Analiza reakcji przetwarzania RNA przy użyciu systemów bezkomórkowych: 3' końcowe rozszczepienie substratów pre-mRNA in vitro
May 3rd, 2014
RNA polimeraza II syntetyzuje prekursorowy RNA, który wykracza poza koniec 3' dojrzałego mRNA. Koniec dojrzałego RNA jest generowany kotranskrypcyjnie, w miejscu dyktowanym przez sekwencje RNA, poprzez aktywność endonukleazy kompleksu rozszczepienia. Tutaj szczegółowo opisujemy metodę badania reakcji rozszczepienia in vitro.
Ogólnym celem tej procedury jest pomyślne zbadanie trzech głównych warstw rozszczepienia mRNA in vitro. Osiąga się to poprzez najpierw wykonanie transkrypcyjnie aktywnego ekstraktu jądrowego z komórek hodowanych w zawiesinie. Drugim etapem procedury jest wytworzenie znakowanych radiowo substratów RNA za pomocą transkrypcji in vitro.
Trzecim krokiem jest żelowe oczyszczenie znakowanych substratów RNA. Ostatnim krokiem jest złożenie reakcji rozszczepienia, w tym ekstraktu jądrowego i znakowanego substratu RNA. Ostatecznie wyniki mogą wykazać trzy podstawowe mRNA, rozszczepione substraty UNC i rozszczepiony produkt za pomocą pionowej radioaktywnej elektroforezy żelowej.
Wizualna demonstracja tej metody jest ważna, mimo że jest wykonywana od 1980 roku, nie jest łatwa do wykonania, ponieważ w trakcie procedury występuje wiele specyficznych kroków, które są trudne. Mają umyte komórki, granulowane i gotowe do lizy. Aby rozpocząć ten protokół do osadu komórkowego, dodaj bufor ze świeżym naziemną telekoalizją.
Dodać pięć objętości szacowanego CPV i za pomocą pipety rozbić osad i pozostawić zawiesinę do ostygnięcia na lodzie. Po 10 minutach odwiruj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza w kołyszącym się wiadrze. Odwirować ostrożnie odessać z supernatantu.
Granulka wchłonie trochę roztworu i pęcznieje. Następnie dodać jeden CPV buforu A i delikatnie rozdrobnić osad końcówką pipety. Wlać zawiesinę do schłodzonego homogenizatora i za pomocą pięciu do 12 pociągnięć ciasnym tłuczkiem zmylić komórki.
Usuń małą porcję, nałóż błękit trianowy i sprawdź komórki, aby określić kompletność ich lizy. W razie potrzeby kontynuuj homogenizację komórek, aż zostaną zlizowane w 90%, ale nie przesadzaj. Teraz przenieś lizat do ultra przezroczystej probówki ultrawirówkowej.
Nagraj całkowitą głośność i zakręć nią tak, jak wcześniej. Odessać mętny supernatant i zapisać go na lodzie. A do analizy cytozolu należy uważać, aby nie naruszyć osadu.
Zawiera jądra. Następnie wiruj pellet na wysokich obrotach przez 15 minut. Usuń niewielką objętość pozostałego supernatantu i połącz ją ze zbiorem cytozolu.
Następnie należy określić objętość jądrową PACT. Dodać do osadu objętość odpowiadającą buforowi C. Następnie usunąć osad za pomocą pipety w czystym homogenizatorze.
Użyj od pięciu do 10 mocnych pociągnięć tłuczkiem, aby zreusować. Zawiesić pellet. Przenieść homogenat do schłodzonej probówki i mieszać przez odwrócenie przez 30 minut.
W temperaturze czterech stopni Celsjusza można użyć płytki mieszającej. Jeśli objętość jest wystarczająco duża, przenieś lizat do probówki ultrawirówkowej UltraClear i w temperaturze czterech stopni Celsjusza odwiruj go przez 30 minut. Przy masie około 25 000 g supernatant jest ekstraktem jądrowym.
Postępując zgodnie z protokołem tekstowym, zakończ dializę od zaledwie jednego mikrograma matrycy. Przygotować sondę przez transkrypcję in vitro przy użyciu zestawu z promotorem kompatybilnym z SP six lub T seven. Podczas ładowania strony użyj trzech mikrolitrów markera i wszystkich 25 mikrolitrów reakcji na każdy substrat RNA.
Zapobiegaj również zanieczyszczeniu krzyżowemu, oddzielając pasy transkrypcji o podobnej wielkości. Uruchom żel tak, aby sonda nukleotydowa o mocy 600 watów działała z mocą 25 watów przez około dwie godziny później. Aby zaznaczyć położenie opasek żelowych, oświetl naświetloną folię lightboxem i połóż owinięty żel na wierzchu.
Wyrównaj marker auto rad i naświetlony marker na folii. A następnie zaznacz lokalizacje opasek czarnym markerem, aby usunąć opaski Rozpakuj żel. Za pomocą czystego ostrza wytnij pasmowe odcinki żelu, przenieś każdą sekcję do własnej probówki i wymyj RNA zgodnie ze standardowymi procedurami.
Po przygotowaniu wszystkich odczynników podgrzej znakowane RNA do 80 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Następnie przenieś RNA do wiru lodowego, 10% PVA, a następnie wiruj go z dużą prędkością przez kilka minut, aby usunąć pęcherzyki, a następnie przystąp do tworzenia mieszanek wzorcowych dla każdej reakcji. Do każdej reakcji dozować 5,25 mikrolitra mieszanki głównej jeden.
Następnie dodaj 6,25 mikrolitra mieszanki ekstraktu jądrowego. Następnie dodaj mikrolitr znakowanego substratu RNA rozcieńczonego do 50 anomolowców. Każda reakcja wykorzystuje mniej niż pięć anomolowców znakowanych RNA.
Teraz delikatnie odwiruj i szybko odkręć mieszaniny reakcyjne. Pozwól, aby reakcja zachodziła do dwóch godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Uwzględnienie przebiegu reakcji w czasie zapewni najlepsze wyniki Po użyciu proteinazy K do trawienia białka w reakcji, a następnie oczyszczania reakcji Stosując metodę chloroformu fenolowego, uruchom produkty na 6% załadowaniu strony, trzy mikrolitry markera lub pięć mikrolitrów na produkt reakcji na pas.
Następnie uruchom żel, a później ostrożnie zdemontuj aparat żelowy. Aby zebrać żel, mocno dociśnij do niego bibułę filtracyjną i odwróć ją. Mocno dociśnij szkło, aby upewnić się, że żel jest całkowicie uchwycony przez papier.
Następnie powoli odklej bibułę filtracyjną z dołączonym żelem. Owiń odsłoniętą stronę żelu folią w folię i przyklej folię do bibuły filtracyjnej po drugiej stronie. Na koniec umieść żel w suszarce na 15 minut z bibułą filtracyjną skierowaną w stronę próżni.
Później przeanalizuj żel, wystawiając go na działanie kamery filmowej lub fosfonowej. Rozszczepiony. Substrat RNA jest najwolniej migrującym pasmem w górnej części żelu.
Konkretny rozszczepiony produkt oznaczony pogrubioną strzałką, szybciej biegnie w żelu przy oczekiwanym rozmiarze. Produkt ten jest nieobecny w kontroli z mutacją punktową w sekwencji pyłkowej. Kwantyfikację aktywności rozszczepienia określono za pomocą wykresu metrycznego DS.
Porównując stosunek rozszczepionego do rozszczepionego, RNA, znormalizowany do kontroli rozszczepionego RNA. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak test poliadenylacji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak aktywność polimerazy poliA. Test ten odbywa się poprzez zmianę warunków reakcji, takich jak dodanie magnezu i usunięcie EDTA.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie koncentruje się na badaniu cięcia trzech pierwszych mRNA in vitro, kluczowym procesie w dojrzewaniu RNA. Metoda polega na użyciu transkrypcjalnie aktywnego wyciągu z jądra komórkowego i radioaktywnie oznaczonych substratów RNA do analizy reakcji cięcia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia RNA
- Biologia molekularna
- Biochemia
Tło
- RNA polimeraza II syntetyzuje prekursory RNA, które rozciągają się poza końcem 3' dojrzałego mRNA.
- Kompleks cięcia określa miejsce generacji dojrzałego RNA.
- Procesy kotranskrypcyjne są niezbędne dla dojrzewania RNA.
- Rozumienie reakcji cięcia może dostarczyć wgląd w mechanizmy przetwarzania RNA.
Cel badania
- Zbadanie cięcia trzech pierwszych mRNA in vitro.
- Zrozumienie roli wyciągów z jądra komórkowego w przetwarzaniu RNA.
- Analiza produktów reakcji cięcia za pomocą elektroforezy na żelu.
Zastosowane metody
- Przygotowanie transkrypcjalnie aktywnego wyciągu z jądra komórkowego z komórek hodowanych w zawiesinie.
- Synteza radioaktywnie oznaczonych substratów RNA poprzez transkrypcję in vitro.
- Oczyszczanie żelowe oznaczonych substratów RNA.
- Montaż reakcji cięcia z wyciągiem z jądra komórkowego i oznaczonymi substratami RNA.
Główne wyniki
- Zaobserwowano pomyślne cięcie trzech pierwszych substratów mRNA.
- Wyniki zostały przeanalizowane za pomocą pionowej elektroforezy na żelu radioaktywnym.
- Zidentyfikowano niepocięte i pocięte substraty UNC oraz produkty cięcia.
- Metodologia zapewnia ramy dla badania reakcji cięcia RNA.
Wnioski
- To badanie opisuje niezawodną metodę badania cięcia mRNA in vitro.
- Rozumienie mechanizmów cięcia może zwiększyć wiedzę o przetwarzaniu RNA.
- Wyniki wnoszą wkład do szerszej dziedziny biologii RNA.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding RNA 3' end processing is critical for target validation in RNA-based therapeutics, where precise transcript maturation influences protein expression levels and functional outcomes. This in vitro cleavage assay enables mechanistic de-risking by isolating the biochemical requirements for accurate pre-mRNA processing, supporting predictive confidence in target engagement. The method provides a quantitative, reproducible system to evaluate how genetic or pharmacological perturbations affect RNA stability and function, informing early discovery decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of RNA processing mechanisms to validate transcript-specific targets involved in gene expression regulation.
- Operational Value: Provides a controlled system to assess how mutations in polyadenylation signals affect cleavage efficiency and RNA stability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of cleavage products to support assay standardization for screening modulators of RNA processing factors.
- Operational Value: Uses gel-based detection to ensure reproducibility and scalability across multiple RNA substrates and experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling by linking RNA processing defects to aberrant transcript isoforms observed in pathological states.
- Operational Value: Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation by defining biochemical thresholds for functional RNA maturation.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, where RNA target validation precedes lead identification and preclinical evaluation by clarifying the functional impact of transcript processing on protein output.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of RNA regulatory elements and mechanistic de-risking of targets involved in mRNA maturation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized substrate preparation and quantitative product detection via gel electrophoresis.
- Analytics: Enables comparison of cleavage efficiency across conditions using normalized product-to-substrate ratios for data-driven target prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical work by defining processing competence as a biomarker for RNA-based therapeutic suitability.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating RNA-targeting modalities across multiple programs and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in RNA target validation by reducing ambiguity in transcript processing mechanisms.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized nuclear extract preparation and labeled substrate quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking RNA processing fidelity to expected protein expression and functional outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying targets with robust, regulatable RNA maturation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, RNA biochemistry, and radioactive labeling techniques.
- Dependent on ultracentrifugation, gel electrophoresis, and autoradiography infrastructure for nuclear extract preparation and product detection.
- Necessitates cross-team standardization of substrate design, reaction conditions, and quantification methods to ensure comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the assay to diverse RNA substrates or disease-relevant systems.
- Limited by the technical complexity of nuclear extract isolation and the need for careful optimization to avoid nonspecific degradation.
