Mapowanie właściwości elastycznych ścian komórkowych w oparciu o AFM: w rozdzielczościach tkankowych, komórkowych i subkomórkowych

Ogólnym celem tej procedury jest odwzorowanie właściwości mechanicznych tkanek roślinnych za pomocą mikroskopu sił atomowych. Najpierw przygotuj szkiełka podstawowe, pipetując kroplę aros o niskiej temperaturze topnienia na wytrawiony obszar szkiełka, aby utworzyć cienką warstwę aros. Drugim krokiem jest wypreparowanie i zamontowanie próbki.

Usuń pąki kwiatowe z łodygi, odetnij łodygę marris od łodygi i natychmiast osadź łodygę cut me w cienkiej folii Agros na szkle. Przesuń następnie, dodaj tyle stopionego agrosu montażowego, aby wypełnić pęknięcie powstałe, gdy łodyga Maris została osadzona w folii Aros. Ostatnim krokiem jest ustawienie mikroskopu sił atomowych do zbierania danych.

Ostatecznie, analiza danych i pomiary pozornego modułu Younga ścian komórkowych generują mechaniczną mapę właściwości ścian komórkowych jednocześnie w rozdzielczościach subkomórkowych i w całych regionach tkanki. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącą metodą jest to, że może ona mierzyć właściwości mechaniczne ściany komórkowej jednocześnie w rozdzielczości subkomórkowej i na całym obszarze tkanki. Pożywka Aros do zatapiania próbek jest przygotowywana z 0,7% niskiej temperatury topnienia, aros w 10% mannitolu w wodzie.

Za pomocą mocnego metalowego narzędzia, takiego jak końcówka wiertła, wytraw obszar o wymiarach 0,5 na 0,5 centymetra w środku szkła mikroskopowego. Suwak ten powoduje zszorstkowanie powierzchni, aby ułatwić przyleganie agros, aby zapewnić, że podłoże agros przykleja się lub mocuje do szkiełka. Kropla około 20 mikrolitrów pożywki do zatapiania agros w wytrawionym obszarze szkiełka.

W ten sposób powstaje cienka warstwa agros. Przechowywać szkiełko podstawowe w wilgotnym pojemniku i czekać, aż pożywki Agros zestalą próbki z rzodkiewnika. Ana zostanie wykorzystana do mikroskopii sił atomowych w celu przygotowania próbek merystemu.

Usuń pąki kwiatowe jeden po drugim z łodygi, pociągając je w dół ultra drobną pęsetą. Ważne jest, aby usunąć wszystkie pąki kwiatowe aż do pąków, które nie wykazują następstw znanych jako P jeden etap. Za pomocą żyletki lub końcówki pęsety odetnij merystem od łodygi.

Cięcie powinno być równoległe do obszaru powierzchni merystemu, który ma być mierzony za pomocą mikroskopu sił atomowych lub FM. Uzyskany wierzchołek powinien mieć wysokość od 300 mikronów do 600 mikronów, aby nie rozpadł się podczas eksperymentu. Natychmiast wepchnij wierzchołek w cienką warstwę przygotowanego wcześniej podłoża aros. Wybierz pozycję na szkiełku podstawowym lub arosie i delikatnie popchnij, tak aby merystem stykał się bezpośrednio ze szkiełkiem podstawowym i wystawał z szkiełka.

Agros pęka pod wpływem nacisku, więc łodyga mari będzie teraz stała w pęknięciu. Bardzo ważne jest, aby umieścić łodygę marit w aros w ciągu kilku sekund, które następują po jej nacięciach od łodygi. Zapobiega to wysychaniu łodygi MA.

W ten sposób można przygotować kilka łodyg MA do obrazowania wsadowego, pod warunkiem, że mają tę samą wysokość i są oddalone od siebie o mniej niż 500 mikronów. Na szkiełku trzymaj przygotowane łodygi ma w wilgotnym pudełku podczas preparowania kolejnych próbek. Przed przejściem do następnego kroku użyj bibuły filtracyjnej, aby delikatnie usunąć nadmiar wody na granicy między merystemem a pąkami kwiatowymi.

Ma to na celu zapobieżenie zalaniu próbki przez stopione agros z powodu sił kapilarnych. Później za pomocą pipety o pojemności 20 mikrolitrów w ilości stopionego agrosu montażowego, aby wypełnić powstałą wcześniej szczelinę i otoczyć każdy merystem, aros powinien osiągnąć poziom blizny po usuniętym pąku kwiatowym lub pierwotnym gimnastyku. Aby to osiągnąć, może być konieczne dodanie agros na każdym końcu pęknięcia.

Po dodaniu agros szybko zaleje szczelinę. Za pomocą pipety zasysaj część stopionego materiału montażowego, aby upewnić się, że trzpień me jest najwyższym punktem na szkiełku. To naprawia łodygę me tak, że nie może się poruszać podczas obrazowania dla korzeni i hipo rozpieszczonych.

W cienkiej warstwie agros nie jest konieczna preparacja. Na przygotowanym szkiełku podstawowym za pomocą mikropęsety wykonaj rowek bezpośrednio nad wytrawionym szkłem lub wzdłuż szklanej blaszki Umieść korzeń lub hipo coddle w tym rowku, upewniając się, że styka się ze szkłem na całej długości uchwytu. Dodaj stopiony agros montażowy wokół próbki w taki sam sposób, jak pokazano dla próbki łodygi me.

Kreator JP PK nano. W tej demonstracji używany jest FM. Aby rozpocząć tę procedurę, zamontuj wspornik z okrągłym wgłębieniem na A FM. Promień określi rozdzielczość X, Y, Z i głębokość wcięcia, przy której można zarchiwizować dokładny pomiar.

Aby wykonać pomiary w skali mezo do nanoskali na powierzchni naskórka, użyj okrągłej wgłębienia o promieniu 50 nanometrów. Aby wykonać pomiary mezoskalowe, użyj okrągłej wgłębienia o promieniu 0,5 mikrona, a aby wykonać pomiary w mikroskali na dwóch do trzech komórkach, użyj okrągłej wgłębienia o promieniu 2,5 mikrona, umieść laser na końcówce wspornika. Ustaw laser na środku porywacza za pomocą lustra.

Umieść czystą szklankę pod podejściem A FM z celem dla wartości zadanej jednego wolta, wybierz do spektroskopii. Wykonaj wcięcie, ustawiając maksymalną względną wartość zadaną na dwa wolty, prędkość rozciągania na 40 mikronów na sekundę, a długość Z na pięć mikronów. Z menu menedżera kalibracji wybierz liniową część krzywej przedniej, aby dopasować czułość.

Za pomocą przycisku wyboru zakresu dopasowania względną wartość zadaną należy przekształcić z objętości na metr przy 200 mikrolitrach 10% roztworu manitolu. Pod końcówką wspornika ustaw laser na środku chwytacza za pomocą lustra, a przesuwając relikt, ponownie skalibruj czułość z menu menedżera kalibracji. Kliknij nieznany przycisk, wybierz cztery spektroskopie i wykonaj wcięcie, jak pokazano wcześniej.

Wybierz liniową część krzywej przedniej, aby dopasować czułość za pomocą przycisku wyboru zakresu dopasowania, aby rozpocząć tę procedurę, umieść zamontowane próbki pod A FM i dodaj 500 mikrolitrów kropli 10% roztworu manitolu na próbki. Roztwór manitolu plazmuje komórki w ciągu kilku minut zbliżają się do celu dla wartości zadanej 20 nano niutonów w wgnieceniu ze względną nastawą 200 nanoniutonów i rozszerzają prędkość 40 mikronów na sekundę i długość Z wynoszącą pięć mikronów. Dostosuj względną wartość zadaną, aby uzyskać wgłębienie 100 nanometrów dla zamontowanego wspornika o długości 200 nanometrów lub 0,5 mikrona dla jednego mikrona.

Tryb mapowania siły wspornikowej zamontowany na pięciu mikronach. Wybierz region do skanowania w poszukiwaniu łodyg mar: 70 na 70 mikronów z rozdzielczością 64 na 64 dla hypo cos i korzeni 100 na 100 mikronów z rozdzielczością 64 na 64. Naciśnij skanowanie, aby uruchomić eksperymenty, zapisać dane wyjściowe.

Zacznij od otwarcia pliku danych w oprogramowaniu do analizy danych. Następnie wybierz opcję Przetwarzanie wsadowe. Aby zastosować tę samą analizę do wszystkich krzywych na jednej mapie.

Wybierz opcję korygowania wysokości gięcia wspornika, aby wyodrębnić głębokość wcięcia. Wybierz funkcję dopasowania modułu Younga. Zakłada to, że siła jest proporcjonalna do obszaru wcięcia.

Ustaw kształt końcówki na paraboliczny, aby założyć, że kształt wcięcia jest parabolą. Wskaż promień końcówki. Następnie wybierz krzywą wycofania do analizy.

Krzywa wycofania jest preferowana w stosunku do krzywej xtend, ponieważ jest mniej wrażliwa na topografię. Ustaw współczynnik poso na 0,5. Na koniec naciśnij, przeanalizuj i zapisz dane wyjściowe.

We wszystkich eksperymentach pokazano tutaj typowe modularne mapy młodych pędów kwiatowych Marsa, młodych i starych hipo-coddles oraz korzeni MA. Wpór jest półkulisty, ale jego promień jest różny, dzięki czemu można uzyskać różne rozdzielczości przestrzenne. Mapy te pokazują typowe wyniki dla wgłębień w skali od mezo do nano o promieniu 50 nanometrów z wgłębieniami o głębokości 50 nanometrów.

Kardiograf ujawnia mikroskalowe niejednorodności w powierzchniowych ścianach komórkowych hipokodalnych komórek naskórka. Pokazano również typowe wyniki dla mezoskalowych wgłębień o promieniu 500 nanometrów z wgłębieniami o głębokości 500 nanometrów dla merystemu kwiatowego, hipo coddle i korzenia. Ten kardiograf do mikroskalowych wgłębień o promieniu 2,5 mikrona z wgłębieniami o głębokości 500 nanometrów ujawnił zmiękczenie tkanek podczas inicjacji narządu, które poprzedzało jakikolwiek widoczny wzrost.

Jednak to skanowanie zostało przerwane ze względu na to, że zakres wysokości próbki przekraczał maksymalny zakres Z A FM. Ruch próbki podczas eksperymentu spowodowany niewłaściwym utrwaleniem może spowodować rozmyty skan, jak pokazano tutaj. Regiony, które są pokryte agrosem, również nie mogą być prawidłowo zmierzone, jak pokazano w tym przykładzie. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.