Name: Izolacja frakcji wzbogaconych jądrami CA1 z wycinków hipokampa w celu zbadania zależnego od aktywności importu jądrowego synaptojądrowych białek przekaźnikowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Poznaj metodę izolacji frakcji jądrowych z hipokampa szczura po indukcji LTP w obszarze CA1. Technika ta umożliwia badanie aktywnościowo-zależnego transportu białek synaptojądrowych w procesach uczenia się i pamięci.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została sfinansowana przez DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), grant DIP (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK i SB), MM jest laureatem długoterminowego stypendium Europejskiej Organizacji Biologii Molekularnej (EMBO) (EMBO ALTF 884-2011) oraz Marie-Curie IEF.

1. Przygotowanie ostrych plastrów hipokampa z mózgu dorosłego szczura
<ol>
	<li>Znieczulić szczury izofluranem. UWAGA: Zabieg należy wykonać przy zamkniętym eksykatorze, nie należy wdychać izofluranu. Upewnij się, że zwierzę jest całkowicie znieczulone.</li>
	<li>Odetnij głowę szczurowi, szybko odizoluj mózg i zanurz go w wstępnie owęglanym (mieszanina 95% O2 / 5% CO2 gazów) lodowatym roztworze Geya (skład w mM: 130 NaCl, 4,9 KCl, 1,5 CaCl2·2H2O, 0,3 MgSO4·2H2O, 11 MgCl2·6H2O, 0,23 KH2PO4, 0,8 na2HPO4·7H2O, 5 Glukoza ·H2O, 25 HEPES, 22 NaHCO3, pH 7,32) przez 30 min1,2,10,16.</li>
	<li>Usuń móżdżek i część kory śródwęchowej. Oddziel półkule korowe nacięciem środkowym strzałkowym, a następnie umieść każdą półkulę na jej przyśrodkowej powierzchni. Następnie wykonać cięcie pod kątem 50-70° (w poprzek 50-70°) wzdłuż krawędzi grzbietowej każdej półkuli13,14.</li>
	<li>Przyklej każdą półkulę świeżo ściętą powierzchnią na platformie do krojenia systemu cięcia. Platforma powinna być pokryta wstępnie karbonogennym, lodowatym roztworem Geya.</li>
	<li>Wytnij 350 μm 50-70° poprzeczne plastry od przedniej do tylnej strony za pomocą wibratomu dostosowanego w celu zminimalizowania oscylacji osi z. Formacja hipokampa, kora podkrążkowa i śródwęchowa, a także kora, która znajduje się grzbietowo-bocznie w stosunku do hipokampa, będą częścią plastrów używanych do eksperymentów13,14.</li>
	<li>Przenieść wycinki hipokampa do inkubatora w kształcie litery U i zanurzonego inkubatora i inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 32 °C z karbogenowanym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (ACSF zawierającym w mM: 110 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl2·2H2O, 1,5 MgSO4·2H2O, 1,24 KH2PO4, 10 Glukoza·H2O, 27,4 NaHCO3, pH 7,3)1,2,10,16.</li>
</ol>
2. Umiejscowienie elektrod, zapis linii bazowej i indukcja LTP
<ol>
	<li>Przenieś wycinek hipokampa do zanurzonej komory zapisowej zamontowanej pod mikroskopem. Perfuzja (6-7 ml/min) z karbogenicznym ACSF przez co najmniej 30 minut w temperaturze 32 °C.</li>
	<li>Przygotuj szklane mikroelektrody kapilarne wypełnione ACSF (rezystancja końcówki wynosi 3-5 MΩ).</li>
	<li>Umieścić szklane mikroelektrody wypełnione ACSF we włóknach pobocznych CA1 Schaffera w celu stymulacji oraz w warstwie promieniowej CA1 w celu zapisu fEPSP1,2,10 (ryc. 2). Odległość między elektrodami powinna wynosić około 300 μm.</li>
	<li>Wywołanie pobudzających potencjałów postsynaptycznych w polu (fEPSPs) poprzez stymulację włókien pobocznych Schaffera dwufazowymi prostokątnymi impulsami prądowymi (200 ms/polaryzacja) w zakresie 3-4 V.</li>
	<li>Wykonaj test maksymalnej stymulacji, mierząc zależność wejścia-wyjścia i zdefiniuj siłę stymulacji jako 40% maksymalnych uzyskanych wartości nachylenia fEPSP i utrzymuj ją na stałym poziomie przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
	<li>Rozpocznij zapis linii podstawowej przez co najmniej 15 minut po teście maksymalnej stymulacji. Mierz reakcje na bodźce testowe co minutę przez cały czas trwania eksperymentu. Wykonuj nagrania podstawowe ze stymulacją o niskiej częstotliwości.</li>
	<li>Zapisuj linię bazową przez co najmniej 30 minut.</li>
	<li>W przypadku późnej indukcji LTP należy zastosować tetanizację o wysokiej częstotliwości 100 Hz składającą się z trzech 1-sekundowych ciągów bodźców przy 100 Hz z 5-minutowym interwałem między treningami. Aby zwiększyć pole stymulacji w obrębie obszaru CA1, 5 μM bicukuliny można wypłukać w ciągu 2 minut przed tężycą i należy ją wypłukać natychmiast po ostatniej tężyczce.</li>
</ol>
3. Zbieranie plastrów po indukcji LTP i błyskawicznym zamrożeniu
<ol>
	<li>Zatrzymaj nagrywanie LTP na 2 minuty lub 30 minut po trzech ciągach stymulacji tężcowej indukującej późne LTP.</li>
	<li>Wyjmij elektrody i szybko przenieś plasterek na wstępnie zimną metalową platformę umieszczoną na suchym lodzie. Powtórzyć procedurę dla plastra kontrolnego trzymanego w inkubatorze w kształcie litery U. UWAGA: Podczas pracy z suchym lodem należy używać rękawiczek.</li>
	<li>Zbierz każdą plasterkę do probówki o pojemności 1,5 ml i przechowuj w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
4. Izolacja frakcji wzbogaconych jądrowo z regionu CA1 hipokampa
<ol>
	<li>Weź 1,5 ml probówek Eppendorfa z zamrożonymi plastrami w temperaturze od -80 °C i trzymaj je na lodzie.</li>
	<li>Dodać do probówki 0,5 ml świeżego, zimnego buforu TBS zawierającego inhibitory proteazy (PI) i fosfatazy (PS). Inkubować przez 2-3 minuty i przenieść do mikroskopu stereoskopowego. UWAGA: Podczas pracy z PI i PS należy używać rękawic ochronnych i fartucha laboratoryjnego.</li>
	<li>Wypreparuj obszar warstwy piramidalnej CA1 hipokampa za pomocą dwóch igieł. Użyj jednej igły do przytrzymania plastra pod mikroskopem stereoskopowym, a drugiej igły do cięcia obszaru CA1.</li>
	<li>Zbierz wycięte regiony CA1 z 5 plasterków (dla każdej grupy) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 50 μl buforu do lizy (1x hipotoniczny bufor do lizy zawierający w mM: 10 HEPES, 1,5 MgCl2, 10 KCl, pH 7,9, z PI i PS). Należy pamiętać, że taka ilość materiału będzie wystarczająca do przeprowadzenia 2-3 immunoblotów.</li>
	<li>Homogenizuj pobraną tkankę, ostrożnie pipetując w górę iw dół. Użyj pipety o pojemności 200 μl. Inkubuj lizat na lodzie przez 5-7 minut, aby komórki mogły pęcznieć.</li>
	<li>Weź 2 μl lizatu, upuść na szkiełko mikroskopowe i wizualizuj pęcznienie komórek pod mikroskopem jasnego pola. Przy prawidłowym obrzęku komórek jądra pojawiają się jako okrągłe, nienaruszone struktury.</li>
	<li>Zebrać 20 μl próbki do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml jako "frakcję homogenatu". Dodać 8 μl denaturującego 4x buforu próbki SDS.</li>
	<li>Pozostałe lizaty odwirować z prędkością 11 000 obr./min przez 1 min.</li>
	<li>Ostrożnie pobrać supernatant od góry ("frakcję cytozolową"), przenieść do nowej probówki i dodać 20 μl 4-krotnego buforu do próbki.</li>
	<li>Zawiesić osad w 60 μl buforu hipotonicznego i dodać 20 μl buforu do 4 x próbki. Frakcja ta jest określana jako "frakcja wzbogacona jądrowo".</li>
	<li>Frakcje homogenatowe, cytozolowe i wzbogacone jądrowo mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C lub -80 °C w celu późniejszego immunoblottingu.</li>
</ol>
5. Semiilościowe immunoblotting dla białek synaptojądrowych
<ol>
	<li>Rozmrozić próbki i gotować je przez 5 minut w temperaturze 95 °C.</li>
	<li>Weź 5 μl z każdej frakcji i oznacz stężenie białka za pomocą testu amido black lub testu BCA.</li>
	<li>Załaduj równą ilość próbek białek z frakcji homogenatycznej, cytoplazmatycznej i wzbogaconej jądrowo na SDS-PAGE. Próbki z plastrów kontrolnych i LTP należy umieścić na tym samym żelu w celu bezpośredniego porównania.</li>
	<li>Wykonaj standardową procedurę western-blotting (zalecany jest transfer na mokro).</li>
	<li>Zbadaj błony wybranym przeciwciałem. Następnie te same bloty (lub te same próbki prowadzone równolegle) mogą być badane za pomocą markera cytoplazmatycznego - enolazy specyficznej dla neuronu2 (NSE2) i markera jądrowego - NeuN oraz przeciwciała -aktyny jako kontroli obciążenia.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Wydajność indukcji LTP może być analizowana przez oprogramowanie Clampfit. Średnie nachylenie zapisów linii bazowej porównano ze spadkami po tężyczce przy użyciu dwukierunkowej ANOVA, p <0,05 uznano za istotnie różne. Wartości nachylenia fEPSP zostały przedstawione na wykresach jako średnia ± S.E.M.</li>
	<li>W celu ilościowego określenia immunoplam należy zeskanować film autoradiograficzny i przeanalizować zintegrowaną gęstość prążków białkowych za pomocą ImageJ lub prążków fluorescencyjnych z systemem Licor. Wartości prążków immunoreaktywnych powinny być znormalizowane w celu kontroli obciążenia i blottingu. Do porównania grupy kontrolnej i LTP można zastosować nieparametryczny test U-Manna-Whitneya.</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa bufora</td>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Stężenie (mM) </td>
			<td>kwota</td>
			<td>Komentarze/Opis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór Geya (pH: 7,3 ~ 7,4)</td>
			<td>Zawartość NaCl </td>
			<td>130</td> szt.
			<td>7,6 gr</td>
			<td>Filtracja sterylna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pojemność 1 000 ml</td>
			<td>Kcl</td>
			<td>Pytanie 4.9</td>
			<td>0,37 grama</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>CaCl2·2H2O</td>
			<td>1,5</td>
			<td>0,22 gr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>MgSO4·2H2O</td>
			<td>0,3</td>
			<td>0,0739 gr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>MgCl2·6H2O</td>
			<td>11</td>
			<td>2,24 grama</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>0,23</td> pkt.
			<td>0,0313 grama</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Na2HPO4·7H2O</td>
			<td>0,8</td>
			<td>0,2145 grama</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Glukoza·H2O</td>
			<td>5</td>
			<td>0,9909 grama</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>HEPESY</td>
			<td>25</td>
			<td>5,96 gr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>22 Rozdział 22</td>
			<td>1,85 grama</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSF (pH: 7,3 ~ 7,4)</td>
			<td>Zawartość NaCl </td>
			<td>Rozdział 110</td>
			<td>6.428 gr</td>
			<td>Filtracja sterylna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pojemność 1 000 ml</td>
			<td>Kcl</td>
			<td>Rozdział 2.5</td>
			<td>0,1865 gr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>CaCl2·2H2O</td>
			<td>Rozdział 2.5</td>
			<td>0,368 gr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>MgSO4·2H2O</td>
			<td>1,5</td>
			<td>0,370 gr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Pytanie 1,24</td>
			<td>0,169 gr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Glukoza·H2O</td>
			<td>10</td>
			<td>1,9817 gr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Pytanie 27,4</td>
			<td>2,3 gr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Bufor hipotoniczny (pH: 7,9)</td>
			<td>HEPESY</td>
			<td>10</td>
			<td>0,23 gr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pojemność 100 ml</td>
			<td>MgCl2·6H2O</td>
			<td>1,5</td>
			<td>0,0304 gr</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Kcl</td>
			<td>10</td>
			<td>0,07455 grama</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. .

<ol><li>Behnisch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+translocation+of+Jacob+in+hippocampal+neurons+after+stimuli+inducing+long-term+potentiation+but+not+long-term+depression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression.</a> PLoS One. 6 (2), e17276(2011).</li>
<li>Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+degradation+by+the+proteasome+is+required+for+synaptic+tagging+and+the+heterosynaptic+stabilization+of+hippocampal+late-phase+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation.</a> Neuroscience. 169 (4), 1520-1526 (2010).</li>
<li>Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+GABA%28A%29+inhibition+on+the+expression+of+long-term+potentiation+in+CA1+pyramidal+cells+are+dependent+on+tetanization+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters.</a> Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).</li>
<li>Ch'ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O'Dell, T. J., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+transport+of+the+transcriptional+coactivator+CRTC1+from+synapse+to+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus.</a> Cell. 150 (1), 207-221 (2012).</li>
<li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caldendrin-Jacob%3A+a+protein+liaison+that+couples+NMDA+receptor+signalling+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus.</a> PLoS Biol. 6 (2), e34(2008).</li>
<li>Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+synapse+to+nucleus+and+back+again--communication+over+distance+within+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">From synapse to nucleus and back again--communication over distance within neurons.</a> J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).</li>
<li>Hardingham, G. E., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+versus+extrasynaptic+NMDA+receptor+signalling%3A+implications+for+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).</li>
<li>Ivanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+role+of+synaptic+and+extrasynaptic+NMDA+receptors+in+regulation+of+the+extracellular+signal-regulated+kinases+%28ERK%29+activity+in+cultured+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons.</a> J. Physiol. 57, 789-798 (2006).</li>
<li>Jordan, B. A., Kreutz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocytoplasmic+protein+shuttling%3A+the+direct+route+in+synapse-to-nucleus+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling.</a> Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).</li>
<li>Karpova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+and+transducing+the+synaptic+or+extrasynaptic+origin+of+NMDA+receptor+signals+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus.</a> Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).</li>
<li>Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+NR2A-+and+NR2B-containing+NMDA+receptors+in+Ras-ERK+signaling+and+AMPA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking.</a> Neuron. 46, 745-760 (2005).</li>
<li>Lai, K. O., Zhao, Y., Ch'ng, T. H., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importin-mediated+retrograde+transport+of+CREB2+from+distal+processes+to+the+nucleus+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).</li>
<li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTP+in+cultured+hippocampal-entorhinal+cortex+slices+from+young+adult+%28P25-30%29+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats.</a> J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).</li>
<li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+activity-dependent+cyclic+AMP-responsive+element-binding+protein+phosphorylation+during+long-lasting+long-term+potentiation+in+area+CA1+of+mature+rat+hippocampal-organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures.</a> Neuroscience. 131 (3), 601-610 (2005).</li>
<li>Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin-dependent+spatial+translocation+of+an+activated+MAP+kinase+in+injured+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve.</a> Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).</li>
<li>Xiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+maintenance+of+mature+hippocampal+slices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro.</a> J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).</li>
<li>Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern-dependent+role+of+NMDA+receptors+in+actin+potential+generation%3A+consequences+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation.</a> J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kroki opisane w powyższym protokole zawierają wskazówki, jak przygotować ostry hipokamp pokrojony z młodych lub dorosłych szczurów, indukować i rejestrować LTP, szybko rozcinać stymulowany obszar plastra i przygotowywać frakcję wzbogaconą jądrowo do badania dynamiki białek zależnej od aktywności. Podejście to wywodzi się z połączenia kilku różnych metod stosowanych niezależnie od siebie. Zoptymalizowaliśmy przepływ pracy i dostarczyliśmy wystarczająco dużo szczegółów, aby początkujący mogli skonfigurować własne eksperyme...

Synaptyczne receptory N-metylo-D-asparaginianu (NMDAR) odgrywają kluczową rolę w plastyczności synaptycznej i sygnalizacji przetrwania komórek, podczas gdy aktywacja pozasynaptycznych NMDAR-ów może wywołać neurodegenerację i śmierć komórki. Zmiany te zależą od ściśle kontrolowanej/regulowanej ekspresji genów zależnej od aktywności, a zatem wymagają stałej komunikacji między aktywowanymi synapsami lub dendrytami a jądrem7. Kinazy MAP ERK1 / 2 są efektorami dalszej sygnalizacji synaptycznych NMDAR i biorą udział w ekspresji genów indukowanej aktywacją NMDAR, podczas gdy sygnalizacja za pośrednictwem pozasynaptycznego NMDAR nie ma wpływu lub hamuje aktywność ERK1 / 28,11.
Istnieje wiele białek, które okazały się przemieszczać między dystalnymi dendrytami a jądrem. Wiele z tych białek zawiera sygnał lokalizacji jądrowej i jest aktywnie transportowanych wzdłuż mikrotubuli w sposób zależny od dyneiny i importyny do jądra6,9. Co ciekawe, niektóre z tych przekaźników przechodzą do jądra tylko w odpowiedzi na określone bodźce synaptyczne. Na przykład wsteczny transport cyklicznego białka wiążącego element odpowiedzi AMP 2 (CREB2) jest indukowany przez substancję chemiczną LTD, ale nie LTP12. Zlokalizowana stymulacja synaptyczna zależna od NMDAR napędza regulowany przez CREB koaktywator transkrypcji (CRTC1) do jądra, proces translokacji, który jest zaangażowany w długoterminową plastyczność hipokampa4. Niedawno wykazano, że białkowy przekaźnik Jacob przemieszcza się do jądra zarówno po synaptycznej, jak i pozasynaptycznej aktywacji NMDAR i reguluje transkrypcję genu 5 zależną odCREB. Synaptyczne lub pozasynaptyczne pochodzenie sygnału jest zakodowane w potranslacyjnej modyfikacji Jacoba. Aktywność synaptyczna indukuje zależną od ERK1/2 fosforylację Jacoba w kluczowej serynie w pozycji 180 (pJacobS 180), co jest niezbędne do późniejszej translokacji do jądra w pierwotnej hodowli hipokampa. Co więcej, w neuronach CA1 ostrych wycinków hipokampa pJacobS 180 przemieszcza się do jądra po LTP pobocznym Schaffera, ale nie LTD1,10. pS180 Jacob prowadzi do zwiększonej ekspresji genów związanych z plastycznością, a ta ekspresja genów wpływa z powrotem na funkcję synaptyczną. W przeciwieństwie do tego, Jacob, który przemieszcza się do jądra po pozasynaptycznej aktywacji NMDAR, nie jest fosforylowany w Ser180 i może być związany z innym kompleksem białkowym w jądrze, powodując "wyłączenie CREB" i wycofanie kontaktów synaptycznych10.
Większość opublikowanych badań nad importem jądrowym synapto-jądrowego przekaźnika białkowego przeprowadzono w zdysocjowanych pierwotnych kulturach neuronalnych. Dlatego interesujące byłoby sprawdzenie, czy takie odkrycia można odtworzyć w fizjologicznie bardziej odpowiednich warunkach przy użyciu wycinków hipokampa, w których połączenia i funkcje neuronów są znacznie lepiej zachowane. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół oceny zależnej od LTP translokacji jądrowej przekaźników białkowych za pomocą immunoblottingu. Metoda ta nadaje się również do analizy zależnej od aktywności fosforylacji białek w surowej frakcji jądrowej. W szczególności obecny protokół obejmuje przygotowanie ostrych wycinków hipokampa CA1, indukcję i rejestrację LTP. Następnie region CA1 jest mikroskopowo wycinany w celu wyizolowania stymulowanego regionu. Połączyliśmy i zmodyfikowaliśmy protokół izolacji jądrowej dostarczony przez zestaw do ekstrakcji CellLytic NuCLEAR ze zmianami wprowadzonymi przez Zhao i współpracowników17. Zoptymalizowana procedura obejmuje lizę wypreparowanych regionów CA1 w hipotonicznym buforze, co pozwala na pęcznienie komórek i uwalnianie jąder. Lizę komórek i morfologię jąder można określić za pomocą badania mikroskopowego. Wzbogacanie jądrowe uzyskuje się poprzez krótki etap wirowania. Analiza immunoblottingu z przeciwciałami przeciwko NeuN i NSE2, specyficznym markerom frakcji jądrowych lub cytozolowych, wskazuje, że podejście to może być wykorzystane jako szybki i powtarzalny protokół do izolacji tych frakcji subkomórkowych i do badania bardzo labilnych modyfikacji potranslacyjnych, takich jak fosforylacja białek. Ponadto metoda ta jest korzystna w przypadku małych próbek tkanek pochodzących z wypreparowanych regionów CA1 wycinków hipokampa i może być stosowana w połączeniu z immunohistochemią wycinków hipokampa.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>CED 1401 AD/DA converter</td><td>Cambridge Electronics Design, Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>a href="http://www.iciba.com/stereomicroscope">Stereomikroskop</a></td><td>Leica S4E, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wibrotom</td><td>Leica VT1000S, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izolowany stymulator tętna</td><td>A-M Systemy, USA</td><td></td><td>Model 2100</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System SDS-PAGE</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cooler</td><td>Julabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop jasnego pola</td><td>Nikon Eclipse TS100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli komórkowych</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Luigs & Neumann, SM-5, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora do bibułowania i dostawca energii elektrycznej</td><td>Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora zapisu typu zanurzonego</td> wykonana <td>na zamówienie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>inkubator w kształcie litery U i zanurzeniowy&nbsp;</td><td>wykonane</td><td></td><td></td>na zamówienie</tr><tr><td>Małe nożyczki</td><td></td><td></td><td></td>chirurgiczne</tr><tr><td>Skalpel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cienka szpatułka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa pipeta</td><td></td><td></td><td></td>Pasteura</tr><tr><td>Plastikowe naczynie do hodowli&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr> do <tr><td>zlewki</td><td></td><td></td><td></td>Bunsena</tr><td colspan="4">Reodczynniki</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>Art.-Nr.3957.1</td><td>&ge; 99,5%, p.a., ACS, ISO</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>Art.-Nr.6781.1</td><td>&ge; 99,5%, rocznie, ACS, ISO</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Merck</td><td>1.02382.0500</td><td>pro analiza</td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 2H2O</td><td>Merck</td><td>5886.05</td><td>pro analiza</td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Zastosowanie Nr</td><td>CAS: 7791-18-6; Nr WE:2320946</td><td>dla biologii molekularnej</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>12034.025</td><td>dla biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 2H2O</td><td>Merck</td><td>1.06574.1000</td><td>ekstra czysty</td></tr><tr><td>glukoza&middot; H2O</td><td>Roth</td><td>Art.-Nr.6887.1</td><td>dla biologii molekularnej</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Roth</td><td>Art.-Nr.9105.4</td><td>PUFFERAN, &ge; 99,5%, rocznie</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1.06329.1000</td><td>pro analiza</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphostop</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicuculline</td><td>Tocris Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Przeciwciała</td></tr><tr><td>Przeciwciała pierwszorzędowe</td><td>Numer</td><td>katalogowy firmy</td><td>Gatunek</td></tr><tr><td>pJac-s180</td><td>Biogeny</td><td></td><td>królik (rozcieńczony 1:100)</td></tr><tr><td>NeuN</td><td>Milipore</td><td>Mysz MAB377</td><td>(rozcieńczony 1:1,000)</td></tr><tr><td>Sygnalizacja komórkowa</td> <td>NSE</td><td>Królik D20H2</td><td>(rozcieńczony 1:1,000)</td></tr><tr><td>Beta-aktyna</td><td>Mysz Sigma</td><td>A-5441</td><td>(rozcieńczona 1:5,000)</td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe</td><td>Numer katalogowy</td> <td>firmy</td><td>Gatunek</td></tr><tr><td>IgG HRP sprzężony</td><td>DAKO</td><td></td><td>koza anty-mysz (1:5 000)</td></tr><tr><td>IgG HRP sprzężony</td><td>z NEB</td><td></td><td>koza anty-królik (1:5 000)</td></tr></tbody></table>

izolacja frakcji wzbogaconych jądrami ca1 z wycinków hipokampa w celu zbadania zależnego od aktywności importu jądrowego synaptojądrowych białek przekaźnikowych

Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

Badanie zależnej od aktywności ekspresji białek, translokacji subkomórkowej lub fosforylacji jest niezbędne do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw plastyczności synaptycznej. Długotrwałe wzmocnienie (LTP) i długotrwała depresja (LTD) indukowane w ostrych wycinkach hipokampa są powszechnie akceptowane jako komórkowe modele uczenia się i pamięci. Istnieje wiele badań, w których wykorzystuje się obrazowanie żywych komórek lub podejścia immunohistochemiczne do wizualizacji dynamiki białek zależnej od aktywności. Jednak metody te opierają się na przydatności przeciwciał do immunocytochemii lub nadekspresji białek znakowanych fluorescencją w pojedynczych neuronach. Immunoblotting białek jest alternatywną metodą zapewniającą niezależne potwierdzenie wyników. Pierwszym czynnikiem ograniczającym w przygotowaniu frakcji subkomórkowych z pojedynczych tetanizowanych wycinków hipokampa jest mała ilość materiału. Po drugie, procedura obchodzenia się z nimi jest kluczowa, ponieważ nawet bardzo krótkie i drobne manipulacje żywymi wycinkami mogą wywołać aktywację pewnych kaskad sygnałowych. Tutaj opisujemy zoptymalizowany przepływ pracy w celu uzyskania wystarczającej ilości wzbogaconej jądrowo frakcji o wystarczającej czystości z regionu CA1 ostrych wycinków hipokampa z mózgu szczura. Jako reprezentatywny przykład pokazujemy, że ufosforylowana forma ERK1 / 2 synapto-jądrowego przekaźnika białkowego Jacob aktywnie przemieszcza się do jądra po indukcji LTP i może być wykryta we frakcji wzbogaconej jądrowo z neuronów CA1.

Wcześniej wykazaliśmy, że synapto-jądrowy białkowy przekaźnik Jacob gromadzi się w jądrze po indukcji LTP, ale nie LTD1. Ponadto translokacja Jacob po stymulacji synaptycznej wymaga aktywacji MAPK ERK1/2 oraz fosforylacji Jacob w pozycji Ser180 (Rysunek 1). Fosforylowany Jacob translokuje do jądra w sposób zależny od importyn, a stan fosforylacji może być utrzymywany przez dłuższy czas dzięki asocjacji z filamentem pośrednim αinternexin15 (Rysunek 1). Stan fosforyla...

Udostępniamy szczegółowy protokół indukcji długotrwałego wzmocnienia w regionie CA1 hipokampa i późniejszej izolacji frakcji wzbogaconych jądrowo z obszaru tetanizowanego wycinka. Podejście to można wykorzystać do określenia zależnego od aktywności importu białek jądrowych w komórkowych modelach uczenia się i pamięci.

Izolacja frakcji wzbogaconych jądrami CA1 z wycinków hipokampa w celu zbadania zależnego od aktywności importu jądrowego synaptojądrowych białek przekaźnikowych

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest badanie zależnej od aktywności translokacji nukleocytoplazmatycznej białek z wykorzystaniem ostrych skrawków hipokampa, w których zachowana jest łączność i funkcja neuronów. Aby osiągnąć ten cel, w pierwszym kroku izolowany jest hipokamp dorosłego samca szczura, a w drugim kroku przygotowywane są ostre skrawki poprzeczne. Skrawki hipokampa przenosi się do komory rejestracyjnej, a następnie indukuje późną fazę LTP w warstwie radiatum obszaru CA1. Następnie potencjalne oraz kontrolne skrawki są gwałtownie zamrażane, a stymulowane obszary CA1 są wycinane w celu wyizolowania frakcji wzbogaconej w jądra komórkowe do dalszej analizy za pomocą immunoblottingu.Wyniki analizy western blotting wykazują różnice w poziomach fosfoprotein jądrowych pomiędzy skrawkami potencjowanymi a kontrolnymi 30 minut po indukcji LTP. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności z dwóch powodów. Po pierwsze, wynika to z małej ilości próbki tkanki, a po drugie z krytycznego czasu wymaganego do lizy próbek w hipotonicznym buforze lizującym, co umożliwia uwolnienie jąder. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ przygotowanie świeżej tk

isolation-ca1-nuclear-enriched-fractions-from-hippocampal-slices-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Izolacja frakcji jądrowych wzbogaconych o CA1 z kawałków hipokampu w celu badania zależnego od aktywności importu białek przekaźnikowo-jądrowych

Opisano przygotowanie ostrych skrawków mózgu z izolowanych struktur hipokampa oraz jednoczesne rejestracje elektrofizjologiczne astrocytów i neuronów w stratum radiatum podczas stymulacji kolaterali Schaffera. Zaprezentowano farmakologiczną izolację prądów transporterów potasu i glutaminianu w astroglei.

Podwójne rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi astroglialnych i neuronalnych wywołanych synaptycznie w ostrych skrawkach hipokampa

Ten film demonstruje hamowanie pobudzających prądów synaptycznych za pośrednictwem mikroRNA w wycinkach mózgu myszy w hipokampie. Neurony CA3 zostały zainfekowane rekombinowanym wektorem wirusowym zawierającym konstrukt do ekspresji fluorescencyjnego reportera, aktywowany światłem kanał błonowy i mikroRNA, który obniża ekspresję kanałów wapniowych bramkowanych napięciem. Po umieszczeniu wycinka w komorze rejestracyjnej i załataniu neuronu CA1 za pomocą pipety rejestrującej, impulsy świetlne...

Hamowanie pobudzających prądów postsynaptycznych za pośrednictwem mikroRNA w mysich wycinkach hipokampa

Lokalizacja i dystrybucja białek dostarcza ważnych informacji dla zrozumienia ich funkcji komórkowych. Doskonała rozdzielczość przestrzenna mikroskopii elektronowej (EM) może być wykorzystana do określenia subkomórkowej lokalizacji danego antygenu po immunohistochemii. W przypadku tkanek ośrodkowego układu nerwowego (OUN) zachowanie integralności strukturalnej przy jednoczesnym zachowaniu antygenowości było szczególnie trudne w badaniach EM. Tutaj przyjmujemy procedurę, która została...

Znakowanie białek synaptycznych po zatopieniu Immunogold w kulturach warstw hipokampa

Sieci korowe są kontrolowane przez mały, ale zróżnicowany zestaw hamujących interneuronów. Funkcjonalne badanie interneuronów wymaga zatem ukierunkowanego rejestrowania i rygorystycznej identyfikacji. Opisano tutaj podejście łączone obejmujące zapisy całych komórek z pojedynczych lub synaptycznie sprzężonych par neuronów z etykietowaniem wewnątrzkomórkowym, analizą morfologiczną post-hoc i immunocytochemiczną.

Nagrania całokomórkowych klamry krosowej z morfologicznie i neurochemicznie zidentyfikowanych interneuronów hipokampa

Ten artykuł wideo opisuje eksperymentalne procedury badania długoterminowej plastyczności i jej procesów asocjacyjnych, takich jak znakowanie synaptyczne, przechwytywanie i krzyżowanie w neuronach piramidowych CA1 przy użyciu ostrych wycinków hipokampa od gryzoni.

Badanie znakowania/przechwytywania synaptycznego i przechwytywania krzyżowego przy użyciu ostrych plastrów hipokampa od gryzoni

Tutaj prezentujemy protokół frakcjonowania błony mózgowej, który stanowi solidną procedurę izolowania białek należących do różnych przedziałów synaptycznych.

Frakcjonowanie błony mózgowej: podejście ex vivo do oceny lokalizacji białek subsynaptycznych

Ten protokół opisuje stabilizację poziomu tlenu w małej objętości buforu z recyklingu oraz metodologiczne aspekty rejestrowania plastyczności synaptycznej zależnej od aktywności w zanurzonych ostrych wycinkach hipokampa.

Rejestrowanie plastyczności synaptycznej w ostrych wycinkach hipokampa utrzymywanych w systemie komór do recyklingu, perfuzji i zanurzenia o małej objętości

Napad elektrowstrząsowy (ECS) to eksperymentalny model terapii elektrowstrząsowej w ciężkiej depresji. ECS globalnie stymuluje aktywność hipokampa, prowadząc do synaptogenezy i plastyczności synaptycznej. W tym miejscu opisujemy metody indukcji ECS u szczurów i subkomórkowego frakcjonowania ich hipokampów w celu zbadania zmian w białkach synaptycznych wywołanych napadami.

Napady elektrowstrząsowe u szczurów i frakcjonowanie ich hipokampów w celu zbadania wywołanych napadami zmian w białkach o gęstości postsynaptycznej

Opisany tutaj protokół opisuje analizę immunofluorescencyjną, odzyskiwanie biocytyny i wysokiej jakości rekonstrukcje interneuronów CA2 w hipokampie po wewnątrzkomórkowych zapisach elektrofizjologicznych in vitro, co pozwala na badanie charakterystyki neuronów i ostatecznie anatomii neuronalnej.

Odzyskiwanie biocytyny i rekonstrukcje 3D wypełnionych interneuronów CA2 w hipokampie

Ten artykuł ma na celu opisanie systematycznego protokołu uzyskiwania poziomych wycinków mózgu hipokampa u myszy. Celem tej metodologii jest zachowanie integralności szlaków włókien hipokampa, takich jak ścieżka perforantu i szlak włókien omszałych, w celu oceny procesów neurologicznych związanych z zakrętem zębatym.

Poziome wycinki hipokampa mózgu myszy

Poznaj metodę izolacji frakcji jądrowych z hipokampa szczura po indukcji LTP w obszarze CA1. Technika ta umożliwia badanie aktywnościowo-zależnego transportu białek synaptojądrowych w procesach uczenia się i pamięci.

Izolacja frakcji wzbogaconych jądrami CA1 z wycinków hipokampa w celu zbadania zależnego od aktywności importu jądrowego synaptojądrowych białek przekaźnikowych (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja frakcji wzbogaconych jądrami CA1 z wycinków hipokampa w celu zbadania zależnego od aktywności importu jądrowego synaptojądrowych białek przekaźnikowych

Przeglądaj więcej filmów