Zastosowanie testu multipleksowania kaspazy w celu określenia apoptozy w modelu komórkowym podwzgórza

Ogólnym celem tego filmu jest zademonstrowanie wysokowyjściowego testu multipleksowego w celu określenia początku apoptozy mierzonej za pomocą kaspazy. Trzy siedem. Po pierwsze, neurony podwzgórza są poddawane indukowaniu apoptozy nasyconym kwasom tłuszczowym, kwasom palmitynowym.

Następnie mierzy się żywotność komórek neuronów za pomocą odczynnika fluorescencyjnego i czytnika mikropłytek po wystąpieniu apoptozy. Do komórek dodaje się substrat lumino, DEVD, który jest sekwencją aminokwasów rozszczepioną przez kaspazę trzecią. Ostatnim etapem procedury jest pomiar luminescencji za pomocą czytnika mikropłytek w celu określenia aktywności kaspazy, która wzrasta w komórkach poddawanych apoptozie.

Ostatecznie stosunek aktywności kaspazy na żywotne komórki można uzyskać w mniej niż pięć do sześciu godzin. W formacie 96 dołków. Główną zaletą tej techniki naszych istniejących metod, takich jak western blot lub liza, jest to, że jest to szybki, niedrogi test, który może bezpośrednio mierzyć aktywność kaspazy trzy siedem w wielu formatach dołków.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w tej dziedzinie, takie jak określenie pierwotnych modulatorów apoptozy. Użyteczność tej techniki polega na tym, że multipleksowanie może być stosowane jako dokładna metoda oceny cytotoksyczności i żywotności. Chociaż test jest dość prosty, wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ zapewni, że test zostanie pomyślnie zakończony.

Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat neurodegeneracji, może być również stosowana do innych chorób i modeli in vitro, takich jak te stosowane w badaniach nad rakiem. Osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą musiały zoptymalizować tę technikę, ponieważ punkty końcowe są zależne od linii komórkowej i agonisty. Aktywność kaspazy trzy siedem jest przejściowa.

Dlatego, w zależności od skuteczności stresora komórkowego, określenie odpowiedniego czasu do oznaczenia aktywności odlewu podstawowego może wymagać pewnego wysiłku, aby rozpocząć szybko. Rozmrozić 12 komórek w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po rozmrożeniu delikatnie przelej komórki do wentylowanej kolby hodowlanej o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych i dodaj 10 mililitrów ciepłych delcos, zmodyfikowanych orłów, pożywki lub DMEM, inkubuj kolbę przez noc w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po 24 godzinach odessać pożywkę i zastąpić ją świeżą, aby kontynuować wzrost komórek, aż do uzyskania od 70 do 80% Konfluencji po dwóch do trzech dniach wzrostu. Aby policzyć komórki, najpierw ciepły DMEM i jeden x trypsyna, roztwór EDTA do 37 stopni Celsjusza. Odessać pożywkę z kolby i przemyć dwa razy sterylnym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym.

Dodaj 500 mikrolitrów roztworu tryin przed inkubacją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez od dwóch do pięciu minut. Odłączyć komórki od kolby za pomocą skrobaka i zawiesić komórki w pożywce o objętości pięciu mililitrów. Przepuść komórki przez sitko do czystej probówki o pojemności 50 mililitrów.

Może być konieczne przepuszczenie komórek przez sitko więcej niż jeden raz, ale nie należy powtarzać więcej niż trzy razy po zliczeniu komórek za pomocą nasion hemocytometru. 6 000 komórek na studzienkę w 96-dołkowej przezroczystej płytce o czarnych lub białych ściankach w końcowej objętości 100 mikrolitrów pożywki, inkubować płytkę w 5% dwutlenku węgla i 37 stopniach Celsjusza przez 24 godziny. Przenieś kwas palmitynowy do sterylnej szklanej fiolki o pojemności pięciu mililitrów i rozpuścić w 100% DMSO.

Po rozcieńczeniu podstawowego roztworu kwasu palmitynowego od 1 do 10 w DMSO, dodaj go do PREWARM DMEM, aby uzyskać końcowe stężenie robocze 0,1 milimolowego kwasu palmitynowego dla pożywek kontrolnych, dodaj to samo stężenie DMSO, które zostało dodane do pożywki zawierającej kwas palmitynowy. Usuń pożywkę z każdej studzienki i zastąp 50 mikrolitrami pożywki plus lub minus kwasu tynowego i inkubuj płytkę w 5% dwutlenku węgla i 37 stopniach Celsjusza przez dwie godziny. Następnie dodać pięć mikrolitrów odczynników żywicznych i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej po inkubacji, załadować płytkę do wielomodowego czytnika mikropłytek i zarejestrować fluorescencję przy długości fali wzbudzenia 560 nanometrów i długości fali emisji 590 nanometrów.

Aby zmierzyć podatność komórek, wyniki są prezentowane jako względne jednostki fluorescencji w stosunku do tej samej płytki. Dodać 55 mikrolitrów odczynnika odlewanego DEVD i inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Ponownie, za pomocą czytnika Microplate, rejestruj luminescencję do pomiaru aktywności kaspazy trzy siedem wyników są przedstawiane jako względne jednostki luminescencji z luminescencją wprost proporcjonalną do kaspazy trzy siedem w celu normalizacji aktywności kaspazy trzy siedem do liczby komórek, podziel żywotność komórek przez aktywność kaspazy trzy siedem siedem.

Protokół ten opisuje wyniki multipleksowania dwóch oddzielnych testów w celu określenia mechanizmów śmierci komórki przez apoptozę. Aktywność kaspazy była znacznie zwiększona w komórkach prowokowanych kwasem palmitynowym. Po dwugodzinnej inkubacji integralność błony komórkowej jest widocznie zmieniona w obecności kwasu palmitynowego.

Pokazano tutaj potencjalną ścieżkę, w której kwas palmitynowy indukuje apoptozę. Zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw stresora wykorzystywanego do indukowania apoptozy pomaga w określeniu czasu inkubacji stresora. Ponieważ enzymy kaspazy muszą być aktywowane przed interakcją z substratem DEVD Po opanowaniu technikę tę można wykonać w mniej niż pięć do sześciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać test aktywności kaspazy multipleksowej trzy siedem przy użyciu modelu hodowli komórek neuronalnych in vitro podwzgórza. Próbując tej procedury, należy pamiętać, że czas inkubacji zależy od typu komórek i użytych stresorów lub agonistów. Rozwój tej techniki pozwala naukowcom w dziedzinie neurobiologii na wykorzystanie niezawodnej i oszczędzającej czas techniki do badań apoptotycznych Po tej procedurze można przeprowadzić dodatkowe testy farmakologiczne, które są ukierunkowane na określone białka w procesie apoptozy w celu nakreślenia podstawowych mechanizmów, które inicjują choroby zwyrodnieniowe.