Analiza reakcji przetwarzania RNA przy użyciu systemów bezkomórkowych: 3' końcowe rozszczepienie substratów pre-mRNA in vitro
3 maja 2014
RNA polimeraza II syntetyzuje prekursorowy RNA, który wykracza poza koniec 3' dojrzałego mRNA. Koniec dojrzałego RNA jest generowany kotranskrypcyjnie, w miejscu dyktowanym przez sekwencje RNA, poprzez aktywność endonukleazy kompleksu rozszczepienia. Tutaj szczegółowo opisujemy metodę badania reakcji rozszczepienia in vitro.
Ogólnym celem tej procedury jest pomyślne zbadanie trzech głównych warstw rozszczepienia mRNA in vitro. Osiąga się to poprzez najpierw wykonanie transkrypcyjnie aktywnego ekstraktu jądrowego z komórek hodowanych w zawiesinie. Drugim etapem procedury jest wytworzenie znakowanych radiowo substratów RNA za pomocą transkrypcji in vitro.
Trzecim krokiem jest żelowe oczyszczenie znakowanych substratów RNA. Ostatnim krokiem jest złożenie reakcji rozszczepienia, w tym ekstraktu jądrowego i znakowanego substratu RNA. Ostatecznie wyniki mogą wykazać trzy podstawowe mRNA, rozszczepione substraty UNC i rozszczepiony produkt za pomocą pionowej radioaktywnej elektroforezy żelowej.
Wizualna demonstracja tej metody jest ważna, mimo że jest wykonywana od 1980 roku, nie jest łatwa do wykonania, ponieważ w trakcie procedury występuje wiele specyficznych kroków, które są trudne. Mają umyte komórki, granulowane i gotowe do lizy. Aby rozpocząć ten protokół do osadu komórkowego, dodaj bufor ze świeżym naziemną telekoalizją.
Dodać pięć objętości szacowanego CPV i za pomocą pipety rozbić osad i pozostawić zawiesinę do ostygnięcia na lodzie. Po 10 minutach odwiruj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza w kołyszącym się wiadrze. Odwirować ostrożnie odessać z supernatantu.
Granulka wchłonie trochę roztworu i pęcznieje. Następnie dodać jeden CPV buforu A i delikatnie rozdrobnić osad końcówką pipety. Wlać zawiesinę do schłodzonego homogenizatora i za pomocą pięciu do 12 pociągnięć ciasnym tłuczkiem zmylić komórki.
Usuń małą porcję, nałóż błękit trianowy i sprawdź komórki, aby określić kompletność ich lizy. W razie potrzeby kontynuuj homogenizację komórek, aż zostaną zlizowane w 90%, ale nie przesadzaj. Teraz przenieś lizat do ultra przezroczystej probówki ultrawirówkowej.
Nagraj całkowitą głośność i zakręć nią tak, jak wcześniej. Odessać mętny supernatant i zapisać go na lodzie. A do analizy cytozolu należy uważać, aby nie naruszyć osadu.
Zawiera jądra. Następnie wiruj pellet na wysokich obrotach przez 15 minut. Usuń niewielką objętość pozostałego supernatantu i połącz ją ze zbiorem cytozolu.
Następnie należy określić objętość jądrową PACT. Dodać do osadu objętość odpowiadającą buforowi C. Następnie usunąć osad za pomocą pipety w czystym homogenizatorze.
Użyj od pięciu do 10 mocnych pociągnięć tłuczkiem, aby zreusować. Zawiesić pellet. Przenieść homogenat do schłodzonej probówki i mieszać przez odwrócenie przez 30 minut.
W temperaturze czterech stopni Celsjusza można użyć płytki mieszającej. Jeśli objętość jest wystarczająco duża, przenieś lizat do probówki ultrawirówkowej UltraClear i w temperaturze czterech stopni Celsjusza odwiruj go przez 30 minut. Przy masie około 25 000 g supernatant jest ekstraktem jądrowym.
Postępując zgodnie z protokołem tekstowym, zakończ dializę od zaledwie jednego mikrograma matrycy. Przygotować sondę przez transkrypcję in vitro przy użyciu zestawu z promotorem kompatybilnym z SP six lub T seven. Podczas ładowania strony użyj trzech mikrolitrów markera i wszystkich 25 mikrolitrów reakcji na każdy substrat RNA.
Zapobiegaj również zanieczyszczeniu krzyżowemu, oddzielając pasy transkrypcji o podobnej wielkości. Uruchom żel tak, aby sonda nukleotydowa o mocy 600 watów działała z mocą 25 watów przez około dwie godziny później. Aby zaznaczyć położenie opasek żelowych, oświetl naświetloną folię lightboxem i połóż owinięty żel na wierzchu.
Wyrównaj marker auto rad i naświetlony marker na folii. A następnie zaznacz lokalizacje opasek czarnym markerem, aby usunąć opaski Rozpakuj żel. Za pomocą czystego ostrza wytnij pasmowe odcinki żelu, przenieś każdą sekcję do własnej probówki i wymyj RNA zgodnie ze standardowymi procedurami.
Po przygotowaniu wszystkich odczynników podgrzej znakowane RNA do 80 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Następnie przenieś RNA do wiru lodowego, 10% PVA, a następnie wiruj go z dużą prędkością przez kilka minut, aby usunąć pęcherzyki, a następnie przystąp do tworzenia mieszanek wzorcowych dla każdej reakcji. Do każdej reakcji dozować 5,25 mikrolitra mieszanki głównej jeden.
Następnie dodaj 6,25 mikrolitra mieszanki ekstraktu jądrowego. Następnie dodaj mikrolitr znakowanego substratu RNA rozcieńczonego do 50 anomolowców. Każda reakcja wykorzystuje mniej niż pięć anomolowców znakowanych RNA.
Teraz delikatnie odwiruj i szybko odkręć mieszaniny reakcyjne. Pozwól, aby reakcja zachodziła do dwóch godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Uwzględnienie przebiegu reakcji w czasie zapewni najlepsze wyniki Po użyciu proteinazy K do trawienia białka w reakcji, a następnie oczyszczania reakcji Stosując metodę chloroformu fenolowego, uruchom produkty na 6% załadowaniu strony, trzy mikrolitry markera lub pięć mikrolitrów na produkt reakcji na pas.
Następnie uruchom żel, a później ostrożnie zdemontuj aparat żelowy. Aby zebrać żel, mocno dociśnij do niego bibułę filtracyjną i odwróć ją. Mocno dociśnij szkło, aby upewnić się, że żel jest całkowicie uchwycony przez papier.
Następnie powoli odklej bibułę filtracyjną z dołączonym żelem. Owiń odsłoniętą stronę żelu folią w folię i przyklej folię do bibuły filtracyjnej po drugiej stronie. Na koniec umieść żel w suszarce na 15 minut z bibułą filtracyjną skierowaną w stronę próżni.
Później przeanalizuj żel, wystawiając go na działanie kamery filmowej lub fosfonowej. Rozszczepiony. Substrat RNA jest najwolniej migrującym pasmem w górnej części żelu.
Konkretny rozszczepiony produkt oznaczony pogrubioną strzałką, szybciej biegnie w żelu przy oczekiwanym rozmiarze. Produkt ten jest nieobecny w kontroli z mutacją punktową w sekwencji pyłkowej. Kwantyfikację aktywności rozszczepienia określono za pomocą wykresu metrycznego DS.
Porównując stosunek rozszczepionego do rozszczepionego, RNA, znormalizowany do kontroli rozszczepionego RNA. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak test poliadenylacji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak aktywność polimerazy poliA. Test ten odbywa się poprzez zmianę warunków reakcji, takich jak dodanie magnezu i usunięcie EDTA.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na analizie rozszczepiania mRNA w pozycji 3' in vitro, co stanowi kluczowy proces w dojrzewaniu RNA. Metoda ta wykorzystuje transkrypcyjnie aktywny ekstrakt jądrowy oraz znakowane radioaktywnie substraty RNA do analizy reakcji rozszczepiania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia RNA
- Biologia molekularna
- Biochemia
Wstęp
- Polimeraza RNA II syntetyzuje prekursor RNA, który wykracza poza koniec 3' dojrzałego mRNA.
- Kompleks cięcia wyznacza miejsce generowania dojrzałego RNA.
- Procesy kotranskrypcyjne są niezbędne dla dojrzewania RNA.
- Zrozumienie reakcji cięcia może dostarczyć wiedzy na temat mechanizmów przetwarzania RNA.
Cel badania
- Zbadanie cięcia mRNA w miejscu 3' in vitro.
- Zrozumienie roli ekstraktów jądrowych w procesowaniu RNA.
- Analiza produktów reakcji cięcia za pomocą elektroforezy żelowej.
Zastosowane metody
- Przygotowanie transkrypcyjnie aktywnego ekstraktu jądrowego z komórek hodowanych w zawiesinie.
- Synteza znakowanych radioaktywnie substratów RNA poprzez transkrypcję in vitro.
- Oczyszczanie żelowe znakowanych substratów RNA.
- Przygotowanie reakcji cięcia z wykorzystaniem ekstraktu jądrowego i znakowanych substratów RNA.
Główne wyniki
- Zaobserwowano skuteczne cięcie trzech substratów mRNA z końcem 3'.
- Wyniki przeanalizowano za pomocą pionowej radioaktywnej elektroforezy w żelu.
- Zidentyfikowano substraty cięte przez UNC oraz produkty cięcia.
- Opracowana metodologia stanowi podstawę do badania reakcji cięcia RNA.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia wiarygodną metodę analizy cięcia mRNA in vitro.
- Zrozumienie mechanizmów cięcia może poszerzyć wiedzę na temat przetwarzania RNA.
- Wyniki te wnoszą wkład w szeroką dziedzinę biologii RNA.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie procesu przetwarzania końca 3' RNA jest kluczowe dla walidacji celu w terapiach opartych na RNA, gdzie precyzyjne dojrzewanie transkryptu wpływa na poziomy ekspresji białek i wyniki funkcjonalne. Ten test cięcia in vitro umożliwia de-risking mechanistyczny poprzez wyizolowanie wymagań biochemicznych niezbędnych do prawidłowego przetwarzania pre-mRNA, co zwiększa pewność prognostyczną w zakresie oddziaływania na cel. Metoda ta zapewnia ilościowy, powtarzalny system do oceny, w jaki sposób perturbacje genetyczne lub farmakologiczne wpływają na stabilność i funkcję RNA, dostarczając informacji niezbędnych do podejmowania decyzji na wczesnym etapie odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie mechanizmów procesowania RNA w celu walidacji specyficznych dla transkryptu celów zaangażowanych w regulację ekspresji genów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia kontrolowany układ do oceny, w jaki sposób mutacje w sygnałach poliadenylacji wpływają na wydajność cięcia i stabilność RNA.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia uzyskanie ilościowych odczytów produktów cięcia w celu wsparcia standaryzacji testów do screeningu modulatorów czynników przetwarzania RNA.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje detekcję opartą na żelu, aby zapewnić powtarzalność i skalowalność dla wielu substratów RNA oraz warunków eksperymentalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie istotne w badaniach nad chorobami poprzez powiązanie defektów przetwarzania RNA z aberracyjnymi izoformami transkrypcyjnymi obserwowanymi w stanach patologicznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych do walidacji przedklinicznej poprzez zdefiniowanie progów biochemicznych dla funkcjonalnego dojrzewania RNA.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, w którym walidacja celu RNA poprzedza identyfikację związku wiodącego oraz ocenę przedkliniczną, wyjaśniając funkcjonalny wpływ przetwarzania transkryptu na poziom białka.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących elementów regulacyjnych RNA oraz redukcję ryzyka mechanistycznego w przypadku celów zaangażowanych w dojrzewanie mRNA.
- Screening: Zapewnia gotowość do przeprowadzania analiz dzięki standaryzowanemu przygotowaniu substratu i ilościowemu wykrywaniu produktów za pomocą elektroforezy w żelu.
- Analityka: Umożliwia porównanie wydajności cięcia w różnych warunkach z wykorzystaniem znormalizowanych stosunków produktu do substratu w celu priorytetyzacji celów w oparciu o dane.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez zdefiniowanie kompetencji przetwarzania jako biomarkera przydatności terapii opartych na RNA.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku do oceny modalności celujących w RNA w wielu programach i klasach celów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów RNA poprzez redukcję niejednoznaczności w mechanizmach przetwarzania transkryptów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji przygotowania ekstraktu jądrowego oraz ilościowemu oznaczeniu znakowanego substratu.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez powiązanie wierności przetwarzania RNA z oczekiwaną ekspresją białek i efektami funkcjonalnymi.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia optymalizację postępów z uwzględnieniem ryzyka poprzez identyfikację celów o stabilnych i regulowalnych profilach dojrzewania RNA.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie biologii molekularnej, biochemii RNA oraz technik znakowania izotopowego.
- Zależne od dostępności infrastruktury do ultrawirowania, elektroforezy w żelu i autoradiografii w celu przygotowania ekstraktów jądrowych oraz detekcji produktów.
- Wymaga standaryzacji projektu substratów, warunków reakcji oraz metod ilościowych pomiędzy zespołami w celu zapewnienia porównywalności wyników.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody przy stosowaniu testu dla różnych substratów RNA lub układów istotnych dla badanych chorób.
- Ograniczone przez złożoność techniczną izolacji ekstraktów jądrowych oraz potrzebę starannej optymalizacji w celu uniknięcia niespecyficznej degradacji.
