Test tworzenia komórek śródbłonka do badania angiogenezy in vitro

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie genów lub szlaków zaangażowanych w angiogenezę przy użyciu szybkiej i ilościowej metody in vitro. W tym celu w pierwszym kroku, na dzień przed wykonaniem testu, poddaje się pierwotne lub unieśmiertelnione komórki śródbłonka głodzeniu seryjnemu. W drugim kroku komórki śródbłonka inkubuje się z kalcyfonicyną przez 30 minut, a następnie przemywa komórki roztworem PBS.

Następnie komórki śródbłonka poddaje się trypsynizacji, filtruje w celu usunięcia skupisk i przelicza. W ostatnim kroku komórki śródbłonka łączy się z medium warunkowanym zawierającym potencjalne czynniki angiogenne, a następnie nanosi je na zestaloną ekstrakcję błony podstawnej. Ostatecznie, do wizualizacji sieci rurek wykorzystuje się mikroskopię świetlną lub fluorescencyjną, a następnie przeprowadza się ich ilościową analizę za pomocą specjalistycznych programów komputerowych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami badania angiogenezy jest łatwość przygotowania, stosunkowo niski koszt oraz zdolność do tworzenia cewek w ciągu kilku godzin, co umożliwia ilościową ocenę z zastosowaniem tej metody. Czy Erica Bullwinkle jest doktorantką na wydziale biologii na American University? Przy użyciu odpowiedniego medium przenieś komórki 3B11 do nowej kolby na dwa dni przed rozpoczęciem testu; dla uzyskania najlepszych wyników należy używać komórek między drugim a szóstym pasażem.

Następnie hoduj komórki przez 24 godziny w uzupełnionym medium dmm. Gdy komórki będą gotowe, należy przeprowadzić ich głodzenie surowkowe. Po zastąpieniu pożywki medium z obniżoną zawartością surowicy, hoduj komórki poddane głodzeniu surowkowemu przez kolejne 24 godziny.

Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy potwierdzić u producenta, czy stężenie roztworu zapasowego BME wynosi 10 mg/mL. Odmrozić zredukowany czynnik wzrostu BME w lodówce. Ponieważ BME krzepnie w temperaturze pokojowej, przed użyciem należy go przechowywać w warunkach chłodniczych.

Następnie rozmrozić pożywkę niezbędną do analizy w celu wizualizacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej i dodać Calcein AM do pożywki do końcowego stężenia 2 µg/mL. Komórki znakowane Calcein AM inkubować w ciemności przez około 30 do 45 minut. Po tym czasie usunąć pożywkę i przemyć komórki 3B11 w DPBS. Następnie poddać komórki trypsynizacji, dodając 1 mL trypsyny z EDTA. Po zakończeniu trypsynizacji.

Resuspender komórki do końcowej objętości 10 ml. W suplementowanym dmm usunąć wszelkie skupiska komórek, filtrując je przez sito komórkowe o oczkach 100 µm. Po policzeniu komórek resuspender je do właściwego stężenia końcowego, aby rozpocząć test tworzenia cewek.

Płytkę 24-dołkową oraz końcówki o objętości jednego mililitra należy ogrzać przez 20 do 30 minut przed napełnianiem. Zapobiega to przedwczesnemu zestaleniu się BME w momencie rozpoczęcia pipetowania. Do każdego dołka płytki 24-dołkowej należy nanieść 250 µL zredukowanego czynnika wzrostu BME. Aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza, nie należy dociskać tłoka pipety do samego końca.

Podczas pipetowania, po napełnieniu dołków, należy upewnić się, że w centrum dołka pozostała wystarczająca ilość BME. Jeśli w momencie tworzenia się menisku macierz będzie zbyt cienka, komórki utworzą jedynie monowarstwę. Następnie inkubuj płytkę przez 30 minut, aby BME uległo zestaleniu.

Po zastygnięciu BME wymieszać około 300 µL medium warunkującego z 10 µL resuspensowanych komórek three B 11, a następnie nanieść zawiesinę komórkową do dołków płytki. Po umieszczeniu płytki w inkubatorze w ciągu dwóch do czterech godzin zaczną tworzyć się cewki. W zależności od stężenia czynników angiogennych w medium warunkującym szczyt tworzenia cewek może nastąpić między 3 a 12 godzinami. Czas trwania testu musi zostać zoptymalizowany dla poszczególnych warunków badania.

Tubule prawdopodobnie zaczną ulegać degradacji w ciągu 18 godzin, a komórki śródbłonka przejdą apoptozę w momencie szczytu formowania tubul. Ostrożnie odessać pożywkę z dołka, aby nie uszkodzić sieci tubul. Następnie przemyć każdy dołek jednym mililitrem DPBS w celu natychmiastowej wizualizacji.

Do każdej studzienki dodaj jeden mililitr świeżego DPBS i wykonaj obrazowanie sieci naczyń za pomocą mikroskopu konfokalnego, aby utrwalić sieć naczyń do późniejszej wizualizacji. Do każdej odessanej studzienki dodaj 4% paraformaldehydu i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po usunięciu paraformaldehydu przemyj studzienki dwukrotnie DPBS, a następnie dodaj jeden mililitr świeżego DPBS do każdej z nich. Obrazy te pokazują, że czynniki angiogenne wydzielane przez keratynocyty lub fibroblasty mysie są zdolne do indukcji tworzenia naczyń.

Z biegiem czasu komórki śródbłonka migrują i zaczynają tworzyć niewielkie rozgałęzienia w ciągu jednej do dwóch godzin od wysiania. Maksymalny stopień tworzenia rurek osiągnięto po czterech do sześciu godzinach. Po 24 godzinach część rozgałęzień pozostała, jednak wiele komórek uległo apoptozie, a rurki zaczęły się rozdzielać.

Liczba komórek ma ogromny wpływ na tworzenie cewek. Gdy wysiewana jest niewystarczająca liczba komórek, powstaje niewiele cewek, a sieć jest minimalna; wraz ze zwiększaniem liczby wysiewanych komórek sieć cewek staje się bardziej rozległa. Jednak przy zbyt wysokim stężeniu komórki zaczynają się skupiać lub tworzyć monowarstwy, co maskuje różnice między grupami badawczymi. Komórki powinny przejść co najmniej dwa pasażowania, aby zapewnić prawidłowe tworzenie cewek.

Szybkość wzrostu linii B 11 jest tak duża, że pasaż 25% komórek w jednym dniu prowadzi do uzyskania konfluencji w kolbie następnego dnia. W niniejszym przypadku program Image J z wtyczką do angiogenezy jest wykorzystywany do analizy sieci cewek barwionych calcine AM w celu wykrycia całkowitej liczby węzłów, cewek w sieci w kombinacji oraz połączeń w sieci. Dodatkowo program ten może być użyty do indywidualnego wykrywania węzłów, cewek lub sieci, co umożliwia ich kwantyfikację.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak w szybki i niezawodny sposób przeprowadzić angiogenezę in vitro, unikając jednocześnie częstych błędów.