Name: Mapowanie właściwości elastycznych ścian komórkowych w oparciu o AFM: w rozdzielczościach tkankowych, komórkowych i subkomórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Poznaj metodę mapowania właściwości mechanicznych ścian komórkowych roślin za pomocą mikroskopii sił atomowych AFM. Technika ta umożliwia pomiary w rozdzielczości subkomórkowej i tkankowej jednocześnie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Szczególne podziękowania kierujemy do Yves Couder za wiele pomocnych dyskusji. Dziękujemy firmie Atef Asnacios za kalibrację wsporników i dyskusję. Dziękujemy Lisie Willis, Elliotowi Meyerowitzowi i Oliverowi Hamantowi za krytyczną lekturę. Praca ta została częściowo sfinansowana z grantu Human Frontier Science Program RGP0062/2005-C; Agence Nationale de la Recherche projektuje projekty "Growpec" i "Mechastem".

1. Przygotuj szkiełka do montażu próbki
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę agarozową do zatapiania: 0,7% agarozy niskotopliwej w 10% mannitolu (w wodzie).</li>
	<li>Za pomocą mocnego metalowego narzędzia (np. końcówki wiertła, wapna) wytrawić obszar o wymiarach 0,5 x 0,5 cm na środku szkiełka mikroskopowego. Lub zamiast tego przyklej mały kawałek szklanej blaszki (około 20 x 200 μm) do szkiełka za pomocą kleju Araldite. UWAGA: Powoduje to zmatowienie powierzchni w celu ułatwienia przylegania agarozy, aby zapewnić, że podłoże agarozowe przykleja się lub mocuje do szkiełka. Ten slajd może być ponownie użyty.</li>
	<li>Umieścić kroplę około 20 μl podłoża agarozowego na wytrawionym obszarze szkiełka podstawowego. Daje to cienką warstwę agarozy.</li>
	<li>Przechowuj szkiełko w wilgotnym pudełku i poczekaj, aż podłoże agarozowe stwardnieje.</li>
</ol>
2. Sekcja i montaż próbek merystemu
<ol>
	<li>Mikropreparuj merystemy do obrazowania konfokalnego: usuń pąki kwiatowe jeden po drugim z łodygi, ciągnąc je w dół ultra cienką pęsetą. Ważne jest, aby usunąć wszystkie pąki kwiatowe aż do pąków, które nie wykazują działek kielicha (tj. Zawiązki P114).</li>
	<li>Za pomocą żyletki lub końcówki pęsety odetnij merystem od łodygi. Cięcie powinno być równoległe do obszaru powierzchni merystemu, który ma być mierzony za pomocą AFM. Uzyskany wierzchołek powinien mieć wysokość od 300 μm do 600 μm, aby zmieścił się pod końcówką AFM.</li>
	<li>Wcisnąć wierzchołek w folię z pożywką agarozową przygotowaną w kroku 1.1.4. Wybierz pozycję na szkiełku podstawowym / agarozie i delikatnie dociśnij tak, aby merystem stykał się bezpośrednio ze szkiełkiem podstawowym i wystawał z agarozy. Bardzo ważne jest, aby umieścić merystem w agarozie w ciągu kilku sekund, które następują po jego odcięciu od łodygi. UWAGA: Ma to na celu zapobieżenie wysychaniu merystemu. Na tym etapie merystem będzie stał w pęknięciu, ponieważ agaroza pękła pod wpływem nacisku.</li>
	<li>W ten sposób należy przygotować kilka merystemów do obrazowania wsadowego, pod warunkiem, że są one tej samej wysokości i znajdują się w odległości mniejszej niż 500 μm od siebie na szkiełku. Przygotowane merystemy należy przechowywać w wilgotnym pojemniku podczas preparowania dalszych próbek. 
	UWAGA: Ogranicza odchylenia wynikające z kalibracji. Idealnie byłoby, gdyby można było przygotować i losowo zmierzyć 2 próbki każdego stanu. Do tej pory nie zaobserwowano wpływu obrazowania wsadowego na pomiar (reakcja wywołana stresem). Może to być spowodowane rozcieńczeniem cząsteczek sygnalizacji stresu w agarze i/lub roztworze montażowym. Alternatywnie, reakcja na stres jest taka sama, niezależnie od ilości przygotowanej próbki.</li>
	<li>Zanim przejdziesz do następnego kroku, upewnij się, że granica między merystemem a pąkami kwiatowymi jest sucha. Jeśli nie, delikatnie usuń nadmiar wody za pomocą bibuły filtracyjnej. Powinno to zapobiec w kolejnym etapie, że stopiona agaroza zaleje próbkę pod wpływem sił kapilarnych.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 20 μl dodać tyle stopionej agarozy montażowej, aby wypełnić pęknięcie powstałe w kroku 1.2.3 i otoczyć każdy merystem. Agaroza powinna osiągnąć poziom blizny po usuniętym pąku kwiatowym (zawiązku). Aby to osiągnąć, może być konieczne dodanie agarozy na każdym końcu pęknięcia.</li>
	<li>Po dodaniu agarozy szybko wleje się do szczeliny; za pomocą pipety odessać część stopionej agarozy montażowej, aby upewnić się, że merystem znajduje się w najwyższym punkcie na szkiełku. To naprawia merystem tak, że nie może się poruszać podczas obrazowania.</li>
</ol>
3. Montaż próbek korzeniowych lub hipokotylowych
<ol>
	<li>W przypadku korzeni i hipokotyli nie jest konieczna sekcja. W cienkiej warstwie agarozy na przygotowanym szkiełku podstawowym wykonaj rowek bezpośrednio nad wytrawieniem w szkle lub wzdłuż szklanej blaszki. Umieść korzeń lub hipokotyl w tym rowku, upewniając się, że styka się ze szkłem na całej jego długości.</li>
	<li>Przed przejściem do następnego kroku upewnij się, że próbka jest sucha na swojej powierzchni. Jeśli nie, delikatnie usuń nadmiar wody za pomocą bibuły filtracyjnej.</li>
	<li>Dodać stopioną agarozę montażową wokół próbki, jak w kroku 1.2.6.</li>
</ol>
4. Przygotowanie AFM i kalibracja czułości (dla JPK Nanowizard AFM)
<ol>
	<li>Zamontuj wspornik na AFM. Wspornik powinien być zamontowany z okrągłym wgłębnikiem. Promień określi rozdzielczość x, y, z i głębokość wcięcia, przy której można zarchiwizować dokładny pomiar.
	<ol>
		<li>Aby wykonać pomiary w mezo-nanoskali na powierzchni naskórka, użyj okrągłego wgłębnika o promieniu 50 nm; aby wykonać pomiary mezoskalowe, użyj okrągłego wgłębnika o promieniu 0,5 μm; aby wykonać pomiary w mikroskali (na 2-3 komórkach), użyj okrągłego wgłębnika o promieniu 2,5 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść laser na końcówce wspornika. Ustaw laser na środku porywacza za pomocą lustra.</li>
	<li>Umieść czystą szklankę pod AFM. 
	UWAGA: następujące czynności mają na celu przekształcenie sygnału położenia lasera na receptorze AFM w odkształcenie wspornika i, poprzez ocenę stałej sprężystości wspornika, przełożenie go na siłę.</li>
	<li>Podejście z "nastawą" siły docelowej 1 V.</li>
	<li>Wybierz "spektroskopia sił". Wykonaj wgłębienie, ustawiając maksymalną "względną wartość zadaną" na 2 V, "prędkość rozszerzenia" na 40 μm/s, a "długość z" na 5 μm.</li>
	<li>Z menu "menedżer kalibracji" wybierz liniową część krzywej do przodu, aby dopasować czułość za pomocą przycisku "wybierz zakres dopasowania". "Względna wartość zadana" powinna zostać przekształcona z "wolta" na "miernik".</li>
	<li>Z menu "menedżer kalibracji" wybierz "stałą sprężystości", aby ocenić elastyczność wspornika za pomocą wahań temperatury. Naciśnij "uruchom", aby uzyskać wykres gęstości widmowej wspornika. Znajdź szczyt rezonansowy o najniższej częstotliwości. Dopasuj go za pomocą przycisku "wybierz zakres dopasowania". 
	UWAGA 1: Aby uzyskać więcej informacji na temat strojenia fluktuacji termicznych, przeczytaj Cook i wsp.15 
	UWAGA 2: Zaleca się stosowanie metody bezpośredniej do oceny elastyczności wspornika przy użyciu wspornika referencyjnego (lub materiału o znanej sztywności). Ten, którego tu użyto, został podarowany przez firmę Atef Asnacios16.</li>
	<li>Dodać 200 μl 10% roztworu mannitolu pod końcówkę wspornika. Ustaw laser na środku porywacza za pomocą lustra.</li>
	<li>Ponownie skalibruj czułość: w menu "menedżer kalibracji" kliknij przycisk "nieznany"; powtórz kroki od 2.3 do 2.5.</li>
</ol>
5. Akwizycja danych: kartografia pozornego modułu Younga
<ol>
	<li>Umieścić zamontowane próbki pod AFM i dodać do próbki kroplę 500 μl 10% roztworu mannitolu. Roztwór mannitolu plazmolizuje komórki w ciągu kilku minut.</li>
	<li>Podejście z siłą docelową ("wartość zadana") 20 nN ("wartość zadana" nie powinna być większa niż 3 V)</li>
	<li>Wcięcie o "względnej wartości zadanej" 200 nN, "prędkości rozciągającej" 40 μm/s i "długości z" 5 μm.</li>
	<li>Skorygować "względną wartość zadaną" w celu uzyskania wgłębienia 100 nm dla zamontowanego wspornika 200 nm lub 0,5 μm dla zamontowanego wspornika 1 μm/5 μm.</li>
	<li>W trybie "mapowania siły" wybierz obszar do skanowania: dla merystemów 70 μm x 70 μm z rozdzielczością ("pikseli") 64 x 64; dla hipokotyli i korzeni 100 μm x 100 μm z rozdzielczością 64 x 64.</li>
	<li>Naciśnij skanowanie, aby uruchomić eksperymenty. Zapisz dane wyjściowe.</li>
</ol>
6. Analiza danych: Obliczenia pozornego modułu Younga
<ol>
	<li>Otwórz plik danych w oprogramowaniu do analizy danych.</li>
	<li>Wybierz opcję "przetwarzanie wsadowe", aby zastosować tę samą analizę do wszystkich krzywych na jednej mapie.</li>
	<li>Wybrać opcję "skoryguj wysokość gięcia wspornika", aby wyodrębnić głębokość wcięcia.</li>
	<li>Wybierz "Funkcję dopasowania modułu Younga", która założy, że siła jest proporcjonalna do obszaru wcięcia. Ustaw "kształt końcówki" na paraboliczny, aby założyć, że kształt wcięcia jest paraboliczny.</li>
	<li>Wskaż promień końcówki.</li>
	<li>Preferencyjnie należy wybrać krzywą "wycofania" dla analizy, ponieważ jest ona mniej wrażliwa na topografię niż krzywa "przedłużająca". Jeśli jednak sonda jest mocno zakleszczona podczas "chowania", należy użyć krzywej "przedłużenia", która jest niewrażliwa na przywieranie.</li>
	<li>Ustaw współczynnik Poissona na 0,5. Naciśnij Analizuj i zapisz dane wyjściowe.</li>
</ol>

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+in+vitro+extensibility+of+growing+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Measuring in vitro extensibility of growing plant cell walls.</a> Methods in molecular biology. 715, 291-303 (2011).</li>
<li>Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+plant+cell+wall+extension+%28creep%29+induced+by+acidic+pH+and+by+alpha-expansin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , 1263(2009).</li>
<li>Durachko, D. anielM., C, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Plant+Cell+Wall+Extension+%28Creep%29+Induced+by+Acidic+pH+and+by+Alpha-Expansin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin.</a> J. Vis. Exp.. , 25(2009).</li>
<li>Suslov, D., Verbelen, J. P., Vissenberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onion+epidermis+as+a+new+model+to+study+the+control+of+growth+anisotropy+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+botany%22%5BJournal%5D)">Onion epidermis as a new model to study the control of growth anisotropy in higher plants.</a> Journal of experimental botany. 60, 4175-4187 (2009).</li>
<li>Parre, E., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin+and+the+role+of+the+physical+properties+of+the+cell+wall+in+pollen+tube+growth+of+Solanum+chacoense%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense.</a> Planta. 220, 582-592 (2005).</li>
<li>Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+growth+in+pollen+tubes+is+associated+with+spatially+confined+dynamic+changes+in+cell+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties.</a> Developmental biology. 334, 437-446 (2009).</li>
<li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysical journal. 103, 386-394 (2012).</li>
<li>Milani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+local+wall+stiffness+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 67, 1116-1123 (2011).</li>
<li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current biology : CB. 21, 1720-1726 (2011).</li>
<li>Braybrook, S. A., Hofte, H., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mechanical+contributions+of+the+pectin+matrix%3A+Insights+for+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+signaling+%26+behavior%22%5BJournal%5D)">Probing the mechanical contributions of the pectin matrix: Insights for cell growth.</a> Plant signaling & behavior. 7, 1037-1041 (2012).</li>
<li>Routier-Kierzkowska, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+force+microscopy+for+in+vivo+measurements+of+plant+tissue+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics.</a> Plant physiology. 158, 1514-1522 (2012).</li>
<li>Agudelo, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TipChip%3A+a+modular%2C+MEMS-based+platform+for+experimentation+and+phenotyping+of+tip-growing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).</li>
<li>Miedes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xyloglucan+endotransglucosylase%2Fhydrolase+%28XTH%29+overexpression+affects+growth+and+cell+wall+mechanics+in+etiolated+Arabidopsis+hypocotyls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+botany%22%5BJournal%5D)">Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls.</a> Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).</li>
<li>Byrne, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+leaves1+mediates+leaf+patterning+and+stem+cell+function+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis.</a> Nature. 408, 967-971 (2000).</li>
<li>Cook, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+implementation+of+dynamic+methods+for+measuring+atomic+force+microscope+cantilever+spring+constants%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants.</a> Nanotechnology. 17, 20135-22145 (2006).</li>
<li>Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creep+function+of+a+single+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Creep function of a single living cell.</a> Biophysical journal. 88, 2224-2233 (2005).</li>
<li>Peaucelle, A., Braybrook, S., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+mechanics+and+growth+control+in+plants%3A+the+role+of+pectins+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+plant+science%22%5BJournal%5D)">Cell wall mechanics and growth control in plants: the role of pectins revisited.</a> Frontiers in plant science. 3, 121(2012).</li>
<li>Mittler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+signaling%3A+the+new+wave%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+plant+science%22%5BJournal%5D)">ROS signaling: the new wave.</a> Trends in plant science. 16, 300-309 (2011).</li>
<li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana%3A+the+relationship+between+auxin+and+pectin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS%22%5BJournal%5D)">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> PLoS. 8, e57813(2013).</li>
<li>Asnacios, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanics+behind+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The mechanics behind cell polarity.</a> Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).</li>
<li>Meister, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluidFM%3A+combining+atomic+force+microscopy+and+nanofluidics+in+a+universal+liquid+delivery+system+for+single+cell+applications+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond.</a> Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).</li>
<li>Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ball+tonometry%3A+a+rapid%2C+nondestructive+method+for+measuring+cell+turgor+pressure+in+thin-walled+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+plant+growth+regulation%22%5BJournal%5D)">Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells.</a> Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).</li>
<li>Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+or+driving+force%3F+The+role+of+turgor+pressure+in+oscillatory+plant+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth.</a> PloS one. 6, e18549(2011).</li>
<li>Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+extraction+of+Arabidopsis+cell+turgor+pressure+using+nanoindentation+in+conjunction+with+finite+element+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W roślinach zmieniające się właściwości mechaniczne odgrywają główną rolę w kierowaniu wzrostem i morfogenezą. Do tej pory poczyniono ogromne postępy w rozwikłaniu sieci genetycznych i chemicznych, które kontrolują wzrost roślin, ale nasza wiedza na temat tego, w jaki sposób sieci te przyczyniają się do zmian właściwości mechanicznych i jak na nie wpływają zmiany, jest szczątkowa. Metoda ta powinna pozwolić nam wypełnić tę lukę, a więc powinna być przedmiotem dużego zainteresowania naukowców zajmujących się badaniem jaki...

Wzrost roślin osiąga się dzięki skoordynowanej ekspansji sztywnych ścian komórkowych, które otaczają każdą komórkę organizmu. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że to właśnie poprzez modyfikację składu chemicznego ściany komórkowej rośliny lokalnie kontrolują tę ekspansję. Uważa się, że ekspansja jest napędzana głównie przez obciążenie ścian komórkowych, spowodowane wysokim ciśnieniem turgoru komórki; Ta reakcja odkształcenia na ciśnienie turgoru jest regulowana przez właściwości mechaniczne ścian komórkowych1. Niewiele wiadomo o tych właściwościach mechanicznych i o tym, jak zmieniają się one podczas rozwoju. Co więcej, niewiele wiadomo o tym, w jaki sposób te właściwości mechaniczne są kontrolowane i czy sprzężenia zwrotne przyczyniają się do zmiany chemii ściany komórkowej w sposób, który wydaje się być skoordynowany w tkance. Jeśli mamy zrozumieć związek między chemicznymi i mechanicznymi zmianami w ścianach komórkowych roślin podczas rozwoju, a ostatecznie w jaki sposób te mikroskopijne interakcje rządzą makroskopowym wzrostem rośliny, potrzebna jest metoda, która może monitorować właściwości mechaniczne ścian komórkowych w rozwijających się narządach w skali komórkowej lub tkankowej.
Opisana tutaj metoda mikroskopii sił atomowych (AFM), która opiera się na mikrometrowych lub nanometrowych kompresjach lub wgłębieniach tkanki, została opracowana właśnie do pomiaru właściwości mechanicznych ścian komórkowych w rozwijających się organach jednocześnie w rozdzielczościach subkomórkowych i w całych regionach tkanki. Inne metody mają rozdzielczość, która jest albo zbyt niska, albo zbyt wysoka: ekstensometr jest w stanie zmierzyć średnie właściwości mechaniczne całej tkanki tylko w skali milimetrowej2-4, która jest na przykład zbyt duża, aby zmierzyć wczesne zdarzenia organogenezy; Mikroindenter może wykonywać pomiary w rozdzielczości subkomórkowej w skali nanometrowej, ale jest ograniczony do pomiaru izolowanych komórek, a nie grup komórek lub narządów5-7. Dzięki AFM wymagane rozdzielczości tkankowe, komórkowe i subkomórkowe można osiągnąć8-10. Ostatnio opracowano kilka protokołów specjalnie do pomiaru mechaniki tkanki roślinnej, które mogą być również wykorzystane11,12.
Przedstawimy tutaj, jak ocenić elastyczność tkanki poprzez pomiar pozornego modułu Younga13.
Moduł Younga jest powszechnie używany do opisania sztywności materiału. Podczas małych odkształceń siła potrzebna do odkształcenia materiału jest proporcjonalna do obszaru wgłębienia. Moduł Younga jest tym współczynnikiem. W przypadku ciągłego materiału jednorodnego ten sam współczynnik będzie mierzony niezależnie od rodzaju wgłębienia (wielkości i kształtu), ale będzie się zmieniał wraz z prędkością pomiaru. W przypadku złożonej budowy tkanki roślinnej zaobserwowaliśmy do tej pory, że siła jest proporcjonalna do odkształcenia, co pozwala na wyznaczenie współczynnika proporcjonalności, który nazywamy "pozornym modułem młodości". W przeciwieństwie do pożywek ciągłych w roślinach, ten pozorny młody moduł jest wrażliwy na wielkość wgłębienia. Nie odpowiada młodym modułom czystej ściany komórkowej. Najlepiej opisuje elastyczność rusztowania ściany komórkowej tkanki.

<table><tbody><tr><td>AFM</td><td>JPK</td><td>NanoWizard</td><td>Wszystkie 3 generacje są w stanie wykonać pracę z tym samym predyspozycjami.</td></tr><tr><td>Stopień AFM</td><td>JPK</td><td>CellHesion</td><td>Wymagane dla próbki o niskiej topografii (mniej niż 11 &mikro; m między najniższym a najwyższym punktem w obszarze skanowania siły).</td></tr><tr><td>Optyka AFM</td><td>Optyka JPK</td><td>Top View Bardzo</td><td>ważne w celu ustawienia próbki. Można go zastąpić lornetką dalekiego zasięgu lub mikroskopem.</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>M125</td><td>Każdy rodzaj mikroskopu stereoskopowego może się nadać.</td></tr><tr><td>Wspornik 150 nm zamontowany</td><td>Nanosensory Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Szwajcaria</td><td>R150-NCL-10</td><td>Do pomiaru tylko ściany komórkowej na powierzchni naskórka użyj.</td></tr><tr><td>1 &mikro; m wspornik montowany na m</td><td>Nanosensory Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Szwajcaria</td><td>SD-Sphere-NCH-S-10</td><td>Do pomiaru mechaniki ściany komórkowej prostopadłej do powierzchni naskórka.</td></tr><tr><td>Wspornik bez końcówki</td><td>Nanosensory Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchâtel, Szwajcaria</td><td>TL-NCH-20</td><td>Aby zmierzyć lokalną mechanikę tkanki (o szerokości 2-3 komórek), użyj 5 &mikro; Wspornik zamontowany M. Dołączyliśmy 5 & mikro; m stopka borokrzemianowa do wspornika bez końcówki.</td></tr><tr><td>5 & mikro; m mikrosfery krzemowe</td><td>Korpuskularne</td><td>C-SIO-5</td><td></td></tr><tr><td>Araldite</td><td>Bartik S.A. 77170 Coubet, Francja</td><td></td><td>Araldite do mocowania stopki do wspornika bez końcówki.</td></tr><tr><td>Niskotopliwa agaroza</td><td>Fisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410</td><td>BP160-100</td><td>34-45 &#176; C temperatura żelowania</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA</td><td>M4125-500G</td><td></td></tr><tr><td>2 Pęseta ze stali nierdzewnej nr 5</td><td>Ideal-Tek 6828 Balerna, Szwajcaria&nbsp;</td><td></td><td></td>951199</tr></tbody></table>

mapowanie właściwości elastycznych ścian komórkowych w oparciu o afm: w rozdzielczościach tkankowych, komórkowych i subkomórkowych

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

Opisujemy niedawno opracowaną metodę pomiaru właściwości mechanicznych powierzchni tkanek roślinnych za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) mikro/nano-wgłębień, dla JPK AFM. W szczególności w tym protokole mierzymy pozorny moduł ścian komórkowych Younga w rozdzielczościach subkomórkowych w regionach do 100 μm x 100 μm w merystemach kwiatowych, hipokotylach i korzeniach. Wymaga to starannego przygotowania próbki, prawidłowego doboru mikrowgłębników i głębokości wgłębień. Aby uwzględnić tylko właściwości ściany komórkowej, pomiary wykonuje się w wysoce stężonych roztworach mannitolu w celu plazmolizy komórek, a tym samym usunięcia wpływu ciśnienia turgoru komórek.
W przeciwieństwie do innych istniejących technik, dzięki zastosowaniu różnych głębokości wgłębników i wgłębień, ta metoda umożliwia jednoczesne pomiary wieloskalowe, tj. w rozdzielczościach subkomórkowych i na setkach komórek składających się na tkankę. Oznacza to, że obecnie możliwe jest przestrzenno-czasowe scharakteryzowanie zmian, jakie zachodzą we właściwościach mechanicznych ścian komórkowych podczas rozwoju, umożliwiając skorelowanie tych zmian ze wzrostem i różnicowaniem. Stanowi to kluczowy krok do zrozumienia, w jaki sposób skoordynowane mikroskopijne zmiany komórkowe powodują makroskopowe zdarzenia morfogenetyczne.
Jednak kilka ograniczeń pozostaje: metoda może być stosowana tylko na dość małych próbkach (około 100 μm średnicy) i tylko na tkankach zewnętrznych; metoda jest wrażliwa na topografię tkanek; mierzy tylko niektóre aspekty złożonych właściwości mechanicznych tkanki. Technika ta jest szybko rozwijana i jest prawdopodobne, że większość z tych ograniczeń zostanie rozwiązana w najbliższej przyszłości.

Na Rysunku 1 przedstawiamy typowe mapy modułów Younga merystemów kwiatowych (Rysunki 1A i 1B), młodych i starych podkiełszaczy (Rysunki 1C-F) oraz merystemu korzenia (Rysunek 1G i 1H). We wszystkich eksperymentach zastosowano wgłębnik półkolisty, jednak jego promień różni się w zależności od wymaganej rozdzielczości przestrzennej. Rysunki 1C i 1D prezentują typowe wyniki dla wgłębników w...

Opisujemy metodę mapowania właściwości mechanicznych tkanek roślinnych za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM). Skupiamy się na tym, jak rejestrować zmiany mechaniczne, które zachodzą w ścianach komórkowych podczas rozwoju roślin w mezoskali szerokopolowej, umożliwiając skorelowanie tych zmian ze wzrostem i morfogenezą.

Mapowanie właściwości elastycznych ścian komórkowych w oparciu o AFM: w rozdzielczościach tkankowych, komórkowych i subkomórkowych

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest mapowanie właściwości mechanicznych tkanek roślinnych przy użyciu mikroskopu sił atomowych. W pierwszej kolejności należy przygotować szkiełka przedmiotowe, n nanosząc pipetą kroplę aros o niskiej temperaturze topnienia na trawiony obszar szkiełka w celu utworzenia cienkiej warstwy aros. Drugim krokiem jest wycięcie i zamocowanie próbki.Usuń pąki kwiatowe z łodygi, odetnij fragment łodygi i natychmiast osadź odcięty fragment w cienkiej warstwie Agros na szkiełku. Następnie dodaj wystarczającą ilość roztopionego Agros montażowego, aby wypełnić szczelinę powstałą podczas osadzania łodygi w warstwie Agros. Ostatnim krokiem jest przygotowanie mikroskopu sił atomowych do akwizycji danych.Ostatecznie analiza danych i pomiary pozornego modułu Younga ścian komórkowych pozwalają na stworzenie mapy mechanicznej właściwości ścian komórkowych jednocześnie w rozdzielczości subkomórkowej i w obrębie całych obszarów tkanki. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest możliwość jednoczesnego pomiaru właściwości mechanicznych ściany komórkowej w rozdzielczości subkomórkowej oraz w całym regionie tkanki. Pożywka Aros do zatapiania prób

afm-based-mapping-elastic-properties-cell-walls-at-tissue-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mapowanie oparte na AFM właściwości elastycznych ścian komórkowych: na poziomie tkanki, komórki i subkomórkowej

Sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływa na wiele zachowań komórek adherentnych. Sztywność macierzy zmienia się przestrzennie w obrębie tkanki i ulega modyfikacjom w różnych stanach chorobowych. W niniejszej pracy opracowujemy metody charakteryzacji zmienności przestrzennej sztywności w normalnej i zwłókniałej tkance płuc myszy z wykorzystaniem mikroindentacji za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Mikromechaniczna charakterystyka tkanki płucnej z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii siłowej

Ten artykuł demonstruje protokół charakteryzujący właściwości mechaniczne żywych komórek za pomocą mikrowgłębienia za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM).

Pomiar właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Nowatorski protokół obrazowania został opracowany przy użyciu niestandardowego mechanicznego siłownika napędzanego silnikiem, aby umożliwić pomiar reakcji w czasie rzeczywistym na mechaniczne naprężenia w żywych komórkach. Istotny z punktu widzenia mechanobiologii system może nanosić szczepy do 20%, umożliwiając jednocześnie obrazowanie w czasie zbliżonym do rzeczywistego za pomocą mikroskopii konfokalnej lub mikroskopii sił atomowych.

Obrazowanie żywych komórek podczas rozciągania mechanicznego

Krystaliczna celuloza jest ważnym składnikiem ściany komórkowej roślin. Jednak jego kwantyfikacja w rozdzielczości komórkowej jest technicznie trudna.  W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie technologii światła spolaryzowanego i przekrojów korzeniowych w celu uzyskania informacji o składzie ściany komórkowej w rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Kwantyfikacja w wysokiej rozdzielczości akumulacji krystalicznej celulozy w korzeniach rzodkiewnika w celu monitorowania specyficznych tkankowo modyfikacji ściany komórkowej

Tutaj prezentujemy mikroskopię sił atomowych (AFM), działającą jako narzędzie do nano- i mikro-indentacji komórek i tkanek. Przyrząd pozwala na jednoczesne pozyskiwanie topografii powierzchni 3D próbki i jej właściwości mechanicznych, w tym modułu Younga ściany komórkowej oraz ciśnienia turgoru.

Zastosowanie mikroskopii sił atomowych do pomiaru właściwości mechanicznych i ciśnienia turgoru komórek roślinnych i tkanek roślinnych

Ten protokół ma na celu automatyzację pomiarów AFM na setkach komórek mikrobiologicznych. Najpierw drobnoustroje są unieruchamiane w mikrostrukturach stemplowych PDMS, a następnie pomiary spektroskopii sił są wykonywane automatycznie na setkach unieruchomionych komórek.

Automatyzacja pomiarów mikroskopem sił bioatomowych na setkach komórek C. albicans

Prezentowany jest tutaj protokół techniki Conpokal, która łączy mikroskopię konfokalną i mikroskopię sił atomowych w jedną platformę instrumentów. Conpokal zapewnia tę samą komórkę, ten sam region, prawie równoczesne obrazowanie konfokalne i mechaniczną charakterystykę żywych próbek biologicznych.

Niemal równoczesna skaning laserowy Mikroskopia konfokalna i mikroskopia sił atomowych (Conpokal) na żywych komórkach

Protokół wgłębień mikroskopii sił atomowych oferuje możliwość przeanalizowania roli fizycznych właściwości ściany komórkowej konkretnej komórki tkanki lub organu podczas normalnego lub ograniczonego wzrostu (tj. przy niedoborze wody).

Mikroskopia sił atomowych w celu zbadania właściwości fizycznych komórek naskórka żywych korzeni rzodkiewnika

Badania biomechaniki ściany komórkowej są niezbędne do zrozumienia wzrostu i morfogenezy roślin. Zaproponowano następujący protokół do zbadania cienkich pierwotnych ścian komórkowych w tkankach wewnętrznych młodych organów roślinnych za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Charakterystyka właściwości mechanicznych pierwotnej ściany komórkowej w żywych organach roślinnych z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych

Ilościowe określenie powierzchni styku i siły wywieranej przez końcówkę sondy mikroskopu sił atomowych (AFM) na powierzchnię próbki umożliwia określenie właściwości mechanicznych w nanoskali. Omówiono najlepsze praktyki w zakresie wdrażania nanotwardości opartej na wspornikach AFM w powietrzu lub płynie na miękkich i twardych próbkach w celu pomiaru modułu sprężystości lub innych właściwości nanomechanicznych.

Mikroskopia sił atomowych Nanotwardość oparta na wspornikach: pomiary właściwości mechanicznych w nanoskali w powietrzu i płynie

Ten protokół wizualizuje, jak przygotować kriosekcje mysiej tkanki płucnej, przeprowadzić eksperymenty z mapą siły pod mikroskopią sił atomowych i przeanalizować dane w celu określenia modułu Younga natywnej mysiej błony podstawnej płuc.

Wyodrębnianie modułu Younga natywnych mysich błon podstawnych płuc z map sił pochodnych mikroskopii sił atomowych

Poznaj metodę mapowania właściwości mechanicznych ścian komórkowych roślin za pomocą mikroskopii sił atomowych AFM. Technika ta umożliwia pomiary w rozdzielczości subkomórkowej i tkankowej jednocześnie.

Mapowanie właściwości elastycznych ścian komórkowych w oparciu o AFM: w rozdzielczościach tkankowych, komórkowych i subkomórkowych (Wideo) | JoVE Journal

Mapowanie właściwości elastycznych ścian komórkowych w oparciu o AFM: w rozdzielczościach tkankowych, komórkowych i subkomórkowych

Przeglądaj więcej filmów