Name: Analiza reakcji przetwarzania RNA przy użyciu systemów bezkomórkowych: 3 końcowe rozszczepienie substratów pre-mRNA in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Poznaj metodę analizy 3' końcowego rozszczepienia pre-mRNA in vitro przy użyciu aktywnych transkrypcyjnie ekstraktów jądrowych i radioznakowanych substratów RNA. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów dojrzewania RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S.V. jest wdzięczny za wsparcie finansowe od K22AI077353 NIH i Fundacji Landenbergera. K.R. z wdzięcznością dziękuje za finansowanie od NIH (5SC1GM083754).

<ol><li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li>
<li>Wahle, E., Ruegsegger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27-End+processing+of+pre-mRNA+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+microbiology+reviews%22%5BJournal%5D)">3'-End processing of pre-mRNA in eukaryotes.</a> FEMS microbiology reviews. 23, 277-295 (1999).</li>
<li>Colgan, D. F., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+regulation+of+mRNA+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanism and regulation of mRNA polyadenylation.</a> Genes Dev. 11, 2755-2766 (1997).</li>
<li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+3%27+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+biology%22%5BJournal%5D)">The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA biology. 9, 563-576 (2012).</li>
<li>Danckwardt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prothrombin+3%27end+formation+signal+reveals+a+unique+architecture+that+is+sensitive+to+thrombophilic+gain-of-function+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The prothrombin 3'end formation signal reveals a unique architecture that is sensitive to thrombophilic gain-of-function mutations.</a> Blood. 104, 428-435 (2004).</li>
<li>Moreira, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+upstream+sequence+element+of+the+C2+complement+poly%28A%29+signal+activates+mRNA+3%27+end+formation+by+two+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The upstream sequence element of the C2 complement poly(A) signal activates mRNA 3' end formation by two distinct mechanisms.</a> Genes Dev. 12, 2522-2534 (1998).</li>
<li>Hall-Pogar, T., Zhang, H., Tian, B., Lutz, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+polyadenylation+of+cyclooxygenase-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Alternative polyadenylation of cyclooxygenase-2.</a> Nucleic Acids Res. 33, 2565-2579 (2005).</li>
<li>Brackenridge, S., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+a+basal+polyadenylation+factor+by+the+upstream+sequence+element+of+the+human+lamin+B2+polyadenylation+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recruitment of a basal polyadenylation factor by the upstream sequence element of the human lamin B2 polyadenylation signal.</a> Molecular and Cellular Biology. 20, 2660-2669 (2000).</li>
<li>Moore, C. L., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+cleavage+and+polyadenylation+of+exogenous+RNA+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Accurate cleavage and polyadenylation of exogenous RNA substrate.</a> Cell. 41, 845-855 (1985).</li>
<li>Gilmartin, G. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGilmartin%2C+GM+%22mRNA+formation+and+function%22">mRNA formation and function</a>. , Academic Press. New York. 79-98 (1997).</li>
<li>Wahle, E., Keller, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWahle%2C+E+%22RNA+Processing.+Vol.+II%22">RNA Processing. Vol. II</a>. , Oxford University Press. 1-34 (1994).</li>
<li>Chabot, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChabot%2C+B+%22RNA+Processing+Vol+I%22">RNA Processing Vol I</a>. 1, Oxford University Press. 1-29 (1994).</li>
<li>Valente, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+mRNA+3%27+end+processing+is+distinctively+regulated+by+eIF3f%2C+CDK11%2C+and+splice+factor+9G8%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 mRNA 3' end processing is distinctively regulated by eIF3f, CDK11, and splice factor 9G8.</a> Mol Cell. 36, 279-289 (2009).</li>
<li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).</li>
<li>Aurup, H., Williams, D. M., Eckstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%27-Fluoro-+and+2%27-amino-2%27-deoxynucleoside+5%27-triphosphates+as+substrates+for+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">2'-Fluoro- and 2'-amino-2'-deoxynucleoside 5'-triphosphates as substrates for T7 RNA polymerase.</a> Biochemistry. 31, 9636-9641 (1992).</li>
<li>Keller, W., Bienroth, S., Lang, K. M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+and+polyadenylation+factor+CPF+specifically+interacts+with+the+pre-mRNA+3%27+processing+signal+AAUAAA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cleavage and polyadenylation factor CPF specifically interacts with the pre-mRNA 3' processing signal AAUAAA.</a> EMBO J. 10, 4241-4249 (1991).</li>
<li>Takagaki, Y., Ryner, L. C., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+factors+are+required+for+3%27-end+cleavage+of+pre-mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Four factors are required for 3'-end cleavage of pre-mRNAs.</a> Genes Dev. 3, 1711-1724 (1989).</li>
<li>Takagaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multisubunit+factor%2C+CstF%2C+is+required+for+polyadenylation+of+mammalian+pre-mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A multisubunit factor, CstF, is required for polyadenylation of mammalian pre-mRNAs.</a> Genes Dev. 4, 2112-2120 (1990).</li>
<li>Ruegsegger, U., Blank, D., Keller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pre-mRNA+cleavage+factor+Im+is+related+to+spliceosomal+SR+proteins+and+can+be+reconstituted+in+vitro+from+recombinant+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Human pre-mRNA cleavage factor Im is related to spliceosomal SR proteins and can be reconstituted in vitro from recombinant subunits.</a> Mol Cell. 1, 243-253 (1998).</li>
<li>Vries, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pre-mRNA+cleavage+factor+II%28m%29+contains+homologs+of+yeast+proteins+and+bridges+two+other+cleavage+factors%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Human pre-mRNA cleavage factor II(m) contains homologs of yeast proteins and bridges two other cleavage factors.</a> EMBO J. 19, 5895-5904 (2000).</li>
<li>Gilmartin, G. M., Nevins, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ordered+pathway+of+assembly+of+components+required+for+polyadenylation+site+recognition+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">An ordered pathway of assembly of components required for polyadenylation site recognition and processing.</a> Genes Dev. 3, 2180-2190 (1989).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3%27+processing+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Mol Cell. 33, 365-376 (2009).</li>
<li>Bentley, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rules+of+engagement%3A+co-transcriptional+recruitment+of+pre-mRNA+processing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rules of engagement: co-transcriptional recruitment of pre-mRNA processing factors.</a> Curr Opin Cell Biol. 17, 251-256 (2005).</li>
<li>Tian, B., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+cleavage+and+polyadenylation%3A+the+long+and+short+of+it%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Alternative cleavage and polyadenylation: the long and short of it.</a> Trends Biochem Sci. 38, 312-320 (2013).</li>
<li>Ryner, L. C., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+accurate+and+efficient+mRNA+3%27+end+cleavage+and+polyadenylation+of+a+simian+virus+40+early+pre-RNA+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Requirements for accurate and efficient mRNA 3' end cleavage and polyadenylation of a simian virus 40 early pre-RNA in vitro.</a> Molecular and Cellular Biology. 7, 495-503 (1987).</li>
<li>Hirose, Y., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+phosphate%2C+not+ATP%2C+is+required+for+3%27+end+cleavage+of+mammalian+pre-mRNA+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Creatine phosphate, not ATP, is required for 3' end cleavage of mammalian pre-mRNA in vitro.</a> J Biol Chem. 272, 29636-29642 (1997).</li>
<li>Ryan, K., Khleborodova, A., Pan, J., Ryan, X. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+activators+of+pre-mRNA+3%27+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Small molecule activators of pre-mRNA 3' cleavage.</a> RNA. 15, 483-492 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Reakcja rozszczepienia pre-mRNA 3' in vitro , przeprowadzona w ekstraktach jądrowych komórek HeLa lub z czynnikami rozszczepienia frakcjonowanymi z tych ekstraktów, umożliwiła identyfikację podstawowych czynników rozszczepienia i ich głównych kompleksów16-21. Ostatnio zidentyfikowano znacznie więcej białek związanych z tymi czynnikami22, a reakcja in vitro może nadal rzucać światło na to, w jaki sposób te białka przyczyniają się do reakcji. Być może dlatego, że reakcja in vivo ...

Biosynteza najbardziej dojrzałych eukariotycznych wiadomości RNA (mRNA) wymaga kilku modyfikacji potranskrypcyjnych, takich jak capping, splicing i poliadenylacja. Modyfikacje te są na ogół sprzężone w celu zapewnienia prawidłowego przetwarzania1 i znacznego zwiększenia stabilności mRNA.
Formacja końca 3' pre-mRNA ssaków jest generowana przez endonukleolityczne rozszczepienie powstającego RNA, po którym następuje dodanie reszt adenylanowych do produktu rozszczepionego 5' przez polimerazę poli(A) (PAP)2-4. U ssaków rozszczepienie odbywa się za pomocą wieloskładnikowego kompleksu białkowego o masie około 800 kDa, który gromadzi się w określonych sekwencjach pre-RNA. Sekwencja sygnałowa poli(A), wysoce konserwatywna kanoniczna sekwencja heksanukleotydowa AAUAAA, kieruje miejsce rozszczepienia na około 10-30 nt w dół. To miejsce jest specyficznie rozpoznawane przez czynnik specyficzności rozszczepienia i poliadenylacji (CPSF), a podjednostka 73 kD CSPF zawiera aktywność endonukleazy. Czynnik stymulacji rozszczepienia (CstF) wiąże bardziej zdegenerowaną sekwencję pierwiastków bogatych w Gu lub U za miejscem poli(A). Do rozszczepienia wymagany jest również czynnik rozszczepienia ssaków I (CFIm) oraz czynnik rozszczepienia ssaków II (CFII). CFIm wiąże specyficzne miejsca UGUA(N) w elementach sekwencji (USEs), które zostały zdefiniowane dla wielu genów i wydają się być zaangażowane w ważne procesy fizjologiczne5-8.
In vitro, reakcje przetwarzania RNA są często analizowane przy użyciu radioznakowanych substratów RNA9-12. Mogą one być syntetyzowane przez transkrypcję odpływową z promotora bakteriofaga T7 lub SP6. Podczas badania miejsca poliadenylacji, które nie zostało wcześniej scharakteryzowane, konieczne jest użycie genomowego DNA, a nie cDNA, do wygenerowania substratu RNA, ponieważ ważne sekwencje dalsze mogą nie być obecne w cDNA. Zaprojektuj substraty tak, aby zawierały co najmniej 150 nt przed i 50 nt za miejscem rozszczepienia/końcem dojrzałego mRNA. Produkt łupliwości migruje szybciej niż podłoże; Ponieważ jednak inne fragmenty mogą być generowane przez niespecyficzne działanie nukleazy, specyficzność reakcji musi być weryfikowana przez jej zależność od prawidłowych sekwencji sygnałów przetwarzania. Dlatego substraty RNA z mutacją punktową w sekwencji AAUAAA (np. AAGAAA) służą jako negatywna kontrola reakcji rozszczepienia.
Biorąc pod uwagę, że niewielka ilość radioznakowanego RNA jest używana do reakcji rozszczepienia, RNazy obecne w dużej obfitości w większości ekstraktów jądrowych mogą być problematyczne i ograniczać wybór materiału wyjściowego do przygotowania ekstraktu. Komórki HeLa mają tendencję do zawierania niskich poziomów endogennych RNaz, a zatem dobrze radzą sobie w tych testach.
Endonukleolityczne rozszczepienie substratów RNA in vivo i in vitro następuje bezpośrednio po addycji poli(A), więc rozszczepiony produkt pośredni nie występuje w wykrywalnych ilościach. Dlatego, aby zbadać określoną sekwencję RNA lub białka biorące udział w reakcji rozszczepienia, przeprowadza się eksperymenty w warunkach, które uniemożliwiają wystąpienie poliadenylacji. Nie ma zależności rozszczepienia od poliadenylacji i odwrotnie, więc można zatrzymać poliadenylację bez szkody dla reakcji rozszczepienia. W ten sposób ATP jest zastępowany analogiem kończącym łańcuch, który nie ma grupy hydroksylowej 3', dzięki czemu tylko pojedynczy nukleotyd może zostać włączony w miejscu poli(A) i można wykryć tylko rozszczepiony RNA.
Biorąc pod uwagę złożoność i wysoki stopień szczegółowości tego typu testów, opisujemy szczegółowy protokół wideo do badania rozszczepienia endonukleolitycznego przez maszynerię rozszczepienia/Poly(A) prekursorów mRNA in vitro. Opisujemy, jak przygotować kompetentne ekstrakty jądrowe, wygenerować znakowane radioaktywnie substraty RNA, przeprowadzić reakcję rozszczepienia oraz przeanalizować i zinterpretować otrzymane produkty. Rysunek 1 przedstawia przykład substratowych RNA kodujących koniec 3' pre-mRNA HIV-1, które mają być użyte do testu rozszczepienia. Koniec 3' genomu RNA HIV składa się z wielu ważnych sekwencji regulatorowych, takich jak miejsce poli(A), region bogaty w G + U i element USE, które są niezbędne do wydajnego dojrzewania wirusowych transkryptów mRNA13. W tym przykładzie spodziewalibyśmy się, że wejściowy substrat RNA będzie wynosił 338 nt, a po rozszczepieniu 237 nt. Gdyby dopuszczono do wystąpienia poliadenylacji, zaobserwowano by rozmaz produktów między 237 a 437 nt.

<table><tbody><tr><td>Kolba 1 L Celstir</td><td>Wheaton</td><td>356884</td><td>Dostępne różne rozmiary</td></tr><tr><td>4-pozycyjne mieszadło wolnoobrotowe</td><td>VWR</td><td>12621-076</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka kubełkowa wahadłowa</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Allegra x-15R z wirnikiem SX4500</td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Optima L-100 XP Ultra z wirnikiem SW41 Wirówka</td></tr><tr><td>stołowa 5417R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Termomikser w lodówce</td></tr><tr><td>inkubator</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml probówki stożkowe</td><td>Corning</td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki stożkowe</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Ultraclear probówki wirówkowe</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>JOKLIK modyfikowany MEM</td><td>Lonza</td><td>04-719Q</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Atlas</td><td>F-0500-A</td><td>Inaktywowana termicznie</td></tr><tr><td>L-glut:pen:strep</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-110</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 8,0</td><td>Mediatech</td><td>46-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>MP Biomedicals</td><td>194844</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Alexis Biomedicals</td><td>280-001-G-010</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>5 M roztwór chlorku sodu</td><td>Mediatech</td><td>46-032-CV</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M roztwór</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889-100ml</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>Fisher</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Kompletne tabletki koktajlowe z inhibitorem proteazy bez EDTA</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw kaset dializacyjnych Slide-A-Lyzer</td><td>Thermo Scientific</td><td>66372</td><td>MWCO 7,000 0,5 ml-3 ml</td></tr><tr><td>15 ml Zestaw młynków do tkanek Dounce</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9938-1SET</td><td>Dostępne</td></tr> <tr><td>różne rozmiaryRozwiń zestaw do PCR o wysokiej wierności</td><td>Roche</td><td>11 732 650 001</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix</td><td>Invitrogen</td><td>Y02256</td><td>10 mM każdy nukleotyd</td></tr><tr><td>Zestaw MaxiScript SP6/T7</td><td>Ambion</td><td>AM1322</td><td></td></tr><tr><td>m7G(5')ppp(5') G Czapeczka RNA</td><td>New England Biolabs</td><td>S1404S</td><td></td></tr><tr><td>Century Marker Template Plus</td><td>Ambion</td><td>AM7782</td><td></td></tr><tr><td>Easytides UTP [&alpha;-32P] 250 &mu; Ci</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU507H250UC</td><td></td></tr><tr><td>Bufor ładujący żel II</td><td>Ambion</td><td>8546G</td><td></td></tr><tr><td>DEPC woda uzdatniona</td><td>Ambion</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>10x TAE</td><td>Fisher</td><td>BP13354</td><td></td></tr><tr><td>10x</td><td>TBE Ameresco Life Sciences</td><td>0658-4L</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Fisher</td><td>BP169-212</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher</td><td>BP150-20</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Fisher</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>40% 19:1 akrylamid: bis-akryloamid</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0144</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>Roche</td><td>10 901 393 001</td><td></td></tr><tr><td>100% absolutny etanol 200 dowód</td><td>Acros</td><td>61509-0040</td><td></td></tr><tr><td>Kwaśny fenol: chloroform</td><td>Ambion</td><td>9720</td><td>Do</td></tr><tr><td>płynu do scyntylacji</td> RNA <td>Fisher</td><td>SX18-4</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor rnazy</td><td>Promega</td><td>N261B</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol poliwinylowy - PVA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136-250G</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan kreatyny</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dATP</td><td>Fisher</td><td>BP2560-4</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Acros</td><td>23042-5000</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Fisher</td><td>BP1700-100</td><td></td></tr><tr><td>Regulowana jednostka sekwencjonująca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z351881-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Spinacze do segregatorów</td><td>Office Depot</td><td>838-056</td><td></td></tr><tr><td>Talerze szklane 20 cm x 42 cm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z352543</td><td>1 ZESTAW</td></tr><tr><td>Talerze szklane 20 cm x 22 cm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z35252-7</td><td>1 ZESTAW</td></tr><tr><td>20 cm x 42 cm aluminiowe płyty chłodzące</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z352667</td><td>1 EA</td></tr><tr><td>Przekładki 0,4 mm x 22 cm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z35230-6</td><td>1 ZESTAW</td></tr><tr><td>dystanse 0,4 mm x 42 cm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z352314-1</td><td>1 ZESTAW</td></tr><tr><td>grzebień 8-dołkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z35195-4</td><td>1 EA</td></tr><tr><td>Grzebień 16-dołkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z351962</td><td>1 EA</td></tr><tr><td>Grzebień 32-dołkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z351970</td><td>1</td></tr><tr><td>EA Żelowa powłoka odstraszająca</td><td>C.B.S. Scientific</td><td>SGR-0401</td><td>lub SGR-0101 do indywidualnej butelki</td></tr><tr><td>Końcówki do ładowania żelem</td><td>Rainin</td><td>GT-10-4</td><td>0,1-10 &mu; l</td></tr><tr><td>Sekwencjonowanie PowerPac HV</td><td>Bio-Rad</td><td>PowerPac HV</td><td>5,000 V/500 mA/400 W</td></tr><tr><td>Suszarka żelowa Model 583</td><td>Bio-Rad</td><td>Model 583</td><td></td></tr><tr><td>Hydrotech pompa próżniowa do suszarki żelowej</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glogos II Markery świecące w ciemności</td><td>Agilent</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Film 8 x 10</td><td>Folia Midsci</td><td>BX810</td><td></td></tr><tr><td>14 x 17</td><td>Phenix</td><td>F-BX1417</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta autoradiograficzna</td><td>Fisher</td><td>FBCA 1417</td><td>dostępny rozmiar 8 x 10</td></tr></tbody></table>

analiza reakcji przetwarzania rna przy użyciu systemów bezkomórkowych: 3' końcowe rozszczepienie substratów pre-mrna in vitro

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

Koniec 3' mRNA ssaków nie powstaje w wyniku nagłego zakończenia transkrypcji przez polimerazę RNA II (RNPII). Zamiast tego RNPII syntetyzuje prekursorowe mRNA poza końcem dojrzałych RNA, a aktywny proces aktywności endonukleazy jest wymagany w określonym miejscu. Rozszczepienie prekursorowego RNA zwykle następuje 10-30 nt poniżej miejsca konsensusu poliA (AAUAAAA) po dinukleotydach CA. Białka z kompleksu rozszczepienia, wieloczynnikowego kompleksu białkowego o masie około 800 kDa, osiągają tę specyficzną aktywność nukleazy. Specyficzne sekwencje RNA przed i za miejscem poliA kontrolują rekrutację kompleksu rozszczepienia. Bezpośrednio po rozszczepieniu pre-mRNA są poliadenylowane przez polimerazę poliA (PAP) w celu wytworzenia dojrzałych stabilnych wiadomości RNA.
Przetwarzanie końca 3' transkryptu RNA może być badane przy użyciu komórkowych ekstraktów jądrowych z określonymi radioznakowanymi substratami RNA. Podsumowując, długi, nienaruszony prekursor RNA znakowany 32P inkubuje się z ekstraktami jądrowymi in vitro, a rozszczepienie ocenia się za pomocą elektroforezy żelowej i autoradiografii. Gdy nastąpi prawidłowe rozszczepienie, wykrywa się i określa ilościowo krótszy 5-stopowy rozszczepiony produkt. W tym miejscu szczegółowo opisujemy test rozszczepienia, używając jako przykładu przetwarzania 3' końca mRNA HIV-1.

Reprezentatywne wyniki testu cięcia miejsc poli(A) RNA wirusa HIV-1 (Rysunek 2). Możemy zaobserwować nieprzecięty substrat RNA, który jest wolniej migrującym prążkiem na górze żelu. Specyficzny produkt cięcia to najbardziej intensywny prążek krótszego fragmentu, który migruje szybciej w żelu w oczekiwanym rozmiarze i jest specyficznie nieobecny w teście cięcia kontroli mutpoly(A), która zawiera mutację punktową w sekwencji polyA (mutPolyA) substratu RNA. Czasami mogą być obserwowane produkty degradacji s...

RNA polimeraza II syntetyzuje prekursorowy RNA, który wykracza poza koniec 3' dojrzałego mRNA. Koniec dojrzałego RNA jest generowany kotranskrypcyjnie, w miejscu dyktowanym przez sekwencje RNA, poprzez aktywność endonukleazy kompleksu rozszczepienia. Tutaj szczegółowo opisujemy metodę badania reakcji rozszczepienia in vitro.

Analiza reakcji przetwarzania RNA przy użyciu systemów bezkomórkowych: 3' końcowe rozszczepienie substratów pre-mRNA in vitro

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomyślne zbadanie cięcia mRNA przez trzy prime in vitro. Jest to realizowane poprzez wcześniejsze przygotowanie transkrypcyjnie aktywnego ekstraktu jądrowego z komórek hodowanych w zawiesinie. Drugim krokiem procedury jest otrzymanie znakowanych izotopowo podłoży RNA poprzez transkrypcję in vitro.Trzecim krokiem jest oczyszczanie żelowe znakowanych substratów RNA. Ostatnim etapem jest przygotowanie reakcji cięcia, z wykorzystaniem ekstraktu jądrowego i znakowanego substratu RNA. Ostatecznie, w wyniku wertykalnej radioaktywnej elektroforezy żelowej, można uzyskać trzy formy mRNA, nieprzecięte substraty UNC oraz produkt cięcia.Wizualna demonstracja tej metody jest istotna; mimo że jest ona stosowana od lat 80., jej wykonanie nie jest proste, ponieważ procedura obejmuje wiele specyficznych i wymagających kroków. Przygotuj przemyte i odwirowane komórki, gotowe do lizy. Aby rozpocząć protokół, do osadu komórkowego dodaj bufor ze świeżym DTT.Dodaj pięć objętości szacowanego CPV i za pomocą pipety rozbij osad, a następnie pozostaw zawiesinę do schłodzenia na lodzie. Po 10 minutach odwiruj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wirówce z koszykiem wahadłowym. Ostrożnie odessij supernatant z probówki po wirowaniu.Osad wchłonie część roztworu i zwiększy swoją objętość. Następnie należy dodać jedną objętość CPV buforu A i delikatnie rozbić osad za pomocą końcówki pipety. Zawiesinę należy przelać do schłodzonego homogenizatora i rozbić komórki, wykonując od pięciu do 12 ruchów dopasowanym tłuczkiem.Pobierz małą alikwot, dodaj błękit trypanu i sprawdź komórki, aby ocenić stopień ich lizy. W razie potrzeby kontynuuj homogenizację komórek, aż zostaną zlizowane w 90%, unikając jednak nadmiernego przetwarzania. Następnie przenieś lizat do rurki do ultracentryfugi typu ultra clear.Zapisz całkowitą objętość i odwirowaj próbkę w sposób opisany wcześniej. Odessaj mętny supernatant i przechowuj go w lodzie. W przypadku analizy cytozolu należy uważać, aby nie naruszyć osadu.Zawiera ona jądra komórkowe. Następnie wirować osad z dużą prędkością przez 15 minut. Usunąć niewielką objętość pozostałego supernatantu i połączyć go z zebranym cytosolem.Następnie określ objętość jąder PACT. Do osadu dodaj objętość buforu C równą objętości osadu. Następnie rozbij osad za pomocą pipety w czystym homogenizatorze kolumnowym.Wykonaj od pięciu do 10 energicznych ruchów tłuczkiem, aby resuspenderć osad. Przenieś homogenat do schłodzonej probówki i mieszaj przez 30 minut poprzez odwracanie.W temperaturze 4 °C można zastosować mieszadło magnetyczne. Jeśli objętość jest wystarczająco duża, należy przenieść lizat do probówki do ultracentryfugi UltraClear i wirować go przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przy prędkości około 25 000 ×g nadpływ stanowi ekstrakt jądrowy.Postępując zgodnie z protokołem tekstowym, przeprowadź dializę z użyciem zaledwie jednego mikrograma matrycy. Przygotuj sondę poprzez transkrypcję in vitro, wykorzystując zestaw z promotorem kompatybilnym z SP6 lub T7. Podczas nakładania na żel, użyj trzech mikrolitrów markera oraz całej objętości reakcji wynoszącej 25 mikrolitrów dla każdego substratu RNA.Należy również zapobiec kontaminacji krzyżowej poprzez zachowanie odstępów między ścieżkami dla transkryptów o podobnej wielkości. Przeprowadź elektroforezę w taki sposób, aby sonda o długości 600 nukleotydów wędrowała przy mocy 25 W przez około dwie godziny. Aby zaznaczyć położenie prążków żelowych, naświetl naświetlony film na podświetlaczu i połóż na nim zawinięty żel.Zrównaj marker auto rad i marker naświetlony na kliszy. Następnie zaznacz czarnym markerem położenie prążków w celu ich usunięcia. Rozwiń żel i za pomocą czystego ostrza wytnij sekcje żelu zawierające prążki. Przenieś każdą sekcję do oddzielnej probówki i eluuj RNA zgodnie ze standardowymi procedurami.Po przygotowaniu wszystkich odczynników RNA z etykietą należy podgrzać do 80 °C przez dwie minuty. Następnie RNA należy przenieść na lód, wymieszać w wortexie z 10% PVA, a następnie wirować z dużą prędkością przez kilka minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza; po tym kroku należy przystąpić do przygotowania mieszanin głównych (master mixów) dla każdej reakcji. Do każdej reakcji należy odpipecieować 5,25 µL mieszaniny głównej nr 1.Następnie dodaj 6,25 µL mieszaniny ekstraktu jądrowego. Następnie dodaj 1 µL znakowanego podłoża RNA rozcieńczonego do stężenia końcowego 50 amM. Każda reakcja wykorzystuje mniej niż 5 amM znakowanego RNA.Następnie delikatnie wymieszaj mieszaniny reakcyjne w wirówce typu vortex i szybko je odwiruj. Pozostaw reakcję do przebiegu na maksymalnie dwie godziny w temperaturze 30 °C. Najlepsze wyniki uzyskasz, wykonując analizę kinetyki reakcji. Po strawieniu białek w mieszaninie reakcyjnej za pomocą proteinazy K i oczyszczeniu produktów metodą fenolo-chloroformową, rozdziel produkty w żelu PAGE o stężeniu 6%. Na każdą ścieżkę nałóż 3 µL markera lub 5 µL produktu reakcji.Następnie przeprowadź elektroforezę, a po jej zakończeniu ostrożnie rozmontuj aparat do elektroforezy. Aby zebrać żel, mocno dociśnij do niego papier filtracyjny, a następnie go odwróć. Mocno dociśnij szkło, aby upewnić się, że żel został w całości przyczepiony do papieru.Następnie powoli odklej papier filtrujący wraz z przytwierdzonym do niego żelem. Owiń odsłoniętą stronę żelu folią plastikową i przymocuj folię taśmą do papieru filtrującego po drugiej stronie. Na koniec umieść żel w suszarce na 15 minut, kierując stronę z papierem filtrującym w stronę próżni.Następnie przeanalizuj żel, eksponując go na film lub obrazowacz fosforyzacyjny (phospho imager). Rozszczepiony substrat RNA stanowi prążek o najwolniejszej migracji, znajdujący się w górnej części żelu.Specyficzny produkt cięcia zaznaczony pogrubioną strzałką przesuwa się w żelu szybciej, osiągając oczekiwaną wielkość. Produkt ten nie występuje w kontroli z mutacją punktową w sekwencji pollier. Ilościowe oznaczenie aktywności cięcia określono za pomocą wykresu metrycznego DS.Porównanie stosunku RNA ciętego do nieciętego, znormalizowane do kontroli RNA ciętego. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak test poliadenlylowania, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. dotyczące aktywności polimerazy polyA. Test ten przeprowadza się poprzez zmianę warunków reakcji, takich jak dodanie magnezu i usunięcie EDTA.

analysis-rna-processing-reactions-using-cell-free-systems-3-end

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza reakcji przetwarzania RNA przy użyciu systemów wolnych od komórek: Przecinanie końca 3' substratów pre-mRNA in vitro

W niniejszym artykule opisujemy prostą metodę izolacji pojedynczych komórek z pierwotnych kultur neuronalnych szczura oraz późniejszą analizę transkryptomu z wykorzystaniem amplifikacji aRNA. Metoda ta może zostać zastosowana do każdego typu komórek.

Analiza transkryptomu pojedynczych komórek

Systemy CRISPR/Cas pośredniczą w odporności adaptacyjnej u bakterii i archeonów. Przypuszcza się, że wiele białek Cas pełni funkcję endorybonukleaz działających na prekursory crRNA o różnej długości. W niniejszej pracy przedstawiamy trzy różne podejścia do generowania substratów pre-crRNA na potrzeby analizy biochemicznej aktywności endonukleazy Cas.

Generowanie substratów dla endonukleaz systemów CRISPR/Cas

Opisujemy tutaj metodę rozszerzania startera opartą na fluorescencji, aby określić punkty początkowe transkrypcji na podstawie bakteryjnych transkryptów i przetwarzania RNA in vivo za pomocą automatycznego sekwenatora żelowego.

Technika rozszerzania starterów oparta na fluorescencji w celu określenia punktów wyjściowych transkrypcji i miejsc cięcia RNaz in vivo

Ten protokół opisuje metodę mapowania końcowych miejsc przetwarzania pre-mRNA 3'.

3' Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania końcowego za pomocą A-seq2

Dwa różne protokoły szybkiej amplifikacji końców cDNA (3' RACE) opisane tutaj wykorzystują dwie różne polimerazy DNA do mapowania sekwencji, które zawierają segment otwartej ramki odczytu (ORF), kodon stop i cały 3' UTR transkryptu za pomocą RNA uzyskanego z różnych linii komórek nowotworowych.

Adaptacja 3'szybkiej amplifikacji końców CDNA do mapowania transkryptów w raku

Kompleksy RNA/białkowe oczyszczone przy użyciu strategii botyna-streptawidyna są eluowane do roztworu w warunkach denaturacji w formie nieodpowiedniej do dalszego oczyszczania i analizy funkcjonalnej. Tutaj opisujemy modyfikację tej strategii, która wykorzystuje fotorozszczepialny łącznik w RNA i delikatny etap elucji UV, dając natywne i w pełni funkcjonalne kompleksy RNA / białko.

Jednoetapowe oczyszczanie kompleksów makromolekularnych za pomocą RNA przyłączonego do biotyny i łącznika fotorozszczepialnego

Tutaj opisujemy składanie kompleksów elongacyjnych polimerazy II (Pol II) wymagających jedynie krótkich syntetycznych oligonukleotydów DNA i RNA oraz oczyszczonego Pol II. Kompleksy te są przydatne do badania mechanizmów leżących u podstaw kotranskrypcyjnego przetwarzania transkryptów związanych z kompleksem elongacyjnym Pol II.

Sztuczne kompleksy elongacyjne polimerazy II RNA do analizy zdarzeń przetwarzania kotranskrypcyjnego RNA

Tutaj prezentujemy protokół zależnego od DNAzymu podziału RNA. Umożliwia to szybką i zależną od miejsca analizę 2'-O-metylacji RNA. Podejście to można wykorzystać do wstępnej lub głównej oceny aktywności snoRNA.

Zależna od DNAzymu analiza 2'-O-metylacji rRNA

Przedstawiamy protokół do pomiaru dynamiki mikro- do milisekundowej na 13C/15N-znakowanych i nieznakowanych RNA za pomocąspektroskopii 1 H R1ρ spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) z dyspersją relaksacyjną. Protokół ten koncentruje się na przygotowaniu próbek o wysokiej czystości i konfiguracji eksperymentów NMR.

Praktyczne aspekty przygotowania próbki i konfiguracji eksperymentów z dyspersją relaksacyjną 1H R 1ρ RNA

Struktura wtórna RNA została głównie zaobserwowana w dojrzałym RNA metodami sondowania struktury. Sekwencjonowanie śledzenia struktury kotranskrypcyjnej (CoSTseq) jednoczy jądrowy run-on, który był wykorzystywany do badania pozycji polimerazy na powstającym RNA, z wykorzystaniem sondowania struktury. CoSTseq umożliwia tym samym obserwację wtórnej struktury RNA w RNA podczas aktywnej transkrypcji.

Porównawcza analiza struktury RNA transkryptów powstających i dojrzałych u Saccharomyces cerevisiae

Poznaj metodę analizy 3' końcowego rozszczepienia pre-mRNA in vitro przy użyciu aktywnych transkrypcyjnie ekstraktów jądrowych i radioznakowanych substratów RNA. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów dojrzewania RNA.

Analiza reakcji przetwarzania RNA przy użyciu systemów bezkomórkowych: 3' końcowe rozszczepienie substratów pre-mRNA in vitro

Przeglądaj więcej filmów