Wykorzystanie interferencji RNA do zbadania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u makrofagów myszy

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie interferencji RNA do zbadania wpływu genów kandydujących na wrodzoną odpowiedź immunologiczną. W makrofagach myszy, aby to zrobić, linie komórkowe makrofagów myszy są trypowane i łączone z roztworem transfekcyjnym i interesującymi RNA SI, mieszanina jest następnie przenoszona na 96-dołkową płytkę VETE nucleo, a system transfekcji Maxa 96 Well służy do transfekcji siRNA do makrofagów i po inkubacji z hodowlą komórkową, pożywka, LPS lub inne aktywatory odporności wrodzonej są nakładane na transfekowane makrofagi w celu ich stymulacji. Na koniec wykonuje się badania Elizy w celu monitorowania produkcji cytokin i oceny wpływu leczenia siRNA na wrodzoną odpowiedź immunologiczną.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z transfekcją za pośrednictwem lipidów jest to, że nasz test jest solidny i może być stosowany do wielu genów w zawodzie o wysokiej przepustowości. Kluczem do tej metody jest praca ze zdrowymi komórkami, delikatne traktowanie ich i wydajna praca podczas procesu transfekcji. Jak pokażemy, protokół ten wykorzystuje surową linię komórkową 2 64 0,7 mysich makrofagów, która jest hodowana zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie.

W ramach przygotowań do transfekcji INA komórki, osiągając płynność 20% CO i rosną przez jeden lub dwa dni, aż komórki nie będą zlewać się w więcej niż 80%. Ważne jest, aby pamiętać, aby używać komórek, które znajdują się między przejściami od trzeciego do dziesiątego. Po rozmrożeniu rozpocznij tę procedurę od zaprogramowania 96-dołkowego systemu wahadłowego, który będzie używany do transfekcji.

Aby to zrobić, uruchom oprogramowanie 96 well shuttle na komputerze podłączonym do wahadłowca z menu pliku w lewym górnym rogu. Wybierz nowy plik parametrów. Zaznacz studzienki, które zostaną transfekowane na wyświetlonym schemacie płytki 96-dołkowej.

Zielone pole wskaże wybrane studnie. Wybierz program, który odpowiada linii komórek makrofagów używanej do surowych 2 64 0,7 komórek. Wybierz DS 1 36, wybierz zastosuj.

Zwróć uwagę, że po wybraniu programu studzienki na tabliczce schematu zostaną pokolorowane. Ciemnoniebieskie puste kółka wskazują studnie, które nie zostały przypisane do programu i nie zostaną zszokowane. Następnie przygotuj działający roztwór efektora nukleo, mieszając 96-dołkowy roztwór efektora nukleonowego linii komórek SF z całą zawartością dołączonej probówki z suplementem.

Pozwól, aby zmieszane odczynniki zrównoważyły się w temperaturze pokojowej. Podgrzej D-M-E-M-R-P-M-I 1640 0,25% tripsin EDTA i PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przygotować eksperymentalny plazmid kontrolny S-I-R-N-A-P max GFP lub znakowane fluorescencyjnie siRNA, rozmrażając je na lodzie w celu oderwania przylegających makrofagów od naczyń do hodowli komórkowych.

Odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki 10 mililitrami PBS. Następnie, po usunięciu PBS, inkubuj komórki z jednym mililitrem wstępnie ostrzeżonego 0,25% tripyny EDTA na płytkę, aż komórki zaczną się odłączać. Zajmuje to od jednej do dwóch minut.

Delikatnie postukaj w płytkę i przesuwaj roztwór podczas inkubacji, aby zmaksymalizować trypsynizację. Po odłączeniu komórek delikatnie dodaj dziewięć mililitrów DMEM plus FBS, pipetując w górę iw dół, a następnie zbierz komórki, pipetując do sterylnej probówki. Policz liczbę izolowanych makrofagów za pomocą cytometru hema.

Spodziewaj się około 10 milionów makrofagów na 10-centymetrową płytkę. Oblicz całkowitą liczbę potrzebnych makrofagów, każda studzienka w 96-dołkowym wahadłowcu wymaga 200 000 komórek. Odpipetować obliczoną liczbę komórek do probówki wirówkowej.

Wiruj komórki przez 10 minut w temperaturze 150 G w temperaturze pokojowej na sterylnej 96-dołkowej okrągłej płytce dolnej, która ułatwia mieszanie, jednocześnie minimalizując straty odczynników. Dodaj dwa mikrolitry każdego IRNA do każdej studzienki, która ma być transfekowana. Należy pamiętać, że w zależności od liczby siRNA, można to osiągnąć na etapie wirowania makrofagów.

Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest elektroporacja, czyli, które bardzo delikatnie traktują ogniwa i działają bardzo szybko. Gdy komórki znajdą się w toksycznym roztworze transfekcji, odessaj pożywkę z komórek wirówki, a następnie delikatnie zawieś je ponownie w roztworze efektora nukleo. SF zawierający roztwór suplementu.

Natychmiast przenieś komórki do sterylnego koryta za pomocą wielokanałowej pipety, przenieś 20 mikrolitrów zawieszonej mieszaniny komórek do każdej studzienki 96-dołkowej płytki zawierającej siRNA, delikatnie zmieszane przez pipetowanie w górę iw dół. Następnie przenieś 20 mikrolitrów mieszaniny INA komórek do 96-dołkowej płytki nukleo-weterynaryjnej. Bardzo ważne jest, aby na tym etapie unikać generowania pęcherzyków, ponieważ może to spowodować błędy podczas czułości jądra.

Po umieszczeniu wszystkich próbek eksperymentalnych na płytce transfekcyjnej, przykryj ją dołączoną pokrywką i bardzo delikatnie postukaj o twardą powierzchnię. Aby usunąć wszelkie pęcherzyki, umieść 96-dołkową płytkę w 96-dołkowym wahadłowcu efektora nukleo, a następnie w prawym dolnym rogu ekranu programu wybierz prześlij i uruchom. Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami programu, aby pomyślnie zapisać wyniki podczas procesu afekcji nukleo

Transfekowany zostanie przedstawiony na schemacie 96 dołków na ekranie za pomocą zielonego kółka ze znakiem plus. Czerwone kółko ze znakiem minus oznacza błąd, najprawdopodobniej spowodowany bąbelkami lub pipetowaniem niewłaściwej objętości odczynników bezpośrednio po ognisku nukleo. Użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 80 mikrolitrów wstępnie podgrzanego RPMI 1640.

Średnio z boku każdego. Cóż, pozwól pożywce powoli wymieszać się z transfekowanymi komórkami, które na tym etapie są bardzo delikatne. Zbyt szybkie dodanie pożywki znacznie zmniejszy żywotność.

Umieść 96-dołkową płytkę z transfekowanymi próbkami i RPMI 1640 w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 na dwie lub więcej minut. Bardzo ważne jest, aby komórki mogły się zregenerować przed dalszą manipulacją. Po wyjęciu płytki z inkubatora za pomocą pipety wielokanałowej ostrożnie przenieść mieszaninę z każdej studzienki do 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.

Następnie ponownie, za pomocą pipety wielokanałowej, dodaj do każdego 100 mikrolitrów DMEM z FBS. Dobrze inkubować przez 24 do 36 godzin natychmiast po transfekcji i powrocie do zdrowia, wykonać cytometrię przepływową. Aby ocenić skuteczność transfekcji znakowanego fluorescencyjnie SI irna, ponad 99% komórek powinno zostać przetransfekowanych dzień po teście transfekcji Aby uzyskać skuteczność transfekcji plazmidu GFP, 30 do 50% komórek powinno wyrażać GFP Po 24 do 36 godzinnej inkubacji przygotować LPS lub inne aktywatory odporności wrodzonej w świeżej pożywce, rozcieńczyć LPS do końcowego stężenia 20 nanogramów na mililitr w DMEM z FBS.

Następnie ostrożnie odessać pożywkę z płytki 96-dołkowej i dodać do komórek świeżą pożywkę zawierającą LPS. Umieść płytkę w inkubatorze, aby monitorować odpowiedź na LPS lub inne stymulatory odporności wrodzonej w różnych momentach po stymulacji. Odpipetować supernatant z komórek do 96-dołkowej płytki do analizy przez Elizę.

Po usunięciu supernatantu w celu monitorowania żywotności komórek, dodać 100 mikrolitrów octanu fluoresceiny do 100 w PBS do każdej studzienki inkubowanej w temperaturze pokojowej przez jedną do pięciu minut. Monitoruj fluorescencję w komórkach za pomocą czytnika płytkowego po rozszczepieniu przez esterazy komórkowe w żywych komórkach. Związek ten staje się fluorescencyjny, aby zilustrować użyteczność tego podejścia do monitorowania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej.

siRNA ukierunkowane na znane wrodzone geny regulatora odpornościowego transfekowano do surowej linii komórkowej 2, 64, 0,7 makrofagów. Komórki zostały następnie stymulowane za pomocą LPS i produkcji cytokin prozapalnych. IL 6 i TNF alfa były monitorowane przez Elizę, jak pokazano tutaj.

Hamowanie receptora toll-podobnego cztery, receptora dla LPS, ale nie dla innych TLR. Za pomocą SIR, silnie zmniejszona produkcja LPS indukowała IL 6 i TNF alfa. Należy zauważyć, że hamowanie IL 6 za pomocą irna zmniejszało produkcję IL 6, ale nie wpływało na produkcję TNF alfa.

Dane te sugerują dobrą skuteczność i dobrą swoistość knockdownu za pośrednictwem siRNA kandydatów na regulatory odporności wrodzonej. Ważne jest, aby pamiętać, że kluczem do dobrej transfekcji i dobrej regeneracji komórek jest praca z bardzo zdrowymi komórkami, delikatne traktowanie ich podczas transfekcji i procesu odzyskiwania oraz szybka praca, gdy komórki znajdują się w roztworze efektora nukleo. Po tej procedurze można wykonać wiele innych testów, w tym QPCR w celu monitorowania knockdownu genów i wiele innych testów w celu zbadania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej.