Name: Zastosowanie testu multipleksowania kaspazy w celu określenia apoptozy w modelu komórkowym podwzgórza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-16T15:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Poznaj multipleksowy test aktywności kaspaz 3/7 do oceny apoptozy w neuronach podwzgórza poddanych działaniu kwasu palmitynowego. Ta metoda umożliwia szybkie i ekonomiczne badanie mechanizmów śmierci komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Opisana tutaj praca została sfinansowana przez Departament Spraw Weteranów Stanów Zjednoczonych, Laboratorium Biomedyczne, Badań i Rozwoju BX001686-1A1 oraz VA Rehabilitacja, Badania.

1. Posiewanie i utrzymanie hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Podgrzej pożywkę hodowlaną Modified Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco (DMEM + 10% FBS + 1% penicyliny/streptomycyny/neomycyny) do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Zaopatrzyć się w zapas zamrożonych komórek A12 w temperaturze od -80 °C.</li>
	<li>Szybko rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C; po rozmrożeniu delikatnie odpipetować komórki, aby przenieść je do kolby hodowlanej o średnicy 75cm2 z wentylacją i dodać 10 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Inkubować kolbę przez noc w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Po 24 godzinach odessać pożywkę i zastąpić ją nową. Kontynuuj wzrost komórek, aż do uzyskania 70-80% konfluencji (2-3 dni wzrostu).</li>
</ol>
2. Liczenie i powlekanie komórek
<ol>
	<li>Ciepły roztwór DMEM i 1x-trypsyna-EDTA do 37 °C.</li>
	<li>Odessać pożywkę z komórek i przemyć dwukrotnie sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS).</li>
	<li>Dodać 500 μl roztworu trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2-5 minut.</li>
	<li>Oderwać komórki od kolby za pomocą skrobaka i zawiesić komórki w 5 ml pożywki. Przepuścić komórki przez sitko i przepuścić przez sitko do czystej probówki o pojemności 50 ml. Może być konieczne przepuszczenie komórek przez sitko więcej niż raz, ale nie powtarzaj więcej niż trzy razy.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru, aby określić ilość komórek do hodowli w celu zasiania 6,000 komórek / studzienki na 96-dołkowej przezroczystej płytce o czarnych lub białych ściankach w końcowej objętości 100 μl pożywki. Inkubować płytkę w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
</ol>
3. Określanie żywotności komórek i aktywności kaspazy-3/7
<ol>
	<li>Przenieść PA do sterylnej szklanej fiolki o pojemności 5 ml i rozpuścić w 100% dimetylosulfotlenku (DMSO). Rozcieńczyć podstawowy roztwór PA w stosunku 1:10 w DMSO i dodać go do wstępnie podgrzanego DMEM, aby uzyskać końcowe stężenie robocze 0,1 mM PA. W przypadku pożywek kontrolnych należy dodać takie samo stężenie DMSO, jakie dodaje się do pożywki zawierającej PA.</li>
	<li>Usuń pożywkę z każdej studzienki i zastąp ją 50 μl pożywki +/- PA. Inkubować płytkę przez 2 godziny w 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Następnie dodać 5 μl odczynnika rezazurynowego i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Za pomocą wielomodowego czytnika mikropłytek zarejestruj fluorescencję (560EX/590EM) w celu zmierzenia żywotności komórek. Wyniki są prezentowane jako względne jednostki fluorescencji (RFU).</li>
	<li>Do tej samej płytki dodać 55 μl odczynnika kaspazy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
	<li>Ponownie za pomocą czytnika mikropłytek zarejestruj luminescencję, aby zmierzyć aktywność kaspazy-3/7. Wyniki przedstawiono jako względne jednostki luminescencji (RLU), przy czym luminescencja jest wprost proporcjonalna do aktywności kaspazy-3/7.</li>
	<li>Aby znormalizować aktywność kaspazy-3/7 do liczby komórek, podziel żywotność komórek (RFU) przez aktywność kaspazy-3/7 (RLU).</li>
</ol>

<ol><li>Akil, L., Ahmad, H. A. Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAkil%2C+L+%22J.+Health+Care+Poor+Underserved%22">J. Health Care Poor Underserved</a>. 22, 61-72 (2011).</li>
<li>Posey, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+proinflammatory+lipid+accumulation%2C+inflammation%2C+and+insulin+resistance+in+rats+fed+a+high-fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a high-fat diet.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296, 1003-1012 (2009).</li>
<li>Moraes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fat+diet+induces+apoptosis+of+hypothalamic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High-fat diet induces apoptosis of hypothalamic neurons.</a> PloS one. 4, (2009).</li>
<li>Mayer, C. M., Belsham, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitate+attenuates+insulin+signaling+and+induces+endoplasmic+reticulum+stress+and+apoptosis+in+hypothalamic+neurons%3A+rescue+of+resistance+and+apoptosis+through+adenosine+5%27+monophosphate-activated+protein+kinase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Palmitate attenuates insulin signaling and induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in hypothalamic neurons: rescue of resistance and apoptosis through adenosine 5' monophosphate-activated protein kinase activation.</a> Endocrinology. 151, 576-585 (2010).</li>
<li>Benoit, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+acid+mediates+hypothalamic+insulin+resistance+by+altering+PKC-theta+subcellular+localization+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Palmitic acid mediates hypothalamic insulin resistance by altering PKC-theta subcellular localization in rodents.</a> J. Clin. Invest. 119, 2577-2589 (2009).</li>
<li>Thaler, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+is+associated+with+hypothalamic+injury+in+rodents+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Obesity is associated with hypothalamic injury in rodents and humans.</a> J. Clin. Invest. 122, 153-162 (2012).</li>
<li>Williams, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nutr.+Soc%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic dysfunction in obesity.</a> Proc. Nutr. Soc. 71, 521-533 (2012).</li>
<li>Belsham, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+phenotypic+array+of+hypothalamic+neuronal+cell+models+to+study+complex+neuroendocrine+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Generation of a phenotypic array of hypothalamic neuronal cell models to study complex neuroendocrine disorders.</a> Endocrinology. 145, 393-400 (2004).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+cell+viability+and+proliferation+in+hydrogel-encapsulated+system+by+resazurin+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).</li>
<li>Butterick, T. A., Nixon, J. P., Billington, C. J., Kotz, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexin+A+decreases+lipid+peroxidation+and+apoptosis+in+a+novel+hypothalamic+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Orexin A decreases lipid peroxidation and apoptosis in a novel hypothalamic cell model.</a> Neurosci. Lett. 524, 30-34 (2012).</li>
<li>Riss, T. L., Moravec, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+multiple+assay+endpoints+to+investigate+the+effects+of+incubation+time%2C+dose+of+toxin%2C+and+plating+density+in+cell-based+cytotoxicity+assays.+Assay+Drug+Dev%5BTitle%5D)+AND+%22Technol%22%5BJournal%5D)">Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev.</a> Technol. 2, 51-62 (2004).</li>
<li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+viability+and+cytotoxicity+testing+and+same-well+multi-parametric+combinations+for+high+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Chem.+Genomics%22%5BJournal%5D)">In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening.</a> Curr. Chem. Genomics. 3, 33-41 (2009).</li>
<li>Steffen, W., Linck, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+immunoblot%3A+a+sensitive+technique+to+stain+proteins+and+detect+multiple+antigens+on+a+single+two-dimensional+replica%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Multiple immunoblot: a sensitive technique to stain proteins and detect multiple antigens on a single two-dimensional replica.</a> Electrophoresis. 10, 714-718 (1989).</li>
<li>Gingrich, J. C., Davis, D. R., Nguyen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+and+quantitation+of+proteins+on+western+blots+using+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection and quantitation of proteins on western blots using fluorescent probes.</a> Biotechniques. 29, 636-642 (2000).</li>
<li>Riss, T. L., Moravec, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+multiple+assay+endpoints+to+investigate+the+effects+of+incubation+time%2C+dose+of+toxin%2C+and+plating+density+in+cell-based+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays.</a> Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).</li>
<li>Smyth, P. G., Berman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+apoptosis%3A+methods+for+elucidating+the+mechanism+of+apoptotic+cell+death+from+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system.</a> Biotechniques. 32, 648-650 (2002).</li>
<li>Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases%3A+pharmacological+manipulation+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Caspases: pharmacological manipulation of cell death.</a> J. Clin. Invest. 115, 2665-2672 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Test multipleksowy jest dobrze akceptowaną techniką, która była wykorzystywana przez naukowców w wielu zastosowaniach, takich jak mikromacierze PCR, immunodetekcja i inne metody wykrywania oparte na białkach13,14. Ostatnio testy multipleksowania są coraz częściej stosowane w eksperymentach in vitro na płytkach i zostały zatwierdzone jako dokładna metoda oceny cytotoksyczności i żywotności12. W powyższym protokole wykazujemy skuteczność multipleksowanych testów fluoresc...

Diety bogate w nasycone kwasy tłuszczowe, takie jak kwas palmitynowy (PA), zostały powiązane z otyłością i innymi chorobami współistniejącymi, w tym chorobami układu krążenia i cukrzycą 1,2. Wykazano również, że diety wysokotłuszczowe zwiększają stres oksydacyjny, apoptozę i zwyrodnienie neuronów w podwzgórzu, ważnym regulatorze apetytu i wydatku energetycznego3-7. Zrozumienie mechanizmu, za pomocą którego ekspozycja na dietę wysokotłuszczową indukuje rozregulowanie podwzgórza, jest zatem ważne dla opracowania farmakologicznych metod leczenia otyłości. Jednak mechanizmy komórkowe, poprzez które tłuszcz w diecie wpływa na funkcje neuronów, pozostają niejasne. Lepsze zrozumienie, w jaki sposób tłuszcze, takie jak PA, mogą wywoływać początek szlaków apoptozy podwzgórza, jest niezbędnym pierwszym krokiem w kierunku tego celu. Celem tego artykułu jest opisanie testu multipleksowego do badania in vitro odpowiedzi neuronalnej na ekspozycję na PA, opracowanego do stosowania w badaniach nad neurodegeneracją podwzgórza. Przedstawiamy szczegółowy opis 96-dołkowego testu multipleksowego w formacie in vitro do pomiaru aktywności kaspazy 3/7 na całkowitą liczbę komórek w zróżnicowanej, unieśmiertelnionej dorosłej linii komórkowej podwzgórza myszy (oznaczonej jako A12) po prowokacji oksydacyjnej PA8.
Krótko mówiąc, żywotność komórek jest określana po prowokacji PA za pomocą testu opartego na reazurynie. Rezazuryna jest związkiem przepuszczalnym dla komórek, który ulega enzymatycznej redukcji w komórkach aktywnych metabolicznie, a proces ten zachodzi za pośrednictwem mitochondriów9. Żywe komórki w sposób ciągły przekształcają resazydynę w rezorufinę, wytwarzając sygnał fluorescencyjny proporcjonalny do liczby żywotnych komórek. Aktywność kaspazy-3/7 jest następnie analizowana za pomocą testu lumogennego opartego na DEVD. DEVD to sekwencja aminokwasowa (Asp-Glu-Val-Asp) rozszczepiona przez kaspazę-3. Gdy ta sekwencja jest sprzężona z substancją lumogenną, po aktywacji wewnątrzkomórkowej kaspazy-3/7, a następnie rozszczepieniu substratu DEVD, uwalniany jest produkt luminescencyjny. Reakcja ta jest proporcjonalna do aktywności kaspazy, a tym samym do indukcji apoptozy. Ponieważ martwe komórki nie mogą wytwarzać kaspazy, aktywność kaspazy-3/7 jest z natury przejściowa; Dlatego analizę należy przeprowadzić między 30 minutami a 4 godzinami po prowokacji, w zależności od skuteczności stresora komórkowego. Żywotność komórek jest odwrotnie proporcjonalna do aktywności kaspazy-3/7 i może być wykorzystana do określenia mechanizmów śmierci komórki. Na przykład metoda ta była wcześniej stosowana w celu wykazania, że wstępne leczenie hormonem peptydowym oreksyną zmniejsza apoptozę w komórkach podwzgórza podtlenionych nadtlenkiem wodoru, co sugeruje, że mechanizmy dotknięte tym leczeniem są ważne w ochronie przed uszkodzeniem oksydacyjnym10. Ważne jest, aby pamiętać, że testy te są zależne od linii komórkowej i tkanki, ponieważ opierają się na aktywności mitochondrialnej w celu zmniejszenia liczby odczynników testowych. Protokół ten został zoptymalizowany dla dorosłych mysich komórek podwzgórza (A12); Opisane metody mogą być jednak modyfikowane tak, aby mieściły się w zakresie podobnych badań.
Multipleksowanie testów z pojedynczej hodowli zapewnia przewagę nad tradycyjną metodą wykonywania indywidualnych testów z kilku powodów. Oprócz oszczędności czasu, próbek komórek i odczynników do hodowli, testy multipleksowania mogą również dostarczyć wiedzy na temat przeżycia i śmierci komórek, zapewnić kontrolę wewnętrzną i wyeliminować potrzebę powtarzania eksperymentów11,12.
Alternatywne metody polegały na Western blot lub ELISA, które są wiarygodnymi testami, ale są drogie i czasochłonne (1-2 dni), zwłaszcza przy użyciu formatu 96-dołkowego. Wyłączając czas potrzebny na hodowlę komórek do testu multipleksowania, całkowity czas wynosi mniej niż 3 godziny. Chociaż protokół ten został zoptymalizowany do użytku z komórkami A12, może zostać zmieniony do użytku w innych modelach, mając na uwadze czynniki, które mogą wpływać na integralność komórek. Ustalenie, czy ten protokół zadziała w przypadku serii eksperymentów, zależy od liczby próbek lub warunków eksperymentalnych oraz od planowanych dalszych eksperymentów.

<table><tbody><tr><td>Linia komórkowa podwzgórza dorosłej myszy mHypoA-1/2&nbsp;</td><td>Cellutions Biosystems Inc.</td><td>CLU172</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium</td><td>Invitrogen</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>PAA Labs</td><td>A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Kwas palmitynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>Dimetynosulfotlenek&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td> Odczynnik do żywotności komórek PrestoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td></td></tr><tr><td>Systemy testowe Caspase-Glo 3/7</td><td>Promega</td><td>G8091</td><td></td></tr><tr><td>96 W Opyczna płyta dolna, polistyren, poddany obróbce kultur komórkowych, z pokrywką, sterylny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5 Multi-Mode</td><td>Microplate Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie testu multipleksowania kaspazy w celu określenia apoptozy w modelu komórkowym podwzgórza

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

Możliwość multipleksowania testów w badaniach złożonych mechanizmów komórkowych eliminuje potrzebę powtarzania eksperymentów, zapewnia wewnętrzną kontrolę i zmniejsza marnotrawstwo kosztów i odczynników. W tym miejscu opisujemy optymalizację testu multipleksowego w celu oceny apoptozy po prowokacji kwasem palmitynowym (PA) w modelu podwzgórza in vitro, wykorzystując zarówno testy fluorescencyjne, jak i luminescencyjne do pomiaru liczby żywotnych komórek i aktywności kaspazy-3/7 w 96-dołkowym formacie płytki do mikromiareczkowania. Po prowokacji PA żywe komórki oznaczono za pomocą testu fluorescencyjnego na bazie resazuryny. Aktywność kaspazy-3/7 została następnie określona za pomocą luminogenicznego substratu, DEVD, i znormalizowana do liczby komórek. Ten test multipleksowania jest przydatną techniką określania zmiany aktywności kaspazy po bodźcu apoptozowym, takim jak prowokacja nasyconymi kwasami tłuszczowymi. Nasycone kwasy tłuszczowe PA mogą zwiększać stres oksydacyjny podwzgórza i apoptozę, co wskazuje na potencjalne znaczenie testów, takich jak opisane tutaj, w badaniu związku między nasyconymi kwasami tłuszczowymi a funkcją neuronów.

Powyższy protokół opisuje wyniki multipleksowania dwóch oddzielnych analiz w celu określenia mechanizmów śmierci komórek. Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat protokołu służącego do oznaczania żywotności komórek oraz aktywności kaspazy-3/7. Aktywność kaspazy była znacząco zwiększona w komórkach poddanych działaniu PA po 2 h inkubacji (Rysunek 2A i Tabela 1). Utrata integralności błony komórkowej jest zmianą morfologiczną związaną z indukcją apoptozy, która jest widoczna ...

Testy multipleksowe mogą dostarczyć korzystnych informacji dla podstawowych mechanizmów komórkowych i wyeliminować marnotrawstwo odczynników oraz niepotrzebne powtarzalne eksperymenty. Opisujemy tutaj multipleksowy test aktywności kaspazy-3/7, przy użyciu metod fluorescencyjnych i luminescencyjnych, w celu określenia żywotności komórek w modelu podwzgórza in vitro po prowokacji oksydacyjnej kwasem palmitynowym.

Zastosowanie testu multipleksowania kaspazy w celu określenia apoptozy w modelu komórkowym podwzgórza

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Ogólnym celem tego filmu jest zaprezentowanie wysokowydajnego testu multipleksowego służącego do określenia momentu rozpoczęcia apoptozy mierzonej poziomem kaspazy 3/7. W pierwszej kolejności neurony podwzgórza poddaje się działaniu kwasu palmitynowego, nasyconego kwasu tłuszczowego indukującego apoptozę.Następnie, po wystąpieniu apoptozy, mierzy się żywotność neuronów przy użyciu odczynnika fluorescencyjnego oraz czytnika mikropłytek. Do komórek dodaje się substrat luminescencyjny DEVD, będący sekwencją aminokwasową rozszczepianą przez kaspazę 3. Ostatnim krokiem procedury jest pomiar luminescencji za pomocą czytnika mikropłytek w celu określenia aktywności kaspazy, która wzrasta w komórkach przechodzących apoptozę.W rezultacie stosunek aktywności kaspazy do liczby żywych komórek można uzyskać w czasie krótszym niż pięć do sześciu godzin, stosując format 96-dołkowy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z naszymi dotychczasowymi metodami, takimi jak western blot czy lizy, jest to, że jest to szybki i niedrogi test, który pozwala na bezpośredni pomiar aktywności kaspazy 3 i 7 w wielu formatach wielodołkowych.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w tej dziedzinie, takie jak określenie głównych modulatorów apoptozy. Użyteczność tej techniki polega na tym, że takie multipleksowanie może być stosowane jako dokładna metoda oceny cytotoksyczności i żywotności. Chociaż sam test jest dość prosty, wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ zapewni ona prawidłowe przeprowadzenie analizy.Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat neurodegeneracji, może być ona również zastosowana w innych chorobach i modelach in vitro, takich jak te wykorzystywane w badaniach nad rakiem. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą będą musiały zoptymalizować tę technikę, ponieważ punkty końcowe zależą od linii komórkowej i stosowanego agonisty. Aktywność kaspazy 3 i 7 ma charakter przejściowy.W związku z tym, w zależności od skuteczności czynnika stresowego dla komórek, ustalenie odpowiedniego momentu oceny aktywności bazy cast może wymagać pewnych starań. Aby rozpocząć, szybko rozmrozić zamrożone komórki a 12 w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Po rozmrożeniu delikatnie przenieść komórki pipetą do wentylowanej kolby hodowlanej o powierzchni 75 cm² i dodać 10 mL ciepłej pożywki DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium). Inkubować kolbę przez noc w inkubatorze z 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.Po 24 godzinach odessać pożywkę i zastąpić ją świeżą; hodowlę komórek można kontynuować, aż po dwóch do trzech dniach wzrostu zostanie osiągnięta konfluencja na poziomie od 70 do 80%. Aby policzyć komórki, najpierw ogrzać DMEM oraz roztwór trypsyny-EDTA 1x do 37°C. Odessać pożywkę z kolby i dwukrotnie przemyć sterylnym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS).Dodaj 500 µL roztworu trypsyny przed inkubacją w temperaturze 37 °C przez okres od dwóch do pięciu minut. Ododerwij komórki od ścianek kolby za pomocą skrobaka i zawieś je w 5 mL pożywki. Przepuść komórki przez sitko komórkowe do czystej probówki o pojemności 50 mL.Może być konieczne przepuszczenie komórek przez sitko więcej niż raz, jednak nie należy powtarzać tej czynności więcej niż trzy razy. Po policzeniu komórek za pomocą cytometru hematologicznego, wysiać 6 000 komórek na dołek w 96-dołkowej płytce z przezroczystym dnem i czarnymi lub białymi ściankami w końcowej objętości 100 µL pożywki; inkubować płytkę w atmosferze 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Przenieść kwas palmitynowy do sterylnej szklanej fiolki o pojemności 5 ml i rozpuścić w 100% DMSO.Po rozcieńczeniu roztworu zapasowego kwasu palmitynowego w DMSO w stosunku 1:10, dodaj go do PODGRZANEGO DMEM, aby uzyskać końcowe stężenie robocze 0,1 mM kwasu palmitynowego dla pożywek kontrolnych; dodaj taką samą ilość DMSO, jaka została dodana do pożywek zawierających kwas palmitynowy. Usuń pożywkę z każdej studzienki i zastąp ją 50 µL pożywki z kwasem palmitynowym lub bez niego, a następnie inkubuj płytkę w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Następnie dodaj 5 µL odczynników żywicznych i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej; po inkubacji umieść płytkę w wielomodalnym czytniku mikropłytek i zarejestruj fluorescencję przy długości fali wzbudzenia 560 nm i długości fali emisji 590 nm.Aby zmierzyć żywotność komórek, wyniki przedstawiono jako względne jednostki fluorescencji dla tej samej płytki. Należy dodać 55 µL odczynnika DEVD i inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Ponownie, korzystając z czytnika mikropłytek, należy zarejestrować luminescencję w celu pomiaru aktywności kaspazy 3/7; wyniki przedstawiono jako względne jednostki luminescencji, gdzie luminescencja jest wprost proporcjonalna do aktywności kaspazy 3/7. Aby znormalizować aktywność kaspazy 3/7 do liczby komórek, należy podzielić żywotność komórek przez aktywność kaspazy 3/7.Niniejszy protokół opisuje wyniki zastosowania multipleksowania dwóch oddzielnych testów w celu określenia mechanizmów śmierci komórkowej w wyniku apoptozy. Aktywność kaspaz była znacząco zwiększona w komórkach poddanych działaniu kwasu palmitynowego. Po dwugodzinnej inkubacji w obecności kwasu palmitynowego widoczna jest zmiana integralności błony komórkowej.Przedstawiono tutaj potencjalną ścieżkę, w której kwas palmitynowy indukuje apoptozę. Zrozumienie mechanizmów działania stresora wykorzystywanego do indukowania apoptozy pomaga w określeniu czasu inkubacji z tym stresorem. Ponieważ enzymy kaspazy muszą zostać aktywowane przed wejściem w interakcję z substratem DEVD, po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w czasie krótszym niż pięć do sześciu godzin, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przeprowadzić wielokrotny pomiar aktywności kaspazy 3 i 7 z wykorzystaniem in vitro modelu hodowli komórek neuronalnych podwzgórza. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że czasy inkubacji zależą od typów komórek oraz stosowanych stresorów lub agonistów. Opracowanie tej metody pozwala badaczom z dziedziny neuronauki na wykorzystanie niezawodnej i oszczędzającej czas techniki w badaniach nad apoptozą. Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać dodatkowe testy farmakologiczne ukierunkowane na konkretne białka w procesie apoptozy, aby określić mechanizmy leżące u podstaw inicjacji chorób degeneracyjnych.

use-caspase-multiplexing-assay-to-determine-apoptosis-hypothalamic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Zastosowanie testu wielokrotnego kaskad proteazowego do określenia apoptozy w hipotalamicznym modelu komórkowym

Obrazowanie żywych komórek w celu analizy apoptozy pośredniczonej przez kaspazę-3 w unieśmiertelnionych kulturach komórek oligodendrocytów N19 z wykorzystaniem substratu kaspazy-3 NucView 488. Technika ta znajduje zastosowanie w testach programowanej śmierci komórki w czasie rzeczywistym w różnych typach komórek i tkanek.

Monitorowanie aktywności rozszczepionej kaspazy-3 i apoptozy unieśmiertelnionych komórek oligodendroglialnych z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek oraz rozszczepialnych fluorescencyjnych substratów barwiących po indukowanej potasem depolaryzacji błony

Ten film opisuje test luminescencyjny in vitro kaspazy-3/7 do ilościowego określenia śmierci komórki lub apoptozy. Test mierzy luminescencję wytwarzaną po rozszczepieniu kaspazy-3/7 proluminescencyjnego substratu DEVD. Generowana luminescencja jest proporcjonalna do aktywności kaspazy-3/7.

Test kaspazy-3/7: Test oparty na luminescencji do ilościowego określania apoptozy poprzez pomiar aktywności kaspazy-3/7 w eksplantatach skóry żaby

Termin anastasis odnosi się do zjawiska, w którym umierające komórki odwracają proces samobójstwa komórki na późnym etapie, naprawiają się i ostatecznie przeżywają. Tutaj pokazujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które przechodzą anastazę.

Strategie śledzenia anastazy, zjawiska przeżycia komórek, które odwraca apoptozę

Aby wykryć zdrowe komórki u całych zwierząt, które zawierają niski poziom aktywności kaspazy, dla Drosophila wygenerowano wysoce czuły biosensor o nazwie CaspaseTracker. Aktywność biosensora zależna od kaspazy jest wykrywana w długowiecznych zdrowych komórkach w narządach wewnętrznych dorosłych zwierząt hodowanych w zoptymalizowanych warunkach przy braku bodźców śmierci.

In vivo (in vivo) Biosensor śledzi nieapoptotyczną aktywność kaspazy u Drosophila

Anastasis jest technicznie trudne do wykrycia in vivo, ponieważ komórki, które odwróciły proces śmierci komórki, mogą być morfologicznie nie do odróżnienia od normalnych zdrowych komórek. Poniżej opisujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które ulegają anastazie u żywych zwierząt, przy użyciu naszego nowo opracowanego systemu biosensorów CaspaseTracker in vivo.

Wykrywanie anastazy in vivo za pomocą biosensora CaspaseTracker

Ten protokół opisuje dwumolekularną komplementację fluorescencji kaspazy (BiFC); metodę opartą na obrazowaniu, która może być użyta do wizualizacji indukowanej bliskości kaspaz inicjujących, co jest pierwszym krokiem w ich aktywacji.

Oświetlanie szlaków aktywacji kaspazy za pomocą bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej

Tutaj prezentowany jest eksperymentalny przepływ pracy, który umożliwia wykrywanie przetwarzania kaspazy-8 bezpośrednio w wywołującym śmierć kompleksie sygnalizacyjnym (DISC) i określa skład tego kompleksu. Metodologia ta ma szerokie zastosowanie, od odkrywania mechanizmów molekularnych szlaków śmierci komórkowej po dynamiczne modelowanie sieci apoptozy.

Pomiar składu kompleksu sygnalizacyjnego indukującego śmierć CD95 i przetwarzanie prokaspazy-8 w tym kompleksie

Prezentowany tutaj jest szczegółowy protokół immunohistochemiczny do identyfikacji, walidacji i celowania w funkcjonalnie istotne kaspazy w złożonych tkankach.

Kwantyfikacja immunologicznie barwionej kaspazy-9 w tkance siatkówki

Ten protokół opisuje kompleksową metodę oceny aktywacji kaspazy (kaspaza-1, kaspaza-3, kaspaza-7, kaspaza-8, kaspaza-9 i kaspaza-11) w odpowiedzi na modele infekcji zarówno in vitro, jak i in vivo (u myszy) infekcji, sterylnych zniewag i raka w celu określenia inicjacji szlaków śmierci komórki, takich jak piroptoza, apoptoza, nekroptoza i PANoptosis.

Ocena aktywacji kaspazy w celu oceny wrodzonej śmierci komórek odpornościowych

Obecny protokół opisuje dwie metody pomiaru aktywności kaspazy za pomocą substratu fluorogenicznego za pomocą cytometrii przepływowej lub spektrofluorometru.

Pomiar aktywności kaspazy za pomocą testu fluorometrycznego lub cytometrii przepływowej

Poznaj multipleksowy test aktywności kaspaz 3/7 do oceny apoptozy w neuronach podwzgórza poddanych działaniu kwasu palmitynowego. Ta metoda umożliwia szybkie i ekonomiczne badanie mechanizmów śmierci komórkowej.

Zastosowanie testu multipleksowania kaspazy w celu określenia apoptozy w modelu komórkowym podwzgórza

Przeglądaj więcej filmów