Name: Wykorzystanie interferencji RNA do zbadania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u makrofagów myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Poznaj metodę transfekcji siRNA do makrofagów myszy przy użyciu systemu Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle. Technika ta umożliwia badanie wpływu genów na wrodzoną odpowiedź immunologiczną poprzez pomiar produkcji cytokin po stymulacji LPS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Podziękowania dla Brada Lackforda za pomoc w optymalizacji niektórych technik opisanych w tym manuskrypcie.

1. Utrzymanie linii komórkowych makrofagów
<ol>
	<li>Hoduj linie komórkowe RAW264.7 i J774A.1 w DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w temperaturze 37 ºC w obecności 5% CO2 . Aby pomóc w utrzymaniu bezpłodności, dodaj 1% penicyliny/streptomycyny (wstrzykiwacz/paciorkowiec) do pożywki (chociaż nie jest to absolutnie konieczne).</li>
	<li>Krok krytyczny: Upewnij się, że makrofagi rosną w zdrowym stanie, aby zapewnić wydajną transfekcję i knockdown genu wywołany przez siRNA. Używaj komórek między pasażami 3 i 10 po świeżym rozmrożeniu, ponieważ te linie makrofagów wykazują najlepszą skuteczność transfekcji i utrzymują solidną przeżywalność po transfekcji na tym etapie; Nie należy używać wyższej liczby pasaży (>20), ponieważ zarówno wydajność transfekcji, jak i knockdown genu znacznie się zmniejszają.</li>
	<li>Aby zoptymalizować transfekcję siRNA, płytki komórek w 20% konfluencji i rosną przez jeden lub dwa dni, aż komórki osiągną nie więcej niż 80% konfluencji. Przerośnięte komórki nie będą skutecznie transfekować.</li>
</ol>
2. Programowanie 96-dołkowego systemu wahadłowego do transfekcji
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie 96-dołkowego wahadłowca na komputerze podłączonym do wahadłowca. Wybierz nowy plik parametrów z menu pliku w lewym górnym rogu.</li>
	<li>Zaznacz dołki, które zostaną transfekowane na wyświetlonym schemacie płytki 96-dołkowej. Zielone pole wskaże, które studnie są wybrane.</li>
	<li>Wybierz program, który odpowiada używanej linii komórek makrofagów (DS-136 dla RAW264.7 lub DS-130 dla J774A.1) i wybierz zastosowanie, znajdujący się poniżej schematycznej płytki 96-dołkowej. Zwróć uwagę, że po wybraniu programu studzienki na tabliczce schematu będą pokolorowane na ciemnoniebiesko. Puste kółka wskazują studnie, które nie zostały przypisane do programu i nie zostaną zszokowane.</li>
</ol>
3. Przygotowanie odczynników do transfekcji
<ol>
	<li>Przygotuj działający roztwór nukleofektora™, mieszając 96-dołkowy roztwór nukleofektora™ linii komórek SF z całą zawartością dołączonej probówki z suplementem. Przed użyciem odczekać, aż zmieszane odczynniki zrównoważą się w temperaturze pokojowej. Nadmiar kompletnego roztworu Nucleofector™ należy przechowywać w temperaturze 4 ºC przez okres do 3 miesięcy do wykorzystania w przyszłości.</li>
	<li>Przed przygotowaniem makrofagów do transfekcji należy wstępnie podgrzać DMEM, RPMI-1640, 0,25% trypsyny/EDTA i sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w temperaturze 37 ºC.</li>
	<li>Przygotuj siRNA do transfekcji przez rozmrażanie na lodzie. Aby zminimalizować liczbę rozmrażania siRNA przez zamrożenie, należy zamrozić nowe siRNA w podwielokrotnościach przy pierwszym użyciu.</li>
	<li>We wstępnych eksperymentach należy użyć siRNA w stosunkowo wysokiej dawce 2 μM (rozcieńczonej 1:10 z 20 μM zapasów). Następnie miareczkowanie siRNA, które indukują silny knockdown genów, do niższych dawek, chociaż zazwyczaj do skutecznego knockdownu genów w makrofagach potrzebne są wyższe dawki w porównaniu z innymi typami komórek. 
	UWAGA: siRNA są dostępne z wielu źródeł; dość silny knockdown genów można uzyskać za pomocą siGenome SMARTPOOLs, które są pulami czterech siRNA ukierunkowanych na każdy gen. Jako kontrolę negatywną użyj dowolnej z różnych niedocelowych pul siRNA lub siRNA.</li>
	<li>Aby monitorować wydajność transfekcji, należy przeprowadzić transfekcję plazmidu kontrolnego pmaxGFP (dostarczonego w zestawach Amaxa) lub znakowanych fluorescencyjnie siRNA równolegle z eksperymentalnymi siRNA. Spodziewaj się 30-50% transfekcji plazmidu GFP (oznaczanej za pomocą mikroskopii lub cytometrii przepływowej następnego dnia po transfekcji) i >99% transfekcji znakowanego fluorescencyjnie siRNA (oznaczanej cytometrią przepływową natychmiast po transfekcji i odzyskaniu).</li>
</ol>
4. Przygotowanie makrofagów do transfekcji
<ol>
	<li>Odłącz przylegające makrofagi od szalek z kulturą komórkową przez trypsynizację. Odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki 10 ml PBS. Po usunięciu PBS inkubuj komórki z podgrzaną 0,25% trypsyną/EDTA (płytka 1 ml/10 cm) przez 1-2 minuty, aż komórki zaczną się odłączać. Delikatnie postukaj w płytkę i przesuwaj roztwór podczas inkubacji, aby zmaksymalizować trypsynizację.</li>
	<li>Po inkubacji dodać 9 ml pożywki DMEM + FBS, delikatnie wymieszać w górę i w dół, a następnie zebrać komórki pipetując do sterylnej probówki.</li>
	<li>Policz liczbę izolowanych makrofagów za pomocą hemocytometru. Spodziewaj się około 10 milionów makrofagów na 10 cm płytce. Oblicz całkowitą liczbę potrzebnych makrofagów; Każda studzienka na 96-dołkowym wahadłowcu wymaga 200 000 komórek. Należy pamiętać o dodaniu kilku dodatkowych komórek o wartości studzienek, aby umożliwić straty związane z pipetowaniem.</li>
	<li>Odpipetować obliczoną liczbę komórek do probówki wirówkowej. Odwirowywać komórki przez 10 minut przy 150 x g w temperaturze pokojowej. Nie należy wirować zbyt szybko, ponieważ zmniejszy to zdrowie makrofagów i wydajność transfekcji.</li>
</ol>
5. Nukleofekcja makrofagów za pomocą siRNA
<ol>
	<li>Używając sterylnej 96-dołkowej okrągłej płytki dolnej (która ułatwia mieszanie, jednocześnie minimalizując straty odczynników), dodaj 2 μl każdego siRNA do każdej studzienki, która ma być transfekowana. 
	Uwaga: W zależności od liczby siRNA, można to osiągnąć na etapie wirowania makrofagów.</li>
	<li>Odessać pożywkę z odwirowanych komórek. Delikatnie zawiesić komórki w roztworze Nucleofector™ SF (zawierającym roztwór suplementu), używając 20 μl na 200 000 granulowanych komórek. Po ponownym zawieszeniu należy natychmiast użyć komórek, aby uzyskać optymalną transfekcję.</li>
	<li>Przenieść zawieszone komórki do sterylnego koryta; za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 20 μl mieszaniny zawieszonych komórek do każdego dołka 96-dołkowej płytki zawierającej siRNA. Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Przenieś 20 μl mieszaniny komórka/siRNA do 96-dołkowej płytki nukleokulety™. Krok krytyczny: unikaj generowania pęcherzyków podczas etapu przenoszenia, ponieważ może to spowodować błędy podczas Nucleofection.</li>
	<li>Po umieszczeniu wszystkich próbek doświadczalnych na płytce do transfekcji, przykryj 96-dołkową płytkę dołączoną pokrywką i bardzo delikatnie postukaj w twardą powierzchnię, aby usunąć wszelkie pęcherzyki z próbek.</li>
	<li>Umieść 96-dołkową płytkę z pokrywką w 96-dołkowym czółenku Nucleofector i wybierz opcję "prześlij i uruchom" w prawym dolnym rogu ekranu programu. Przed uruchomieniem Nucleofection postępuj zgodnie z instrukcjami programu, aby zapisać wyniki. 
	Uwaga: Podczas procesu Nucleofection, studnie pomyślnie przetransfekowane zostaną przedstawione na schemacie 96-dołkowym na ekranie za pomocą zielonego kółka ze znakiem plus. Czerwone kółko ze znakami minus oznacza błąd, najprawdopodobniej spowodowany pęcherzykami powietrza lub nieprawidłowym pipetowaniem odpowiedniej objętości odczynników.</li>
</ol>
6. Odzyskiwanie i powlekanie makrofagów
<ol>
	<li>Bezpośrednio po nukleofekcji, za pomocą pipety wielokanałowej, dodać 80 μl wstępnie podgrzanej (37 ºC) pożywki RMP1-1640 do każdego dołka. Dodaj pożywkę z boku każdej studzienki, pozwalając pożywce powoli wymieszać się z transfekowanymi komórkami, które na tym etapie są bardzo delikatne. Nie dodawaj nośnika zbyt szybko, ponieważ znacznie zmniejszy to żywotność.</li>
	<li>Umieścić 96-dołkowe płytki z transfekowanymi próbkami i RPMI-1640 w inkubatorze o temperaturze 37 ºC z 5% CO2 2 na 2 minuty; ma to kluczowe znaczenie, aby umożliwić komórkom regenerację przed dalszą manipulacją.</li>
	<li>Wyjąć 96-dołkową płytkę z inkubatora i ostrożnie przenieść mieszaninę z każdej studzienki do 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 100 μl wstępnie podgrzanego (37 ºC) podłoża DMEM+FBS do każdego dołka.</li>
	<li>Inkubować 96-dołkową płytkę do hodowli tkankowej z próbkami w inkubatorze o temperaturze 37 ºC z 5% CO2 przez 24-36 godzin (zoptymalizuj dokładny czas dla poszczególnych siRNA, chociaż ten zakres czasu na ogół działa dobrze).</li>
</ol>
7. Stymulacja makrofagów za pomocą LPS
<ol>
	<li>Po 24-36 godzinnej inkubacji po nukleofekcji przygotuj LPS (lub inne PAMP) w świeżych pożywkach. Przygotować wystarczającą ilość świeżej pożywki do wszystkich dołków (200 μl pożywki/dołek z płytki 96-dołkowej plus trochę więcej do pipetowania). Rozcieńczyć LPS do końcowego stężenia 20 ng/ml w DMEM+FBS.</li>
	<li>Ostrożnie odessać pożywkę z płytki 96-dołkowej i dodać do komórek świeżą pożywkę zawierającą LPS.</li>
	<li>Monitoruj odpowiedź na LPS lub inne PAMP w różnych momentach po stymulacji. 6 godzin wystarczy, aby wytworzyć silną odpowiedź cytokin zapalnych na cytokiny, takie jak IL-6 lub TNFα.</li>
</ol>
8. Monitorowanie indukowanej wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, knockdownu genów i żywotności makrofagów
<ol>
	<li>Aby monitorować produkcję cytokin indukowaną przez LPS, należy pipetować supernatant z komórek do 96-dołkowej płytki do przechowywania. Produkcja cytokin może być następnie mierzona za pomocą testu ELISA.</li>
	<li>Po usunięciu supernatantu należy monitorować żywotność komórek za pomocą dioctanu fluoresceiny (po rozszczepieniu przez esterazy komórkowe w żywych komórkach związek ten staje się fluorescencyjny). Zidentyfikuj siRNA, które celują w geny kontrolujące żywotność komórek przy użyciu tego podejścia. Uwaga: sam proces transfekcji powinien mieć niewielki wpływ na żywotność, jeśli zostanie przeprowadzony prawidłowo.
	<ol>
		<li>Dodać dioctan fluoresceiny (5 mg/ml zapasu acetonu) do każdego dołka (końcowe rozcieńczenie 1:100 w PBS).</li>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną do pięciu minut, a następnie monitorować fluorescencję w komórkach za pomocą czytnika płytek (wzbudzenie 460 nm, emisja 515 nm).</li>
		<li>Opcjonalnie: Aby zapewnić jednolitą fluorescencję w studzienkach, należy poddać ogniwa lizie za pomocą takich jak RIPA; zapewnia to jednolity sygnał fluorescencyjny w studzience, ponieważ niektóre czytniki płytek są skonfigurowane do monitorowania tylko niewielkiej części studzienki; jeśli komórki nie są równomiernie posiane, dioctan fluoresceiny może dać niedokładny odczyt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywą dla monitorowania żywotności komórek jest monitorowanie knockdownu genów wywołanego przez siRNA za pomocą qPCR przy użyciu RNA pochodzącego z przylegających komórek.
	<ol>
		<li>Po usunięciu supernatantu z komórek (krok 8.1 powyżej), dodaj bufor RLT (który jest używany do lizy i zachowania RNA) bezpośrednio do przylegających komórek w celu ich lizy.</li>
		<li>Wyizoluj RNA za pomocą zestawu do przygotowania RNA, takiego jak mini-zestaw RNeasy, i użyj qPCR ze starterami specyficznymi dla genu do monitorowania knockdownu genów w stosunku do kontroli leczenia siRNA. Użyj starterów do Βaktyny lub GAPDH w celu normalizacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inną alternatywą dla monitorowania innych aspektów wrodzonej odpowiedzi immunologicznej jest monitorowanie zdolności fagocytarnych makrofagów poprzez dodawanie cząstek E. coli znakowanych FITC bezpośrednio do przylegających komórek za pomocą zestawu. Postępując zgodnie z protokołem producenta, który trwa tylko kilka godzin, monitoruj wychwyt fagocytarny za pomocą czytnika płytek lub mikroskopii.</li>
</ol>

<ol><li>Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufmann%2C+SHE+%22The+innate+immune+response+to+infection%22">The innate immune response to infection</a>. , ASM Press. (2004).</li>
<li>Adams, D. O., Hamilton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of macrophage activation.</a> Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).</li>
<li>Fujiwara, N., Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+inflammation.+Current+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+allergy%22%5BJournal%5D)">Macrophages in inflammation. Current drug targets.</a> Inflammation and allergy. 4, 281-286 (2005).</li>
<li>Gordon, S., Martinez, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%3A+mechanism+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages: mechanism and functions.</a> Immunity. 32, 593-604 (2010).</li>
<li>Martinez, F. O., Helming, L., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%3A+an+immunologic+functional+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective.</a> Annual review of immunology. 27, 451-483 (2009).</li>
<li>Fairweather, D., Cihakova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatively+activated+macrophages+in+infection+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity.</a> Journal of autoimmunity. 33, 222-230 (2009).</li>
<li>Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in bacterial infections.</a> Journal of immunology. 181, 3733-3739 (2008).</li>
<li>Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization comes of age.</a> Immunity. 23, 344-346 (2005).</li>
<li>Burke, B., Lewis, C. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurke%2C+B+%22The+macrophage%22">The macrophage</a>. , 2nd edn, Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Lee, G., Santat, L. A., Chang, M. S., Choi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+methodologies+for+the+functional+study+of+signaling+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">RNAi methodologies for the functional study of signaling molecules.</a> PloS one. 4, (2009).</li>
<li>Carralot, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+high-throughput+siRNA+transfection+in+raw+264.7+macrophages%3A+a+case+study+for+optimization+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomolecular+screening%22%5BJournal%5D)">Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure.</a> Journal of biomolecular screening. 14, 151-160 (2009).</li>
<li>Alper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+innate+immunity+genes+and+pathways+using+a+comparative+genomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22ProcNatl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of innate immunity genes and pathways using a comparative genomics approach.</a> ProcNatl Acad Sci USA. 105, 7016-7021 (2008).</li>
<li>De Arras, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+innate+immunity+protein+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bio.+Chem%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved innate immunity protein interaction network.</a> J. Bio. Chem. , 1967-1978 (2013).</li>
<li>Yang, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+regulators+of+the+systemic+response+to+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel regulators of the systemic response to lipopolysaccharide.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 45, 393-402 (2011).</li>
<li>Yang, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+innate+immune+genes+by+transcriptional+profiling+of+macrophages+stimulated+with+TLR+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of novel innate immune genes by transcriptional profiling of macrophages stimulated with TLR ligands.</a> Molecular immunology. 48, 1886-1895 (2011).</li>
<li>Yang, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+genes+that+mediate+innate+immunity+using+inbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of novel genes that mediate innate immunity using inbred mice.</a> Genetics. 183, 1535-1544 (2009).</li>
<li>Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+macrophage+cell+lines+transformed+by+Abelson+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus.</a> Cell. 15, 261-267 (1978).</li>
<li>Ralph, P., Moore, M. A., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysozyme+synthesis+by+established+human+and+murine+histiocytic+lymphoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines.</a> The Journal of experimental medicine. , 1528-1533 (1976).</li>
<li>Zumbansen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+siRNA+library+screening+in+hard-to-transfect+HUVEC+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+RNAi+and+gene+silencing%22%5BJournal%5D)">First siRNA library screening in hard-to-transfect HUVEC cells.</a> Journal of RNAi and gene silencing. 6, 354-360 (2010).</li>
<li>Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS%2FTLR4+signal+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42, 145-151 (2008).</li>
<li>Aliprantis, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+activation+and+apoptosis+by+bacterial+lipoproteins+through+toll-like+receptor-2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2.</a> Science. 285, 736-739 (1999).</li>
<li>Alexopoulou, L., Holt, A. C., Medzhitov, R., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+double-stranded+RNA+and+activation+of+NF-kappaB+by+Toll-like+receptor+3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3.</a> Nature. 413, 732(2001).</li>
<li>Conforti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+effects+of+toll-like+receptor+%28TLR3%29+signaling+in+tumors+can+be+therapeutically+uncoupled+to+optimize+the+anticancer+efficacy+of+TLR3+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Opposing effects of toll-like receptor (TLR3) signaling in tumors can be therapeutically uncoupled to optimize the anticancer efficacy of TLR3 ligands.</a> Cancer Res. 70, 490-500 (2010).</li>
<li>Fernandez-Botran, R., Větvička, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFernandez-Botran%2C+R+%22Methods+in+Cellular+Immunology%22">Methods in Cellular Immunology</a>. 8, CRC Press. 8(2001).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Ten artykuł był sponsorowany przez Lonza, Inc.

Opublikowano liczne badania, w których poszczególne geny były celem siRNA w mysich makrofagach. Podczas gdy transfekcja za pośrednictwem lipidów została wykorzystana do indywidualnego dostarczania siRNA do linii komórkowych makrofagów, metody te mają potencjalny wpływ na żywotność, ograniczony knockdown genu i zmienność między genami. Aby opracować bardziej niezawodne testy, które można by wykorzystać do celowania w geny w sposób średnio- lub wysokoprzepustowy, zoptymalizowaliśmy techniki przy użyciu 96-dołkowego systemu...

W tym protokole opisujemy skuteczne metody hamowania genów w liniach komórkowych makrofagów myszy za pomocą siRNA i monitorujemy wpływ tych zabiegów na wrodzoną odpowiedź immunologiczną. Procedury te są wykonywane w formacie 96-dołkowym, co pozwala na badania przesiewowe RNAi w sposób średnio- lub wysokoprzepustowy.
W odpowiedzi na infekcję, ludzie wywołują natychmiastową wrodzoną odpowiedź immunologiczną i wolniejszą, ale bardziej specyficzną adaptacyjną odpowiedź immunologiczną. Ta szybka wrodzona odpowiedź immunologiczna obejmuje rekrutację i aktywację fagocytarnych wrodzonych komórek odpornościowych, w tym makrofagów1. Klasycznie aktywowane makrofagi biorą udział w ostrych reakcjach zapalnych i wytwarzają białka i związki przeciwdrobnoustrojowe, cytokiny i chemokiny oraz prezentują antygeny2,3. Alternatywnie aktywowane makrofagi odgrywają rolę w regulacji odporności, utrzymywaniu tolerancji, naprawie tkanek i gojeniu się ran4-8. Ze względu na szeroki wachlarz funkcji makrofagi mogą odgrywać rolę w wielu chorobach, w tym miażdżycy, zapaleniu stawów i rakach9. W związku z tym badanie makrofagów jest od pewnego czasu kluczowym obszarem badań w wielu różnych dziedzinach chorób.
Pomimo ich znaczenia we wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, makrofagi mogą być wyzwaniem dla komórek. W szczególności trudno jest uzyskać skuteczną transfekcję przy użyciu odczynników lipidowych w makrofagach bez związanej z tym toksyczności10,11. Co więcej, nawet jeśli siRNA jest skutecznie dostarczane do makrofagów, wytrzymałość genów wywołanych przez RNAi często może być dość umiarkowana i może się różnić w zależności od genu.
Aby sprostać tym technicznym wyzwaniom, zoptymalizowaliśmy techniki transfekcji i knockdownu12-16 w dwóch liniach komórkowych makrofagów myszy, RAW264.717 i J774A.118. Podejście to wykorzystuje do transfekcji 96-dołkowy system wahadłowy Amaxa Nucleofector Shuttle System; System ten wykorzystuje kombinację specjalistycznych odczynników i elektroporacji do transfekcji komórek w 96-dołkowym formacie19. Po transfekcji opisujemy metody maksymalizacji odzysku i żywotności komórek oraz maksymalizacji późniejszego knockdownu genu wywołanego przez siRNA. Aby zilustrować użyteczność tego podejścia, opisujemy protokół dostarczania siRNA do tych linii komórkowych makrofagów, stymulujemy te komórki lipopolisacharydem (LPS) i monitorujemy wrodzoną odpowiedź immunologiczną na poziomie produkcji kilku cytokin prozapalnych. Dostarczamy przykładowe dane, w których celujemy w rodzinę receptorów Toll-podobnych (TLR), której członkowie wyczuwają LPS i inne wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP), w celu regulacji odporności wrodzonej.

<table><tbody><tr><td>Amaxa nucleofector 96-dołkowy system wahadłowy</td><td>Lonza</td><td>AAM-1001S</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa Amaxa SF 96-dołkowy zestaw nukleofektorów</td><td>Lonza</td><td>V4SC-2096</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 mysia linia komórkowa makrofagów</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 mysia linia komórkowa makrofagów</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td></td></tr><tr><td>siGenome smartpool siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>różni się w zależności od na genie</td><td></td></tr><tr><td>Nieukierunkowana kontrolna pula siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-13-20</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny oligo Block-iT do elektroporacji</td><td>Invitrogen</td><td>13750062</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure E. coli O111:B4 LPS</td><td>Wykaz Laboratoria biologiczne</td><td>421</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoki poziom glukozy</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny (Pen/Strep)</td><td>Fisher</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>Fisher</td><td>07-200-89 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe sterylne płytki z okrągłym dnem (niepowlekane)</td><td>Fisher</td><td>07-200-745</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IL-6 Duoset Zestaw ELISA</td><td>R& D Biosystems</td><td>DY406</td><td></td></tr><tr><td>Mysz TNF&alpha; Zestaw Duoset ELISA</td><td>R& D Biosystems</td><td>DY410</td><td></td></tr><tr><td>Dioctan fluoresceiny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7378</td><td></td></tr><tr><td>Bufor RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania fagocytozy Vybrant</td><td>Invitrogen</td><td>V-6694</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie interferencji rna do zbadania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u makrofagów myszy

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Makrofagi są kluczowymi wrodzonymi komórkami odpornościowymi fagocytarnymi. Kiedy makrofagi napotykają patogen, wytwarzają białka i związki przeciwdrobnoustrojowe, które zabijają patogen, wytwarzają różne cytokiny i chemokiny do rekrutacji i stymulacji innych komórek odpornościowych oraz prezentują antygeny w celu stymulowania adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. W związku z tym możliwość skutecznego manipulowania makrofagami za pomocą technik takich jak interferencja RNA (RNAi) ma kluczowe znaczenie dla naszej zdolności do zbadania tej ważnej wrodzonej komórki odpornościowej. Jednak transfekcja makrofagów może być technicznie trudna i może wykazywać nieefektywny knockdown genów wywołany przez RNAi. W tym protokole opisujemy metody efektywnej transfekcji dwóch linii komórkowych makrofagów myszy (RAW264.7 i J774A.1) za pomocą siRNA przy użyciu 96-dołkowego systemu Amaxa Nucleofector Shuttle System i opisujemy procedury maksymalizujące wpływ siRNA na knockdown genów. Ponadto opisane metody są przystosowane do pracy w formacie 96-dołkowym, co pozwala na prowadzenie badań średnio- i wysokoprzepustowych. Aby zademonstrować użyteczność tego podejścia, opisujemy eksperymenty, które wykorzystują RNAi do hamowania genów regulujących produkcję cytokin indukowaną lipopolisacharydami (LPS).

Aby wykazać skuteczność transfekcji z zastosowaniem tej metody, monitorowano pobieranie siRNA znakowanego FITC przy użyciu cytometru przepływowego (Rysunek 1).
Aby zilustrować użyteczność naszego podejścia w monitorowaniu wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, do linii komórkowej makrofagów RAW264.7 transfektowano siRNA nakierowane na znane geny regulujące odporność wrodzoną, stymulowano komórki LPS, a następnie monitorowano produkcję cytokin prozapalnych IL-6 i TNFα. Różne TLR...

W tym protokole opisujemy metody efektywnej transfekcji linii komórkowych mysich makrofagów za pomocą siRNA za pomocą 96-dołkowego systemu Amaxa Nucleofector Shuttle System, stymulacji makrofagów lipopolisacharydem i monitorowania wpływu na produkcję cytokin zapalnych.

Wykorzystanie interferencji RNA do zbadania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u makrofagów myszy

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie interferencji RNA do zbadania wpływu genów kandydackich na wrodzoną odpowiedź immunologiczną. Aby przeprowadzić te badania na makrofagach mysich, linie komórkowe makrofagów mysich poddaje się trypsynizacji, a następnie łączy z roztworem do transfekcji i odpowiednimi siRNA; tak przygotowaną mieszaninę przenosi się do 96-dołkowej płytki Nucleofect, a do transfekcji siRNA do makrofagów wykorzystuje się system transfekcyjny Maxfect 96-dołkowy. Po inkubacji w pożywce hodowlanej, do transfekowanych makrofagów aplikuje się LPS lub inne aktywatory odporności wrodzonej w celu ich stymulacji. Na koniec przeprowadza się testy ELISA, aby monitorować produkcję cytokin i ocenić wpływ traktowania siRNA na wrodzoną odpowiedź immunologiczną.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z transfekcją za pomocą lipidów jest to, że nasz test jest odporny i może być stosowany do wielu genów w procesach wysokoprzepustowych. Kluczem do tej metody jest praca ze zdrowymi komórkami, delikatne obchodzenie się z nimi oraz efektywne działanie podczas procesu transfekcji. Jak wykażemy, protokół ten wykorzystuje linię komórkową makrofagów mysich RAW 264.7, którą ho

using-rna-interference-to-investigate-innate-immune-response-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wykorzystanie interferencji RNA do zbadania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w makrofagach mysich

Ten film demonstruje test do zbadania zależnej od receptora toll-like (TLR) aktywności czynników transkrypcyjnych: czynnika jądrowego-kappa-B (NF-κB) i białka aktywatora-1 (AP-1) w makrofagach. TLR uruchamiają prozapalną kaskadę sygnalizacyjną po rozpoznaniu wzorców molekularnych związanych z uszkodzeniem (DAMP), aktywując NF-κB i AP-1. Zmodyfikowane makrofagi reporterowe wytwarzają embrionalny enzym fosfatazę alkaliczną (SEAP) po aktywacji NF-κB i AP-1, który jest wykrywany w reakcji...

Test sygnalizacji czynnika transkrypcyjnego NF-&kcy;B/AP-1 zależnego od TLR w makrofagach

Ten film demonstruje test oparty na komórkach reporterowych do badania potencjalnych bioaktywnych nanocząstek, które hamują sygnalizację receptora Toll-podobnego (TLR). Test polega na wprowadzeniu lipopolisacharydów (LPS) zmieszanych z hybrydami nanocząstek peptydu i złota do makrofagów reporterowych eksprymujących białka reporterowe - wydzielaną embrionalną fosfatazę alkaliczną (SEAP) i lucyferazę. Redukcja sygnału TLR indukowanego przez LPS, w którym pośredniczą hybrydy, jest określana przez...

Test do badań przesiewowych bioaktywnych nanocząstek pod kątem hamowania sygnalizacji receptora toll-podobnego

Opisujemy protokół pomiaru produkcji cytokin przeciwwirusowych u myszy zakażonych modelowym herpeswirusem, mysim gamma herpesvirus 68 (γHV68), który jest blisko spokrewniony z ludzkim wirusem opryszczki Kaposiego (KSHV) i wirusem Epsteina-Barr (EBV). Wykorzystując genetycznie zmodyfikowane szczepy myszy i mysie fibroblasty embrionalne (MEF), oceniliśmy produkcję cytokin przeciwwirusowych zarówno in vivo, jak i ex vivo. "Odtwarzając" ekspresję wrodzonych składników odpornościowych w...

Analiza wrodzonej sygnalizacji immunologicznej w unikaniu produkcji cytokin przez wirusa

Opisujemy tutaj prosty protokół izolacji mysich makrofagów otrzewnowych. Po tej procedurze następuje ekstrakcja RNA w celu przeprowadzenia analizy ekspresji genów po stymulacji receptorów Toll-podobnych.

Izolacja mysich makrofagów otrzewnowej w celu przeprowadzenia analizy ekspresji genów po stymulacji receptorów toll-podobnych

Opisujemy wykrywanie aktywacji inflamasomu NLRP3 na bazie komórkowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i barwienia dla aktywnej kaspazy-1 i adaptera, ASC. Przedstawiono test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w celu wykrycia lizy piroptotycznej w skali populacji. Techniki te można dostosować do badania wielu aspektów biologii inflamasomów.

Wykrywanie aktywacji inflamasomu i śmierci komórek piroptotycznych w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Opisujemy metodę użycia superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza pokrytych polietylenoiminą (PEI) do transfekcji makrofagów za pomocą siRNA. Te nanocząstki mogą skutecznie dostarczać siRNA do makrofagów in vitro i in vivo oraz wyciszać ekspresję docelowych genów.

Nanocząstki tlenku żelaza pokryte polietylenopiną jako nośnik do dostarczania małych interferujących RNA do makrofagów in vitro i in vivo

Makrofagi, zwłaszcza makrofagi pierwotne, są trudne do transfekcji, ponieważ specjalizują się w wykrywaniu cząsteczek pochodzenia niewłasnego. Opisujemy protokół, który umożliwia wysoce wydajną transfekcję pierwotnych makrofagów za pomocą mRNA generowanego z matryc DNA, takich jak plazmidy.

Wysoce wydajna transfekcja pierwotnych makrofagów za pomocą mRNA transkrybowanego in vitro

Aby przetestować wpływ chemokiny na rekrutację makrofagów in vivo, do wykrycia ektopowej ekspresji chemokiny użyto całej hybrydyzacji in situ, a do oznaczania makrofagów użyto barwienia immunologicznego. Obrazowanie na żywo wykorzystano do obserwacji migracji makrofagów w czasie rzeczywistym.

Ektopowy model ekspresji chemokiny do badania rekrutacji makrofagów in vivo

Ten protokół dostarcza badaczom szybkiej, pośredniej metody pomiaru aktywności czynnika transkrypcyjnego NF-кB/AP-1 zależnego od TLR w linii komórkowej mysich makrofagów w odpowiedzi na różnorodne powierzchnie polimerowe i zaadsorbowane warstwy białek, które modelują mikrośrodowisko implantu biomateriału.

Test komórek reporterowych makrofagów do zbadania sygnalizacji NF-kB/AP-1 za pośrednictwem receptora toll-podobnego na zaadsorbowanych warstwach białek na powierzchniach polimerowych

Pokazujemy krok po kroku protokół badania funkcji genów w makrofagach rezydujących w tkance otrzewnej in vivo, przy użyciu wektorów lentiwirusowych.

Preparat wektora lentiwirusowego do skutecznej modulacji genów i mikroRNA makrofagów rezydujących w tkankach jamy otrzewnej in vivo u myszy

Poznaj metodę transfekcji siRNA do makrofagów myszy przy użyciu systemu Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle. Technika ta umożliwia badanie wpływu genów na wrodzoną odpowiedź immunologiczną poprzez pomiar produkcji cytokin po stymulacji LPS.

Wykorzystanie interferencji RNA do zbadania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u makrofagów myszy

Przeglądaj więcej filmów