Name: Test tworzenia komórek śródbłonka do badania angiogenezy in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Poznaj test tworzenia komórek śródbłonka do badania angiogenezy in vitro. Ta metoda pozwala wizualizować i ilościowo oceniać sieci naczyń krwionośnych w ciągu kilku godzin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było częściowo wspierane przez Intramural Research Program National Cancer Institute at the National Institutes of Health, oraz przez granty NCI UA5CA152907.

1. Zbiór kondycjonowanych pożywek do badania potencjału angiogennego
<ol>
	<li>Hoduj pierwotne lub unieśmiertelnione komórki, które mają być testowane pod kątem potencjału angiogennego lub antyangiogennego w pożywce natywnej lub o niskiej surowicy i zbierz kondycjonowane podłoża.
	<ol>
		<li>Alternatywnie należy natychmiast użyć kondycjonowanych pożywek lub podtrzymać je i przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy. Stosować niekondycjonowane pożywki natywne lub o niskiej surowicy jako kontrolę ujemną i używać niekondycjonowanych kompletnych pożywek wzrostowych (10% FBS lub odpowiednie stężenie) jako kontroli pozytywnej. Alternatywnie, aby przetestować potencjalne stymulatory angiogenezy, uzupełnij pożywki pozbawione węgla drzewnego pozbawione czynników wzrostu znanymi stężeniami określonych białek będących przedmiotem zainteresowania i porównaj je z samymi pożywkami wolnymi od czynników wzrostu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek śródbłonka przed testem
<ol>
	<li>Dwa dni przed testem należy przejść komórki 3B-11 do nowej kolby T-75. Ważna jest liczba komórek pasażowych. Ten test działa najlepiej, gdy komórki znajdują się między drugim a szóstym pasażem. Test nie będzie działał dobrze, jeśli komórki śródbłonka zostaną użyte przed drugim lub po dziesiątym pasażu.</li>
	<li>Hoduj komórki przez 24 godziny w DMEM uzupełnionym 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.</li>
	<li>Na dzień przed badaniem surowica głodze komórki 3B-11 w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę z komórek 3B-11.</li>
		<li>Dodaj zredukowaną pożywkę surowicy DMEM uzupełnioną 0,2% FBS, 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.</li>
		<li>Hoduj komórki przez dodatkowe 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie odczynników przed testem
UWAGA: Stężenia BME są bardzo zmienne w zależności od partii. BME nie działa dobrze, jeśli stężenie jest mniejsze niż 10 mg/ml, dlatego przed zakupem należy skontaktować się z producentem BME, aby zapewnić nabycie odpowiednio skoncentrowanej partii.
<ol>
	<li>Rozmrażaj zredukowany czynnik wzrostu BME w lodówce. BME krzepnie na ciepło, dlatego przed użyciem należy go przechowywać w niskiej temperaturze. BME może być przechowywany w lodówce przez kilka tygodni lub porcjowany i zamrażany w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>BME o obniżonym współczynniku wzrostu jest preferowany w stosunku do tradycyjnego BME. Brak czynników angiogennych w BME ułatwi obserwację wpływu czynników z kondycjonowanych pożywek na tworzenie się rurek.</li>
	<li>Rozmrozić podłoże do przetestowania.</li>
</ol>
4. Przygotowanie komórek śródbłonka bezpośrednio przed badaniem
<ol>
	<li>Umyj komórki 3B-11 w DPBS.
	<ol>
		<li>Jeśli pożądana jest wizualizacja za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej, przed przemyciem komórek 3B-11 dodaj kalceinę AM do komórek śródbłonka w pożywce w końcowym stężeniu 2 μg/ml. Umieść komórki znakowane kalceiną w ciemności w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przed rozpoczęciem testu. Rozpuścić kalceinę podstawową AM w DMSO, a po rozcieńczeniu kalceiny w pożywce końcowe stężenie DMSO nie powinno przekraczać 0,1%. Po 30-45 minutach wypłucz kalceinę AM z komórek (krok 4.1 powyżej) i kontynuuj eksperyment.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trypsynizować komórki, dodając 1 ml trypsyny-EDTA do kolby T-75.</li>
	<li>Po zakończeniu trypsynizacji zneutralizuj trypsynę, ponownie zawieszając komórki do końcowej objętości 10 ml w DMEM, 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.</li>
	<li>Przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 100 μm, aby usunąć grudki.</li>
	<li>Policz komórki i ponownie zawieś komórki do końcowego stężenia 7,5 x 106 komórek/ml w DMEM, 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.</li>
</ol>
5. Test tworzenia probówek
<ol>
	<li>Umieść 24-dołkową płytkę i końcówki o pojemności 1 ml w lodówce lub na lodzie na 20-30 minut przed załadowaniem płytki, aby BME nie zastygło przedwcześnie.</li>
	<li>Odmierzyć pipetę 250 μl zredukowanego czynnika wzrostu BME do każdego dołka na 24-dołkowej płytce. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza, nie wciskając pipety do ostatniego oporu podczas dozowania. Uważaj, aby wystarczająca ilość BME pozostała w środku studni, gdy utworzy się łąkotka; Jeśli matryca jest zbyt cienka, komórki utworzą tylko monowarstwę.</li>
	<li>Inkubować 24-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut w celu zestalenia BME.</li>
	<li>Po związaniu BME wymieszaj około 300 μl kondycjonowanej pożywki z 10 μl zawieszonych komórek 3B-11 (około 75 000 komórek).
	<ol>
		<li>Dostosuj objętość kondycjonowanej pożywki i liczbę posianych komórek w zależności od użytego typu komórek śródbłonka i przetestuj seryjne rozcieńczenia kondycjonowanej pożywki, aby wykazać aktywność. Porównując komórki hodowane w różnych warunkach, znormalizuj objętość kondycjonowanej pożywki do liczby komórek, które zostały użyte do kondycjonowania pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Probówki zaczną się formować w ciągu 2-4 godzin. W zależności od stężenia czynnika angiogennego w kondycjonowanym pożywce, tworzenie się piku w probówce może nastąpić między 3 a 12 godzinami, a czas testu będzie musiał zostać zoptymalizowany. W przypadku pracy z pierwotnymi komórkami śródbłonka zamiast komórek unieśmiertelnionych, początkowe tworzenie rurki może być opóźnione o kilka godzin.
	<ol>
		<li>Rurki często zaczynają się pogarszać w ciągu 18 godzin, a komórki śródbłonka ulegają apoptozie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W momencie tworzenia się rurki szczytowej należy ostrożnie zassać media ze studni, aby uniknąć zakłócenia sieci rur w BME.
	<ol>
		<li>Umyj każdą studzienkę 1 ml DPBS, a następnie aspiruj.
		<ol>
			<li>W celu natychmiastowej wizualizacji dodać 1 ml świeżego DPBS do każdej studzienki i zobrazować sieć probówek za pomocą mikroskopu odwróconego podłączonego do kamery cyfrowej lub mikroskopu fluorescencyjnego/konfokalnego, jeśli komórki były barwione kalceiną AM, jak w 4.1.1.</li>
			<li>Aby zamocować sieć probówek do późniejszej wizualizacji, dodaj 4% paraformaldehydu do każdej zasysanej studzienki i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
			<ol>
				<li>Usuń paraformaldehyd, przemyj dwukrotnie DPBS, a następnie dodaj 1 ml świeżego DPBS do każdej studzienki.</li>
				<li>Obraz mikroskopowy przed fiksacją, ponieważ podczas tej procedury może pęknąć kilka rurek.</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja sieci rur
<ol>
	<li>Określ ilościowo sieć rur na kilka różnych sposobów, w zależności od preferencji badacza, a kilka programów komputerowych ma możliwość pomiaru następujących parametrów: liczba rurek, liczba pętli/oczek, liczba miejsc rozgałęzień/węzłów, długość rur.</li>
	<li>Użyj reprezentatywnego programu komputerowego, takiego jak Image J z wtyczką Angiogenesis Analyzer16 do ilościowego oznaczania sieci lamp.</li>
</ol>

<ol><li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+life%2C+disease+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438, 932-936 (1038).</li>
<li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473, 298-307 (2011).</li>
<li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146, 873-887 (2011).</li>
<li>Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+and+VEGF+in+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells and VEGF in vascular development.</a> Nature. 438, 937-945 (2005).</li>
<li>Bouis, D., Kusumanto, Y., Meijer, C., Mulder, N. H., Hospers, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+pro-+and+anti-angiogenic+factors+as+targets+of+clinical+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+research+%3A+the+official+journal+of+the+Italian+Pharmacological+Society%22%5BJournal%5D)">A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention.</a> Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society. 53, 89-103 (2006).</li>
<li>Ausprunk, D. H., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+and+proliferation+of+endothelial+cells+in+preformed+and+newly+formed+blood+vessels+during+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis.</a> Microvascular research. 14, 53-65 (1977).</li>
<li>Chung, A. S., Lee, J., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+tumour+vasculature%3A+insights+from+physiological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting the tumour vasculature: insights from physiological angiogenesis.</a> Nature reviews. Cancer. 10, 505-514 (2010).</li>
<li>Chung, A. S., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Developmental and pathological angiogenesis.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27, 563-584 (2011).</li>
<li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor angiogenesis.</a> The New England journal of medicine. 358, 2039-2049 (2008).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+angiogenesis%3A+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor angiogenesis: therapeutic implications.</a> The New England journal of medicine. 285, 1182-1186 (1056).</li>
<li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+laminin+and+basement+membrane+in+the+morphological+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.</a> The Journal of cell biology. 107, 1589-1598 (1988).</li>
<li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+cell+tube+formation+assay+on+basement+membrane+turns+20%3A+state+of+the+science+and+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art.</a> Angiogenesis. 12, 267-274 (2009).</li>
<li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+angiogenesis%3A+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nature protocols. 5, 628-635 (2010).</li>
<li>Walter-Yohrling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+endothelial+cell+lines+as+models+of+tumor+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+cancer+research+%3A+an+official+journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Murine endothelial cell lines as models of tumor endothelial cells.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 10, 2179-2189 (2004).</li>
<li>Connell, K. A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> Journal of immunology. , Baltimore, Md. 144-521 (1950).</li>
<li>Carpentier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+contribution%3A+Angiogenesis+Analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22ImageJ+News%22%5BJournal%5D)">ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer.</a> ImageJ News. , (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Angiogeneza bierze udział zarówno w procesach fizjologicznych, jak i patologicznych. Badanie mechanizmów związanych z angiogenezą wymaga użycia testów, które podsumowują główne etapy angiogenezy. Test tworzenia komórek śródbłonka ma kilka zalet w porównaniu z innymi testami. Jest łatwy w konfiguracji, jest stosunkowo niedrogi, wytwarza kanaliki w ciągu kilku godzin i jest wymierny. Co więcej, można go wykonać na płytkach 24- lub 96-dołkowych, a tym samym może być stosowany do wysokoprzepustowych badań przesiewowych w cel...

Angiogeneza, rozwój nowych naczyń krwionośnych z wcześniej istniejących naczyń, jest niezbędna dla różnych procesów, w tym wzrostu narządów, rozwoju embrionalnego i gojenia się ran1-3. Nowo powstałe naczynia krwionośne, wyściełane komórkami śródbłonka, dostarczają tlen i składniki odżywcze do tkanek, wspomagają nadzór immunologiczny przez komórki krwiotwórcze i usuwają produkty przemiany materii2,4. Angiogeneza ma kluczowe znaczenie podczas rozwoju embrionalnego i płodowego. Jednak proces ten pozostaje uśpiony u osoby dorosłej, z wyjątkiem okresów gojenia się ran, wzrostu szkieletu, ciąży lub cyklu miesiączkowego1-3.
W ciągu ostatnich dwóch dekad zaczęły się wyłaniać kluczowe mechanizmy molekularne regulujące angiogenezę. Angiogeneza jest ściśle regulowanym zdarzeniem, równoważonym przez sygnały pro i antyangiogenne, w tym integryny, chemokiny, angiopoetyny, środki wykrywające tlen, cząsteczki łączące i endogenne inhibitory5. Po wywołaniu sygnałów proangiogennych, takich jak podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF), płytkowy czynnik wzrostu (PDGF) i naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), aktywują receptory komórek śródbłonka, komórki śródbłonka uwalniają proteazy w celu degradacji błony podstawnej. Komórki śródbłonka następnie namnażają się i migrują, tworząc kiełki w tempie kilku milimetrów dziennie6,7.
Angiogeneza jest związana z różnymi stanami patologicznymi, takimi jak rak, łuszczyca, retinopatia cukrzycowa, zapalenie stawów, astma, choroby autoimmunologiczne, choroby zakaźne i miażdżyca8-10. Ze względu na znaczenie angiogenezy w różnych chorobach, zrozumienie genów i szlaków, które regulują ten proces, ma kluczowe znaczenie dla projektowania lepszych terapii.
Test tworzenia probówek jest szybką i ilościową metodą określania genów lub szlaków zaangażowanych w angiogenezę. Po raz pierwszy opisany w 1988 roku, zasady leżące u podstaw tego testu polegają na tym, że komórki śródbłonka zachowują zdolność do szybkiego podziału i migracji w odpowiedzi na sygnały angiogenne11-13. Co więcej, komórki śródbłonka są indukowane do różnicowania się i tworzenia struktur przypominających rurki, gdy są hodowane na matrycy ekstraktu z błony podstawnej (BME). Rurki te zawierają światło otoczone komórkami śródbłonka połączonymi ze sobą kompleksami połączeniowymi. Tworzenie się rurki następuje szybko, przy czym większość probówek tworzy się w tym teście w ciągu 2-6 godzin, w zależności od ilości i rodzaju bodźców angiogennych.
Do tego testu można użyć kilku typów komórek śródbłonka, w tym zarówno komórek pierwotnych, jak i linii komórek unieśmiertelnionych14,15. Linia komórkowa użyta w tym artykule to mysia 3B-11, ale ta sama metodologia może być zastosowana do innych linii komórek śródbłonka, takich jak SVEC4-10 (mysz) lub pierwotnych komórek śródbłonka, takich jak HUVEC (ludzkie). W zależności od tego, która linia komórkowa jest używana i czy komórki śródbłonka są przekształcone, czy nie, konieczne będzie przeprowadzenie optymalizacji w celu określenia idealnego czasu potrzebnego do prawidłowego uformowania rurki.

<table><tbody><tr><td>Costar 24-dołkowa płytka poddana kulturze tkankowej</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel matryca błony podstawnej, obniżony czynnik wzrostu</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Gibco 0,05% trypsyna-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Gibco L-glutamina 200 mM (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Paciorkowiec Gibco pen paciorkowiec</td><td>Life Technologie</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gibco DMEM (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Gibco DPBS (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Atlas Biologicals</td><td>F-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ATCC</td><td>4-X</td><td></td></tr></tbody></table>

test tworzenia komórek śródbłonka do badania angiogenezy in vitro

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogeneza jest procesem niezbędnym do prawidłowego rozwoju tkanek i gojenia się ran, ale jest również związana z różnymi stanami patologicznymi. Korzystając z tego protokołu, angiogenezę można mierzyć in vitro w szybki i wymierny sposób. Pierwotne lub unieśmiertelnione komórki śródbłonka miesza się z kondycjonowanym podłożem i plateruje na macierzy błony podstawnej. Komórki śródbłonka tworzą struktury przypominające naczynia włosowate w odpowiedzi na sygnały angiogenne znajdujące się w kondycjonowanych pożywkach. Tworzenie rurki następuje szybko, a komórki śródbłonka zaczynają się wyrównywać w ciągu 1 godziny, a kanaliki zawierające światło zaczynają pojawiać się w ciągu 2 godzin. Probówki można wizualizować za pomocą mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym lub komórki można leczyć kalceiną AM przed testem, a probówki wizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej. Liczba miejsc/węzłów rozgałęzień, pętli/siatek lub liczba lub długość utworzonych rurek mogą być łatwo określone ilościowo jako miara angiogenezy in vitro. Podsumowując, test ten można wykorzystać do identyfikacji genów i szlaków, które są zaangażowane w promowanie lub hamowanie angiogenezy w szybki, powtarzalny i ilościowy sposób.

Mysie komórki śródbłonka 3B-11 wysiano na zestalone BME o zredukowanej zawartości czynników wzrostu – w tym badaniu wykorzystano produkt Matrigel – a następnie obserwowano je w czasie. Jak pokazano na Rysunku 1, czynniki angiogenne wydzielane przez mysie keratynocyty lub fibroblasty są w stanie indukować tworzenie rurek w czasie. Komórki śródbłonka migrują i zaczynają tworzyć małe odgałęzienia w ciągu 1-2 hr od wysiania. Maksymalne tworzenie rurek osiągnięto po 4-6 hr przy użyciu pożywek kondycjonowanych...

Test tworzenia probówek jest szybką, mierzalną metodą pomiaru angiogenezy in vitro. Komórki śródbłonka łączy się z kondycjonowanymi pożywkami i plateruje ekstraktem z błony podstawnej. Tworzenie się rurki następuje w ciągu kilku godzin, a nowo utworzone kanaliki można łatwo określić ilościowo.

Test tworzenia komórek śródbłonka do badania angiogenezy in vitro

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie genów lub szlaków zaangażowanych w angiogenezę przy użyciu szybkiej i ilościowej metody in vitro. W tym celu w pierwszym kroku, na dzień przed wykonaniem testu, poddaje się pierwotne lub unieśmiertelnione komórki śródbłonka głodzeniu seryjnemu. W drugim kroku komórki śródbłonka inkubuje się z kalcyfonicyną przez 30 minut, a następnie przemywa komórki roztworem PBS.Następnie komórki śródbłonka poddaje się trypsynizacji, filtruje w celu usunięcia skupisk i przelicza. W ostatnim kroku komórki śródbłonka łączy się z medium warunkowanym zawierającym potencjalne czynniki angiogenne, a następnie nanosi je na zestaloną ekstrakcję błony podstawnej. Ostatecznie, do wizualizacji sieci rurek wykorzystuje się mikroskopię świetlną lub fluorescencyjną, a następnie przeprowadza się ich ilościową analizę za pomocą specjalistycznych programów komputerowych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami badania angiogenezy jest łatwość przygotowania, stosunkowo niski koszt oraz zdolność do tworzenia cewek w ciągu kilku godzin, co umożliwia ilościową ocenę z zastosowaniem tej metody. Czy Erica Bullwinkle jest doktorantką na wydziale biologii na American University? Przy użyciu odpowiedniego medium przenieś komórki 3B11 do nowej kolby na dwa dni przed rozpoczęciem testu; dla uzyskania najlepszych wyników należy używać komórek między drugim a szóstym pasażem.Następnie hoduj komórki przez 24 godziny w uzupełnionym medium dmm. Gdy komórki będą gotowe, należy przeprowadzić ich głodzenie surowkowe. Po zastąpieniu pożywki medium z obniżoną zawartością surowicy, hoduj komórki poddane głodzeniu surowkowemu przez kolejne 24 godziny.Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy potwierdzić u producenta, czy stężenie roztworu zapasowego BME wynosi 10 mg/mL. Odmrozić zredukowany czynnik wzrostu BME w lodówce. Ponieważ BME krzepnie w temperaturze pokojowej, przed użyciem należy go przechowywać w warunkach chłodniczych.Następnie rozmrozić pożywkę niezbędną do analizy w celu wizualizacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej i dodać Calcein AM do pożywki do końcowego stężenia 2 µg/mL. Komórki znakowane Calcein AM inkubować w ciemności przez około 30 do 45 minut. Po tym czasie usunąć pożywkę i przemyć komórki 3B11 w DPBS. Następnie poddać komórki trypsynizacji, dodając 1 mL trypsyny z EDTA. Po zakończeniu trypsynizacji.Resuspender komórki do końcowej objętości 10 ml. W suplementowanym dmm usunąć wszelkie skupiska komórek, filtrując je przez sito komórkowe o oczkach 100 µm. Po policzeniu komórek resuspender je do właściwego stężenia końcowego, aby rozpocząć test tworzenia cewek.Płytkę 24-dołkową oraz końcówki o objętości jednego mililitra należy ogrzać przez 20 do 30 minut przed napełnianiem. Zapobiega to przedwczesnemu zestaleniu się BME w momencie rozpoczęcia pipetowania. Do każdego dołka płytki 24-dołkowej należy nanieść 250 µL zredukowanego czynnika wzrostu BME. Aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza, nie należy dociskać tłoka pipety do samego końca.Podczas pipetowania, po napełnieniu dołków, należy upewnić się, że w centrum dołka pozostała wystarczająca ilość BME. Jeśli w momencie tworzenia się menisku macierz będzie zbyt cienka, komórki utworzą jedynie monowarstwę. Następnie inkubuj płytkę przez 30 minut, aby BME uległo zestaleniu.Po zastygnięciu BME wymieszać około 300 µL medium warunkującego z 10 µL resuspensowanych komórek three B 11, a następnie nanieść zawiesinę komórkową do dołków płytki. Po umieszczeniu płytki w inkubatorze w ciągu dwóch do czterech godzin zaczną tworzyć się cewki. W zależności od stężenia czynników angiogennych w medium warunkującym szczyt tworzenia cewek może nastąpić między 3 a 12 godzinami. Czas trwania testu musi zostać zoptymalizowany dla poszczególnych warunków badania.Tubule prawdopodobnie zaczną ulegać degradacji w ciągu 18 godzin, a komórki śródbłonka przejdą apoptozę w momencie szczytu formowania tubul. Ostrożnie odessać pożywkę z dołka, aby nie uszkodzić sieci tubul. Następnie przemyć każdy dołek jednym mililitrem DPBS w celu natychmiastowej wizualizacji.Do każdej studzienki dodaj jeden mililitr świeżego DPBS i wykonaj obrazowanie sieci naczyń za pomocą mikroskopu konfokalnego, aby utrwalić sieć naczyń do późniejszej wizualizacji. Do każdej odessanej studzienki dodaj 4% paraformaldehydu i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po usunięciu paraformaldehydu przemyj studzienki dwukrotnie DPBS, a następnie dodaj jeden mililitr świeżego DPBS do każdej z nich. Obrazy te pokazują, że czynniki angiogenne wydzielane przez keratynocyty lub fibroblasty mysie są zdolne do indukcji tworzenia naczyń.Z biegiem czasu komórki śródbłonka migrują i zaczynają tworzyć niewielkie rozgałęzienia w ciągu jednej do dwóch godzin od wysiania. Maksymalny stopień tworzenia rurek osiągnięto po czterech do sześciu godzinach. Po 24 godzinach część rozgałęzień pozostała, jednak wiele komórek uległo apoptozie, a rurki zaczęły się rozdzielać.Liczba komórek ma ogromny wpływ na tworzenie cewek. Gdy wysiewana jest niewystarczająca liczba komórek, powstaje niewiele cewek, a sieć jest minimalna; wraz ze zwiększaniem liczby wysiewanych komórek sieć cewek staje się bardziej rozległa. Jednak przy zbyt wysokim stężeniu komórki zaczynają się skupiać lub tworzyć monowarstwy, co maskuje różnice między grupami badawczymi. Komórki powinny przejść co najmniej dwa pasażowania, aby zapewnić prawidłowe tworzenie cewek.Szybkość wzrostu linii B 11 jest tak duża, że pasaż 25% komórek w jednym dniu prowadzi do uzyskania konfluencji w kolbie następnego dnia. W niniejszym przypadku program Image J z wtyczką do angiogenezy jest wykorzystywany do analizy sieci cewek barwionych calcine AM w celu wykrycia całkowitej liczby węzłów, cewek w sieci w kombinacji oraz połączeń w sieci. Dodatkowo program ten może być użyty do indywidualnego wykrywania węzłów, cewek lub sieci, co umożliwia ich kwantyfikację.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak w szybki i niezawodny sposób przeprowadzić angiogenezę in vitro, unikając jednocześnie częstych błędów.

endothelial-cell-tube-formation-assay-for-vitro-study

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Test tworzenia tubuli komórek śródbłonkowych do in vitro badań nad angiogeneszą

Niniejszy film prezentuje protokół testu angiogenezy in vitro, który odtwarza kilka etapów angiogenezy. Przedstawiono obrazy time-lapse ukazujące kiełkowanie, formowanie światła naczyń, rozgałęzianie oraz anastomozę – kluczowe cechy angiogenezy.

Zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego do badania angiogenezy

Test tworzenia cewek stosuje się do oceny aktywności naczyniowej komórek nowotworowych.

Test tworzenia rurek na Matrigelu do oceny aktywności waskulogennej komórek nowotworowych

Mysia siatkówka noworodka dostarcza dobrze scharakteryzowanego fizjologicznego modelu angiogenezy, który pozwala na badanie ról różnych genów lub leków modulujących angiogenezę w kontekście in vivo. Barwienie immunofluorescencyjne w celu dokładnej wizualizacji splotu naczyniowego ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego typu badań.

Barwienie immunofluorescencyjne siatkówki noworodka myszy w celu zbadania angiogenezy in vivo

Ten manuskrypt opisuje test tworzenia rurki w celu ilościowego określenia wpływu danego związku lub stanu na angiogenezę za pomocą tworzenia komórek śródbłonka w kontrolowanym środowisku.

Strategiczny test tworzenia rurki śródbłonkowej: porównanie macierzy zewnątrzkomórkowej i zredukowanej macierzy zewnątrzkomórkowej czynnika wzrostu

Przedstawiamy protokół do badania interakcji między ludzkim śródbłonkiem a perycytami u myszy za pomocą wariantu testu angiogenezy z zatyczką żelową macierzy.

In vivo (in vivo) Badanie interakcji śródbłonka człowieka z perycytami za pomocą testu Matrix Gel Plug u myszy

Tutaj oceniamy wpływ ekstraktu wodnego z Ruta graveolens na tworzenie sieci naczyń krwionośnych, używając testu formowania probówek na zżelowanej matrycy podstawowej.

Test tworzenia rurki HUVEC w celu oceny wpływu produktów naturalnych na angiogenezę

Celem tej metody jest uzyskanie matryc 3D pochodzących z fibroblastów jako naturalnego rusztowania dla kolejnych testów komórkowych. Fibroblasty wysiewa się na wstępnie poddanej obróbce płytce hodowlanej i stymuluje kwasem askorbinowym w celu wytworzenia matrycy. Matryce są decellularizowane i blokowane w celu hodowli odpowiednich komórek (np. komórek śródbłonka).

System matrycowy 3D pochodzący z fibroblastów mający zastosowanie do oznaczania tworzenia rurki śródbłonka

Prezentowany tutaj jest protokół do analizy hybrydyzacji RNA in situ u ryb danio pręgowanych oraz testu tworzenia probówek w indukowanych pluripotencjalnych komórkach śródbłonka pochodzących od pacjenta w celu zbadania roli endoglinu w tworzeniu naczyń krwionośnych.

Hybrydyzacja in situ w całości w zarodkach danio pręgowanego i test tworzenia rurek w iPSC-EC w celu zbadania roli endoglinu w rozwoju naczyniowym

Ten test wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała embrionalne hodowane w żelu 3D-collagen do analizy procesów biologicznych, które kontrolują angiogenezę kiełkowania in vitro. Technika ta może być stosowana do testowania leków, modelowania chorób oraz do badania określonych genów w kontekście delecji, które są śmiertelne dla zarodka.

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

Obecny protokół pozwala na odzyskanie struktur przypominających rurki powstałych w klasycznym teście angiogenezy in vitro, gdzie komórki, takie jak komórki trofoblastu, organizują się w struktury podobne do naczyń włosowatych na warstwie zewnątrzkomórkowej macierzy błony podstawnej. Odzyskane struktury są wykorzystywane do izolacji RNA i białek do różnych analiz biochemicznych.

Odzyskiwanie komórek trofoblastu z testu tworzenia rurki angiogenezy do analizy ekspresji markerów różnicowania

Poznaj test tworzenia komórek śródbłonka do badania angiogenezy in vitro. Ta metoda pozwala wizualizować i ilościowo oceniać sieci naczyń krwionośnych w ciągu kilku godzin.

Test tworzenia komórek śródbłonka do badania angiogenezy in vitro

Przeglądaj więcej filmów