Izolacja frakcji wzbogaconych jądrami CA1 z wycinków hipokampa w celu zbadania zależnego od aktywności importu jądrowego synaptojądrowych białek przekaźnikowych

Udostępniamy szczegółowy protokół indukcji długotrwałego wzmocnienia w regionie CA1 hipokampa i późniejszej izolacji frakcji wzbogaconych jądrowo z obszaru tetanizowanego wycinka. Podejście to można wykorzystać do określenia zależnego od aktywności importu białek jądrowych w komórkowych modelach uczenia się i pamięci.

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zbadanie zależnego od aktywności cytoplazmatycznego przenoszenia białek jądra przy użyciu ostrych wycinków hipokampa, w których dobrze zachowana jest łączność i funkcja neuronów Aby osiągnąć ten cel, najpierw izoluje się hipokamp dorosłego samca szczura, a jako drugi etap przygotowuje się ostre poprzeczne plasterki. Warstwy hipokampa są przenoszone do komory rejestrującej, a późna forma LTP jest indukowana w atomie promieni warstwy CA one. Następnie wzmocnione i kontrolne plastry są pękane, zamrażane, a stymulowane regiony ca one są preparowane w celu wyizolowania frakcji wzbogaconej jądrem do dalszej analizy immunoblott.

Wyniki oparte na analizie western blotting pokazują różnice w poziomach fosfoproteiny jądrowej między plastrami wzmocnionymi i kontrolnymi 30 minut po indukcji LTP. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z dwóch powodów. Po pierwsze, mała ilość próbki tkanki, a po drugie, krytyczne ramy czasowe, które powtarzają się w przypadku lizy próbek w hipotonicznym buforze do lizy, umożliwiającym uwolnienie jąder Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ przygotowanie życia w hipokampie i izolacja regionu C wymagają szybkich i bardzo dokładnych sekcji, ale istnieją pewne sztuczki.

Aby to ułatwić, należy postępować zgodnie zarówno z pisemnymi, jak i zobrazowanymi instrukcjami przygotowania frakcji wzbogaconej jądrowo z obszaru C jednego hipokampa. Pokaz lizy zabiegu zostanie przeprowadzony przez Laboratorium Pocztowe Pinon. Pokaże, jak przygotować się do ostrej lizy hipokampa i indukować LTP.

Po rozebraniu regionu C jeden z nich przez Berra g student z naszego laboratorium pokaże Ci, jak wyizolować jądro i zniszczenie. Rozpocznij tę procedurę od wyizolowania mózgu szczura i zanurzenia go w wstępnie gazowanym roztworze lodowatego spojrzenia. Następnie usuń móżdżek i część kory dojelitowej.

Oddziel półkule korowe środkowym nacięciem strzałkowym. Następnie wykonaj cięcie pod kątem od 50 do 70 stopni wzdłuż grzbietowej krawędzi każdej półkuli. Następnie umieść każdą półkulę na jej przyśrodkowej powierzchni, przyklej każdą półkulę świeżo wyciętą powierzchnią na platformie do krojenia vibrato.

Następnie przykryj platformę wstępnie karbogenicznym roztworem lodowatego spojrzenia. Wytnij 350 mikrometrowe plastry zawierające formację hipokampa, korę podskórną i dojelitową od przedniej do tylnej strony za pomocą vibram. Następnie przenieś plastry do inkubatora w kształcie litery U i zanurzonego w zanurzeniu i inkubuj je przez co najmniej dwie godziny w temperaturze 32 stopni Celsjusza z karbogenem A CSF.

Teraz przenieś wycinek hipokampa do zanurzonej komory zapisowej zamontowanej pod mikroskopem. Perfundować plasterek gazowanym płynem rdzeniowym A w ilości sześciu mililitrów na minutę przez co najmniej 30 minut w temperaturze 32 stopni Celsjusza. Po 30 minutach napełnij szklane mikroelektrody kapilarne płynem mózgowo-rdzeniowym.

Umieść mikroelektrodę w CA jedno włókno poboczne Schaefera w celu stymulacji, a drugie w atomie gotowym do około jednej warstwy do nagrywania EPSP w polu w odległości 300 mikrometrów od siebie. Następnie wywołaj pole EP SSP, dostarczając od trzech do czterech woltów za pomocą fazowych prostokątnych impulsów prądu do włókien bocznych Schafer. Wykonaj test maksymalnej stymulacji, mierząc zależność wejściowo-wyjściową i zdefiniuj siłę stymulacji jako 40% maksymalnej wartości nachylenia pola EPSP.

Następnie rejestruj linię bazową przez co najmniej 15 minut, mierząc reakcje na bodźce testowe co minutę przez cały czas trwania eksperymentu. Aby wywołać późne LTP, zastosuj teinę o wysokiej częstotliwości, aby zwiększyć pole wywołane EPSP w około jednym regionie. Nałożyć pięć mikromolowców przez COE na płyn mózgowo-rdzeniowy A na dwie minuty przed tężyną i wypłukać natychmiast po ostatnim tężcu.

Zatrzymaj nagrywanie. Dwie minuty lub 30 minut po spóźnionej indukcji LTP wyjmij elektrody i szybko przenieś plasterek na wstępnie schłodzoną metalową platformę umieszczoną na suchym lodzie. Następnie zbierz każdy plasterek w 1,5-mililitrowej probówce z eend orph i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Na tym etapie wyjmij zamrożone plastry z ujemnych 80 stopni Celsjusza i trzymaj je na lodzie. Dodać 0,5 mililitra świeżego zimnego buforu TBS zawierającego inhibitory proteazy i fosfatazy do probówki. Inkubuj je przez dwie do trzech minut przed przeniesieniem do mikroskopu stereoskopowego.

Następnie rozetnij CA jeden region warstwy parama dole hipokampa, przytrzymując plasterek jedną igłą i przecinając CA jeden obszar drugim. Następnie zbierz wycięte około jednego regionu z pięciu plasterków na grupę w nowej jednopunktowej probówce mililitrowej zawierającej 50 mikrolitrów buforu do lizy. Następnie homogenizuj pobrane tkanki, ostrożnie pipetując w górę iw dół za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów.

Inkubuj lizat na lodzie przez pięć do siedmiu minut, aby komórki mogły pęcznieć. Następnie weź dwa mikrolitry lizatu i upuść go na szkiełko mikroskopowe. Wizualizuj pęcznienie komórek pod mikroskopem jasnego pola.

Jądra wyglądają jak okrągłe, nienaruszone struktury z odpowiednim obrzękiem. Teraz zbierz 20 mikrolitrów próbki w świeżej 1,5 mililitrowej probówce jako frakcję homogenatu. Dodać osiem mikrolitrów denaturacji czterech do próbek XSDS.

Następnie odwirować pozostały lizat w temperaturze 1100 RCF przez jedną minutę. Po minucie ostrożnie zebrać supernatant od góry i przenieść go do nowej probówki. Następnie dodać 20 mikrolitrów czterech x buforu do próbek.

Następnie ponownie zawiesić osad w 60 mikrolitrach buforu hipotonicznego i dodać 20 mikrolitrów czterokrotnego buforu do próbek. Frakcja ta jest określana jako frakcja wzbogacona jądrowo. Frakcje homogenatowe, cytozolowe i wzbogacone jądrowo należy przechowywać w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza lub ujemnej 80 stopni Celsjusza.

W celu późniejszego immunoblottingu w tej procedurze należy rozmrozić próbki i gotować je przez pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza przed pomiarem stężenia białka za pomocą testu AM mito black lub obciążenia testowego BCA, równej ilości próbek białka z frakcji homogenatu, cytoplazmatycznej i wzbogaconej jądrowo. Na stronie karty charakterystyki próbki żelu z plastrów kontrolnych i LTP należy umieścić na tym samym żelu w celu bezpośredniego porównania w Western blot. Rysunek ten przedstawia immuno blot dla homogenatów, cytozolowych i wzbogaconych jądrowo frakcji ca jednego lizatu badanego markerami cytozolowymi i jądrowymi.

Jest to analiza immuno blot poziomów PJS 180 w homogenacie dwie minuty i 30 minut po indukcji teiny, a jest to analiza immunologiczna krwi poziomów PJS 180 we frakcji wzbogaconej jądrowo. Dwie minuty i 30 minut po izacji poziomy fosfo Jacoba pozostały niezmienione w całkowitych homogenatach białka CA one i we frakcji wzbogaconej jądrowo dwie minuty po izacji. Ale znaczny wzrost stwierdzono w p Jacob, S 180 Immunoreaktywność 30 minut po indukcji LTP.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o użyciu odpowiedniej objętości hipotonicznego zaworu do lizy. Należy również ustandaryzować krytyczne ramy czasowe lizy próbek. W szczególności, gdy metoda ta jest stosowana do izolacji jądra i frakcji z próbek tkanki mózgowej szczura lub myszy innych niż hipokamp Po tej procedurze pomocne w weryfikacji tych wyników mogą być inne metody, takie jak uzupełniające barwienie immunologiczne przeciwciałem przeciwko białkom kandydującym importowanym do jądra po indukcji OTP lub cząsteczki sygnałowe, takie jak aktywne formy kinazy lub fosfatazy.

Leczenie farmakologiczne można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania. Na przykład, jakie kaskady sygnałowe są zaangażowane w translokację synaptycznych białek jądrowych lub jak wpływają na funkcję jądrową. Ponadto można badać rolę białek przekaźnikowych jądrowych synap w chorobach obejmujących hipokamp.

Na przykład choroba Alzheimera.