitro sferoidy 3D przy użyciu komórek PANC-1, ustalonej linii komórkowej raka trzustki, o której wiadomo, że tworzy sferoidy39, ale wszystkie pomiary opisane w niniejszym dokumencie mają szerokie zastosowanie do badania guzów litych przy użyciu różnych linii komórkowych odpowiednich do hodowli 3D. Ponieważ metoda ta jest z natury oparta na obrazowaniu, idealnie nadaje się do jednoczesnej rejestracji danych mikroreologicznych o wysokiej rozdzielczości z dużymi polami widzenia światła przechodzącego, które zgłaszają zmiany we wzroście, migracji i fenotypie komórek. Implementacja PTM zintegrowanego w ten sposób z mikroskopią światła przechodzącego zakłada powtarzalne pozycjonowanie stolika mikroskopu, które jest zwykle dostępne w zmotoryzowanych, komercyjnych mikroskopach biologicznych epifluorescencji szerokokątnej. Opracowany poniżej protokół może być zaimplementowany za pomocą dowolnego rozsądnie wyposażonego automatycznego fluorescencyjnego mikroskopu biologicznego. Jest to metoda z natury wymagająca dużej ilości danych, która wymaga pozyskania gigabajtów danych z cyfrowej mikroskopii wideo do przetwarzania w trybie offline.
W poniższym protokole, Protokół 1 odnosi się do początkowego przygotowania sferoid guza, które jest tutaj opisane przy użyciu nakładki na agarozę, ale może być zastąpione różnymi innymi metodami, takimi jak techniki wiszącej kropli40 lub hodowli rotacyjnej41. Protokół 2 opisuje proces osadzania sferoid w rusztowaniu kolagenowym, chociaż alternatywnie, guzy 3D in vitro mogą być hodowane przez enkapsulację lub osadzanie ponownie zawieszonych komórek w ECM12,15, a nie pojedyncze, wstępnie uformowane, nieprzylegające sferoidy. Kolejne protokoły opisują procedury uzyskiwania pomiarów mikroreologicznych z rozdzielczością czasową poprzez odpowiednio pozyskiwanie i przetwarzanie danych z mikroskopii wideo. Przetwarzanie danych jest opisane za pomocą MATLAB, wykorzystując procedury open source dla PTM zbudowane na algorytmach pierwotnie opisanych przez Crockera i Griera42, które zostały również szeroko opracowane dla różnych platform oprogramowania (patrz http://www.physics.emory.edu/~weeks/idl/).

<table><tbody><tr><td>Kolagen bydlęcy typu 1</td><td>BD Biosciences, San Jose, Kalifornia</td><td>354231</td><td></td></tr><tr><td>PANC-1</td><td>Hodowla komórek typu amerykańskiego, Manassas, VA</td><td>CRL1469</td><td>lub inny odpowiedni typ komórki</td></tr><tr><td>Mikrosfery fluorescencyjne</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td><td>906906</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences, Bedford, MA</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Fisher Bioodczynniki, Waltham, MA</td><td>C12H18O9</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td><td>NC0480985</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki obrazowe</td><td>Corning Inc., Corning, NY</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone, Waltham, MA</td><td>SH30243.01</td><td>lub odpowiednie podłoża do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Mikroskop Zeiss AxioObsever</td><td>Zeiss, Oberkochen, Niemcy</td><td></td><td>zawiera szybką kamerę i oprogramowanie do obrazowania</td></tr><tr><td>Oprogramowanie MATLAB</td><td>The Mathworks, Natick, MA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

podłużny pomiar sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej w modelach 3d guzów przy użyciu mikroreologii śledzenia cząstek

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Wykazano, że mikrośrodowisko mechaniczne działa jako kluczowy regulator zachowania i sygnalizacji wzrostu guza, który sam w sobie jest przebudowywany i modyfikowany jako część zestawu złożonych, dwukierunkowych interakcji mechanowrażliwych. Podczas gdy opracowanie biologicznie istotnych modeli 3D guzów ułatwiło mechanistyczne badania nad wpływem reologii macierzy na wzrost guza, odwrotny problem mapowania zmian w środowisku mechanicznym wywołanych przez nowotwory pozostaje wyzwaniem. W tym miejscu opisujemy implementację mikroreologii śledzenia cząstek (PTM) w połączeniu z modelami 3D raka trzustki jako część solidnego i wykonalnego podejścia do podłużnego monitorowania zmian fizycznych w mikrośrodowisku guza, in situ. Opisana tutaj metodologia integruje system przygotowania modeli 3D in vitro osadzonych w modelowym rusztowaniu macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) kolagenu typu I z fluorescencyjnie znakowanymi sondami równomiernie rozmieszczonymi do pomiarów mikroreologicznych zależnych od położenia i czasu w całej próbce. Guzy in vitro są platerowane i badane w warunkach równoległych przy użyciu wielodołkowych płytek obrazowych. Opierając się na ustalonych metodach, filmy z ruchami sondy śledzącej są przekształcane za pomocą uogólnionej relacji Stokesa Einsteina (GSER) w celu zgłoszenia złożonego, zależnego od częstotliwości modułu ścinania lepkosprężystego, G*(ω). Ponieważ podejście to opiera się na obrazowaniu, charakterystyka mechaniczna jest również mapowana na duże pola przestrzenne światła przechodzącego, aby jednocześnie zgłaszać zmiany jakościowe w wielkości i fenotypie guza 3D. Przedstawiono reprezentatywne wyniki pokazujące kontrastującą odpowiedź mechaniczną w podregionach związanych z zlokalizowaną degradacją matrycy wywołaną inwazją, a także kalibracją systemu, dane walidacyjne. Przedstawiono również niepożądane wyniki typowych błędów eksperymentalnych i rozwiązywanie tych problemów. Format posiewu 3D z 96 dołkami zaimplementowany w tym protokole sprzyja korelacji pomiarów mikroreologicznych z terapeutycznymi testami przesiewowymi lub obrazowaniem molekularnym w celu uzyskania nowych informacji na temat wpływu leczenia lub bodźców biochemicznych na mikrośrodowisko mechaniczne.

Aby zweryfikować poprawność pomiarów G*(ω) w lokalnych pozycjach w obrębie złożonego modelu mikrośrodowiska guza, przeprowadzono dwa wstępne eksperymenty walidacyjne. Po pierwsze, dążono do walidacji pomiarów w odniesieniu do „złotego standardu”, jakim jest objętościowa reometria ścinania oscylacyjnego. Przygotowano identyczne próbki matrycy kolagenowej (bez komórek) o stężeniu 1,0 mg/ml kolagenu. Próbki te badano za pomocą reometru objętościowego (TA Instruments AR-G2, stosując geometrię równoległych płyt o śre...

Mikroreologia śledząca cząstki może być wykorzystana do nieniszczącego ilościowego i przestrzennego mapowania zmian właściwości mechanicznych macierzy zewnątrzkomórkowej w modelach 3D nowotworów.

Podłużny pomiar sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej w modelach 3D guzów przy użyciu mikroreologii śledzenia cząstek

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar podłużnych zmian właściwości mechanicznych macierzy zewnątrzkomórkowej w trójwymiarowych modelach nowotworowych. Osiąga się to poprzez najpierw pobranie komórek nowotworowych i hodowlę sferoidu nowotworowego odpowiednią metodą, aż do osiągnięcia pożądanego rozmiaru. Drugim krokiem jest osadzenie sferoidu nowotworowego w kolagenie lub innej odpowiedniej macierzy zewnątrzkomórkowej.Następnie tworzona jest siatka punktów pomiarowych i w każdym z nich rejestrowane jest nagranie wideo. Ostatnim krokiem jest analiza danych wideo oraz obliczenie i korejestracja rzeczywistych właściwości logicznych w każdym punkcie przestrzennym. Ostatecznie protokół ten wykorzystuje analizę trajektorii sond znacznikowych do podłużnego ilościowego określania zmian przestrzennych w mechanice macierzy zewnątrzkomórkowej w sposób nieniszczący.Koncepcja ta polega na tym, że dzięki połączeniu pomiarów radiologicznych macierzy zewnątrzkomórkowej opartych na obrazowaniu z in vitro 3D modelami nowotworowymi, które przywracają oddziaływania macierzy zewnątrzkomórkowej, podejście to może dostarczyć ilościowych informacji na temat zależnych od czasu zmian w mechanicznym mikrośrodowisku, które towarzyszą wzrostowi guza, procesom inwazji oraz odpowiedzi na leczenie. Metoda przedstawiona w tym filmie wykorzystuje podejście z nałożeniem aros w celu generowania nieprzylegających 3D OID z ustalonej linii komórkowej raka trzustki pan one. Aby rozpocząć, wymieszaj 10 ml wody klasy do hodowli komórkowych z 0,1 g aros, aby uzyskać 1% roztwór aros.Podgrzać roztwór aros do temperatury powyżej 70 °C przed aplikacją. Odpipetować 40 µl roztworu do każdego dołka płytki 96-dołkowej i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Zebrać komórki nowotworowe za pomocą trypsyny i przygotować zawiesinę pojedynczych komórek, a następnie rozcieńczyć zawiesinę do stężenia 1000 komórek/ml. Dodać 100 µl tego rozcieńczenia do dołka zawierającego utwardzoną warstwę aros.Po inkubacji umieść próbkę na wytrząsarce w inkubatorze ustawionym na 37 °C i 5% CO2 na noc. Zdejmij próbkę z wytrząsarki, dodaj 100 µL pożywki do hodowli komórkowej, a następnie inkubuj powstały sferoid, aż osiągnie on pożądany rozmiar. Przykładowo, po dziewięciu dniach jeden sferoid będzie miał średnicę około 450 µm.W pierwszej kolejności należy przygotować stanowisko pracy w komorze z laminarnym przepływem powietrza, wyposażając je w dwie probówki o pojemności 2 ml. Pierwsza probówka będzie zawierać steroid nowotworowy, a druga będzie służyć jako kontrola wolna od komórek. Przygotuj rozcieńczoną mieszaninę fluorescencyjnych sond znacznikowych o średnicy 1 µm modyfikowanych grupami karboksylowymi, dodając dwie części roztworu zapasowego sond do 25 części wody sterylnej.Wyjąć z lodówki butelkę kolagenu bydlęcego o stężeniu 3,1 mg/mL i umieścić ją w lodzie. Do pierwszej probówki odpipekować 125 µL kolagenu, a następnie 50 µL rozcieńczonego roztworu sondy znacznikowej; krótko wymieszać w wirówce typu vortex w celu równomiernego rozprowadzenia sond. Następnie dodać 235 µL odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowej zawierającej czerwień fenolową, aby uzyskać objętość całkowitą 410 µL, i krótko wymieszać w wirówce typu vortex przed pobraniem 205 µL i przeniesieniem ich do drugiej probówki. Następnie do probówki dodać około 2 µL 1 M wodorotlenku sodu.Aby przywrócić roztworowi neutralne pH, należy go krótko wymieszać w wortexie. Następnie należy natychmiast przenieść go na statyw z lodem, aby zapobiec rozpoczęciu procesu sieciowania. Ostrożnie pobrać 40 µL medium z dołka zawierającego steroid nowotworowy.Zachowaj te 40 µL podczas wykonywania następnego kroku. Sprawdź studzienkę, aby upewnić się, czy steryd został usunięty w poprzednim kroku. Jeśli nie, przenieś 40 µL z powrotem do studzienki i powtórz poprzedni krok.Jeśli tak, dodaj 40 µL zawierających steroid do fiolki. Delikatnie wymieszaj zawartość fiolki pierwszej, a następnie przenieś mieszaninę w porcjach po 60 µL do trzech oddzielnych dołków płytki 96-dołkowej. Po dodaniu mieszaniny obejrzyj każdy dołek pod mikroskopem, aby ustalić, który z nich zawiera steroid. Następnie dodaj około 2 µL 1 M wodorotlenku sodu oraz 40 µL pożywki do hodowli komórkowych do fiolki drugiej i wymieszaj w wortexie przed alikwotowaniem.Przenieś 60 µL tej mieszaniny do pustej studzienki na płytce 96-dołkowej i oznacz ją jako kontrolę bezkomórkową. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na co najmniej jedną godzinę, aby utworzyła się siatka punktów próbnych. Następnie przenieś płytkę z próbkami z inkubatora na stolik mikroskopu.Jeśli dostępny nie jest stolik grzejny, odczekać 10 minut, aż próbka wyrówna temperaturę do temperatury pokojowej. Próbkę należy obejrzeć przy użyciu obiektywów o małym powiększeniu, aby upewnić się, że jest ona nienaruszona i gotowa do obrazowania. Należy określić położenie guza w studzience i udokumentować je za pomocą obrazu w świetle przechodzącym w celu późniejszej korejestracji przestrzennej.Zazwyczaj 20 punktów próbkowania w każdej studzience, rozmieszczonych w koncentrycznych pierścieniach wokół sferoidu S, pozwoli na uzyskanie odpowiednio szczegółowych wyników. Przesuń stolik w każdą z pożądanych pozycji i użyj oprogramowania interfejsu mikroskopu, aby zapisać współrzędne XNY. Przełącz mikroskop na obiektyw o dużym powiększeniu i wybierz odpowiedni kostkę filtrów dla długości fali ekscytacji sond znacznika.Korzystając z listy utworzonych punktów, przejdź do pierwszego punktu w siatce. Przed przesunięciem w górę dostosuj ostrość, aby zlokalizować dno dołka. Znajdź pole widzenia zawierające kilka ostrych sond znacznikowych.Obserwuj histogram intensywności i dostosuj natężenie oraz czas ekspozycji, aby uzyskać jak największy zakres dynamiczny, zapewniając jednocześnie, że obraz nie zostanie przesycony. Pozyskaj sekwencję wideo przy częstotliwości klatek od 20 do 30 milisekund na klatkę i zapisz ją, stosując odpowiedną konwencję nazewnictwa. Podczas nagrywania nie dotykaj mikroskopu ani stołu.Powtórz pomiar dla każdego punktu próbkowania w siatce. Następnie powtórz cały proces w celu utworzenia siatki dla każdej studni w eksperymencie oraz powtórz całą procedurę dla każdego punktu czasowego w trakcie monitorowania podłużnego.Aby rozpocząć analizę danych, skopiuj wszystkie dane wideo do folderu analizy. Zaimportuj dane obrazowe do programu MATLAB lub innego oprogramowania analitycznego.Skalibruj oprogramowanie poprzez analizę kilku klatek filmu, aby odpowiednio określić parametry selekcji i odrzucania służące do identyfikacji pozycji środków sond. Następnie wykorzystaj oprogramowanie do automatycznego wyznaczenia pozycji każdej sondy dla wszystkich klatek filmu, a następnie połącz te pozycje w trajektorie. Wykorzystaj dane z trajektorii do obliczenia średniego przesunięcia kwadratowego (MSD) jako funkcji czasu opóźnienia, pamiętając o zastosowaniu odpowiedniego współczynnika kalibracji przestrzennej dla konkretnego obiektywu lub zastosowanego binningu pikseli.Oblicz G* korzystając z uogólnionej relacji Stokesa-Einsteina, biorąc pod uwagę granice stosowalności tej relacji dla danej próbki. Powtórz kroki analizy dla każdego pola widzenia w eksperymencie. Przeprowadź korejestrację danych pozycyjnych z modułem wiskoelastycznym I przy danej częstotliwości, w zależności od producenta użytego mikroskopu.Ten etap może zostać ułatwiony dzięki niestandardowej procedurze odczytującej metadane mikroskopu lub dane o położeniu można zestawić ręcznie. Sekwencje wideo są pozyskiwane z wielu pozycji przestrzennych w obrębie reprezentatywnej studzienki zawierającej 3D guza nowotworowego i łączone w celu stworzenia przestrzennej mapy mikroradiologicznej próbki podczas monitorowania podłużnego populacji komórek na obwodzie naczynia. Jedna z linii komórkowych użytych w tym przykładzie będzie spontanicznie degradować otaczające włókna kolagenowe i naciekać do macierzy zewnątrzkomórkowej w ciągu kilku dni.W tym przykładzie korejestracja obrazowania mikroskopowego zapewnia ilościowy odczyt wyraźnej inwazji w macierz, która zachodzi po lewej, ale nie po prawej stronie steroidu. Monitorowanie podłużne tych odrębnych obszarów przestrzennych wykazuje spadek części rzeczywistej zespolonego modułu ścinania lepko-sprężystego o około cztery rzędy wielkości towarzyszący inwazji. Pełne dane zależne od częstotliwości przedstawiają kontrast właściwości reologicznych materiału w regionie pierwszym i regionie drugim w czwartym dniu.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu ostrożności, aby uniknąć powszechnych błędów w analizie trajektorii sond, które mogą prowadzić do niewłaściwych wniosków. Zachęcamy czytelników do zapoznania się z przywołaną tutaj literaturą dotyczącą PTM, w której omówiono kwestie takie jak dryf próbki oraz interpretacja heterogeniczności. Procedurę tę można połączyć z dodatkowym podłużnym lub końcowym obrazowaniem fluorescencyjnym w celu udzielenia odpowiedzi na inne pytania, na przykład dotyczące tego, jak przebudowa mechaniczna koreluje z kluczowymi zdarzeniami sygnalizacyjnymi lub odpowiedzią cytotoksyczną na interwencję.

longitudinal-measurement-extracellular-matrix-rigidity-3d-tumor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Pomiar wzdłużny sztywności łańcucha pozakomórkowego w 3D modelach nowotworów z wykorzystaniem mikroreologii opartej na śledzeniu cząstek

Sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływa na wiele zachowań komórek adherentnych. Sztywność macierzy zmienia się przestrzennie w obrębie tkanki i ulega modyfikacjom w różnych stanach chorobowych. W niniejszej pracy opracowujemy metody charakteryzacji zmienności przestrzennej sztywności w normalnej i zwłókniałej tkance płuc myszy z wykorzystaniem mikroindentacji za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Mikromechaniczna charakterystyka tkanki płucnej z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii siłowej

Ten protokół opisuje technikę monitorowania zmian sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej za pomocą mikroreologii śledzenia cząstek (PTM). Odbywa się to poprzez hodowlę sferoid 3D guza trzustki w ECM z wbudowanymi sondami fluorescencyjnymi do śledzenia i analizy cząstek wideo.

Monitorowanie mikrośrodowiska guza na podstawie PTM: metoda śledzenia zmian sztywności ECM za pomocą sferoid guza

Ten film prezentuje ilościową mikroskopię poklatkową do oceny zależnej od sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej rozprzestrzeniania się Listeria monocytogenes przez komórki śródbłonka. Bardziej miękki hydrożel ułatwia szybsze rozprzestrzenianie się bakterii przez komórki śródbłonka w porównaniu ze sztywniejszymi odpowiednikami, co podkreśla wpływ sztywności matrycy na rozprzestrzenianie się bakterii.

Ilościowa mikroskopia poklatkowa do oceny rozsiewu bakterii zależnego od sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej

Ten artykuł przedstawia metodę fluorescencyjnego znakowania kolagenu, która może być dalej wykorzystywana zarówno do obrazowania na żywo, jak i do obrazowania na żywo kultur komórkowych 3D. Zapewniamy również zoptymalizowany protokół wizualizacji endogennych białek cytoszkieletu komórek hodowanych w środowiskach 3D.

Odkrywanie organizacji cytoszkieletu inwazyjnych komórek nowotworowych w 3D

Macierz zewnątrzkomórkowa ulega znacznej przebudowie podczas gojenia się ran, stanów zapalnych i nowotworzenia. Przedstawiamy nowatorskie podejście do mikroskopii immunofluorescencyjnej przyżyciowej do wizualizacji dynamiki fibrylarnych, a także siatkowych składników matrycy z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej lub dwufotonowej.

Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie immunofluorescencyjne składników macierzy tkankowej z mikroskopią epifluorescencyjną i dwufotonową

Mechaniczna sztywność w mikrośrodowisku guza odgrywa kluczową rolę w napędzaniu złośliwych zachowań poprzez zwiększanie aktywności inwadopodii i kurczliwości aktomiozyny. Za pomocą żeli poliakrylamidowych (PAA), testy inwadopodiów i siły trakcyjnej można wykorzystać do badania właściwości inwazyjnych i kurczliwych komórek rakowych w odpowiedzi na sztywność matrycy.

Żele poliakryloamidowe do oznaczania inwadopodiów i siły trakcyjnej na komórkach nowotworowych

Mikroreologia śledząca cząstki bada lepkosprężystość materiałów. W tym przypadku technika ta jest wykorzystywana do określania lepkosprężystości, podatności pełzania i efektywnych ról sieciowania różnych składników matrycy biofilmu bakteryjnego. Matryca składa się z substancji polimerowych wydzielanych przez bakterie, a jej składniki decydują o budowie biofilmu i właściwościach mechanicznych.

In Situ Mapowanie właściwości mechanicznych biofilmów za pomocą mikroreologii śledzącej cząstki

Tutaj wyjaśniamy protokół modelowania mikrośrodowiska biofizycznego, w którym sieciowanie i zwiększona sztywność błony podstawnej (BM) indukowana przez zaawansowane produkty końcowe glikacji (AGE) ma patologiczne znaczenie.

Jak badać sztywność błony podstawnej jako biofizyczny wyzwalacz w raku prostaty i innych patologiach związanych z wiekiem lub chorobach metabolicznych

Opracowaliśmy wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek. Test ten jest kompatybilny z cytometrią przepływową, barwieniem immunologicznym i mikroskopią sił trakcyjnych, umożliwiając ilościowe pomiary interakcji biomechanicznych między komórkami, ich macierzą zewnątrzkomórkową i bakteriami chorobotwórczymi.

Wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek

Optyczna tomografia koherentna (OCT), technologia obrazowania trójwymiarowego, została wykorzystana do monitorowania i charakteryzowania kinetyki wzrostu sferoid wielokomórkowych guzów. Wykazano precyzyjną wolumetryczną kwantyfikację sferoid guza przy użyciu metody liczenia wokseli oraz bezznacznikowe wykrywanie martwych tkanek w sferoidach w oparciu o wewnętrzny kontrast tłumienia optycznego.

Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Tutaj prezentujemy protokół oparty na mechanice, który ma na celu zakłócenie połączenia szczelinowego 43 i zmierzenie późniejszego wpływu, jaki ma to na biomechanikę śródbłonka poprzez obserwację trakcji i naprężeń międzykomórkowych.

Zaburzanie biomechaniki śródbłonka poprzez zakłócenie strukturalne Connexin 43

Poznaj metodę mikroreologii śledzenia cząstek do pomiaru zmian sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej w trójwymiarowych modelach guzów. Technika ta umożliwia nieinwazyjną analizę mechaniki nowotworowej w czasie.

Podłużny pomiar sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej w modelach 3D guzów przy użyciu mikroreologii śledzenia cząstek

Przeglądaj więcej filmów